यहां, हम निम्नलिखित के बारे में विस्तृत जानकारी के साथ एक अनुकूलित ऑन-फिल्टर पाचन प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं: प्रोटीन पाचन, पेप्टाइड शुद्धिकरण और डेटा स्वतंत्र अधिग्रहण विश्लेषण। यह रणनीति व्यक्त प्रोस्थेटिक स्राव-मूत्र नमूनों के विश्लेषण पर लागू होती है और उच्च प्रोटेम कवरेज और मूत्र प्रोटेम के कम लापता मूल्य लेबल-मुक्त प्रोफाइलिंग की अनुमति देती है।
फ़िल्टर-एडेड नमूना प्रोटोकॉल (एफएएसपी) का व्यापक रूप से प्रोटेओमिक्स नमूना तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है क्योंकि यह पतला नमूनों को ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देता है और यह विभिन्न प्रकार के डिटर्जेंट के साथ संगत है। एफएएसपी जैसे बॉटम-अप प्रोटेओमिक्स वर्कफ्लो तेजी से डेटा-स्वतंत्र विश्लेषण (डीआईए) मोड में किए गए एलसी-एमएस/एमएस तरीकों पर भरोसा करते हैं, एक स्कैनिंग विधि जो डीप प्रोटेम कवरेज और लापता मूल्यों की कम घटनाओं की अनुमति देती है।
इस रिपोर्ट में, हम एक कार्यप्रवाह का विवरण प्रदान करेंगे जो मूत्र प्रोटेम मैपिंग के लिए व्यास मोड में एफएएसपी प्रोटोकॉल, एक डबल स्टेजटिप शुद्धिकरण कदम और एलसी-एमएस/एमएस को जोड़ती है । एक मॉडल नमूने के रूप में, हमने व्यक्त प्रोस्थेटिक स्राव (ईपीएस) का विश्लेषण किया, जो डिजिटल गुदा परीक्षा (डीआरई) के बाद एकत्र किया गया एक नमूना है, जो प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर खोज अध्ययनों में रुचि रखता है।
प्रोटेओमिक प्रौद्योगिकियों के निरंतर विकास के लिए रोग निदान और ऊतकों और biofluids जैसे नमूनों की एक विस्तृत विविधता में मौजूद प्रमुख आणविक प्रभावकों के उच्च संकल्प नक्शे प्रदान करके उपचार के लिए प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी की मदद करने में काफी प्रभाव पड़ने का वादा किया है । विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण से, मूत्र संग्रह में आसानी और दूसरों के संबंध में प्रोटेम की प्रमुख स्थिरता जैसे कई फायदे प्रदान करता है बायोफ्लुइड1। मूत्र का प्रोटेओमिक विश्लेषण मूत्र रोगों के कैंसर पर बायोमार्कर खोज अध्ययन में विशेष रुचि रखता है, क्योंकि यह ब्याज2के ऊतकों के निकट गैर-विकासात्मक नमूने की अनुमति देता है। विशेष रूप से, एक नमूना जो प्रोस्टेट से संबंधित विकृतियों का अध्ययन करने के लिए आशाजनक प्रतीत होता है, ईपीएस-मूत्र3,4 (यानी, एक डिजिटल गुदा परीक्षा (DRE) के बाद एकत्र किया गया मूत्र नमूना है। नमूना संग्रह से पहले यह उत्तरार्द्ध ऑपरेशन प्रोस्टेट विशिष्ट प्रोटीन के साथ मूत्र को समृद्ध करता है। ईपीएस-मूत्र प्रोस्टेट कैंसर (पीसीए) सहित प्रोस्टेट ग्रंथि5 से संबंधित विकारों की जांच करने के लिए एक अच्छा उम्मीदवार है, क्योंकि ड्रे के माध्यम से, ट्यूमर द्वारा स्रावित प्रोटीन मूत्र नमूने में डाला जा सकता है, जिससे कैंसर ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने की संभावना बढ़ जाती है।
संभावित प्रोटीन बायोमार्कर का पता लगाने और मात्राकरण की अनुमति देने में एक महत्वपूर्ण भूमिका मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा निभाई जाती है। पिछले दो दशकों में, प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए एमएस आधारित प्रोटोकॉल ने एमएस इंस्ट्रूमेंटेशन में निरंतर सुधार और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर6में निरंतर सुधार के लिए एक एलसी-एमएस/एमएस रन में प्रोटीन की बढ़ती संख्या का पता लगाने की अनुमति दी है ।
एमएस-आधारित प्रोटेओमिक नमूना तैयारी में आम तौर पर प्रोटीन मिश्रण का एंजाइमेटिक पाचन शामिल होता है, जिसे विभिन्न प्रकार के प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है जैसे: इन-सॉल्यूशन पाचन, एमएसस्टर्न ब्लॉटिंग7,सस्पेंशन ट्रैपिंग (एस-ट्रैप)8,सॉलिड-फेज-एन्हांस्ड सैंपल तैयारी (एसपी 3)9,इन-स्टेजटिप पाचन10 और फ़िल्टर एडेड सैंपल तैयारी (एफएएसपी)11. सभी प्रोटोकॉल मूत्र प्रोटेओमिक्स के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, भले ही परिणाम पहचाने गए प्रोटीन और पेप्टाइड्स की संख्या और प्रजननक्षमता 12के संदर्भ में भिन्न हो सकते हैं।
इस काम में हमारा ध्यान एफएएसपी प्रोटोकॉल द्वारा ईपीएस-यूरिन के विश्लेषण पर केंद्रित था । FASP प्रोटोकॉल मूल रूप से ऊतकों और सेल संस्कृतियों से निकाले गए प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसके उपयोग को मूत्र13जैसे अन्य नमूना प्रकारों के विश्लेषण में विस्तारित किया गया था। सरल इन-सॉल्यूशन पाचन के संबंध में एफएएसपी एक अधिक लचीला प्रोटेओमिक दृष्टिकोण14है, क्योंकि एंजाइमेटिक पाचन15से पहले प्रोटीन मिश्रण से डिटर्जेंट और अन्य संदूषकों जैसे कि नमकों को प्रभावी ढंग से हटाने के द्वारा, यह इष्टतम प्रोटीन घुलनशीलता स्थितियों के विकल्प की अनुमति देता है। इसके अलावा, FASP की एक अतिरिक्त विशेषता यह है कि यह नमूना एकाग्रता के लिए एक साधन प्रदान करता है। यह मूत्र प्रोटेओमिक विश्लेषण के लिए विशेष रुचि है, क्योंकि यह अपेक्षाकृत बड़े नमूना संस्करणों (सैकड़ों माइक्रोलीटर) से शुरू करने की अनुमति देता है। एफएएसपी प्रोटोकॉल की क्षमता के आलोक में, कई अध्ययनों ने प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने और समानांतर16में नमूनों की एक ऊंचा संख्या को संसाधित करने के उद्देश्य से कार्यप्रवाह स्वचालन पर ध्यान केंद्रित किया है।
हमारे वर्कफ़्लो में, एफएएसपी के बाद डेटा-स्वतंत्र विश्लेषण (डीआईए) में एलसी-एमएस/एमएस अधिग्रहण किया जाता है, जो उच्च प्रोटेम कवरेज, अच्छी मात्रात्मक परिशुद्धता और लापता मूल्यों की कम घटना प्रदान करता है । व्यास दृष्टिकोण एक संवेदनशील तरीका है जहां सभी आयनों एमएस/एमएस घटनाओं के लिए चुना जाता है, क्या डेटा पर निर्भर विश्लेषण (डीडीए) में होता है के विपरीत जहां केवल उच्चतम तीव्रता के साथ आयनों खंडित हैं । बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर, व्यास मोड में काम कर रहा है, पूरे एम/जेड अग्रदूत रेंज को कवर करने के लिए विभिन्न अलगाव चौड़ाई के साथ स्कैन चक्र करता है । यह दृष्टिकोण प्रति यूनिट समय पेप्टाइड्स की एक उच्च संख्या का पुन: पता लगाने की अनुमति देता है, जो नमूना17का प्रोटेओमिक्स स्नैपशॉट प्रदान करता है। इसके अलावा, डीआईए द्वारा उत्पन्न डेटा में एक और दिलचस्प विशेषता है: एक पोस्टरी विश्लेषण18की संभावना। डीआईए डेटा डीडीए द्वारा प्राप्त उन लोगों की तुलना में अधिक जटिल हैं, क्योंकि एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा व्यास परिणाम में प्रत्येक m/z विंडो19के भीतर कई अग्रदूत आयनों के सह-अलगाव से । एक स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी और डेटा विश्लेषण के लिए एक समर्पित सॉफ्टवेयर: दो मौलिक तत्वों का उपयोग करके समग्र एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को अलग और विशिष्ट पेप्टाइड संकेतों में अलग-अलग रूप से प्राप्त किया जाता है। स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी एक डेटा-निर्भर प्रयोग द्वारा उत्पन्न होती है, जिसमें आमतौर पर प्रोटेम कवरेज को अधिकतम करने के लिए पेप्टाइड आंशिकता शामिल होती है, जो विचाराधीन नमूने में पेप्टाइड्स का पता लगाने योग्य हजारों प्रयोगात्मक रूप से निर्धारित अग्रदूत आयनों और पेप्टाइड्स के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा की एक सूची प्रदान करता है । डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इसके बजाय, स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी में निहित जानकारी का उपयोग विशिष्ट निकाले गए आयन क्रोमाटोग्राम उत्पन्न करके व्यास डेटा की व्याख्या करने के लिए करता है जो पेप्टाइड डिटेक्शन और क्वांटिफिकेशन की अनुमति देता है। जबकि पुस्तकालय मुक्त व्यास डेटा विश्लेषण अब संभव है, पुस्तकालय आधारित व्यास अभी भी प्रोटेम कवरेज20के मामले में बेहतर परिणाम प्रदान करता है ।
यहां नमूना तैयारी प्रोटोकॉल(चित्रा 1)में निम्नलिखित चरण शामिल हैं: एक अपकेंद्रित्र चरण (सेल मलबे को हटाने के लिए), एफएएसपी पाचन, स्टेजटिप शुद्धिकरण21,प्रोटीन और डीआईए विश्लेषण का मात्राकरण। इस प्रोटोकॉल को प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर खोज के संदर्भ में ईपीएस-यूरिन के विश्लेषण के लिए डिजाइन किया गया है, लेकिन इसे किसी भी मूत्र नमूने के प्रोटेओमिक विश्लेषण पर लागू किया जा सकता है।
इस काम में ईपीएस-यूरिन सैंपल का विश्लेषण करने की रणनीति पेश की जाती है। एफएएसपी प्रोटोकॉल मूत्र प्रोटेओमिक्स के लिए एक आदर्श विकल्प है क्योंकि यह एंजाइमेटिक पाचन से पहले नमूना एकाग्रता की अनुमति देता है। वास्तव में, इस वर्कफ़्लो का उपयोग करके, मूत्र के कई सैकड़ों माइक्रोलीटर को एक फिल्टर पर लोड किया जा सकता है और संसाधित किया जा सकता है। इसके अलावा, ऑन-फिल्टर पाचन देना विकृति की स्थिति के विकल्प में सापेक्ष स्वतंत्रता प्रदान करता है। हमारे काम में, ट्रिस, एसडीएस और डीटीटी (अंतिम एकाग्रता: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT) युक्त बफर में मूत्र के नमूनों को कमजोर करके प्रोटीन डेनैचेशन हासिल किया जाता है। सक्रिय प्रोटीज द्वारा अवांछित गिरावट से बचने के लिए, नमूने को विगलन करने के तुरंत बाद प्रोटीन को कुशलतापूर्वक विकृत किया जाता है। 100 माइक्रोन से 200 माइक्रोन तक वॉश की मात्रा बढ़ाकर मूल एफएएसपी प्रोटोकॉल में सुधार किया गया है। इस तरह, अवशेषों को बेहतर तरह से हटाना, विशेष रूप से फिल्टर से डिटर्जेंट, प्राप्त किया जाता है।
एंजाइमेटिक पाचन के बाद, एक तेजी से एलसी-एमएस/एमएस का उपयोग करके बाहरी मानक द्वारा प्रोटीन अनुमान, डेटा-निर्भर विधि प्रोटोकॉल के अंतिम चरणों से पहले की जाती है, जिसमें सभी नमूनों (2 माइक्रोग्राम) के लिए समान प्रारंभिक सामग्री पर, व्यास मोड में डबल स्टेजटिप शुद्धिकरण और एलसी-एमएस/एमएस विश्लेषण शामिल है।
FASP की बहुमुखी प्रतिभा व्यास दृष्टिकोण के साथ जुड़ा हुआ है, एक संवेदनशील विधि लापता मूल्यों की एक कम संख्या प्रदान17। हमारे काम में, 2387 प्रोटीन की पहचान की गई और मात्रा निर्धारित की गई, इस प्रकार ईपीएस-मूत्र की विस्तृत प्रोटेओमिक प्रोफाइल तैयार करने में सक्षम बनाया गया। 2387 प्रोटीन की पहचान और मात्रा एक समृद्ध स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी की पीढ़ी के माध्यम से संभव थी, जो पेप्टाइड्स के उच्च पीएच उलट अंश के माध्यम से प्राप्त की गई थी, और हमारी व्यास विधि द्वारा, एक विस्तृत एम/जेड अग्रदूत रेंज में निर्देशित। इस कार्यप्रवाह ने पहले प्रत्यक्ष-ईपीएस विश्लेषण में पाए जाने वाले 80% से अधिक प्रोटीन की पहचान की, यह प्रदर्शित करता है कि ईपीएस-मूत्र प्रोटेम का एक काफी अंश वास्तव में व्यक्त प्रोस्थेटिक स्राव से प्राप्त होता है, इस प्रकार प्रोस्टेट ऊतक-विशिष्ट प्रोटीन26का एक समृद्ध स्रोत है।
अंत में, हमारे प्रयोगात्मक डिजाइन ने मूत्र प्रोटेम का समृद्ध नक्शा प्राप्त करने के लिए व्यास की संवेदनशीलता के साथ FASP की बहुमुखी प्रतिभा को जोड़ दिया। ईपीएस-मूत्र नमूनों का विश्लेषण करने के लिए इस रणनीति की सिफारिश की जाती है, लेकिन इसके उपयोग को सामान्य रूप से मूत्र प्रोटेओमिक्स या अन्य नमूना प्रकारों तक बढ़ाया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को एमआईयूआर (मिनिस्टरो यूनीवर्सिटा राइसर्का, प्रिंस 2017 से एमजी) और पीओआर कैलाब्रिया एफईआर 2014-2020, एक्शन 1.2.2, “इनोप्रोस्ट” द्वारा समर्थित किया गया था।
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |