Summary
여기서, 우리는 투과 전자 현미경 검사법(TEM)을 사용하여 시투에서 거대 카르요세포의 초구조를 분석하는 프로토콜을 제시한다. 뮤린 뼈 졸은 수집, 고정, 에폭시 수지에 내장및 초박형 섹션에서 절단됩니다. 대조 염색 후, 골수는 120 kV에서 TEM 현미경으로 관찰된다.
Abstract
메가카요세포의 분화 및 성숙은 골수의 세포 및 세포 외 구성 요소와 밀접한 관련이 있습니다. 이러한 공정은 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 거대 카르요세포 세포질에서 필수 구조의 점진적인 출현, 경계막 시스템(DMS) 및 순환 혈소판에서 발견되는 조밀하고 알파 과립이라고 불리는 내부 멤브레인 네트워크인 폴리플로이드 및 폴리로부트 핵과 같은 필수 구조의 점진적인 외관을 특징으로 합니다. 본 기사에서는, 우리는 골수의 성숙 단계와 세포 밀도를 정의하는 주요 특성의 식별을 허용하는 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)을 사용하여 뮤린 거대 카르요세포의 시투 초구조 적 연구를위한 표준화 된 프로토콜을 설명합니다. 뼈 로는 플러시, 고정, 에탄올탈수, 플라스틱 수지에 내장, 횡단면을 생성하기 위해 장착된다. 반박형 및 얇은 단면은 각각 조직학 및 TEM 관측을 위해 준비됩니다. 이 방법은 모든 EM 시설에서 모든 골수 세포에 사용할 수 있으며 동일한 마우스에서 여러 이미징 접근법의 조합을 허용하는 작은 샘플 크기를 사용하는 장점이 있습니다.
Introduction
메가카요세포는 골수에 국한되어 혈소판 생산1을담당하는 대형 폴리플로이드 세포를 특수화한다. 그(것)들은 복잡한 성숙 과정을 통해 조혈 줄기 세포에서 유래하고, 그 동안 거대 karyocyte 전구체가 점진적으로 크기가 증가하는 동안, 세포질과 핵2에있는 광대한 수반성 형태 변경을 겪고 있는 동안. 성숙 하는 동안, 메가 karyocytes 포함 하 여 구별 할 수 있는 구조 요소의 수를 개발: 폴리로부이트 핵, 경계 막 시스템을 형성 하는 표면 막의 질 (DMS), 액틴 기반 사이토스켈레탈 네트워크에 의해 둘러싸인 세포기관이 없는 주변 영역, α-과립, 고밀도 과립, 굴절을 포함 하 여 수많은 세포기관. 초구조적 수준에서, 관찰된 주요 수정은 DMS3에의해 분리된 이산 영역으로 세포질 구획화이다. 멤브레인의이 광범위한 공급은 혈소판 생산의 초기 단계에서 긴 세포질 공정의 확장을 연료, 다음 순환 내부 혈소판으로 리모델링됩니다. 메가카요세포 분화 및 성숙 중 모든 결함은 혈소판 수 및/또는 혈소판 기능의 기간 동안 혈소판 생산에 영향을 미칠 수 있습니다.
얇은 층 투과 전자 현미경 검사법 (TEM)은 혈전 포에이시스4,5의생리학에 대한 우리의 이해를 형성 한 거대 카르요세포의 고품질 초구조를 제공하는 수십 년 동안 선택의 이미징 접근 방식이었다. 이 논문은 모든 골수 세포 유형을 분석하는 기초가 될 수 있는 토착 골수 마이크로 환경 내에서 발생하는 혈소판 생물 발생 과정을 포착할 수 있는 표준화된 TEM 방법에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는 미숙한 에서 완전히 성숙에 메가 카르요세포의 개발의 초구조적 예를 제공, 이는 시누소이드6의미세 순환으로 세포질 공정을 확장. 우리는 또한 골수의 재생 및 혈소판 생산 능력에 지시, 다른 메가 카요세포 성숙 단계를 정량화하는 쉬운 절차를 설명합니다.
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Protocol
모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 데티크 앙 마티에르 디에리포앙 마티에르 데테리션 애니멀 스트라스부르)에 따라 수행되었습니다. 프로토콜은 그림 1에괄호로 표시됩니다.
1. 골수 수집 및 고정 (그림 1A)
주의: 이 절차는 발암성, 돌연변이 및/또는 독성 물질을 포함하며 화학 추출 후드에서 수행됩니다. 장갑및 보호 안경과 같은 적절한 보호 장비를 착용하십시오.
- 캘코디레이트 버퍼에서 2.5% 글루타랄데히드로 구성된 고정 솔루션을 준비합니다(보충 파일참조).
- 골수 컬렉션
- 성인 C57BL/6 생쥐를 성관계 12-18주 중으로 사용하십시오. CO2 질식 및 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시.
- 얇은 가위 한 켤레로 허벅지 주위의 피부를 자르고 핀셋을 사용하여 피부를 벗겨냅니다. 발의 사지를 제거한 다음 엉덩이와 허벅지 사이를 잘라냅니다. 무릎 관절에서 절단하여 대퇴골에서 경골을 분리하고 메스를 사용하여 음정과 대퇴골에 부착 조직을 제거합니다.
- 날카로운 면도날로 표피를 제거합니다. 핀셋으로 대퇴골을 들고 있는 동안 21G 바늘로 카콜딜레이트 버퍼로 채워진 5mL 주사기를 사용하여 골수를 2mL 의 교정 버퍼로 채워진 15mL 튜브로 플러시하십시오. 이렇게하려면, 골수 개구부에 바늘의 bevel을 삽입하고 골수가 추방 될 때까지 천천히 플런저를 누릅니다.
- 골수 고정에 급속한 몰입에 의해 고정.
- 플러싱 직후 플라스틱 파이펫을 사용하여 골수 실린더를 실온에서 60분 동안 신선한 글루타랄데히드 고정 용액(이전에 1.1으로 준비)으로 옮기는 것입니다.
참고: 조직을 보존하려면 뼈 해부에서 고정 단계에 이르는 전체 프로세스가 10분 이내에 완료되었는지 확인합니다. 고정을 위해, 고정 솔루션이 열 충격을 방지하기 위해 실온에 있는지 확인합니다.
- 플러싱 직후 플라스틱 파이펫을 사용하여 골수 실린더를 실온에서 60분 동안 신선한 글루타랄데히드 고정 용액(이전에 1.1으로 준비)으로 옮기는 것입니다.
2. 아가로즈에 골수를 포함
참고: 골수 조직은 다른 세척 단계 동안 무결성을 유지하기에 충분히 응집력이 없으며 재료는 쉽게 손실 될 수 있습니다. 이 문제를 극복하기 위해, 골수는 탈수하기 전에 한천의 젤로 덮여있다.
- 보충 파일에 설명된 대로 아가로즈 솔루션을 준비한다.
- 1.3절에서 고정된 골수를 카코딜레이트 버퍼에서 세척하고 플라스틱 파이펫을 사용하여 유리 슬라이드로 조심스럽게 옮겨주세요. 따뜻한 파이펫을 사용하여 골수 실린더에 2% 액체 화고 한 방울을 빠르게 발라주세요.
참고: 냉각 하는 동안 한천신속 하 게 고형화. 골수의 균일한 덮개를 보장하기 위해, 천 용액은 슬라이드에 증착 될 때까지 따뜻하게 유지해야합니다. - 한천이 굳어질 때까지 빠르게 슬라이드를 얼음 위에 놓습니다(1-2분).
- 현미경의 밑에, 이 지역에 있는 가능한 조직 압축 때문에 골수 실린더의 사지를 절단하고 폐기하기 위하여 날카로운 면도날을 이용하십시오. 1mL의 카코딜레이트 버퍼를 포함하는 1.5mL 마이크로센트심심분리기 튜브에서 골수 블록을 전달한다.
3. 수지에 골수를 포함
주의: 수지 성분은 독성이 있습니다. 일부는 발암성이며 화학 추출 후드에서 주의를 기울여야합니다. 장갑및 보호 안경과 같은 적절한 보호 장비를 사용하십시오. 오스뮴 테트옥사이드는 실온에서 매우 휘발성이 높으며 증기는 눈, 코 및 인후에 매우 해롭습니다. 폐기되기 전에 식물성 기름의 두 배를 추가하여 2 % 오스뮴 테트옥사이드를 중화해야합니다.
- 보충 파일에설명된 대로 에폭시 수지준비.
- 수지 포함
참고: 오스뮴, 우란 아세테이트 및 에탄올의 연속된 욕조에서 인큐베이션 하는 동안 동일한 미세 원심 분리튜브에 샘플을 보관하십시오. 파스퇴르 파이펫으로 슈퍼네이터를 흡인합니다. 각 욕조에 사용되는 용액의 부피는 샘플의 부피의 10배 이상이어야 합니다.- 4°C에서 1시간 동안 1% 오스뮴으로 블록을 수정한 다음, 한 번 은근한 완충액을 한 번 세척한 다음 증류수로 한 번 세척합니다.
- 증류수에 4% 우라일 아세테이트를 1시간 동안 더러워, 증류수로 두 번 씻어낸 스테인.
- 증류수에 에탄올의 등급 시리즈를 통해 탈수: 5 분 동안 75 % 에탄올에서 4 번, 20 분 동안 95 % 에탄올에서 3 번, 그리고 20 분 동안 100 % 에탄올에서 3 번. 이 단계에서는 냉동고에서 에폭시 수지 1개를 꺼내십시오.
참고: 프로토콜은 1시간 동안 100% 에탄올로 일시 중지할 수 있습니다. - 골수 내부에 에폭시 수지의 균일한 침투 및 중합을 얻으려면, 15 분 동안 프로필렌 옥사이드의 2 연속 목욕에서 블록을 먼저 배양한다.
- 1:1 혼합물의 100% 프로필렌 옥사이드와 에폭시 수지와 1시간 동안 배양한다. 샘플을 실온에서 느린 회전 셰이커에 놓습니다.
- 100% 에폭시 수지를 추가하여 교반 하에서 하룻밤 잠복식시 샘플을 남깁니다.
- 2 시간 인큐베이션에 100 % 에폭시 수지추가 여전히 교반 중입니다.
- 현미경의 밑에, 평평한 실리콘 금형에 골수 블록을 놓습니다. 전체 골수의 후속 횡단 절위를 허용하기 위해 샘플을 지향한다. 에폭시 수지로 금형을 채우고 48 h에 대한 60 °C에서 배치합니다.
참고: 모든 솔루션(에탄올 및 프로필렌 옥사이드 제외)은 샘플 오염을 방지하기 위해 0.22 μm 필터를 통해 필터링됩니다. 수지의 적절한 중합을 보장하기 위해 금형을 채우는 동안 거품을 피하십시오.
4. 초박형 단면(그림 1B)
참고: 전송 EM은 전자가 세포, 구조 및 내부 세포기관의 내부의 투영 영상을 생성할 수 있는 얇은 조직 섹션(과립, 내풍구성 망상, 골기) 및 세포세포 내 세포막의 배열을 요구합니다.
- 초미세토메 지지대에서 시료 블록을 장착합니다. 샘플 홀더에 넣습니다. 회전 다이아몬드 또는 텅스텐 밀링 커터와 조직 주위 수지의 과잉을 제거하기 위해 45 °에서 샘플을 손질.
- 물 탱크가 장착 된 다이아몬드 칼 날로 초미세 토메에 샘플을 장착하십시오. 조직학적 및 TEM 분석을 위해 500nm 및 100 nm 두께의 가로 부분을 각각 절단합니다. 루프를 통해 수면의 부동 섹션을 수집합니다.
- 유리 슬라이드에 500 nm 두께의 섹션과 200 메쉬 얇은 바 구리 그리드에 100 nm 두께의 섹션을 종이 필터로 보관하십시오. 하나의 조건에 대해 5개의 그리드를 준비합니다: 두 개의 그리드를 먼저 염색하고 필요한 경우 나머지 세 개의 그리드를 백업으로 유지합니다.
5. 히스토로지톨루이딘 블루 스테인싱
참고: 조직학을 위한 염색 단면도는 3가지 이유로 중요합니다: 1) 조직이 실제로 절단되고 수지가 아닌지 확인하고, 2) 포함의 품질을 확인하고, 3) 골수 샘플을 빠르게 평가한다. 이것이 정확하지 않은 경우 블록에서 더 자세히 잘라냅니다.
- 열판(60°C)에서 반박구간 슬라이드를 건조시다.
- 슬라이드에 증류수에 여과된 1% toluidine 블루/1% 나트륨 붕산염을 넣고 핫 플레이트(60°C)에서 1-2분 동안 가열합니다. 증류수로 슬라이드를 씻고 열판에서 건조시키십시오.
- 폴리(부틸 메틸 메타크릴레이트) 장착 매체를 장착하고 가벼운 현미경으로 검사하여 커버립에 단면을 장착합니다.
6. TEM 관찰을위한 중금속 염색(도 1C)
참고: 대조적으로, 그리드의 상부는 루프가 있는 각 연속 목욕의 100 μL 방울에 반전됩니다. 사용하기 전에 각 용액은 0.22 μm필터링됩니다. 필터 용지의 그리드 측에 부드럽게 접촉하여 각 욕조 사이에 액체의 과잉을 제거합니다.
- 증류수에 4% 우라인 아세테이트를 5분 동안 더러워 진 스테인.
- 증류수로 3회 5분 세척합니다.
- 3 분 동안 리드 구연산염얼룩.
- 증류수로 3회 5분 세척합니다.
- 필터 용지와 접촉하여 아래쪽으로 그리드를 적기시켜 건조시합니다.
참고: 중금속은 이산화탄소가 존재하여 반응합니다. 침전을 최소화하기 위해, 대조 하는 동안 공기 변위를 방지, 말을 하지 마십시오, 환경을 진정 유지 하 고 에어컨을 해제.
7. TEM(그림 1E)
참고: 섹션은 TEM 현미경으로 소개되고 120 kV에서 검사됩니다.
- 먼저 낮은 배율(< 500x)에서 섹션을 검사하여 준비의 일반적인 측면을 평가합니다(수지의 구멍이 없는 경우, 단면의 주름/압축, 얼룩으로 인한 침전).
- 그런 다음 더 높은 배율(~ 2000x~성숙의 단계를 구별할 수 있음)에서 단면을 검사합니다. 전체 트랜스버라 구간에서 성숙의 각 단계에서 메가카요사이클을 수동으로 계산합니다(각 스테이지를 시각적으로 식별하는 방법에 대한 대표 결과 참조).
참고: 그리드의 각 사각형은 검사 영역으로 정의됩니다(200메쉬 구리 그리드의 경우 16000 μm2와 동일). - 메가카요사이클의 수를 평가하려면 섹션으로 완전히 덮인 사각형만 정량화합니다. 이렇게 하려면 범위의 스크리닝을 기반으로 모델을 사용합니다. 섹션의 극단에서 다른 사각형, 같은 방법으로 다른 범위 등으로 의 첫 번째 범위를 관찰하십시오. 이 절차를 사용하여 전체 골수 횡단 섹션 사각형을 정사각형으로 완전히 체계적으로 화면으로 검사합니다.
- 각 사각형에 대해 스테이지 I, II 또는 III 메가카요사이클의 수를 점수매기세요.
참고: 과립, DMS 조직, 세포질 영역의 크기 및 폴리로부이드 된 핵을 분석하기 위해서는 배율이 높아지도록 요구됩니다.
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Representative Results
골수 히스토로지
가벼운 현미경하에서 골수 톨루이딘 청색 조직학을 관찰하는 것은 조직 압축성, 미세혈관 연속성, 메가카르요세포의 크기 및 형상(도 1D)과 같은 관점에서 전체 조직 아키텍처를 빠르게 분석하는 열쇠이다. 그것은 골수 블록에서 더 깊은 절단의 필요성을 결정하기 위해 초박형 섹션 전에 수행됩니다. 거대한 크기와 핵 로빙으로 인해 더 성숙한 메가카요세포는 40배의 목표로 쉽게 시각화할 수 있습니다. 이것은 조직에 있는 성숙한 megakaryocytes의 조밀도 및 마이크로 혈관에 그들의 상대적인 현지화의 우수하고 빠른 개요를 제공합니다. 메가카요세포 증식 및 성숙의 이상은 이미 반박한 섹션에서 검출될 수 있었다.
골수 울트라 구조
뚜렷한 초구조적 특성에 기초하여, 뮤린 메가카요세포는 성숙의 순차적 단계를 나타내는 4단계로 나뉩니다(그림2A). 단계 I 메가카요세포는 직경 10-15 μm이며, 대부분의 세포를 차지하고 풍부한 리보솜과 거친 내피성 망상을 함유하고 있는 큰 핵이 있다. DMS의 초기 검출 단계의 존재, 사전 DMS라고, 또한 TEM 분석3에서단계 I MKs를 구별하기위한 핵심 기준이다. 성숙의 단계 II에서, 과립 형성이 시작되고 DMS의 발달이 시작됩니다. 메가카요세포의 크기는 15-25 μm의 직경을 측정하고 핵 로브를 개발합니다. 성숙한 단계 III 거대 카르요세포는 직경 25-50 μm의 거대한 세포입니다. 그들의 세포질은 명확하게 정의된 세포질 영토와 세포기관이 없는 주변 지역을 가진 잘 발달된 DMS를 포함합니다. 이 단계에서 핵은 일반적으로 편심으로 위치하며 핵 막에 있는 응축된 크로마틴으로 매우 불규칙하게 나타납니다. 마지막 단계는 세포질의 대부분이 제거된 후에 플라즈마 막에 둘러싸인 큰 핵으로 이루어져 있는 피레노세포라고도 하는 벌거벗은 핵을 특징으로 합니다. 야생 형 C57BL/6 마우스에서, 골수는 대략 8% 단계 I, 20% 단계 II, 71% 단계 III 거대 카르요사이클 및 < 1% 피레노사이클을 포함한다. 메가카요세포의 평균 수는 평방 당 1.7에서 2.2 세포 사이입니다. 이 임의분류를 통해 지속적인 세포 분화 과정을 편리하게 모니터링하고 가능한 이상을 감지할 수 있습니다.
이러한 고전적인 성숙 단계 외에도, 골수의 고정 된 메가 카요세포의 관찰은 거대 카르요세포가 부비동벽 (도 2B)과 상호 작용함에 따라 발생하는 일련의 사건을 분석 할 수 있습니다. 내피 세포와 접촉하는 메가 카요세포는 얇은 섹션에서 자주 관찰된다. 때때로 하나는 내피성 또는 부비동 루멘으로 세포질의 큰 투영을 확장 짧은 침략 적 돌출을 형성하는 메가 카요사이클을 관찰7,8. 놀랍게도, 이러한 인트라바스내 세포질 공정은 가변 크기, 길이 및 직경을 표시하여 순환에서 프로그레시브 혈소판 리모델링을 보여줍니다. 평상시 순환에 이미 존재하는 혈소판은, 일주 마이크로투룰코일에 의해 유지되는 디스코이드 모양을 갖는, 또한 부비동의 루멘에서 볼 수 있다. 혈소판의 이 전형적인 형태는 시편의 정확한 고정을 나타낸다.
전송 전자 현미경 검사법은 핵 로빙, DMS및 과립의 공간 조직과 같은 초구조적 세부 사항을 크기, 모양 및 분포 측면에서 시각화하는 데 필요한 해상도 수준을 가지고 있습니다. 도 2C는 α 과립, 골기 시스테나, 미토콘드리아 및 내피성 망상의 존재를 보여주는 단계 III 메가카요시테에서 perinuclear 영역의 예입니다. 도 2C에서도 주목할 만한 다각체는 알파 및 조밀한 과립의 형성에서 중간 단계를 나타내는 다중 혈관 바디로, 직경9,10에서 200Å 미만의 다중 외형을 함유하고있다. 마지막으로, 전염 전자 현미경 검사는 세포가 다른 살아있는세포(11)를관통하는 에페리폴시스에게 불린 드문 과정에 따라, (도 2D) 거대 karyocytes 안에 존재하는 호중구 및 그밖 조혈 세포를 시각화할 수 있게 한다. 정상적인 생리적 조건에서 메가카요낭의 4%를 우려하는 이 과정은 특정 병리학 적 조건에서 크게 증가 할 수있습니다(12).
그림 1: 실험 설정의 회로도 그림. (A)골수 임베드 절차. 골수는 글루타랄데히드 용액에 빠르게 침수되어 세척되고 고정됩니다. 사진은 플러시 후 골수 실린더의 전형적인 모습을 보여줍니다. 실온에서 1시간 동안 고정된 후, 골수는 아가로즈로 둘러싸여 있으며, 오스뮴 테트옥사이드로 후 고정되어 우라일 아세테이트로 배양됩니다. 조직은 그 때 완충에서 헹구고, 일련의 등급에 있는 에탄올에서 탈수되고, 프로필렌 옥사이드에서 배양하고 에폭시 수지로 침투합니다. (B)뼈 로는 단면을 차단합니다. 내장된 골수는 45°로 트리밍된 초미세토메 홀더에 장착되어 반박(500nm) 또는 얇은(100nm) 섹션으로 절단됩니다. 초구조 적 연구의 경우 부동 섹션은 루프로 픽업되고 아래에 종이 필터가있는 그리드에 증착됩니다. (C)TEM 관측에 대한 대비 염색. 그리드는 우라일 아세테이트 방울에 반전되어 증류수 방울에 세척되고 또 다른 세척이 실행되기 전에 납 구연산에 배양됩니다. 건조 후(섹션이 있는 상부) 샘플은 TEM 하에서 검사할 준비가 되어 있습니다. (D)톨루이딘 블루로 염색된 마우스 대퇴골골부의 연수. 거대한 세포는 성숙한 거대 카르요세포 (1)에 해당하며, 일부는 부비동성 (2)과 접촉합니다. 부비동은 큰 중앙 부비동 정맥 (3)에 수렴합니다. 바: 20 μm. Inset: 40배 배율로 성숙한 메가카요시테의 정상적인 외관. (E)낮은 배율에서 골수 섹션의 대표적인 TEM 이미지. 세포는 세포 외 공간이 거의 없습니다. 단면의 각 그리드 사각형은 단개에서 다른 쪽으로 관찰되며, 회로도 화살표 경로(빨간색 화살표)를 따라다볼 수 있습니다. 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 거대 카르요세포 초구조의 시상 영상을 대표한다. (A)야생형 메가카르요세포의 특징적인 성숙 단계. 메가카요세포는 4개의 성숙 단계로 분류됩니다: 단계 I, 큰 핵을 가진 직경의 세포 10-15 μm; 단계 II, 개발 중인 DMS를 포함하는 직경 15-30 μm 세포; 단계 III, 세포질 영역을 정의하고 세포가 없는 주변 영역을 갖는 잘 발달된 경계 막 시스템(DMS)을 포함하는 30-50 μm 세포. 피레노세포는 전체 세포질 확장 에 따라 골수에 남아있는 벌거 벗은 폴리로부트 핵에 해당합니다. 바: 10 μm(B)메가카요시테 내피 세포 상호 작용 및 내트라바스 내세포 공정. (i) 메가카요세포의 주변 영역(PZ)은 부비동성 내피의 아블루미탈 표면에 밀접하게 서게 된다. (ii) 내피층(arrowheads)에 깊이 침투하는 짧은 침략적 돌출을 형성하는 메가카요세포. (iii-v) 화살표는 다양한 직경을 가진 거대 카르요세포의 세포질 과정을 나타내며, 그 중 일부는 매우 크고 혈류에 들어간 파편을 나타낼 수 있는 주변 영역이 있습니다. (vi) 부비동 루멘에서 관찰된 전형적인 디스코이드 혈소판(P). 각 현미경그래프에서, 적색선은 내피 장벽의 광원 측을 나타내고 별은 부비동루멘을 나타낸다. 바: 2 μm.(C)성숙한 거대 핵세포의 회핵 영역의 높은 배율. α, 알파 과립; rer, 거친 풍안성 망상; G, 골기; MVB, 다각체; m, 미토콘드리아. 바: 0.5 μm.(D)에페리폴리스를 나타내는 메가카요시테의 예. 삼켜진 호중구는 거대 카르요세포와의 상호 작용에 의해 형태학적으로 변하지 않는 것처럼 보입니다. 바: 2 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 : 시약의 준비. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
그들의 토착 환경에서 메가 카요 세포의 직접 검사는 메가 karyopoiesis 및 혈소판 형성을 이해하는 데 필수적이다. 본 원고에서, 우리는 골수 홍조와 침수에 의한 고정을 결합한 투과 전자 현미경 법을 제공하여 골수에서 일어나는 메가 카요세포 형태 발생의 전체 과정의 형태 학적 특성을 시상할 수 있도록 합니다.
골수의 플러싱은 고품질 플러싱의 성공은 작업자의 연습과 교육에 따라 달라지므로 이 방법의 중요한 단계입니다. 비록 섬세하지만, 골수를 플러시하는 것은 일반적으로 거대 카르요세포 형태에 중요한 유물과 관련된 완전한 탈석화를 위해 2 주 EDTA 치료를 필요로하는 미네랄 화 뼈의 제거를 피하는 가장 좋은 방법입니다. 추가적으로, 경골과 대퇴골에서 전체 고정되지 않은 뼈 marrows를 수집하는 주요 이점은 동일한 마우스에 여러 이미징 접근 방식을 결합하는 기능입니다. 실제로, 초구조 연구에는 단일 골수만 필요하며, 다른 세 가지 표본은 상호 보완적인 분석을 위해 사용할 수 있습니다. 두 번째 골수는 신선한 골수 박종의 준비에 사용될 수 있으며, 네이티브 메가카요세포6의프로플라틀 형성의 역학을 실시간으로 연구할 수 있다. 세 번째 샘플은 일반적으로 두꺼운 섹션에 대한 면역 염색 연구를 위해 설계되어 자연 환경 내에서 3D 이미징 및 거대 핵세포 분포를 제공합니다. 마지막 시료는 면역금 전자 현미경 검사법에 의한 추가 연구를 위해 동결 및 저장될 수 있으며, 여기서 단백질의 세포소세포 국소화는 고해상도4에서조사된다. 이러한 결합된 이미징 방법은 마우스에 있는 유전자의 표적 삭제/돌연변이의 가용성과 더불어, 혈전포에 있는 주어진 단백질의 생물학 역할을 현장에서 삭제하는 중요한 수단을 제공합니다. 그러나, 이 방법의 한 가지 제한은 골수를 플러시하는 데 필요한 epiphyses의 철수입니다 여기에서 지적되어야 한다. Epiphys는 조혈증을 위한 중요한 지역으로 알려져 있고, 그들의 제거는 그러므로 조혈줄기 세포 및 결합의 초기 단계를 분석의 어떤 가능성을 방해합니다13. 또 다른 제한은 미숙한 단계 전에 메가 카요세포의 전구가 특정 초구조적 특징을 가지고 있지 않기 때문에 식별 할 수 없다는 것입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 EM 면역골드 접근법을 사용할 수 있습니다.
이 방법의 두 번째 중요한 단계는 침수에 의한 골수 고정입니다. 여기에 설명된 조건하에서 수행될 때, 즉, 컴팩트한 골수 실린더를 플러시한 직후에 고정하면 다음과 같은 장점이 있습니다: (i) 빠르고 수행하기 쉽고, (ii) 관류6에의한 고정에 가까운 초구조를 보존하고, (iii) 무량 핵세포 공정및 혈소판을 유지한다. 이 기술을 통해 부비동순환에 메가카요사이클의 진입을 조사하고 혈소판이 발생하는 모든 중간 형태의 세포질 공정을 특징으로 할 수있다. 이에 따라, 최근에는 생체 내 의 거대 카르요세포로부터 의대돌출이 생체내메가카요세포에 의해 형성된 얇은 확장과 구조적으로 구별되는 것으로 보고되고 있으며, 특히 마이크로투튜블7의상이한 배열이 있다. 유사하게, 우리는 최근에 생체 내에서 혈소판 형성을 지배하는 기계장치가 시험관 14에서확인된 것과 다르다는 것을 보여주었습니다.
중요한 초구조적 차이는 생체외 배양과 생체 내 생성 된 네이티브 메가 카요사이클 사이에 점점 더 인식되고 있으며, 전체 메가 카요세포 분화 / 성숙을위한 골수 미세 환경의 필요성을 강조합니다. 이 문서에 설명된 침수에 의한 골수 플러싱 및 고정의 조합에 이어, 기존의 투과 전자 현미경 검사는 여전히 생리학적 및 병리학적 조건 하에서 거대 핵세포 생물학 및 혈소판 형성을 연구하는 귀중한 도구로 남아 있습니다.
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Disclosures
저자는 선언할 이해 관계의 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 파비엔 프로머, 장 이브 린켈, 데이비드 호프만, 모니크 프룬드에게 기술 지원을 부탁드립니다. 이 작품은 ARMESA (협회 드 Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)을 통해 유럽 연합과 그랜트 ANR-17-CE14-0001-01H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
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