Här presenterar vi ett optimerat matsmältningsprotokoll på filter med detaljerad information om följande: proteinsammanfattning, peptidrening och dataoberoende förvärvsanalys. Denna strategi tillämpas på analys av uttryckt prostata sekret-urin prover och tillåter hög proteome täckning och lågt saknade värde etikett-fri profilering av urinary proteome.
Filterstödda provprotokoll (FASP) används ofta för proteomikprovberedning eftersom det gör det möjligt att koncentrera utspädda prover och det är kompatibelt med en mängd olika tvättmedel. Nedifrån och upp-proteomikarbetsflöden som FASP förlitar sig i allt högre grad på LC-MS/MS-metoder som utförs i dataoberoende analysläge (DIA), en skanningsmetod som möjliggör djup proteomtäckning och låg incidens av saknade värden.
I den här rapporten kommer vi att tillhandahålla information om ett arbetsflöde som kombinerar ett FASP-protokoll, ett dubbelt Stegtips reningssteg och LC-MS/MS i DIA-läge för kartläggning av urinproteom. Som ett modellprov analyserade vi uttryckt prostatautsöndringar (EPS)-urin, ett prov som samlats in efter en digital rektalundersökning (DRE), som är av intresse för upptäcktsstudier av prostatacancerbiomarkör.
Den ständiga utvecklingen av proteomisk teknik lovar att ha en betydande inverkan på att hjälpa sjukdomsdiagnostik och förutsägelse av svar på behandling genom att tillhandahålla högupplösta kartor över viktiga molekylära effektorer som finns i en mängd olika prover som vävnader och biofluider. Ur analytisk synvinkel erbjuder urin flera fördelar som enkel insamling och stor stabilitet hos proteomen med avseende på andra biofluider1. Proteomisk analys av urin är av särskilt intresse för biomarkörupptäcktsstudier på urologiska cancerformer, eftersom det möjliggör icke-invasiv provtagning i närheten av vävnader av intresse2. I synnerhet är ett prov som verkar lovande för att studera prostatarelaterade patologier EPS-urin3,4 (dvs. ett urinprov som samlats in efter en digital rektalundersökning (DRE)). Denna senare operation före provtagning berikar urin med prostataspecifika proteiner. EPS-urin är en bra kandidat för att undersöka störningar relaterade till prostatakörteln5 inklusive prostatacancer (PCa), eftersom proteiner som utsöndras av tumören genom DRE kan hällas i urinprovet, vilket ökar risken för att upptäcka cancervävnadsspecifika proteiner.
En avgörande roll för att möjliggöra upptäckt och kvantifiering av potentiella proteinbiomarkörer spelas av masspektrometri (MS). Under de senaste två decennierna har MS-baserade protokoll för proteomisk analys gjort det möjligt att upptäcka ett ständigt ökande antal proteiner i en enda LC-MS/MS-körning tack vare kontinuerliga förbättringar av MS-instrumentering och i dataanalysprogramvara6.
MS-baserade proteomiska provberedning innebär i allmänhet enzymatisk matsmältning av proteinblandningen, som kan uppnås via en mängd olika protokoll såsom: matsmältning i lösning, MStern blotting7,suspensionsfångst (S-fälla)8, fastfasförbättrad provberedning (SP3)9, i stegTip-matsmältning10 och filtrerad stödprovberedning (FASP)11. Alla protokoll kan användas för urinproteomik, även om resultaten kan variera med avseende på antalet identifierade proteiner och peptider och när det gäller reproducerbarhet12.
I detta arbete fokuserades vår uppmärksamhet på analys av EPS-urin genom FASP-protokollet. FASP-protokollet utformades ursprungligen för att analysera proteiner som extraherats från vävnader och cellkulturer, men dess användning utvidgades sedan till analys av andra provtyper, såsom urin13. När det gäller enkel matsmältning i lösningen FASP är en mer flexibel proteomiskstrategi 14, eftersom det genom att uppnå effektivt avlägsnande av tvättmedel och andra föroreningar som salter från proteinblandningen före enzymatisk matsmältning15, tillåter valet av optimala proteinlöslighetsförhållanden. Dessutom är en ytterligare egenskap hos FASP att den ger ett medel för provkoncentration. Detta är av särskilt intresse för urinproteomisk analys, eftersom det gör det möjligt att börja från relativt stora provvolymer (hundratals mikroliter). Mot bakgrund av FASP-protokollets potential har flera studier fokuserat uppmärksamheten på automatisering av arbetsflöden, i syfte att minska experimentell variabilitet och bearbeta ett förhöjt antal prover parallellt16.
I vårt arbetsflöde följs FASP av LC-MS/MS förvärv i dataoberoende analys (DIA), vilket ger hög proteomtäckning, god kvantitativ precision och låg incidens av saknade värden. DIA-metoden är en känslig metod där alla joner väljs för MS/MS-händelser, mittemot vad som händer i databeroende analys (DDA) där endast joner med högsta intensitet fragmenteras. Masspektrometern, som arbetar i DIA-läge, utför skanningscykler med olika isoleringsbredd som täcker hela m/z-prekursorområdet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt att reproducerbart upptäcka ett stort antal peptider per enhetstid, vilket ger en proteomisk ögonblicksbild avprovet 17. Dessutom har data som genereras av DIA en annan intressant egenskap: möjligheten till en posteriorianalys 18. DIA-data är mer komplexa än de som erhålls av DDA, eftersom MS/MS-spektra i DIA är ett resultat av samtidig isolering av flera prekursorjoner inom varje m/z-fönster 19. Disentangling av den sammansatta MS/MS-spektra i distinkta och specifika peptidsignaler uppnås med hjälp av två grundläggande element: ett spektralbibliotek och en dedikerad programvara för dataanalys. Spektralbiblioteket genereras av ett databeroende experiment, vanligtvis med peptidfraktionering för att maximera proteomtäckningen, som ger en lista över tusentals experimentellt bestämda prekursorjoner och MS/ MS-spektra av peptider som kan upptäckas i det övervägande provet. Dataanalysprogramvaran använder istället informationen i spektralbiblioteket för att tolka DIA-data genom att generera specifika extraherade jonkromatogram som möjliggör peptiddetektering och kvantifiering. Även om biblioteksfri DIA-dataanalys nu är genomförbar, ger biblioteksbaserad DIA fortfarande bättre resultat när det gäller proteomtäckning20.
Provberedningsprotokollet här beskrivet (Figur 1) består av följande steg: ett centrifugeringssteg (för att avlägsna cellskräp), FASP-matsmältning, StageTip-rening21,kvantifiering av proteiner och DIA-analys. Detta protokoll har utformats för analys av EPS-urin i samband med upptäckt av prostatacancerbiomarkör, men det kan tillämpas på proteomisk analys av alla urinprov.
I detta arbete presenteras en strategi för att analysera EPS-urinprover. FASP-protokollet är ett idealiskt val för urinproteomik eftersom det tillåter provkoncentration före enzymatisk matsmältning. Faktum är att med hjälp av detta arbetsflöde kan flera hundratals mikroliter urin laddas på ett enda filter och bearbetas. Dessutom erbjuder matsmältningen på filtret relativ frihet i valet av denatureringsförhållanden. I vårt arbete uppnås proteindenaturering genom att späda urinprover i en buffert som innehåller Tris, SDS och DTT (slutlig koncentration: 50 mM Tris, 1% SDS, 50 mM DTT). Proteiner denatureras effektivt omedelbart efter upptining av provet, för att undvika oönskad nedbrytning genom aktiva proteaser. Det ursprungliga FASP-protokollet har förbättrats genom att öka volymen av tvättar från 100 μL till 200 μL. På detta sätt uppnås bättre avlägsnande av rester, särskilt tvättmedel från filtret.
Efter enzymatisk matsmältning, proteinuppskattning med extern standard med hjälp av en snabb LC-MS/MS, utförs databeroende metod före protokollets sista steg, som omfattar dubbelstegsrening och LC-MS/MS-analys i DIA-läge, på lika utgångsmaterial för alla prover (2 μg).
Mångsidigheten hos FASP är associerad med DIA-metoden, en känslig metod som ger ett lågt antal saknade värden17. I vårt arbete identifierades och kvantifierades 2387 proteiner, vilket möjliggör en detaljerad proteomisk profil av EPS-urin att ritas. Identifiering och kvantifiering av 2387 proteiner var möjlig genom generering av ett rikt spektralbibliotek, erhållet via hög-pH omvänd fraktionering av peptider, och med vår DIA-metod, riktad mot ett brett m / z prekursorsortiment. Detta arbetsflöde identifierade över 80% av proteiner som tidigare hittats i direkt EPS-analys, vilket visar att en betydande del av EPS-urinerad proteom faktiskt härrör från uttryckta prostatautsöndringar, vilket är en rik källa till prostatavävnadsspecifika proteiner26.
Sammanfattningsvis parar vår experimentella design fasps mångsidighet med DIA: s känslighet för att få en rik karta över urinproteomen. Denna strategi rekommenderas för att analysera EPS-urinprover, men dess användning kan utvidgas till urinproteomik i allmänhet, eller till och med till andra provtyper.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av MIUR (Ministero Università Ricerca, PRIN 2017 till MG) och av POR Calabria FESR 2014-2020, åtgärd 1.2.2, “INNOPROST”.
1 M Tris HCL pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
2-iodoacetamide for synthesis | Merck | 8047440100 | |
Acetonitrile for HPLC LC-MS grade | VWR | 83640.290 | |
Ammonium acetate | Fluka | 9690 | |
ammonium hydroxide solution | Sigma | 30501 | |
ammonium hydroxide volumetric standard, 5N solution in water | Merck | 318612-500ML | |
Dithiothreitol | Amresco | 0281-25G | |
Empore Cation 47mm Extraction Disks | Microcolumn | 2251 | |
Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
Formic acid optima | Fisher Scientific | A117-50 | |
Hela Protein Digest Standard | Fisher Scientific | 88329 | |
Microcon-10kDa Centrifugal Filter Unit with Ultracel-10 membrane | MERCK | MRCPRT010 | |
sodium dodecyl sulfate solution | Merck | 71736-500ML | |
Thiethylammonium bicarbonate buffer | Merck | T7408-100ML | |
trifluoroacetic acid | Riedel-de Haën | 34957 | |
Trypsin from porcine pancreas | Merck | T6567-1MG | |
Urea | Merck | U6504-500G | |
Water HPLC gradient grade | Fisher Scientific | W/0106/17 | |
Proteome Discoverer 1,4 | Thermo Fisher Scientific | ||
Spectronaut 14.0 | Biognosys |