Summary
Hier presenteren we een protocol om de ultrastructuur van de megakaryocyten in situ te analyseren met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Murine beenmerg wordt verzameld, gefixeerd, ingebed in epoxyhars en gesneden in ultradunne secties. Na contrastkleuring wordt het beenmerg waargenomen onder een TEM-microscoop bij 120 kV.
Abstract
Differentiatie en rijping van megakaryocyten vinden plaats in nauwe associatie met de cellulaire en extracellulaire componenten van het beenmerg. Deze processen worden gekenmerkt door het geleidelijk verschijnen van essentiële structuren in het cytoplasma van megakaryocyten, zoals een polyploïde en polylobulated kern, een intern membraannetwerk genaamd demarcation membrane system (DMS) en de dichte en alfakorrels die zullen worden gevonden in circulerende bloedplaatjes. In dit artikel beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor de in situ ultrastructurele studie van muriene megakaryocyten met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), waardoor de belangrijkste kenmerken kunnen worden geïdentificeerd die hun rijpingsfase en cellulaire dichtheid in het beenmerg bepalen. Beenmerg wordt gespoeld, gefixeerd, gedehydrateerd in ethanol, ingebed in plastic hars en gemonteerd voor het genereren van doorsneden. Halfdunne en dunne secties worden voorbereid op respectievelijk histologische en TEM-waarnemingen. Deze methode kan worden gebruikt voor elke beenmergcel, in elke EM-faciliteit en heeft het voordeel dat kleine steekproefgroottes worden gebruikt die de combinatie van verschillende beeldvormingsbenaderingen op dezelfde muis mogelijk maken.
Introduction
Megakaryocyten zijn gespecialiseerde grote polyploïde cellen, gelokaliseerd in het beenmerg, verantwoordelijk voor de productie van bloedplaatjes1. Ze zijn afkomstig van hematopoëtische stamcellen door middel van een ingewikkeld rijpingsproces, waarbij megakaryocytvoorlopers geleidelijk in omvang toenemen, terwijl ze uitgebreide gelijktijdige morfologische veranderingen in het cytoplasma en kernondergaan 2. Tijdens de rijping ontwikkelen megakaryocyten een aantal te onderscheiden structurele elementen, waaronder: een polylobulated nucleus, invaginaties van het oppervlaktemembraan die het demarcatiemembraansysteem (DMS) vormen, een perifere zone zonder organellen omringd door het op actine gebaseerde cytoskeletale netwerk, en talrijke organellen waaronder α-korrels, dichte korrels, lysosomen en meerdere Golgi-complexen. Op ultrastructureel niveau is een belangrijke waargenomen wijziging de cytoplasmatische compartimentering in discrete gebieden begrensd door het DMS3. Deze uitgebreide toevoer van membranen zal de uitbreiding van lange cytoplasmatische processen in de beginfase van de bloedplaatjesproductie voeden, die vervolgens in de circulatie zullen worden omgevormd tot bloedplaatjes. Elk defect tijdens megakaryocytendifferentiatie en rijping kan de bloedplaatjesproductie beïnvloeden in termen van het aantal bloedplaatjes en / of de bloedplaatjesfunctie.
Thin layer transmission electron microscopy (TEM) is al tientallen jaren de beeldvormingsbenadering bij uitstek en biedt hoogwaardige ultrastructuur van megakaryocyten die ons begrip van de fysiologie van trombopoiese hebben gevormd4,5. Dit artikel richt zich op een gestandaardiseerde TEM-methode die het mogelijk maakt om het proces van bloedplaatjesbiogenese vast te leggen dat in situ plaatsvindt in de inheemse beenmergmicro-omgeving, die ook als basis kan dienen om elk beenmergceltype te analyseren. We bieden ultrastructurele voorbeelden van de ontwikkeling van megakaryocyten van onvolwassen tot volledig volwassen, die cytoplasmatische processen uitbreiden naar de microcirculatie van sinusoïden6. We beschrijven ook een eenvoudige procedure om de verschillende rijpingsstadia van megakaryocyten te kwantificeren, waarbij we instructies geven over de regeneratie- en bloedplaatjesproductiecapaciteit van het beenmerg.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese normen 2010/63/EU en het CREMEAS Committee on the Ethics of Animal Experiments van de Universiteit van Straatsburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Het protocol is schematisch weergegeven in figuur 1.
1. Verzameling en fixatie van beenmerg ( Figuur 1A)
LET OP: Deze procedure omvat kankerverwekkende, mutagene en/of giftige stoffen en wordt uitgevoerd onder een chemische extractiekap. Draag geschikte beschermingsmiddelen zoals handschoenen en een beschermingsbril.
- Bereid de fixatieve oplossing bestaande uit 2,5% glutaaraldehyde in cacodylaatbuffer (zie aanvullend bestand).
- Beenmerg collectie
- Gebruik volwassen C57BL/6 muizen van beide geslachten van 12-18 weken oud. Euthanaseer de muizen door CO 2-verstikking en cervicale dislocatie.
- Knip met een dunne schaar de huid rond de dij en gebruik een pincet om de huid af te pellen. Verwijder het uiteinde van de poot en snijd vervolgens tussen de heup en de dij. Maak het scheenbeen los van het dijbeen door te snijden bij de knie articulatie en verwijder aanhangend weefsel op tibia's en dijbenen met behulp van een scalpel.
- Verwijder de epifysen met een scherp scheermesje. Gebruik tijdens het vasthouden van het dijbeen met een pincet een spuit van 5 ml gevuld met cacodylaatbuffer met een naald van 21 G om het beenmerg in een buis van 15 ml gevuld met 2 ml cacodylaatbuffer te spoelen. Om dit te doen, steekt u de schuine kant van de naald in de beenmergopening en drukt u langzaam op de zuiger totdat het merg is uitgestoten.
- Beenmergfixatie door snelle onderdompeling in fixatief.
- Gebruik onmiddellijk na het spoelen een plastic pipet om de beenmergcilinder gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur over te brengen in 1 ml verse glutaaraldehyde fixatieoplossing (eerder bereid in 1.1).
OPMERKING: Om het weefsel te behouden, moet u ervoor zorgen dat het hele proces, van botdissectie tot de fixatiestap, in minder dan 10 minuten is voltooid. Zorg er voor de fixatie voor dat de fixatieve oplossing op kamertemperatuur is om hitteschok te voorkomen.
- Gebruik onmiddellijk na het spoelen een plastic pipet om de beenmergcilinder gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur over te brengen in 1 ml verse glutaaraldehyde fixatieoplossing (eerder bereid in 1.1).
2. Inbedding van beenmerg in agarose
OPMERKING: Mergweefsel is niet voldoende samenhangend om de integriteit ervan te behouden tijdens de verschillende wasstappen en materiaal kan gemakkelijk verloren gaan. Om dit probleem te overwinnen, is het merg bedekt met een gel van agar vóór uitdroging.
- Bereid de agarose-oplossing zoals beschreven in het aanvullend bestand.
- Was het vaste merg uit sectie 1.3 in cacodylaatbuffer en breng het voorzichtig over op een glasplaat met behulp van een plastic pipet. Breng met een warme pipet snel een druppel van 2% vloeibare agar aan op de beenmergcilinder.
OPMERKING: De agar stolt snel tijdens het afkoelen. Om een homogene bedekking van het beenmerg te garanderen, moet de agar-oplossing warm worden gehouden totdat deze op de glijbaan wordt afgezet. - Plaats de glijbaan snel op ijs totdat de agar stolt (1-2 min).
- Gebruik onder een microscoop een scherp scheermesje om de ledematen van de beenmergcilinder te snijden en weg te gooien vanwege mogelijke weefselcompressie in deze gebieden. Breng de mergblokken over in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met 1 ml cacodylaatbuffer.
3. Beenmerg inbedden in hars
LET OP: Harscomponenten zijn giftig; sommige zijn kankerverwekkend en moeten met zorg worden behandeld onder een chemische extractiekap. Gebruik geschikte beschermingsmiddelen zoals handschoenen en een beschermende bril. Osmiumtetroxide is zeer vluchtig bij kamertemperatuur en de dampen zijn zeer schadelijk voor de ogen, neus en keel. Voordat het wordt weggegooid, moet 2% osmiumtetroxide worden geneutraliseerd door tweemaal het volume plantaardige olie toe te voegen.
- Bereid de epoxyhars voor zoals beschreven in het Aanvullend Dossier.
- Hars inbedding
OPMERKING: Bewaar de monsters in dezelfde microcentrifugebuizen tijdens incubaties in opeenvolgende baden van osmium, uranylacetaat en ethanol. Aspirateer de supernatanten met een Pasteur pipet. Het volume van de oplossing dat voor elk bad wordt gebruikt, moet ten minste 10x het volume van het monster zijn.- Fixeer de blokken na met 1% osmium in cacodylaatbuffer gedurende 1 uur bij 4 °C, was eenmaal in cacodylaatbuffer en daarna eenmaal in gedestilleerd water.
- Vlek met 4% uranylacetaat in gedestilleerd water gedurende 1 uur, tweemaal wassen in gedestilleerd water.
- Uitdrogen door een gesorteerde reeks ethanol in gedestilleerd water: 4 keer in 75% ethanol gedurende 5 minuten, gevolgd door 3 keer in 95% ethanol gedurende 20 minuten en vervolgens 3 keer in 100% ethanol gedurende 20 minuten. Haal bij deze stap een spuit epoxyhars uit de vriezer.
OPMERKING: Het protocol kan gedurende 1 uur worden gepauzeerd in 100% ethanol. - Om uniforme infiltratie en polymerisatie van epoxyhars in het merg te verkrijgen, incubeer eerst de blokken in 2 opeenvolgende baden van propyleenoxide gedurende 15 minuten.
- Voeg een 1:1 mengsel van 100% propyleenoxide en epoxyhars toe en incubeer gedurende 1 uur. Plaats de monsters op een langzame roterende shaker bij kamertemperatuur.
- Voeg 100% epoxyhars toe en verlaat het monster voor incubatie gedurende de nacht onder roeren.
- Voeg 100% epoxyhars toe voor 2 uur incubatie, nog steeds onder agitatie.
- Plaats onder een microscoop de mergblokken in platte siliconen mallen. Oriënteer monsters om daaropvolgende transversale sectie van het gehele beenmerg mogelijk te maken. Vul de mallen met epoxyhars en zet ze gedurende 48 uur op 60 °C.
OPMERKING: Alle oplossingen (behalve ethanol en propyleenoxide) worden gefilterd door een filter van 0,22 μm om verontreiniging van de monsters te voorkomen. Om een adequate polymerisatie van de hars te garanderen, vermijdt u bellen tijdens het vullen van de mallen.
4. Ultradunne doorsnede (Figuur 1B)
OPMERKING: Transmissie EM vereist dunne weefselsecties waardoor elektronen kunnen passeren en een projectiebeeld genereren van het inwendige van cellen, structuur en organisatie van binnenste organellen (korrels, endoplasmatisch reticulum, Golgi) en de opstelling van intracellulaire celmembranen.
- Monteer het monsterblok in een ultramicrotoomondersteuning. Leg het op de monsterhouder. Snijd de monsters op 45° om het teveel aan hars rond het weefsel te verwijderen met een roterende diamant- of wolfraamfrezensnijder.
- Monteer de monsters op de ultramicrotoom met een diamantmesblad uitgerust met een watertank. Snijd dwarsdoorsneden van respectievelijk 500 nm en 100 nm dikte voor histologische en TEM-analyses. Verzamel drijvende delen op het wateroppervlak met een lus.
- Deponeer het 500 nm dikke gedeelte op een glasplaat en 100 nm dikke delen op 200 mesh dunne staaf koperen roosters met een papieren filter eronder. Bereid vijf roosters voor op één voorwaarde: eerst twee roosters bevlekken en bewaar de drie resterende roosters indien nodig als back-up.
5. Toluidine blauwe kleuring voor histologie
OPMERKING: Kleuringssecties voor histologie zijn om drie redenen belangrijk: 1) om ervoor te zorgen dat het weefsel daadwerkelijk wordt gesneden en niet de hars, 2) om de kwaliteit van de opname te controleren en 3) om het mergmonster snel te evalueren. Als dit niet klopt, snijd dan dieper in het blok.
- Droog de halfdunne delen op een warmteplaat (60 °C).
- Voeg gefilterd 1% toluidineblauw/1% natriumboraat toe in gedestilleerd water op de glijbanen en verwarm op een hete plaat (60 °C) gedurende 1-2 min. Was de glaasjes met gedestilleerd water en laat drogen op de warmteplaat.
- Monteer secties op coverslips met een druppel Poly (butylmethacrylaat-co-methylmethacrylaat) montagemedium en onderzoek onder een lichtmicroscoop.
6. Kleuring van zware metalen voor TEM-observatie(figuur 1C)
OPMERKING: Voor het contrast is de bovenzijde van de rasters omgekeerd op 100 μL druppels van elk opeenvolgend bad met een lus. Vóór gebruik wordt elke oplossing 0,22 μm gefilterd. Verwijder het teveel aan vloeistof tussen elk bad door voorzichtig contact te maken met de roosterzijde op een filtreerpapier.
- Beits met 4% uranylacetaat in gedestilleerd water gedurende 5 min.
- Was 3 keer in gedestilleerd water gedurende 5 min.
- Beits met loodcitraat gedurende 3 min.
- Was 3 keer in gedestilleerd water gedurende 5 min.
- Deponeer de roosters aan de onderzijde in contact met het filtreerpapier om ze te laten drogen.
OPMERKING: Zware metalen reageren in de aanwezigheid van koolstofdioxide. Om de neerslag te minimaliseren, vermijd luchtverplaatsing tijdens het contrast, spreek niet, houd de omgeving kalm en schakel de airconditioning uit.
7. TEM (Figuur 1E)
OPMERKING: De secties worden in een TEM-microscoop geïntroduceerd en onderzocht bij 120 kV.
- Onderzoek eerst de secties bij lage vergroting (< 500x) om het algemene aspect van het preparaat te waarderen (afwezigheid van gat in de hars, plooien / compressie in de secties, neerslag als gevolg van kleuring).
- Onderzoek vervolgens de secties bij een hogere vergroting (~ 2000x waardoor het stadium van rijping kan worden onderscheiden). Tel handmatig de megakaryocyten van elke rijpingsfase over hele transversale secties (zie Representatieve resultaten over hoe elke fase visueel te identificeren).
OPMERKING: Elk vierkant van de rasters wordt gedefinieerd als een gebied voor onderzoek (dat gelijk is aan 16000 μm2 voor 200 mesh koperen roosters). - Om het aantal megakaryocyten te beoordelen, kwantificeert u alleen de vierkanten die volledig bedekt zijn met een sectie. Gebruik hiervoor een model op basis van de screening van bereiken. Observeer een eerste bereik van vierkanten van een uiteinde van de sectie naar een ander, dan een ander bereik op dezelfde manier, enz. Met behulp van deze procedure wordt het hele mergtransversale gedeelte vierkant voor vierkant volledig en systematisch gezeefd.
- Scoor voor elk vierkant het aantal fase I, II of III megakaryocyten.
OPMERKING: Hogere vergrotingen zijn nodig om de korrels, de DMS-organisatie, de grootte van cytoplasmatische gebieden en de polylobulaire kern te analyseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Beenmerg histologie
Observatie van de beenmerg toluïsblauwe histologie onder een lichtmicroscoop is de sleutel tot het snel analyseren van de algehele weefselarchitectuur in termen van bijvoorbeeld weefselcompactheid, continuïteit van microvessel en de grootte en vorm van megakaryocyten (figuur 1D). Het wordt uitgevoerd vóór ultradunne secties om de noodzaak van dieper snijden in het beenmergblok te bepalen. Vanwege hun gigantische grootte en nucleaire lobulatie kunnen de meer volwassen megakaryocyten gemakkelijk worden gevisualiseerd met een 40x-objectief. Dit geeft een uitstekend en snel overzicht van de dichtheid van volwassen megakaryocyten in het weefsel en hun relatieve lokalisatie ten opzichte van de microvessels. Anomalieën in megakaryocytenproliferatie en rijping konden al worden gedetecteerd in dergelijke semi-dunne secties.
Beenmerg ultrastructuur
Op basis van verschillende ultrastructurele kenmerken zijn muriene megakaryocyten verdeeld in 4 stadia die sequentiële stadia in hun rijping vertegenwoordigen (figuur 2A). Stadium I megakaryocyten hebben een diameter van 10-15 μm met een grote kern die het grootste deel van de cel in beslag neemt en overvloedige ribosomen en ruw endoplasmatisch reticulum bevat. De aanwezigheid van het vroegst detecteerbare stadium van het DMS, pre-DMS genaamd, is ook een belangrijk criterium voor het onderscheiden van fase I-MKs in TEM-analyse3. In het stadium II van rijping begint de korrelvorming en wordt de ontwikkeling van het DMS geïnitieerd. Megakaryocyten nemen in omvang toe, meten 15-25 μm in diameter en ontwikkelen nucleaire lobulatie. Volwassen stadium III megakaryocyten zijn gigantische cellen met een diameter van 25-50 μm. Hun cytoplasma bevat een goed ontwikkeld DMS met duidelijk gedefinieerde cytoplasmatische territoria en een perifere zone zonder organellen. In dit stadium bevindt de kern zich over het algemeen excentrisch en lijkt zeer onregelmatig met gecondenseerd chromatine op het kernmembraan. De laatste stap wordt gekenmerkt door een naakte kern, ook wel pyrenocyt genoemd, bestaande uit een grote kern omgeven door een plasmamembraan nadat het grootste deel van het cytoplasma is geëlimineerd. Bij wilde type C57BL/6 muizen bestaat het beenmerg uit ongeveer 8% stadium I, 20% stadium II, 71% stadium III megakaryocyten en < 1% pyrenocyten. Het gemiddelde aantal megakaryocyten ligt tussen de 1,7 en 2,2 cellen per vierkant. Deze willekeurige classificatie maakt het mogelijk om gemakkelijk een continu proces van celdifferentiatie te volgen en de mogelijke anomalieën ervan te detecteren.
Naast deze klassieke stadia van rijping, maakt observatie van vaste megakaryocyten in het beenmerg het mogelijk om de reeks gebeurtenissen te analyseren die optreden als megakaryocyten interageren met de sinusoïdale wand (Figuur 2B). Megakaryocyten in contact met de endotheelcellen worden vaak waargenomen in dunne secties. Soms ziet men megakaryocyten die korte invasieve uitsteeksels vormen die het endotheel binnendringen of een grote projectie van het cytoplasma in het sinusvormige lumen7,8uitstrekken . Opmerkelijk is dat deze intravasculaire cytoplasmatische processen variabele maten, lengtes en diameters vertonen, wat de progressieve remodellering van bloedplaatjes in de bloedsomloop illustreert. Bloedplaatjes die al in de algemene circulatie aanwezig zijn, met een discoïde vorm die wordt gehandhaafd door omtrekkende microtubulispoelen, zijn ook zichtbaar in het lumen van de sinusoïden. Deze typische morfologie van de bloedplaatjes is indicatief voor de juiste fixatie van het monster.
Transmissie-elektronenmicroscopie heeft het resolutieniveau dat nodig is om ultrastructurele details te visualiseren, zoals nucleaire lobulatie, ruimtelijke organisatie van het DMS en korrels in termen van grootte, vorm en verdeling. Figuur 2C is een voorbeeld van het perinucleaire gebied in een stadium III megakaryocyt die de aanwezigheid van α korrels, Golgi-cisternae, mitochondriën en endoplasmatisch reticulum laat zien. Ook opmerkelijk in figuur 2C is een multivesiculaire lichaam, dat een tussenstadium vertegenwoordigt in de vorming van alfa- en dichte korrels, met veelvouden exosomen met een diameter van minder dan 200Å 9,10. Ten slotte maakt transmissie-elektronenmicroscopie het mogelijk om neutrofielen en andere hematopoëtische cellen die aanwezig zijn in de megakaryocyten te visualiseren , (Figuur 2D) na een ongewoon proces dat emperipolese wordt genoemd, waarbij een cel een andere levende cel binnendringt11. Dit proces, dat betrekking heeft op 4% megakaryocyten in normale fysiologische toestand, kan aanzienlijk worden verhoogd in bepaalde pathologische omstandigheden12.
Figuur 1: Schematische illustratie van de experimentele opstelling. (A) Procedure voor het inbedden van beenmerg. Het beenmerg wordt gespoeld en gefixeerd door snelle onderdompeling in glutaaraldehyde-oplossing. De foto illustreert het typische uiterlijk van de beenmergcilinder na het spoelen. Na 1 uur fixatie bij kamertemperatuur wordt het merg omgeven door agarose, nagefixeerd in osmiumtetroxide en geïncubeerd in uranylacetaat. De weefsels worden vervolgens gespoeld in buffer, gedehydrateerd in een reeks gesorteerde ethanol, geïncubeerd in propyleenoxide en geïnfiltreerd met epoxyhars. (B) Beenmergblokken doorsnede. Het ingebedde beenmerg is gemonteerd op een ultramicrotome houder, getrimd op 45° en gesneden in semi-dunne (500 nm) of dunne (100 nm) secties. Voor ultrastructurele studies worden de drijvende delen opgepikt met een lus en op roosters afgezet met een papieren filter eronder. (C) Contrastkleuring voor TEM-waarnemingen. Roosters worden omgekeerd op uranylacetaatdruppels, gewassen op gedestilleerde waterdruppels en geïncubeerd op loodcitraat voor een nieuwe wasbeurt. Na het drogen (bovenzijde met de secties) zijn de monsters klaar om onder de TEM te worden onderzocht. (D) Histologie van een femorale mergsectie van muizen gekleurd met toluidineblauw. De reuzencellen komen overeen met volwassen megakaryocyten (1), waarvan sommige in contact komen met sinusoïden (2). De sinusoïden komen samen op een grote centrale sinusader (3). Bar: 20 μm. Inzet: Normaal uiterlijk van een volwassen megakaryocyt bij 40x vergroting. (E) Representatief TEM-beeld van een beenmergsectie bij lage vergroting. Cellen zijn dicht opeengepakt met weinig extracellulaire ruimte. Elk rastervierkant van de sectie wordt van een uiteinde naar een ander waargenomen door het schematische pijlpad (rode pijlen) te volgen. Bar: 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve in situ beelden van megakaryocyten ultrastructuur. (A) Karakteristieke rijpingsstadia van wild-type megakaryocyten. Megakaryocyten worden ingedeeld in vier rijpingsstadia: stadium I, een cel met een diameter van 10-15 μm met een grote kern; fase II, een cel met een diameter van 15-30 μm die het DMS in ontwikkeling bevat; stadium III, een cel van 30-50 μm met een goed ontwikkeld demarcatiemembraansysteem (DMS) dat cytoplasmatische gebieden definieert en een organelvrije perifere zone heeft. Een pyrenocyt komt overeen met de naakte polylobulated kern die in het beenmerg achterblijft na volledige cytoplasmatische uitbreiding. Repen: 10 μm (B) Megakaryocyt-endotheelcelinteracties en intravasculaire cytoplasmatische processen. i) De perifere zone (PZ) van een megakaryocyt ligt dicht bij het abluminale oppervlak van het sinusoïdaal endotheel. (ii) Een megakaryocyt die korte invasieve uitsteeksels vormt die diep in de endotheellaag (pijlpunten) doordringen. iii-v) De pijlen geven cytoplasmatische processen van megakaryocyten met verschillende diameters aan, waarvan sommige erg groot zijn en een perifere zone hebben die fragmenten kan vertegenwoordigen die net in de bloedbaan zijn gekomen. (vi) Een typisch discoïde bloedplaatje (P) waargenomen in het sinuslumen. In elke micrograaf geeft de rode lijn de luminale kant van de endotheelbarrière aan en de ster geeft het sinusvormige lumen aan. Staven: 2 μm. (C) Hogere vergrotingen van het perinucleaire gebied van een volwassen megakaryocyt. α, alfakorrel; rer, ruw endoplasmatisch reticulum; G, golgi; MVB, multivesiculaire lichaam; m, mitochondriën. Bar: 0,5 μm. (D) Voorbeeld van een megakaryocyt die emperipolese vertoont. De verzwolgen neutrofiel lijkt morfologisch ongewijzigd door de interactie met megakaryocyten. Bar: 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier: Voorbereiding van de reagentia. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Direct onderzoek van megakaryocyten in hun oorspronkelijke omgeving is essentieel om megakaryopoiese en bloedplaatjesvorming te begrijpen. In dit manuscript bieden we een transmissie-elektronenmicroscopiemethode die beenmergspoeling en fixatie door onderdompeling combineert, waardoor in situ de morfologische kenmerken van het hele proces van megakaryocytenmorfogenese in het beenmerg kunnen worden ontleed.
Het spoelen van het beenmerg is een cruciale stap van deze methode, omdat het succes van een hoogwaardige spoeling afhangt van de praktijk en training van de operator. Hoewel delicaat, is het spoelen van het beenmerg de beste manier om verwijdering van het gemineraliseerde bot te voorkomen, wat meestal een EDTA-behandeling van 2 weken vereist voor volledige ontkalking geassocieerd met significante artefacten op de megakaryocytenmorfologie. Bovendien is een groot voordeel van het verzamelen van hele niet-gefixeerde beenmerg van scheenbeen en dijbenen de mogelijkheid om verschillende beeldvormingsbenaderingen voor dezelfde muis te combineren. In de praktijk is slechts één beenmerg nodig voor het ultrastructurele onderzoek, terwijl de andere drie monsters beschikbaar zijn voor aanvullende analyses. Het tweede beenmerg kan vervolgens worden gebruikt voor de bereiding van verse beenmergexplantaten, om in realtime de dynamiek van proplateletvorming van inheemse megakaryocyten te bestuderen6. Het derde monster is meestal ontworpen voor immunostainingstudies op dikke secties, die 3D-beeldvorming en distributie van megakaryocyten in hun natuurlijke omgeving bieden. Het laatste monster kan worden ingevroren en opgeslagen voor verdere studies door immunogold elektronenmicroscopie, waarbij de subcellulaire lokalisatie van eiwitten wordt onderzocht bij hoge resolutie4. Deze gecombineerde beeldvormingsmethoden, samen met de beschikbaarheid van de gerichte deletie/mutatie van genen in een muis, bieden een belangrijk middel om in situ de biologische rol van een bepaald eiwit in trombopoiese af te bakenen. Hier moet echter worden opgemerkt dat een beperking van deze methode de terugtrekking van de epifysen is die nodig zijn om het merg te spoelen. Van epifysen is bekend dat ze belangrijke gebieden zijn voor hematopoëse en hun verwijdering belemmert daarom elke mogelijkheid om hematopoëtische stamcellen en de eerste fasen van betrokkenheid te analyseren13. Een andere beperking is dat voorlopers van megakaryocyten vóór het onrijpe stadium I niet kunnen worden geïdentificeerd omdat deze cellen geen specifieke ultrastructurele kenmerken hebben. Om deze beperking te overwinnen, zou een EM immunogold-benadering kunnen worden gebruikt.
De tweede belangrijke stap van de methode is de beenmergfixatie door onderdompeling. Wanneer het wordt uitgevoerd onder de hier beschreven omstandigheden, d.w.z. fixatie onmiddellijk na het uitspoelen van de compacte beenmergcilinder, heeft het de volgende voordelen: (i) het is snel en gemakkelijk uit te voeren, (ii) het behoudt een ultrastructuur die dicht bij die waargenomen na fixatie door perfusie6ligt, en (iii) het handhaaft vrije megakaryocytenprocessen en bloedplaatjes in de sinusoïde bloedbaan die anders worden weggespoeld / verloren na perfusie. Met deze techniek is het mogelijk om de binnenkomst van megakaryocyten in de sinusoïdale circulatie te onderzoeken en alle tussenvormen van cytoplasmatische processen waaruit bloedplaatjes ontstaan te karakteriseren8. In lijn hiermee is onlangs gemeld dat de grote uitsteeksels die intravaseren van megakaryocyten in vivo structureel verschillen van de dunne uitbreidingen gevormd door megakaryocyten in vitro, met met name een andere opstelling van de microtubuli7. Evenzo hebben we onlangs aangetoond dat het mechanisme voor de vorming van bloedplaatjes in vivo verschilt van het mechanisme dat in vitrois geïdentificeerd14.
Belangrijke ultrastructurele verschillen worden steeds meer erkend tussen in vitro gekweekte en in vivo gegenereerde inheemse megakaryocyten, wat de noodzaak onderstreept van de beenmergmicro-omgeving voor een volledige megakaryocytendifferentiatie / rijping. Na de combinatie van beenmergspoeling en fixatie door onderdompeling die in dit artikel wordt beschreven, blijft conventionele transmissie-elektronenmicroscopie nog steeds een waardevol hulpmiddel om megakaryocytenbiologie en bloedplaatjesvorming te bestuderen, onder fysiologische en pathologische omstandigheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs willen Fabienne Proamer, Jean-Yves Rinckel, David Hoffmann, Monique Freund bedanken voor de technische assistentie. Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), de Europese Unie via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO) en door Subsidie ANR-17-CE14-0001-01 aan H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
