Summary
Здесь мы представляем протокол анализа ультраструктуры мегакариоцитов in situ с помощью просвечивающих электронных микроскопий (ТЭМ). Мышиные косточки собирают, фиксируют, встраивают в эпоксидную смолу и разрезают на ультратонкие срезы. После контрастного окрашивания костный мозг наблюдается под микроскопом ТЭМ на 120 кВ.
Abstract
Дифференцировка и созревание мегакариоцитов происходят в тесной связи с клеточными и внеклеточными компонентами костного мозга. Эти процессы характеризуются постепенным появлением в цитоплазме мегакариоцитов существенных структур, таких как полиплоидное и полигобулированное ядро, внутренняя мембранная сеть, называемая демаркационной мембранной системой (DMS), и плотные и альфа-гранулы, которые будут найдены в циркулирующих тромбоцитах. В этой статье мы описываем стандартизированный протокол ультраструктурного исследования in situ мышиных мегакариоцитов с использованием просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ), позволяющий идентифицировать ключевые характеристики, определяющие стадию их созревания и клеточную плотность в костном мозге. Костный мозг промывывается, фиксируется, обезвоживается в этаноле, внедряется в пластиковую смолу и монтируется для создания поперечных сечений. Полутонкие и тонкие срезы подготовлены для гистологических и ТЕА наблюдений соответственно. Этот метод может быть использован для любой клетки костного мозга, в любом электромагнитном объекте и имеет преимущество использования небольших размеров выборки, позволяющих комбинировать несколько подходов к визуализации на одной мыши.
Introduction
Мегакариоциты представляют собой специализированные крупные полиплоидные клетки, локализованные в костном мозге, отвечающие за выработку тромбоцитов1. Они происходят из гемопоэтических стволовых клеток посредством сложного процесса созревания, в ходе которого предшественники мегакариоцитов постепенно увеличиваются в размерах, подвергаясь обширным сопутствующим морфологическим изменениям в цитоплазме и ядре2. Во время созревания мегакариоциты развивают ряд различимых структурных элементов, в том числе: полигобулированное ядро, инвагинации поверхностной мембраны, которые образуют демаркационную мембранную систему (DMS), периферическую зону, лишенную органелл, окруженных цитоскелетной сетью на основе актина, и многочисленные органеллы, включая α-гранулы, плотные гранулы, лизосомы и множественные комплексы Гольджи. На ультраструктурном уровне основной наблюдаемой модификацией является цитоплазматическое разделение на дискретные области, разграниченные DMS3. Этот обширный запас мембран будет способствовать расширению длительных цитоплазматических процессов на начальной фазе производства тромбоцитов, которые затем будут ремоконструированы в тромбоциты внутри циркуляции. Любой дефект во время дифференцировки и созревания мегакариоцитов может влиять на выработку тромбоцитов с точки зрения количества тромбоцитов и/или функции тромбоцитов.
Тонкослойная просвечивающая электронная микроскопия (ТЭМ) была подходом к визуализации на протяжении десятилетий, обеспечивая высококачественную ультраструктуру мегакариоцитов, которые сформировали наше понимание физиологии тромбопоизиса4,5. В данной статье основное внимание уделяется стандартизированной методике ТЭМ, позволяющей охватить процесс биогенеза тромбоцитов, происходящий in situ в микросреде нативного костного мозга, который также может служить основой для анализа любого типа клеток костного мозга. Приведены ультраструктурные примеры развития мегакариоцитов от незрелых до полностью зрелых, которые расширяют цитоплазматические процессы в микроциркуляцию синусоид6. Мы также описываем простую процедуру количественной оценки различных стадий созревания мегакариоцитов, инструктируя о регенерации и производительности тромбоцитов костного мозга.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg). Протокол схематически показан на рисунке 1.
1. Сбор и фиксация костного мозга (рисунок 1А)
ВНИМАНИЕ: Эта процедура включает канцерогенные, мутагенные и/или токсичные вещества и выполняется под вытяжкой химической экстракции. Носите соответствующее защитное снаряжение, такое как перчатки и защитные очки.
- Готовят фиксаторный раствор, состоящий из 2,5% глутаральдегида в какодилатном буфере (см. Дополнительный файл).
- Сбор костного мозга
- Используйте взрослых мышей C57BL/6 любого пола в возрасте 12-18 недель. Усыпить мышей путем удушьяCO2 и вывиха шейки матки.
- С помощью тонких ножниц отрежьте кожу вокруг бедра и используйте пинцет, чтобы очистить кожу. Удалите конечность лапы, а затем разрезайте между бедром и бедром. Отсоединять большеберцовую кость от бедренной кости путем разрезания коленного сустава и удалить адгезивную ткань на большеберцовой и бедренной голенях с помощью скальпеля.
- Удалите эпифизы острым лезвием бритвы. Удерживая бедренную кость пинцетом, используйте шприц 5 мл, заполненный какодилатным буфером с иглой 21 г, чтобы промыть костный мозг в трубку 15 мл, заполненную буфером какодилата 2 мл. Для этого вставьте скос иглы в отверстие костного мозга и медленно нажимайте на поршень до тех пор, пока костный мозг не будет изгнан.
- Фиксация костного мозга путем быстрого погружения в фиксатор.
- Сразу после промывки используйте пластиковую пипетку для переноса цилиндра костного мозга в 1 мл свежего фиксаторного раствора глутаральдегида (предварительно приготовленного в 1,1) в течение 60 мин при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить ткань, убедитесь, что весь процесс, от рассечения кости до этапа фиксации, завершен менее чем за 10 минут. Для фиксации убедитесь, что фиксатор находится при комнатной температуре, чтобы избежать теплового удара.
- Сразу после промывки используйте пластиковую пипетку для переноса цилиндра костного мозга в 1 мл свежего фиксаторного раствора глутаральдегида (предварительно приготовленного в 1,1) в течение 60 мин при комнатной температуре.
2. Встраивание костного мозга в агарозу
ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань костного мозга недостаточно сплочена, чтобы сохранить ее целостность во время различных этапов промывки, и материал может быть легко потерян. Чтобы преодолеть эту проблему, костный мозг перед обезвоживанием покрывают гелем агара.
- Подготовьте раствор агарозы, как описано в дополнительном файле.
- Вымойте неподвижный костный мозг из секции 1.3 в какодилатном буфере и аккуратно переложите его на стеклянную горку с помощью пластиковой пипетки. Используя теплую пипетку, быстро нанесите каплю 2% жидкого агара на цилиндр костного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Агар быстро затвердеет при охлаждении. Чтобы обеспечить однородное покрытие костного мозга, раствор агара необходимо держать в тепле до тех пор, пока он не будет нанесен на горку. - Быстро поместите горку на лед до затверденья (1-2 мин).
- Под микроскопом используйте острое лезвие бритвы, чтобы разрезать и отбросить конечности цилиндра костного мозга из-за возможного сжатия ткани в этих областях. Переложить блоки костного мозга в микроцентрифужные трубки по 1,5 мл, содержащие 1 мл какодилатного буфера.
3. Встраивание костного мозга в смолу
ВНИМАНИЕ: Компоненты смолы токсичны; некоторые из них являются канцерогенными и должны обрабатываться с осторожностью под вытяжкой химической экстракции. Используйте соответствующие защитные средства, такие как перчатки и защитные очки. Тетроксид осмия очень летучий при комнатной температуре, и его пары очень вредны для глаз, носа и горла. Перед выбросом 2% тетроксида осмия необходимо нейтрализовать, добавив в два раза объем растительного масла.
- Подготовьте эпоксидную смолу, как описано в дополнительном файле.
- Встраивание смолы
ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы в одних и тех же микроцентрифужных трубках во время инкубации в последовательных ваннах с осмием, уранилацетатом и этанолом. Аспирировать супернатанты пипеткой Пастера. Объем раствора, используемого для каждой ванны, должен быть не менее чем в 10 раз больше объема образца.- Постфиксируют блоки с 1% осмия в какодилатном буфере в течение 1 ч при 4 °C, промыть один раз в какодилатном буфере, а затем один раз в дистиллированной воде.
- Окрашивание 4% уранилацетатом в дистиллированной воде в течение 1 ч, дважды промыть в дистиллированной воде.
- Обезвоживание через градуированный ряд этанола в дистиллированной воде: 4 раза в 75% этаноле в течение 5 мин, затем 3 раза в 95% этаноле в течение 20 мин и затем 3 раза в 100% этаноле в течение 20 мин. На этом этапе выньте из морозильной камеры один шприц эпоксидной смолы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен в 100% этаноле в течение 1 ч. - Для получения равномерной инфильтрации и полимеризации эпоксидной смолы внутри костного мозга инкубируют сначала блоки в 2 последовательных ваннах оксида пропилена в течение 15 мин.
- Добавьте смесь 1:1 из 100% оксида пропилена и эпоксидной смолы и инкубируют в течение 1 ч. Поместите образцы на медленный вращающийся шейкер при комнатной температуре.
- Добавьте 100% эпоксидную смолу, оставьте образец для ночной инкубации под перемешиванием.
- Добавьте 100% эпоксидную смолу в течение 2 ч инкубации, еще при перемешивании.
- Под микроскопом поместите блоки костного мозга в плоские силиконовые формы. Ориентируйте образцы, чтобы обеспечить последующее поперечным сечением всего костного мозга. Заполните формы эпоксидной смолой и поместите их при 60 °C в течение 48 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все растворы (за исключением этанола и оксида пропилена) фильтруются через фильтр 0,22 мкм во избежание загрязнения образцов. Чтобы обеспечить адекватную полимеризацию смолы, избегайте пузырьков при заполнении форм.
4. Ультратонкое сечение(рисунок 1B)
ПРИМЕЧАНИЕ: Передача ЭМ требует тонких тканевых участков, через которые электроны могут проходить, генерируя проекционное изображение внутренней части клеток, структуры и организации внутренних органелл (гранул, эндоплазматический ретикулум, Гольджи) и расположения внутриклеточных клеточных мембран.
- Установите блок образцов в ультрамикротомную опору. Положите его на держатель образца. Обрежьте образцы под 45°, чтобы удалить избыток смолы вокруг ткани с помощью вращающегося алмазного или вольфрамового фреза.
- Установите образцы на ультрамикротом с помощью лезвия алмазного ножа, оснащенного резервуаром для воды. Разрезайте поперечные срезы толщиной 500 нм и 100 нм для гистологического и ТЕА-анализа соответственно. Соберите плавающие секции на поверхности воды с помощью петли.
- Нанесите участок толщиной 500 нм на стеклянную горку и секции толщиной 100 нм на 200-сетчатые тонкополосные медные сетки с бумажным фильтром под ним. Подготовьте пять сеток для одного условия: сначала окрасьте две сетки и сохраните три оставшиеся сетки в качестве резервной копии, если это необходимо.
5. Окрашивание толуидином синего цвета для гистологии
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание срезов для гистологии важно по трем причинам: 1) чтобы убедиться, что ткань действительно разрезана, а не смола, 2) чтобы проверить качество включения и 3) быстро оценить образец костного мозга. Если это не так, срежьте глубже в блоке.
- Высушите полутонкие секции скользить на тепловой пластине (60 °C).
- Добавить фильтрованный 1% толуидин синего/1% бората натрия в дистиллированную воду на горках и нагревать на конфорке (60 °C) в течение 1-2 мин. Вымойте горки дистиллированной водой и дайте высохнуть на нагревательной пластине.
- Монтировать секции на крышки с каплей поли(бутилметакрилата-со-метилметакрилата) монтажной среды и исследовать под световым микроскопом.
6. Окрашивание тяжелых металлов для наблюдения ТЕА(рисунок 1С)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для контраста верхняя сторона сеток перевернута на 100 мкл капель каждой последующей ванны с петлей. Перед использованием каждый раствор фильтруется на 0,22 мкм. Удалите избыток жидкости между каждой ванной, осторожно контактив со стороны сетки на фильтровальной бумаге.
- Окрашивание 4% уранилацетатом в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Промыть 3 раза в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Окрашивание свинцом цитрата в течение 3 мин.
- Промыть 3 раза в дистиллированной воде в течение 5 мин.
- Нанесите сетки на нижнюю сторону в контакт с фильтровальной бумагой, чтобы они высохли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция реакции тяжелых металлов в присутствии углекислого газа. Чтобы свести к минимуму осадки, избегайте смещения воздуха во время контраста, не говорите, сохраняйте спокойствие окружающей среды и выключите кондиционер.
7. ТЕА(рисунок 1Е)
ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы вводятся в микроскоп ТЕА и исследуются при 120 кВ.
- Сначала осмотрите срезы при малом увеличении (< 500х), чтобы оценить общий аспект подготовки (отсутствие отверстия в смоле, складки/сжатие в срезах, осадки из-за окрашивания).
- Затем осмотрите участки при большем увеличении (~ 2000х, что позволяет различить стадию созревания). Подсчитывайте вручную мегакариоциты с каждой стадии созревания по целым поперечным слочкам (см. Репрезентативные результаты о том, как визуально идентифицировать каждую стадию).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый квадрат сетки определяется как площадь для исследования (которая равна 16000 мкм2 для 200-сетчатых медных сеток). - Чтобы оценить количество мегакариоцитов, количественно оценивайте только квадраты, которые полностью покрыты сечением. Для этого используйте модель, основанную на скрининге диапазонов. Наблюдайте первый диапазон квадратов от оконечности сечения к другому, затем другой диапазон таким же образом и т.д. Используя эту процедуру, полностью и систематически просеивайте весь поперечный участок костного мозга квадрат за квадратом.
- Для каждого квадрата начисляйте количество мегакариоцитов I, II или III стадии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие увеличения необходимы для анализа гранул, организации DMS, размера цитоплазматических территорий и полилобулированного ядра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Гистология костного мозга
Наблюдение за гистологией толуидинового синего цвета костного мозга под световым микроскопом является ключом к быстрому анализу общей архитектуры ткани с точки зрения, например, компактности тканей, непрерывности микрососудов, а также размера и формы мегакариоцитов (рисунок 1D). Его выполняют перед ультратонкими срезами, чтобы определить необходимость разрезать глубже в блоке костного мозга. Из-за их гигантских размеров и ядерной дольки более зрелые мегакариоциты могут быть легко визуализированы с целью 40x. Это дает отличный и быстрый обзор плотности зрелых мегакариоцитов в ткани и их относительной локализации на микрососудах. Аномалии пролиферации и созревания мегакариоцитов уже могли быть обнаружены в таких полутонких срезах.
Ультраструктура костного мозга
На основании различных ультраструктурных характеристик мышиные мегакариоциты делятся на 4 стадии, представляющие последовательные стадии в их созревании (рисунок 2А). Мегакариоциты I стадии имеют диаметр 10-15 мкм с большим ядром, занимающим большую часть клетки и содержащим обильные рибосомы и грубый эндоплазматический ритикулум. Наличие самой ранней обнаруживаемой стадии DMS, называемой pre-DMS, также является ключевым критерием для различения MK стадии I в анализе TEM3. На II стадии созревания начинается гранулообразование и инициируется развитие ДМС. Мегакариоциты увеличиваются в размерах, измеряя 15-25 мкм в диаметре и развивают ядерную долькуляцию. Зрелые мегакариоциты III стадии представляют собой гигантские клетки диаметром 25-50 мкм. Их цитоплазма содержит хорошо развитую ДМС с четко очерченными цитоплазмическими территориями и периферической зоной, лишенной органелл. На этой стадии ядро обычно расположено эксцентрично и выглядит очень нерегулярным с конденсированным хроматином, расположенным на ядерной мембране. Последняя ступень характеризуется голым ядром, также называемым пиреноцитом, состоящим из большого ядра, окруженного плазматической мембраной после того, как основная часть цитоплазмы была устранена. У диких мышей типа C57BL/6 костный мозг содержит около 8% стадии I, 20% стадии II, 71% мегакариоцитов III стадии и < 1% пиреоцитов. Среднее количество мегакариоцитов составляет от 1,7 до 2,2 клеток на квадрат. Такая произвольная классификация позволяет удобно контролировать непрерывный процесс дифференцировки клеток и выявлять ее возможные аномалии.
Помимо этих классических стадий созревания, наблюдение за фиксированными мегакариоцитами в костном мозге позволяет проанализировать ряд событий, происходящих по мере взаимодействия мегакариоцитов с синусоидальной стенкой (рисунок 2В). Мегакариоциты при контакте с эндотелиальными клетками часто наблюдаются в тонких срезах. Иногда наблюдаются мегакариоциты, образующие короткие инвазивные выступы, проникающие в эндотелий или расширяющие большую проекцию его цитоплазмы в синусоидальный просвет7,8. Примечательно, что эти внутрисосудистые цитоплазматические процессы демонстрируют различные размеры, длину и диаметры, иллюстрируя прогрессирующее ремоделирование тромбоцитов в циркуляции. Тромбоциты, уже присутствующие в общем кровообращении, имеющие дискоидную форму, поддерживаемую кольцевыми катушками микротрубочек, также видны в просвете синусоид. Эта типичная морфология тромбоцитов свидетельствует о правильной фиксации образца.
Просвечивающая электронная микроскопия имеет уровень разрешения, необходимый для визуализации ультраструктурных деталей, таких как ядерная долька, пространственная организация DMS и гранул с точки зрения размера, формы и распределения. Рисунок 2C является примером перинуклеарной области в мегакариоците III стадии, показывающей наличие α гранул, цистерн Гольджи, митохондрий и эндоплазматического решетчатого. Также примечательным на фиг.2С является мультивезикулярное тело, представляющее собой промежуточную стадию в образовании альфа- и плотных гранул, содержащих кратные экзосомы размером менее 200 Å диаметром9,10. Наконец, просвечивающая электронная микроскопия позволяет визуализировать нейтрофилы и другие кроветворные клетки, присутствующие внутри мегакариоцитов (рисунок 2D), после необычного процесса, называемого эмпериполезом, посредством которого клетка проникает в другую живую клетку11. Этот процесс, который касается 4% мегакариоцитов в нормальном физиологическом состоянии, может быть значительно усилен при определенных патологических состояниях12.
Рисунок 1:Схематическая иллюстрация экспериментальной установки. (A) Процедура встраивания костного мозга. Костный мозг промывают и фиксируют быстрым погружением в раствор глутаральдегида. Фотография иллюстрирует типичный внешний вид цилиндра костного мозга после промывки. После фиксации через 1 ч при комнатной температуре костный мозг окружают агарозой, постфиксируют в тетроксиде осмия и инкубируют в уранилацетате. Затем ткани промывают в буфере, обезвоживают в серии градуированного этанола, инкубируют в оксиде пропилена и инфильтрируют эпоксидной смолой. (B) Костного мозга блокирует сечение. Встроенный костный мозг монтируется на держателе ультрамикротома, обрезается под 45° и разрезается либо полутонкими (500 нм), либо тонкими (100 нм) участками. Для ультраструктурных исследований плавающие секции подбираются петлей и наносятся на сетки с бумажным фильтром под ними. (С)Контрастное окрашивание для наблюдений ТЕА. Сетки инвертируют на каплях уранилацетата, промывают на каплях дистиллированной воды и инкубируют на цитрате свинца перед очередной серией промывок. После сушки (верхняя сторона с секциями) образцы готовы к исследованию в рамках ТЕА. (D) Гистология участка бедренного мозга мыши, окрашенного толуидиновым синим цветом. Гигантские клетки соответствуют зрелым мегакариоцитам (1), некоторые из которых находятся в контакте с синусоидами (2). Синусоиды сходятся на большой центральной синусовой вене (3). Бар: 20 мкм. Вставка: Нормальный внешний вид зрелого мегакариоцита при 40-кратном увеличении. (E)Репрезентативное изображение ТЕА участка костного мозга при низком увеличении. Клетки плотно упакованы с небольшим внеклеточным пространством. Каждый квадрат сетки участка наблюдается от конечности к другой, следуя схематическому контуру со стрелками (красные стрелки). Бар: 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Репрезентативные in situ изображения ультраструктуры мегакариоцитов. (А) Характерные стадии созревания мегакариоцитов дикого типа. Мегакариоциты классифицируются на четыре стадии созревания: стадия I, клетка диаметром 10-15 мкм с большим ядром; II стадия, клетка диаметром 15-30 мкм, содержащая развиваемую ДМС; III стадия, клетка 30-50 мкм, содержащая хорошо развитую демаркационную мембранную систему (ДМС), определяющую цитоплазматические территории и имеющую свободную от органелл периферическую зону. Пиреноцит соответствует голому полилобулированного ядра, остающегося в костном мозге после полного цитоплазматического расширения. Бары: 10 мкм(В)Взаимодействия мегакариоцитарных эндотелиальных клеток и внутрисосудистые цитоплазматические процессы. (i) Периферическая зона (PZ) мегакариоцита тесно прикладывается к аблюминальной поверхности синусоидального эндотелия. (ii) Мегакариоцит, образующий короткие инвазивные выступы, которые проникают глубоко в эндотелиальный слой (наконечники стрел). (iii-v) Стрелки указывают на цитоплазматические процессы мегакариоцитов с различными диаметрами, некоторые из которых очень большие и имеют периферическую зону, которая может представлять собой фрагменты, только что попавшие в кровоток. vi) типичный дискоидный тромбоцит (P), наблюдаемый в просвете пазух. На каждой микрофотографии красная линия указывает на просветную сторону эндотелиального барьера, а звезда указывает на синусоидальный просвет. Бары: 2 мкм.(C)Более высокие увеличения перинуклеарной области зрелого мегакариоцита. α, альфа-гранулы; rer, грубый эндоплазматический ретикулум; Г, гольджи; MVB, мультивезикулярное тело; м, митохондрии. Бар: 0,5 мкм. (D) Пример мегакариоцита, показывающего эмпериполез. Поглощенный нейтрофил оказывается морфологически неизменным при взаимодействии с мегакариоцитами. Бар: 2 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл: Подготовка реагентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Непосредственное исследование мегакариоцитов в их родной среде имеет важное значение для понимания мегакариопоэтиса и образования тромбоцитов. В данной рукописи представлен метод просвечивающей электронной микроскопии, сочетающий промывку костного мозга и фиксацию погружением, позволяющий препарировать in situ морфологические характеристики всего процесса морфогенеза мегакариоцитов, происходящего в костном мозге.
Промывка костного мозга является критическим этапом этого метода, так как успех качественного промывания зависит от практики и обучения оператора. Несмотря на деликатность, промывка костного мозга является лучшим способом избежать удаления минерализованной кости, что обычно требует 2-недельного лечения ЭДТА для полной декальцинации, связанной со значительными артефактами на морфологии мегакариоцитов. Кроме того, основным преимуществом сбора целых нефиксированных костных мозгов из большеберцовой и бедренной костей является возможность комбинировать несколько подходов к визуализации одной и той же мыши. На практике для ультраструктурного исследования требуется только один костный мозг, а остальные три образца доступны для дополнительного анализа. Второй костный мозг затем можно использовать для приготовления свежих эксплантов костного мозга, для изучения в режиме реального времени динамики образования проплатлетов нативных мегакариоцитов6. Третий образец обычно предназначен для иммуноокрашивания исследований на толстых участках, обеспечивающих 3D-визуализацию и распределение мегакариоцитов в их естественной среде. Последний образец может быть заморожен и сохранен для дальнейших исследований с помощью иммунозолотой электронной микроскопии, где субклеточная локализация белков исследуется с высоким разрешением4. Эти комбинированные методы визуализации, вместе с наличием целевой делеции/мутации генов у мыши, обеспечивают важное средство определения in situ биологической роли данного белка в тромбопоозисе. Однако здесь следует отметить, что одним из ограничений этого метода является изъятие эпифизов, необходимых для промывки костного мозга. Эпифизы, как известно, являются важными областями для кроветворения, и поэтому их удаление препятствует любой возможности анализа гемопоэтических стволовых клеток и начальных фаз взаимодействия13. Другим ограничением является то, что прародители мегакариоцитов до незрелой стадии I не могут быть идентифицированы, поскольку эти клетки не имеют специфических ультраструктурных особенностей. Чтобы преодолеть это ограничение, можно использовать подход EM immunogold.
Вторым важным этапом метода является фиксация костного мозга погружением. При выполнении в условиях, описанных здесь, т.е. фиксации сразу после промывки компактного цилиндра костного мозга, он имеет следующие преимущества: (i) он быстро и легко выполняется, (ii) он сохраняет ультраструктуру, близкую к той, которая наблюдается после фиксации перфузией6,и (iii) он поддерживает свободные мегакариоцитарные процессы и тромбоциты в синусоидальном кровотоке, которые в противном случае вымываются / теряются после перфузии. С помощью данной методики можно исследовать поступление мегакариоцитов в синусоидальный кровоток и охарактеризовать все промежуточные формы цитоплазматических процессов, из которых возникают тромбоциты8. В соответствии с этим недавно сообщалось, что большие протрузии, интравазии, интравазирующие из мегакариоцитов in vivo, структурно отличаются от тонких расширений, образованных мегакариоцитами in vitro,с заметно отличающимся расположением микротрубочек7. Аналогичным образом, мы недавно показали, что механизм, управляющий образованием тромбоцитов in vivo, отличается от механизма, идентифицированного in vitro14.
Важные ультраструктурные различия все чаще признаются между культивируемыми in vitro и in vivo генерируемыми нативными мегакариоцитами, подчеркивая необходимость микроокружения костного мозга для полной дифференцировки/созревания мегакариоцитов. После сочетания промывки костного мозга и фиксации погружением, описанного в этой статье, обычная просвечивающая электронная микроскопия по-прежнему остается бесценным инструментом для изучения биологии мегакариоцитов и образования тромбоцитов в физиологических и патологических условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Фабьен Проамер, Жан-Ива Ринкеля, Давида Хоффмана, Моник Фройнд за техническую помощь. Эта работа была поддержана ARMESA (Ассоциация исследований и развития в области медицины и санте), Европейским союзом через Европейский фонд регионального развития (ERDF) и грантом ANR-17-CE14-0001-01 H.d.S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,4,6-Tri(dimethylaminomethyl)phenol (DMP-30) | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| Agarose type LM-3 Low Melting Point Agar | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl2 Calcium chloride hexahydrate | Merck, Germany | 2083 | |
| Copper grids 200 mesh thin-bar | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| Dimethylarsinic acid sodium salt trihydrate | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| Dodecenyl Succinic Anhydride (DDSA) | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| Double Edge Stainless Razor blade | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| Ethanol absolut | VWR International, France | 20821296 | |
| Filter paper, 90 mm diameter | Whatman, England | 512-0326 | |
| Flat embedding silicone mould | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| Glutaraldehyde 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| Heat plate Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo Diamond Knife 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus TEM microscope | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| Lead citrate - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 resin | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl2 Magnesium chloride hexahydrate | Sigma, France | M2393-100g | |
| Mounting medium - Poly(butyl methacrylate-co-methyl methacrylate) | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| Nadic Methyl Anhydride (NMA) | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| Osmium tetroxide 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| Propylene oxide (1.2-epoxypropane) | Sigma, France | 82320-250ML | |
| Saline injectable solution 0.9% NaCl | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| Scalpel Surgical steel blade | Swann-Morton, England | .0508 | |
| Sodium tetraborate - Borax | Sigma, France | B-9876 | |
| Sucrose | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| Syringe filter 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| Toluidine blue | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| Trimmer EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| Ultramicrotome Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| Uranyl acetate | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
References
- Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
- Zucker-Franklin, D., Termin, C. S., Cooper, M. C. Structural changes in the megakaryocytes of patients infected with the human immune deficiency virus (HIV-1). American Journal of Pathology. 134 (6), 9 (1989).
- Eckly, A., et al. Biogenesis of the demarcation membrane system (DMS) in megakaryocytes. Blood. 123 (6), 921-930 (2014).
- Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. , 1-10 (2020).
- Behnke, O., Forer, A. From megakaryocytes to platelets: platelet morphogenesis takes place in the bloodstream. European Journal of Haematology. 60, 3-23 (2009).
- Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Platelets and Megakaryocytes. 788, 175-192 (2012).
- Brown, E., Carlin, L. M., Nerlov, C., Lo Celso, C., Poole, A. W. Multiple membrane extrusion sites drive megakaryocyte migration into bone marrow blood vessels. Life Science Alliance. 1 (2), 201800061 (2018).
- Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. , 15024 (2020).
- Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
- Heijnen, H. F. G., Debili, N., Vainchencker, W., Breton-Gorius, J., Geuze, H. J. Multivesicular Bodies Are an Intermediate Stage in the Formation of Platelet α-Granules. Blood. 7 (7), 2313-2325 (1998).
- Gupta, N., Jadhav, K., Shah, V. Emperipolesis, entosis and cell cannibalism: Demystifying the cloud. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 21 (1), 92 (2017).
- Centurione, L., et al. Increased and pathologic emperipolesis of neutrophils within megakaryocytes associated with marrow fibrosis in GATA-1low mice. Blood. 104 (12), 3573-3580 (2004).
- Ellis, S. L., et al. The relationship between bone, hemopoietic stem cells, and vasculature. Blood. 118 (6), 1516-1524 (2011).
- Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
