Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לניתוח אולטרה מבנה של megakaryocytes במקום באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM). מח עצם מורין נאספים, קבועים, מוטבעים בשרף אפוקסי וחתוכים בחלקים אולטרה-דקים. לאחר כתמי ניגודיות, מוח העצם נצפה תחת מיקרוסקופ TEM ב 120 kV.
Abstract
בידול והתבגרות של megakaryocytes להתרחש בשיתוף הדוק עם הרכיבים התאיים והחוץ תאיים של מח העצם. תהליכים אלה מאופיינים בהופעה הדרגתית של מבנים חיוניים בציטופלסמה של מגהקריוציטים כגון גרעין פוליפלואידי ופוליבולוס, רשת ממברנות פנימית הנקראת מערכת קרום תיחום (DMS) וגרגרי אלפא צפופים ואלפא שיימצאו בטסיות דם במחזור. במאמר זה, אנו מתארים פרוטוקול סטנדרטי למחקר אולטרה-מבני של מקרונים מורין באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM), המאפשר זיהוי של מאפיינים מרכזיים המגדירים את שלב ההתבגרות שלהם ואת הצפיפות התאית במח העצם. מח העצם הוא סמוק, קבוע, מיובש באתנול, מוטבע שרף פלסטיק, ומותקן ליצירת חתך. חלקים דקים ודקים למחצה מוכנים לתצפיות היסתולוגיות ו- TEM, בהתאמה. שיטה זו יכולה לשמש עבור כל תא מח עצם, בכל מתקן EM ויש לו את היתרון של שימוש בגדלים מדגם קטן המאפשר שילוב של מספר גישות הדמיה על אותו עכבר.
Introduction
Megakaryocytes הם תאים פוליפלואידים גדולים מיוחדים, מקומי במח העצם, אחראי על ייצור טסיות דם1. מקורם בתאי גזע hematopoietic באמצעות תהליך התבגרות מורכב, שבמהלכו מבשרי megakaryocyte גדלים בהדרגה, תוך כדי שינויים מורפולוגיים בו זמנית נרחבים בציטופלסמה ובגרעין2. במהלך ההבשלה, megakaryocytes לפתח מספר אלמנטים מבניים בולטים כולל: גרעין polylobulated, פולשים של קרום פני השטח היוצרים את מערכת קרום התיחום (DMS), אזור היקפי נטול אברונים מוקף רשת cytos שלד מבוסס actin, אברונים רבים כולל α-גרגירים, גרגירים צפופים, ליזוזומים, ומתחמי Golgi מרובים. ברמה האולטרה-מבנית, שינוי משמעותי שנצפה הוא המידור הציטופלסמי לאזורים נפרדים המופרדים על ידי DMS3. אספקה נרחבת זו של ממברנות תדלק את הרחבת התהליכים הציטופלסמיים הארוכים בשלב הראשוני של ייצור טסיות הדם, אשר לאחר מכן לשפץ לתוך טסיות בתוך מחזור הדם. כל פגם במהלך בידול megakaryocyte והתבגרות יכול להשפיע על ייצור טסיות דם במונחים של ספירת טסיות דם ו /או פונקציית טסיות דם.
מיקרוסקופיית אלקטרונים העברת שכבה דקה (TEM) הייתה גישת ההדמיה של בחירה במשך עשרות שנים ומספקת אולטרה-מבנה באיכות גבוהה של מגהקריוציטים שעיצבו את הבנתנו את הפיזיולוגיה של תרומבוזיס4,5. מאמר זה מתמקד בשיטת TEM מתוקננת המאפשרת ללכוד את תהליך ביוגנזה טסיות הדם המתרחשות במקום בתוך microenvironment מח העצם המקומי, אשר יכול לשמש גם כבסיס לנתח כל סוג תא מח עצם. אנו מספקים דוגמאות אולטרה-מבניות להתפתחות של מגהקריוציטים ממבוגרים עד בוגרים לחלוטין, המרחיבים תהליכים ציטופלסמיים לתוך מיקרו-סירקולציה שלסינוסים 6. אנו מתארים גם הליך קל לכימות שלבי ההתבגרות השונים של המגקריוציט, המלמדים על התחדשות ויכולת ייצור טסיות הדם של מח העצם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). הפרוטוקול מוצג באופן סכמטי באיור 1.
1. איסוף מח עצם קיבעון ( איור 1A)
זהירות: הליך זה כולל חומרים מסרטנים, מוטגניים ו/או רעילים ומבוצע תחת מכסה מנוע כימי. ללבוש ציוד מגן מתאים כגון כפפות ומשקפי הגנות.
- הכן את הפתרון הקיבוטורי המורכב 2.5% glutaraldehyde במאגר קקודילאט (ראה קובץ משלים).
- אוסף מח עצם
- השתמש עכברי C57BL/6 בוגרים של כל מין 12-18 שבועות של גיל. להרדים את העכברים על ידי חנק CO2 ונקע צוואר הרחם.
- עם זוג מספריים דקים, לחתוך את העור סביב הירך ולהשתמש פינצטה כדי לקלף את העור. הסר את הגפיים של כף היד ולאחר מכן לחתוך בין הירך לירך. לנתק את השוקה מ עצם הירך על ידי חיתוך בניסוח הברך ולהסיר רקמה דבקה על השוקה ועל עצם הירך באמצעות אזמל.
- הסר את האפיפיזות עם סכין גילוח חד. בעת החזקת עצם הירך עם פינצטה, השתמש מזרק 5 מ"ל מלא חוצץ קקודילאט עם מחט 21 G כדי לשטוף את מוח העצם לתוך צינור 15 מ"ל מלא חוצץ קקודילאט 2 מ"ל. כדי לעשות זאת, להכניס את שיפוע המחט לתוך פתח מח העצם ולאט לאט לחץ על הבוכנה עד מוח הוא גורש.
- קיבוע מח עצם על ידי טבילה מהירה לתוך קיבוע.
- מיד לאחר שטיפה, להשתמש pipette פלסטיק להעביר את גליל מח העצם לתוך 1 מ"ל של פתרון קיבוע glutaraldehyde טרי (שהוכן בעבר 1.1) במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
הערה: כדי לשמר את הרקמה, ודא כי התהליך כולו, מ ניתוח עצם לשלב הקיבעון, הושלם בתוך פחות מ -10 דקות. עבור הקיבעון, ודא כי הפתרון הקיבוינטיבי הוא בטמפרטורת החדר כדי למנוע הלם חום.
- מיד לאחר שטיפה, להשתמש pipette פלסטיק להעביר את גליל מח העצם לתוך 1 מ"ל של פתרון קיבוע glutaraldehyde טרי (שהוכן בעבר 1.1) במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר.
2. הטמעת מח עצם באגרוז
הערה: רקמת מח עצם אינה מגובשת מספיק כדי לשמור על שלמותה במהלך שלבי הכביסה השונים והחומר יכול ללכת לאיבוד בקלות. כדי להתגבר על בעיה זו, מח העצם מכוסה בג'ל אגר לפני התייבשות.
- הכן את פתרון אגרוז כמתואר בקובץ המשלים.
- לשטוף את מח העצם הקבוע מסעיף 1.3 במאגר קקודילט ולהעביר אותו בזהירות למגלשת זכוכית באמצעות pipette פלסטיק. באמצעות פיפטה חמה, להחיל במהירות טיפה של 2% אגר נוזלי על גליל מח העצם.
הערה: אגר מתמצק במהירות בעת קירור. כדי להבטיח כיסוי הומוגני של מח העצם, יש לשמור על פתרון אגר חם עד שהוא מופקד על המגלשה. - מניחים במהירות את המגלשה במהירות על הקרח עד שהאגר מתמצק (1-2 דקות).
- תחת מיקרוסקופ, השתמש בסכין גילוח חדה כדי לחתוך ולהשליך את הגפיים של גליל מח העצם בגלל דחיסת רקמות אפשרית באזורים אלה. העבר את בלוקי מח העצם בצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של חוצץ קקודילאט.
3. הטמעת מח עצם בשרף
זהירות: רכיבי שרף רעילים; חלקם מסרטנים ויש לטפל בהם בזהירות תחת מכסה מנוע מיצוי כימי. יש להשתמש בציוד מגן מתאים כגון כפפות ומשקפי הגנה. אוסמיום tetroxide הוא נדיף מאוד בטמפרטורת החדר והאדים שלה מזיקים מאוד לעיניים, לאף ולגרון. לפני שהושלך, 2% osmium tetroxide חייב להיות מנוטרל על ידי הוספת כפול נפח שמן צמחי שלה.
- הכן את שרף אפוקסי כמתואר בקובץ המשלים.
- הטבעת שרף
הערה: שמור את הדגימות באותם צינורות microcentrifuge במהלך דגירה באמבטיות רצופות של אוסמיום, אצטט אורניל ואתנול. שאפו את אנטנטי העל עם פיפטת פסטר. נפח הפתרון המשמש עבור כל אמבטיה חייב להיות שווה לפחות פי 10 מנפח המדגם.- לאחר לתקן את הבלוקים עם 1% אוסמיום במאגר קקודילאט עבור 1 שעות ב 4 °C (70 °F), לשטוף פעם אחת במאגר קקודילציה ולאחר מכן פעם במים מזוקקים.
- כתם עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך שעה אחד, לשטוף פעמיים במים מזוקקים.
- להתייבש דרך סדרה מדורגת של אתנול במים מזוקקים: 4 פעמים ב 75% אתנול במשך 5 דקות, ואחריו 3 פעמים ב 95% אתנול במשך 20 דקות ולאחר מכן 3 פעמים ב 100% אתנול במשך 20 דקות. בשלב זה, להוציא מזרק אחד של שרף אפוקסי מהמקפיא.
הערה: הפרוטוקול יכול להיות מושהה ב 100% אתנול במשך 1 שעה. - כדי להשיג חדירה אחידה פילמור של שרף אפוקסי בתוך מח העצם, דגירה תחילה בלוקים ב 2 אמבטיות רצופות של תחמוצת פרופילן במשך 15 דקות.
- מוסיפים תערובת 1:1 של תחמוצת פרופילן 100% ושרף אפוקסי ודגרה במשך שעה אחת. מניחים את הדגימות על שייקר סיבובי איטי בטמפרטורת החדר.
- מוסיפים 100% שרף אפוקסי להשאיר את המדגם עבור דגירה לילה תחת תסיסה.
- מוסיפים 100% שרף אפוקסי לדגירה של 2 שעות, עדיין תחת עצבנות.
- תחת מיקרוסקופ, מניחים את גושי מח העצם לתוך תבניות סיליקון שטוחות. כוון דגימות כדי לאפשר חתך רוחבי עוקב של מח העצם כולו. ממלאים את התבניות בשרף אפוקסי ומניחים אותן ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
הערה: כל הפתרונות (למעט אתנול ותחמוצת פרופילן) מסוננים באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר כדי למנוע זיהום דגימות. כדי להבטיח פילמור נאות של שרף, להימנע בועות בעת מילוי התבניות.
4. חתך אולטרה-דק (איור 1B)
הערה: שידור EM דורש מקטעי רקמות דקות שדרכם אלקטרונים יכולים לעבור יצירת תמונת הקרנה של פנים התאים, המבנה, וארגון של אברונים פנימיים (גרגירים, רטיקולום אנדופלסמי, Golgi) ואת הסידור של קרום התא התא התאי.
- הר את בלוק המדגם בתמיכה אולטרה-מיקרוטומית. שים את זה על מחזיק הדגימה. חותכים את הדגימות ב 45° על מנת להסיר את עודף השרף סביב הרקמה עם יהלום מסתובב או חותך טונגסטן כרסום.
- הר את הדגימות על ultramicrotome עם להב סכין יהלום מצויד במיכל מים. חתוך מקטעים רוחביים של 500 ננומטר ועובי של 100 ננומטר עבור ניתוחים היסתולוגיים ו- TEM, בהתאמה. לאסוף קטעים צפים על פני המים עם לולאה.
- הפקד את החלק בעובי 500 ננומטר על מגלשת זכוכית וחלקים בעובי 100 ננומטר על רשתות נחושת 200 רשת דק-בר עם מסנן נייר מתחת. הכן חמש רשתות לתנאי אחד: הכתים שתי רשתות תחילה ושמור על שלוש הרשתות הנותרות כגיבוי במידת הצורך.
5. תכתם כחול טולואידין להיסתולוגיה
הערה: מקטעי הכתמה עבור היסתולוגיה חשוב משלוש סיבות: 1) כדי לוודא כי הרקמה נחתכת למעשה ולא את השרף, 2) כדי לבדוק את איכות ההכללה, ו 3) כדי להעריך במהירות את דגימת מח העצם. אם זה לא נכון, לחתוך עמוק יותר בבלוק.
- יבש את החלקים הדקים למחצה להחליק על צלחת חום (60 °C (60 °C ).
- הוסף מסנן 1% טולואידין כחול / 1 % נתרן בוראט במים מזוקקים על המגלשות וחום על צלחת חמה (60 °C )C) במשך 1-2 דקות. לשטוף את המגלשות עם מים מזוקקים ולתת לו להתייבש על צלחת החום.
- הרכבה של מקטעים על כיסויים עם טיפה של פולי (בוטיל מתקליט-שותף-מתיל מת'קרילט) הרכבה בינונית ובוחנת תחת מיקרוסקופ אור.
6. כתמי מתכת כבדה לתצפית TEM (איור 1C)
הערה: עבור הניגודיות, הצד העליון של הרשתות הפוכים על 100 טיפות μL של כל אמבטיה רצופה עם לולאה. לפני השימוש, כל פתרון מסונן ב- 0.22 מיקרומטר. הסר את עודף הנוזל בין כל אמבטיה על ידי מגע עדין בצד הרשת על נייר מסנן.
- כתם עם 4% אורניל אצטט במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- כתם עם ציטוט עופרת במשך 3 דקות.
- לשטוף 3 פעמים במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- הפקד את הרשתות בצד התחתון במגע עם נייר המסנן כדי לאפשר להם להתייבש.
הערה: מתכות כבדות מגיבות בנוכחות פחמן דו חמצני. כדי למזער את המשקעים, הימנעו מהתזוזת אוויר במהלך הניגודיות, אל תדברו, שמרו על הסביבה רגועה וכבה את המזגן.
7. טמ (איור 1E)
הערה: המקטעים מוצגים במיקרוסקופ TEM ונבדקים ב- 120 kV.
- ראשית לבחון את הסעיפים בהגדלה נמוכה (< 500x) כדי להעריך את ההיבט הכללי של ההכנה (היעדר חור בשרף, קפלים / דחיסה בקטעים, משקעים עקב כתמים).
- לאחר מכן לבחון את הסעיפים בהגדלה גבוהה יותר (~ 2000x המאפשר להבחין בין שלב ההתבגרות). ספירה ידנית של המגקריוציטים מכל שלב של התבגרות על-פני מקטעים רוחביים שלמים (ראה תוצאות מייצגות כיצד לזהות חזותית כל שלב).
הערה: כל ריבוע של הרשתות מוגדר כאזור לבדיקה (השווה ל- 16000 מיקרומטר2 עבור 200 רשתות נחושת רשת). - כדי להעריך את מספר המגקריוציטים, לכמת רק את הריבועים המכוסים במלואם במקטע. כדי לעשות זאת, השתמש במודל המבוסס על הקרנת טווחים. צפה בטווח הראשון של ריבועים מקיצוניות של המקטע למשנהו, ואז טווח אחר באותו אופן, וכו '. באמצעות הליך זה, לסנן באופן מלא ושיטתי את כל מח העצם רוחבי קטע מרובע אחר ריבוע.
- עבור כל ריבוע, הבקיעו את מספר המגקריוציטים שלב I, II או III.
הערה: הגדלות גבוהות יותר נדרשות כדי לנתח את הגרגרים, ארגון DMS, את גודל השטחים הציטופלסמיים ואת הגרעין polylobulated.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היסתולוגיה של מח עצם
התבוננות בהיסתולוגיה הכחולה של מח העצם תחת מיקרוסקופ אור היא המפתח לנתח במהירות את ארכיטקטורת הרקמות הכוללת במונחים של למשל, דחיסות רקמות, המשכיות מיקרו-בסל, וגודלם וצורה של מגה-קריוציטים (איור 1D). זה מבוצע לפני קטעים ultrathin כדי לקבוע את הצורך של חיתוך עמוק יותר בבלוק מח העצם. בשל גודלם הענק ו lobulation הגרעיני שלהם, megakaryocytes בוגר יותר ניתן לדמיין בקלות עם מטרה 40x. זה נותן סקירה מצוינת ומהירה של הצפיפות של megakaryocytes בוגר ברקמה ואת לוקליזציה יחסית שלהם microvessels. אנומליות בהתפשטות מגה-קריוצייטים והתבגרות כבר זוהו בחלקים דקים למחצה כאלה.
מבנה מח עצם אולטרה
על בסיס מאפיינים אולטרה-מבניים מובהקים, מקרוציטים מורינים מחולקים לארבעה שלבים המייצגים שלבים רציפים בהבשלתם (איור 2A). שלב I megakaryocytes הם בקוטר 10-15 מיקרומטר עם גרעין גדול הכובש את רוב התא ומכיל ריבוזומים בשפע ורטיקולום אנדופלסמי מחוספס. נוכחותו של השלב המוקדם ביותר לזיהוי של DMS, הנקרא pre-DMS, היא גם קריטריון מרכזי להבחנה בין חברי פרלמן בשלב I בניתוח TEM3. בשלב II של ההתבגרות, היווצרות גרגר מתחילה ואת הפיתוח של DMS הוא יזם. Megakaryocytes להגדיל את גודל, מדידת 15-25 מיקרומטר קוטר ולפתח lobulation גרעיני. בוגר שלב III megakaryocytes הם תאים ענקיים 25-50 מיקרומטר קוטר. הציטופלסמה שלהם מכילה DMS מפותח עם שטחים ציטופלסמיים מוגדרים בבירור ואזור היקפי נטול אברונים. בשלב זה, הגרעין ממוקם בדרך כלל באופן אקסצנטרי ונראה מאוד לא סדיר עם כרומטין מרוכז הממוקם בממברנה הגרעינית. השלב האחרון מאופיין בגרעין עירום, המכונה גם פירנוציט, המורכב מגרעין גדול המוקף בקרום פלזמה לאחר שרוב הציטופלסמה בוטלה. בעכברים מסוג בר C57BL/6, מח העצם כולל כ-8% שלב I, 20% שלב II, 71% מגהקריוציטים בשלב III ו-< 1% פירנוציטים. המספר הממוצע של מגהקריוציטים הוא בין 1.7 ל- 2.2 תאים לריבוע. סיווג שרירותי זה מאפשר לעקוב בנוחות אחר תהליך מתמשך של בידול תאים ולזהות את הסטיות האפשריות שלו.
לצד שלבים קלאסיים אלה של התבגרות, התבוננות במגקריוציטים קבועים במח העצם מאפשרת לנתח את סדרת האירועים המתרחשים כאשר מגהקריוציטים מתקשרים עם הקיר הסינוסואידי (איור 2B). Megakaryocytes במגע עם תאי אנדותל נצפים לעתים קרובות בחלקים דקים. מדי פעם מתבוננים במגקריוציטים היוצרים בליטות פולשניות קצרות החודרות לאנדהולם או מאריכות הקרנה גדולה של הציטופלסמה שלו ללומן הסינוסואידי7,8. למרבה הפלא, תהליכים ציטופלסמיים תוך-וסקולריים אלה מציגים גדלים, אורכים וקוטרים משתנים, וממחישים את שיפוץ טסיות הדם המתקדמות במחזור הדם. טסיות דם כבר נוכח במחזור הכללי, בעל צורה דיסקואיד נשמר על ידי סלילי microtubule היקף, נראים גם בלומן של הסינוסים. מורפולוגיה טיפוסית זו של טסיות הדם מעידה על הקיבעון הנכון של הדגימה.
למיקרוסקופיית אלקטרונים שידור יש את רמת הרזולוציה הנדרשת כדי לדמיין פרטים אולטרה-מבניים, כגון lobulation גרעיני, ארגון מרחבי של DMS וגרגרים במונחים של גודל, צורה והתפלגות. איור 2C הוא דוגמה לאזור perinuclear בשלב III megakaryocyte המציג את נוכחותם של גרגירים α, בור ים גולגי, מיטוכונדריה ורטיקולום אנדופלסמי. כמו כן ראוי לציין באיור 2C הוא גוף רב-לשוני, המייצג שלב ביניים בהיווצרות גרגירים אלפא וצפופים, המכילים כפולות אקסוזומים בקוטר של פחות מ-200 Åבקוטר 9,10. לבסוף, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור מאפשרת לדמיין נויטרופילים ותאים hematopoietic אחרים נוכחים בתוך megakaryocytes, (איור 2D) בעקבות תהליך נדיר שנקרא emperipolesis לפיו תא חודר תא חי אחר11. תהליך זה, אשר נוגע 4% של megakaryocytes במצב פיזיולוגי נורמלי, ניתן להגדיל באופן משמעותי בתנאים פתולוגיים מסוימים12.
איור 1: איור סכמטי של ההתקנה הניסיונית. (א)הליך הטמעת מח עצם. מח העצם הוא סמוק וקבוע על ידי טבילה מהירה פתרון glutaraldehyde. התמונה ממחישה את המראה הטיפוסי של גליל מח העצם לאחר שטיפה. לאחר קיבוע של שעה בטמפרטורת החדר, מח העצם מוקף באגרוז, לאחר קבוע ב osmium tetroxide ודגרה אצטט אורניל. לאחר מכן הרקמות נשטפות במאגר, מיובשות בסדרה של אתנול מדורג, דגירה בתחמוצת פרופילן ומסתננות עם שרף אפוקסי. (B)מח עצם חוסם חתך. מח העצם המוטמע מותקן על מחזיק אולטרה-מיקרודום, נחתך ב-45° וחתוך בחלקים דקים למחצה (500 ננומטר) או דקים (100 ננומטר). עבור מחקרים אולטרה-מבניים, החלקים הצפים נאספים בלולאה ומופקדים על רשתות עם מסנן נייר מתחת. (ג)כתמי ניגודיות לתצפיות TEM. רשתות הפוכות על טיפות אצטט אורניל, שטף על טיפות מים מזוקקים ודגורה על ציטראט עופרת לפני ריצה נוספת של כביסה. לאחר הייבוש (הצד העליון עם המקטעים), הדגימות מוכנות לבדיקה תחת TEM. (ד)היסתולוגיה של קטע מח עצם הירך של העכבר מוכתם בכחול טולואידין. התאים הענקיים מתאימים למגקריוציטים בוגרים (1), חלקם במגע עם סינוסואידים (2). הסינוסואידים מתכנסים על וריד סינוס מרכזי גדול (3). בר: 20 מיקרומטר. Inset: מראה נורמלי של megakaryocyte בוגר בהגדלה 40x. (E)תמונת TEM מייצגת של מקטע מח עצם בהגדלה נמוכה. התאים עמוסים היטב עם מעט שטח חוץ-תאי. כל ריבוע רשת של המקטע נצפה מגפיים לאחר על-ידי ביצוע הנתיב החץ הסכמטי (חצים אדומים). בר: 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נציג בתמונות במקום של מבנה אולטרה-מבני של מגה-קריוציטים. (A)שלבי התבגרות אופייניים של מגה-קריוציטים מסוג בר. Megakaryocytes מסווגים בארבעה שלבי התבגרות: שלב I, תא בקוטר 10-15 מיקרומטר עם גרעין גדול; שלב II, תא בקוטר 15-30 מיקרומטר המכיל את ה- DMS בפיתוח; שלב III, תא 30-50 מיקרומטר המכיל מערכת קרום תיחום מפותחת (DMS) המגדירה שטחים ציטופלסמיים ויש לה אזור היקפי ללא אברונים. פירנוציט מתאים לגרעין הפולילובולי העירום שנותר במח העצם לאחר הרחבה ציטופלסמית מלאה. ברים: 10 מיקרומטר (B) אינטראקציות תא מקרוציטים-אנדותל ותהליכים ציטופלסמיים תוך כלי דם. (i) האזור ההיקפי (PZ) של מגהקריוצייט מועלה מקרוב אל פני השטח האבלומינליים של אנדותל הסינוסואידלי. (ii) מגה-קרוציט היוצר בליטות פולשניות קצרות החודרות עמוק לשכבה האנדיותל (ראשי חץ). (iii-v) החצים מצביעים על תהליכים ציטופלסמיים של מגה-קיריוציטים בקוטרים שונים, שחלקם גדולים מאוד ויש להם אזור היקפי שעשוי לייצג שברים שזה עתה נכנסו למחזור הדם. (vi) טסיות דיסקואיד טיפוסיות (P) נצפו בלומן הסינוסים. בכל מיקרוגרף, הקו האדום מציין את הצד הזוהר של מחסום האנדהל והכוכב מציין את הלומן הסינוסואידי. ברים: 2 מיקרומטר. (C)הגדלות גבוהות יותר של האזור perinuclear של megakaryocyte בוגר. α, גרגר אלפא; rer, רטיקולום אנדופלסמי מחוספס; G, גולגי; MVB, גוף רב-לשוני; מ', מיטוכונדריה. בר: 0.5 מיקרומטר. (D) דוגמה למגקריוצית המציגה אפריפולזיס. הנויטרופיל הנבלע נראה ללא שינוי מורפולוגי על ידי האינטראקציה עם megakaryocytes. בר: 2 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
קובץ משלים: הכנת ריאגנטים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדיקה ישירה של megakaryocytes בסביבתם הטבעית חיונית כדי להבין megakaryopoiesis היווצרות טסיות דם. בכתב יד זה, אנו מספקים שיטת מיקרוסקופיה אלקטרונית שידור המשלבת שטיפה של מח עצם קיבעון על ידי טבילה, ומאפשר לנתח במקום את המאפיינים המורפולוגיים של כל התהליך של מורפוגנזה מגהקריוציט המתרחש במח העצם.
שטיפה של מח העצם היא צעד קריטי של שיטה זו, כמו ההצלחה של שטיפה באיכות גבוהה תלוי בפועל והכשרה של המפעיל. למרות עדין, שטיפה של מח העצם היא הדרך הטובה ביותר להימנע מהסרת העצם מינרלית, אשר בדרך כלל דורש טיפול EDTA 2 שבועות עבור הסתיידות מלאה הקשורים חפצים משמעותיים על מורפולוגיה megakaryocyte. בנוסף, יתרון מרכזי באיסוף מח עצם שלם ללא תיקון מעצם השוקה ועצם הירך הוא היכולת לשלב מספר גישות הדמיה לאותו עכבר. בפועל, רק מח עצם אחד נדרש למחקר אולטרה-מבני, שלוש הדגימות האחרות זמינות עבור ניתוחים משלימים. לאחר מכן ניתן להשתמש במח העצם השני להכנת מח עצם טרי, כדי לחקור בזמן אמת את הדינמיקה של היווצרות פרופלטלטים של מגהקריוציטים מקומיים6. המדגם השלישי מיועד בדרך כלל למחקרים חיסוניים על חלקים עבים, המספקים הדמיה תלת ממדית והפצה של מגהקריוציטים בתוך הסביבה הטבעית שלהם. הדגימה האחרונה יכולה להיות קפואה ומאוחסנת למחקרים נוספים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים אימונוגולד, שם לוקליזציה תת תאית של חלבונים נחקרת ברזולוציה גבוהה4. שיטות הדמיה משולבות אלה, יחד עם הזמינות של המחיקה/מוטציה הממוקדת של גנים בעכבר, מספקות אמצעי חשוב לתיווג במקום את התפקיד הביולוגי של חלבון נתון בטרומבוזיס. עם זאת, יש לציין כאן כי מגבלה אחת של שיטה זו היא הנסיגה של epiphyses הדרוש כדי לשטוף את מח העצם. אפיפיסות ידועות כתחומים חשובים עבור hematopoiesis, ולכן הסרתם מעכבת כל אפשרות של ניתוח תאי גזע hematopoietic ואת השלבים הראשונים של מעורבות13. מגבלה נוספת היא כי אבות של megakaryocytes לפני השלב הלא בוגר אני לא יכול להיות מזוהה כי תאים אלה אין תכונות אולטרה מובנות ספציפיות. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן להשתמש בגישה חיסונית EM.
השלב החשוב השני של השיטה הוא קיבוע מח העצם על ידי טבילה. כאשר מבוצע בתנאים המתוארים כאן, כלומר, קיבעון מיד לאחר שטיפה החוצה את גליל מח העצם הקומפקטי, יש לו את היתרונות הבאים: (i) זה מהיר וקל לביצוע, (ii) הוא שומר על מבנה אולטרה קרוב לזה שנצפו לאחר קיבעון על ידי זלוף6, ו (iii) הוא שומר על תהליכי megakaryocyte חינם טסיות דם במחזור הדם sinusoid אשר אחרת סמוק החוצה / איבד לאחר זלוף. עם טכניקה זו ניתן לחקור את כניסתם של megakaryocytes לתוך מחזור הסינוסואידים ולאפיין את כל צורות הביניים של תהליכים ציטופלסמיים שממנו טסיות דם להתעורר8. בהתאם לכך, לאחרונה דווח כי בליטות גדולות תוך פולשניות מ megakaryocytes ב vivo נבדלים מבחינה מבנית מן הרחבות דקות שנוצרו על ידי megakaryocytes במבחנה, עם סידור שונה של microtubules7. באופן דומה, לאחרונה הראינו כי המנגנון השולט היווצרות טסיות דם ב vivo שונה מזה שזוהה במבחנה14.
הבדלים אולטרה-מבניים חשובים מזוהים יותר ויותר בין מקרו-קריוציטים מקומיים בתרבית במבחנה לבין מגה-קריוציטים מקומיים שנוצרו על ידי vivo, המדגישים את הצורך במיקרו-סביבה של מח העצם לבידול/התבגרות מלאה של מגה-קריוציטים. בעקבות שילוב של שטיפה של מח עצם וקיבעון על ידי טבילה המתוארת במאמר זה, מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור קונבנציונלית עדיין נשאר כלי רב ערך לחקר ביולוגיה megakaryocyte ויצירת טסיות דם, בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לפביאן פרומר, ז'אן איב רינקל, דיוויד הופמן, מוניק פרוינד על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), האיחוד האירופי באמצעות הקרן האירופית לפיתוח אזורי (ERDF) ועל ידי גרנט ANR-17-CE14-0001-01 ל- H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
