Her præsenterer vi en optimeret in-filter fordøjelsesprotokol med detaljerede oplysninger om følgende: protein fordøjelse, peptidrensning og data uafhængig erhvervelse analyse. Denne strategi anvendes til analyse af udtrykte prostatiske sekreter-urinprøver og giver mulighed for høj proteom dækning og lav manglende værdi etiket-fri profilering af urin proteome.
Den filterstøttede prøveprotokol (FASP) anvendes i vid udstrækning til proteomics prøveforberedelse, fordi den gør det muligt at koncentrere fortyndede prøver, og den er kompatibel med en lang række vaske- og rengøringsmidler. Bottom-up proteomics-arbejdsprocesser som FASP er i stigende grad afhængige af LC-MS/MS-metoder, der udføres i data-uafhængig analysetilstand (DIA), en scanningsmetode, der giver mulighed for dyb proteomdækning og lav forekomst af manglende værdier.
I denne rapport vil vi give oplysninger om en arbejdsproces, der kombinerer en FASP-protokol, et dobbelt trin til rensning af trin til trin for trin til rensning af trin i stagetip og LC-MS/MS i DIA-tilstand til tilknytning af urinproteome. Som modelprøve analyserede vi udtrykte prostatiske sekreter (EPS)-urin, en prøve indsamlet efter en digital rektal eksamen (DRE), som er af interesse i prostatakræft biomarkør opdagelsesundersøgelser.
Den konstante udvikling af proteomic teknologier lover at have en betydelig indvirkning på at hjælpe sygdom diagnose og forudsigelse af reaktion på behandling ved at give høj opløsning kort over centrale molekylære effektorer til stede i en bred vifte af prøver såsom væv og biofluider. Fra et analytisk synspunkt tilbyder urin flere fordele såsom let indsamling og stor stabilitet i proteomet med hensyn til andre biofluider1. Proteomic analyse af urin er af særlig interesse i biomarkør opdagelse undersøgelser af urologiske kræftformer, da det giver mulighed for noninvasive prøveudtagning i nærheden af væv af interesse2. Især en prøve, der synes at være lovende for at studere prostata-relaterede patologier er EPS-urin3,4 (dvs. en urinprøve indsamlet efter en digital rektal eksamen (DRE)). Sidstnævnte operation forud for prøveopsamling beriger urinen med prostataspecifikke proteiner. EPS-urin er en god kandidat til at undersøge lidelser relateret til prostata5, herunder prostatakræft (PCa), da gennem DRE, proteiner udskilles af tumoren kan hældes i urinprøven, øge chancen for at opdage kræft væv-specifikke proteiner.
Massespektrometrien (MS) spiller en afgørende rolle med hensyn til at muliggøre detektion og kvantificering af potentielle proteinbiomarkører. I løbet af de sidste to årtier har MS-baserede protokoller til proteomic analyse gjort det muligt at opdage et stadigt stigende antal proteiner i en enkelt LC-MS/MS-kørsel takket være løbende forbedringer i MS-instrumentering og i dataanalysesoftware6.
Ms-baseret proteomic prøveforberedelse indebærer generelt enzymatisk fordøjelse af proteinblandingen, som kan opnås via en lang række protokoller såsom: fordøjelse i opløsning, MStern blotting7, suspensionsfangst (S-fælde)8, massivt faseforbedret prøveforberedelse (SP3)9, in-StageTip fordøjelse10 og filtreret hjælpeprøveforberedelse (FASP)11. Alle protokoller kan anvendes til urin proteomics, selv om resultaterne kan variere med hensyn til antallet af identificerede proteiner og peptider og med hensyn til reproducerbarhed12.
I dette arbejde var vores opmærksomhed fokuseret på analysen af EPS-urin ved FASP-protokollen. FASP-protokollen blev oprindeligt designet til at analysere proteiner udvundet fra væv og cellekulturer, men dens anvendelse blev derefter udvidet til analyse af andre prøvetyper, såsom urin13. Med hensyn til ligetil in-solution fordøjelse FASP er en mere fleksibel proteomic tilgang14, da det ved at opnå effektiv fjernelse af rengøringsmidler og andre forurenende stoffer som salte fra proteinblandingen før enzymatisk fordøjelse15giver mulighed for valg af optimale proteinopløselighedsforhold. Desuden er et yderligere kendetegn ved FASP, at det giver mulighed for at udtage prøver. Dette er af særlig interesse for urin proteomic analyse, fordi det gør det muligt at starte fra relativt store prøvemængder (hundredvis af mikroliter). I lyset af FASP-protokollens potentiale har flere undersøgelser fokuseret opmærksomheden på automatisering af arbejdsgange med det formål at reducere eksperimentel variation og behandle et forhøjet antal prøver parallelt16.
I vores arbejdsgang efterfølges FASP af LC-MS/MS-erhvervelse i datauafhængig analyse (DIA), som giver høj proteomdækning, god kvantitativ præcision og lav forekomst af manglende værdier. DIA-tilgangen er en følsom metode, hvor alle ioner vælges til MS/MS-hændelser, modsat hvad der sker i dataafhængig analyse (DDA), hvor kun ioner med den højeste intensitet er fragmenteret. Massespektrometeret, der kører i DIA-tilstand, udfører scanningscyklusser med forskellig isolationsbredde, der dækker hele m/z-prækursorområdet. Denne fremgangsmåde gør det muligt reproducerbart at detektere et stort antal peptider pr. enhedstid, hvilket giver et proteomics øjebliksbillede af prøven17. Desuden har data genereret af DIA en anden interessant egenskab: muligheden for en efterfølgende analyse18. DIA-data er mere komplekse end dem, DDA har opnået, fordi MS/MS-spektre i DIA skyldes, at flere prækursorioner er i samisolation inden for hvert m/z vindue19. Disentangling af de sammensatte MS/MS-spektre i forskellige og specifikke peptidsignaler opnås ved hjælp af to grundlæggende elementer: et spektralbibliotek og en dedikeret software til dataanalyse. Spektralbiblioteket genereres af et dataafhængigt eksperiment, der normalt involverer peptidfraktionering for at maksimere proteomedækningen, som giver en liste over tusindvis af eksperimentelt bestemte prækursorioner og MS/MS-spektre af peptider, der kan påvises i den pågældende prøve. Dataanalysesoftwaren bruger i stedet oplysningerne i spektralbiblioteket til at fortolke DIA-dataene ved at generere specifikke udvundne ionkromatogrammer, som muliggør peptiddetektering og kvantificering. Mens biblioteksfri DIA-dataanalyse nu er mulig, giver biblioteksbaseret DIA stadig bedre resultater med hensyn til proteome-dækning20.
Prøveforberedelsesprotokollen her beskrevet (figur 1) består af følgende trin: et centrifugeringstrin (for at fjerne cellerester), FASP-fordøjelse, StageTip-rensning21, kvantificering af proteiner og DIA-analyse. Denne protokol er designet til analyse af EPS-urin i forbindelse med prostatakræft biomarkør opdagelse, men det kan anvendes til proteomic analyse af enhver urinprøve.
I dette arbejde præsenteres en strategi for analyse af EPS-urinprøver. FASP-protokollen er et ideelt valg til urin proteomics, fordi den tillader prøvekoncentration før enzymatisk fordøjelse. Faktisk kan flere hundrede mikroliter urin indlæses på et enkelt filter og behandles ved hjælp af denne arbejdsgang. Desuden giver fordøjelsen på filter relativ frihed i valget af denatureringsforhold. I vores arbejde opnås protein denaturering ved at fortynde urinprøver i en buffer, der indeholder Tris, SDS og DTT (endelig koncentration: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureres effektivt umiddelbart efter optøning af prøven for at undgå uønsket nedbrydning ved hjælp af aktive proteaser. Den oprindelige FASP-protokol er blevet forbedret ved at øge mængden af vaske fra 100 μL til 200 μL. På denne måde opnås bedre fjernelse af rester, især rengøringsmidler fra filteret.
Efter enzymatisk fordøjelse, proteinestimering efter ekstern standard ved hjælp af en hurtig LC-MS/MS, udføres dataafhængig metode før protokollens sidste trin, som omfatter dobbelt stagetip-rensning og LC-MS/MS-analyse i DIA-tilstand, på lige udgangsmateriale for alle prøver (2 μg).
Alsidigheden af FASP er forbundet med DIA-tilgangen, en følsom metode, der giver et lavt antal manglende værdier17. I vores arbejde blev 2387 proteiner identificeret og kvantificeret, hvilket gjorde det muligt at tegne en detaljeret proteomic profil af EPS-urin. Identifikation og kvantificering af 2387 proteiner var mulig gennem generering af et rigt spektralbibliotek, opnået via høj pH-omvendt fraktionering af peptider og ved vores DIA-metode rettet mod et bredt m / z prækursorområde. Denne arbejdsgang identificerede over 80% af proteiner, der tidligere blev fundet i direkte EPS-analyse, hvilket viser, at en betydelig brøkdel af EPS-urin proteome faktisk stammer fra udtrykte prostatiske sekreter, og er således en rig kilde til prostatavævsspecifikke proteiner26.
Afslutningsvis parrer vores eksperimentelle design FASP’s alsidighed med DIA’s følsomhed for at opnå et rigt kort over urinproteomet. Denne strategi anbefales til analyse af EPS-urinprøver, men dens anvendelse kan udvides til urin proteomics generelt eller endda til andre prøvetyper.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 til MG) og af POR Calabria FESR 2014-2020, aktion 1.2.2, “INNOPROST”.
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |