Her presenterer vi en optimalisert fordøyelsesprotokoll på filteret med detaljert informasjon om følgende: protein fordøyelse, peptidrensing og datauavhengig anskaffelsesanalyse. Denne strategien brukes til analyse av uttrykte prostatiske sekreter-urinprøver og tillater høy proteomdekning og lav manglende verdi etikettfri profilering av urinproteomet.
Filterassistert prøveprotokoll (FASP) er mye brukt til proteomics prøvepreparering fordi det gjør det mulig å konsentrere fortynnede prøver, og det er kompatibelt med et bredt utvalg av vaskemidler. Nedenfra-og-opp-proteomiske arbeidsflyter som FASP er i økende grad avhengige av LC-MS/MS-metoder utført i datauavhengig analysemodus (DIA), en skannemetode som tillater dyp proteomdekning og lav forekomst av manglende verdier.
I denne rapporten vil vi gi detaljer om en arbeidsflyt som kombinerer en FASP-protokoll, et dobbelt StageTip-rensetrinn og LC-MS/MS i DIA-modus for urinproteomkartlegging. Som modellprøve analyserte vi uttrykte prostatiske sekreter (EPS)-urin, en prøve samlet inn etter en digital rektal eksamen (DRE), som er av interesse for oppdagelsesstudier av prostatakreftbiomarkør.
Den konstante utviklingen av proteomiske teknologier lover å ha en betydelig innvirkning på å hjelpe sykdomsdiagnose og prediksjon av respons på behandling ved å gi høyoppløselige kart over viktige molekylære effektorer tilstede i et bredt utvalg av prøver som vev og biofluider. Fra et analytisk synspunkt tilbyr urin flere fordeler som enkel innsamling og stor stabilitet av proteomet med hensyn til andre biofluider1. Proteomisk analyse av urin er av spesiell interesse for biomarkøroppdagelsesstudier på urologiske kreftformer, siden det tillater ikke-invasiv prøvetaking i nærheten av vev av interesse2. Spesielt er en prøve som ser ut til å være lovende for å studere prostatarelaterte patologier EPS-urin3,4 (dvs. en urinprøve samlet inn etter en digital rektal eksamen (DRE)). Denne sistnevnte operasjonen før prøveinnsamling beriker urin med prostataspesifikke proteiner. EPS-urin er en god kandidat til å undersøke lidelser relatert til prostatakjertelen5 inkludert prostatakreft (PCa), siden gjennom DRE kan proteiner utskilt av svulsten helles i urinprøven, noe som øker sjansen for å oppdage kreftvevsspesifikke proteiner.
En avgjørende rolle i å tillate deteksjon og kvantifisering av potensielle proteinbiomarkører spilles av massespektrometri (MS). I løpet av de siste to tiårene har MS-baserte protokoller for proteomisk analyse gjort det mulig å oppdage et stadig økende antall proteiner i en enkelt LC-MS/MS-kjøring takket være kontinuerlige forbedringer i MS-instrumentering og i dataanalyseprogramvare6.
MS-basert proteomisk prøvepreparering innebærer generelt enzymatisk fordøyelse av proteinblandingen, som kan oppnås via et bredt spekter av protokoller som: fordøyelse i løsningen, MStern blotting7,suspensjonsfangst (S-felle)8, solidfaseforbedret prøvepreparering (SP3)9, in-StageTip fordøyelse10 og filterassistert prøvepreparering (FASP)11. Alle protokoller kan brukes til urinproteomikk, selv om resultatene kan variere med hensyn til antall identifiserte proteiner og peptider og når det gjelder reproduserbarhet12.
I dette arbeidet var vår oppmerksomhet fokusert på analysen av EPS-urin av FASP-protokollen. FASP-protokollen ble opprinnelig designet for å analysere proteiner hentet fra vev og cellekulturer, men bruken ble deretter utvidet til analyse av andre prøvetyper, for eksempel urin13. Med hensyn til enkel fordøyelse i løsningen FASP er en mer fleksibel proteomisk tilnærming14, siden ved å oppnå effektiv fjerning av vaskemidler og andre forurensninger som salter fra proteinblandingen før enzymatisk fordøyelse15, tillater det valg av optimale proteinløsningsforhold. Videre er en ekstra egenskap ved FASP at den gir et middel for prøvekonsentrasjon. Dette er spesielt interessant for urinproteomisk analyse, fordi det gjør det mulig å starte fra relativt store prøvevolumer (hundrevis av mikroliter). I lys av potensialet i FASP-protokollen har flere studier fokusert oppmerksomheten på arbeidsflytautomatisering, med sikte på å redusere eksperimentell variasjon og behandle et forhøyet antall prøver parallelt16.
I arbeidsflyten vår etterfølges FASP av LC-MS/MS-anskaffelse i datauavhengig analyse (DIA), som gir høy proteomdekning, god kvantitativ presisjon og lav forekomst av manglende verdier. DIA-tilnærmingen er en sensitiv metode der alle ioner velges for MS/MS-hendelser, motsatt av hva som skjer i dataavhengig analyse (DDA) der bare ioner med høyest intensitet fragmenteres. Massespektrometeret, som opererer i DIA-modus, utfører skannesykluser med forskjellig isolasjonsbredde som dekker hele m / z forløperområdet. Denne tilnærmingen gjør det mulig å reprodusere et høyt antall peptider per enhetstid, noe som gir et proteomisk øyeblikksbilde avprøven 17. Videre har data generert av DIA en annen interessant egenskap: muligheten for en posteriorianalyse 18. DIA-data er mer komplekse enn de som er innhentet av DDA, fordi MS/MS-spektra i DIA er et resultat av samtidig isolering av flere forløperioner i hvert m/z-vindu 19. Disentangling kompositt MS / MS spektra i distinkte og spesifikke peptid signaler oppnås ved hjelp av to grunnleggende elementer: et spektral bibliotek og en dedikert programvare for dataanalyse. Spektralbiblioteket genereres av et dataavhengig eksperiment, som vanligvis involverer peptidfraksjonering for å maksimere proteomdekningen, som gir en liste over tusenvis av eksperimentelt bestemte forløperioner og MS /MS-spektra av peptider som kan påvises i prøven som vurderes. Dataanalyseprogramvaren bruker i stedet informasjonen i spektralbiblioteket til å tolke DIA-dataene ved å generere spesifikke ekstraherte ionkromatogrammer som tillater peptiddeteksjon og kvantifisering. Selv om biblioteksfri DIA-dataanalyse nå er mulig, gir bibliotekbasert DIA fortsatt bedre resultater når det gjelder proteomdekning20.
Prøveprepareringsprotokollen her beskrevet (figur 1) består av følgende trinn: et sentrifugeringstrinn (for å fjerne celleavfall), FASP-fordøyelse, StageTip rensing21, kvantifisering av proteiner og DIA-analyse. Denne protokollen er designet for analyse av EPS-urin i sammenheng med biomarkøroppdagelse av prostatakreft, men den kan brukes til proteomisk analyse av enhver urinprøve.
I dette arbeidet presenteres en strategi for å analysere EPS-urinprøver. FASP-protokollen er et ideelt valg for urinproteomikk fordi den tillater prøvekonsentrasjon før enzymatisk fordøyelse. Faktisk, ved hjelp av denne arbeidsflyten, kan flere hundre mikroliter urin lastes på et enkelt filter og behandles. Videre gir fordøyelsen på filteret relativ frihet i valg av denatureringsforhold. I vårt arbeid oppnås protein denaturering ved å fortynne urinprøver i en buffer som inneholder Tris, SDS og DTT (sluttkonsentrasjon: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureres effektivt umiddelbart etter opptining av prøven, for å unngå uønsket nedbrytning ved aktive proteaser. Den opprinnelige FASP-protokollen er forbedret ved å øke volumet av vasker fra 100 μL til 200 μL. På denne måten oppnås bedre fjerning av rester, spesielt vaskemidler fra filteret.
Etter enzymatisk fordøyelse utføres proteinestimering etter ekstern standard ved hjelp av en rask LC-MS/MS, dataavhengig metode før de siste trinnene i protokollen, som består av dobbel StageTip-rensing og LC-MS/MS-analyse i DIA-modus, på likt startmateriale for alle prøver (2 μg).
Allsidigheten til FASP er knyttet til DIA-tilnærmingen, en sensitiv metode som gir et lavt antall manglende verdier17. I vårt arbeid ble 2387 proteiner identifisert og kvantifisert, slik at en detaljert proteomisk profil av EPS-urin kunne trekkes. Identifisering og kvantifisering av 2387 proteiner var mulig gjennom generering av et rikt spektralbibliotek, oppnådd via høy-pH reversert fraksjonering av peptider, og ved vår DIA-metode, rettet mot et bredt m / z forløperområde. Denne arbeidsflyten identifiserte over 80% av proteiner som tidligere ble funnet i direkte EPS-analyse, og viste at en betydelig brøkdel av EPS-urinproteomet faktisk er avledet fra uttrykte prostatiske sekreter, og er dermed en rik kilde til prostatavevsspesifikke proteiner26.
Til slutt parer vår eksperimentelle design allsidigheten til FASP med følsomheten til DIA for å få et rikt kart over urinproteomet. Denne strategien anbefales for å analysere EPS-urinprøver, men bruken kan utvides til urinproteomikk generelt, eller til og med til andre prøvetyper.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 to MG) og av POR Calabria FESR 2014-2020, aksjon 1.2.2, “INNOPROST”.
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |