Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تعديلات على طريقة Langendorff لعزل المتزامنة من الخلايا العضلية الأذيني والبطيني من الفئران الكبار

Published: May 13, 2021 doi: 10.3791/62514
Automatic Translation
1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cardiology, Bejing Anzhen Hospital, Capital Medical University, 2Department of Cardiology, Bejing Chuiyangliu Hospital

Summary

يصف هذا البروتوكول تعديلات طريقة Langendorff بما في ذلك عمق علبة الشريان الأورطي لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية المتزامنة من الفئران البالغة.

Abstract

وكريات القلب واحد هو أداة حيوية في الدراسات الخلوية ودون الخلوية من بيولوجيا القلب والأمراض كوحدة أساسية من الانكماش والنشاط الكهربائي. وبالتالي ، فإن عزل خلايا القلب القابلة للحياة وعالية الجودة عن القلب هو الخطوة التجريبية الأولية والأكثر أهمية. مقارنة البروتوكولات المختلفة لعزل خلايا القلب من الفئران البالغة، وتغلغل Langendorff الرجعية هو الأسلوب الأكثر نجاحا واستنساخها ذكرت في الأدب، وخاصة لعزل الخلايا العضلية البطينية. ومع ذلك ، فإن عزل الخلايا العضلية الأذينية عالية الجودة عن القلب المتغلغل لا يزال صعبا ، ولا تتوفر سوى تقارير عزل ناجحة قليلة. حل هذه المشكلة المعقدة مهم للغاية لأنه بصرف النظر عن مرض البطين ، يمثل المرض الأذيني جزءا كبيرا من أمراض القلب. لذلك، هناك ما يبرر إجراء مزيد من التحقيقات على المستوى الخلوي للكشف عن الآليات. في هذه الورقة، يتم إدخال بروتوكول يستند إلى طريقة التخثر الرجعي Langendorff وبعض التعديلات في عمق علبة الشريان الأورطي والخطوات التي قد تؤثر على عملية الهضم لعزل الخلايا العضلية الأذينية والبطينية تم إجراؤها في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، يتم تأكيد خلايا القلب معزولة لتكون قابلة لتصحيح التحقيق المشبك.

Introduction

أمراض القلب هي واحدة من الأسباب العالمية الرئيسية للوفيات1. لمعالجة هذا العبء على نظام الرعاية الصحية ، من الضروري فهم متعمق لعلم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في القلب. إلى جانب إعداد الحيوانات والقلب سليمة، وإعداد الخلوية هو أداة أخرى لا غنى عنها للدراسة وظيفية والمرض2. من خلال تطبيق المشبك التصحيح، والتصوير الكالسيوم، والبيولوجيا الجزيئية، وغيرها من التكنولوجيات المتقدمة، يمكن للباحثين الحصول على مزيد من المعلومات حول خصائص الكهربية، التوازن الكالسيوم، ومسارات الإشارات، والدول الأيضية، والنسخ الجينية في عضلة القلب واحدة (CM). هذا مفيد للغاية في الكشف عن الآليات الفسيولوجية والمرضية لعملية أمراض القلب3،4،5،6،7. وبالنسبة للبحوث الحيوانية، يمكن استخدام أنواع تتراوح بين الحيوانات الصغيرة (مثل الفئران والجرذان والخنازير الغينية) والحيوانات الكبيرة (مثل الأرانب والأسماك). وعادة ما يفضل الحيوانات الصغيرة، ولا سيما الفئران، لأنها قابلة للتلاعب بالنموذج الوراثي والمرضي8,9,10.

وقد مرت تقنيات CMs المعزولة بشكل حاد بفترة تطور طويلة ولا تزال تتطور11. إن التشوه الرجعي Langendorff هو أنجح طريقة عزل CMs وأكثرها قابلية للاستنساخ المطبقة على الفئران والجرذان ، خاصة لعزل الخلايا العضلية البطينية (VMs)12،13،14،15. ومع ذلك ، فإن التقارير عن خلايا الخلايا العضلية الأذينية المعزولة بنجاح (AMs) نادرة16،17،18. هناك ما يبرر إجراء المزيد من التحقيقات على كلا المستويين من الجهاز / النظام بأكمله والخلوية / دون الخلوية للكشف عن الآليات واستكشاف نهج علاجية جديدة لأن الرجفان الأذيني (AF) ، وهو النوع الأكثر شيوعا من عدم انتظام ضربات القلب ، أصبح شائعا بشكل متزايد على مستوى العالم ، ولا تزال طرق العلاج الحالية في كل من العلاجات الدوائية واجتثاث القلب غير فعالة في حوالي 40٪ -50٪ من مرضى AF19 . ناجحة الكبار الماوس CMs العزلة هي الخطوة الأولى للدراسة الخلوية. يمكن استخدام طريقتين عزل أساسيتين: طرق قطعة و Langendorff. في طريقة التشوش Langendorff، هضم الأنسجة يعتمد على محلول الانزيم تسليمها من قبل الشرايين التاجية وفروعها إلى الأسرة الشعرية. عمق التنمية الأبهر السليم الذي يمكن تجنب اختراق الصمامات الأبهري وحجب أوستيا الشريان التاجي هو الشرط المسبق لتحقيق مثل هذا النمط التخثر، والذي هو أيضا الخطوة الأساسية لعملية الهضم كفاءة والغلة VM المثالي. ومن ثم، فمن المعقول أن نفترض أن عمق علبة الشريان الأورطي قد تؤثر بالمثل على تغلغل السفينة الأذينية وتؤثر في النهاية على غلة AM. لاختبار هذه الفرضية، تم إجراء علبة الشريان الأورطي في أعماق مختلفة ومقارنة غلة AM المقابلة. وأظهرت البيانات أن عمق علبة الشريان الأورطي له صلة مباشرة بعائد AM. هنا، يتم تقديم بروتوكول لعزل AMs و VMs في وقت واحد.

Protocol

تم شراء الفئران البالغة من الذكور C57BL/6 التي تزن 20-30 جراما ، من عمر 8-10 أسابيع من مركز الحيوانات في جامعة كابيتال الطبية ، بكين ، الصين. وقد وافقت لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة كابيتال الطبية على جميع الإجراءات التجريبية، وأجريت وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبرات الذي اقترحه معهد الموارد الحيوانية ونشرته المعاهد الوطنية للصحة. تم استخدام Excel وOri origin 8.5 للحصول على البيانات وتحليلها. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD ، للتقييم الإحصائي ، تم استخدام اختبار الطالب t واعتبر P < 0.05 مهما إحصائيا.

1. الحل والتشويش إعداد الجهاز

  1. تجميع جهاز Langendorff تدفق مستمر (المتاحة تجاريا أو عصامي). الشكل 1 يوفر تخطيط بسيط.
  2. إعداد الحلول وفقا للكواشف المعطاة في الجدول 1 والجدول 2.
  3. قم بتشغيل حمام المياه المتداول وضبط درجة حرارة إدخال مناسبة (42.7 درجة مئوية في مختبرنا) لضمان وصول تدفق نظام الدوران من القنية إلى 37 درجة مئوية.
  4. تنظيف نظام التشوه عن طريق تعميم المياه deionized. إذا كانت هناك حاجة إلى حالة معقمة، قم بتشغيل الإيثانول بنسبة 75٪ من خلال نظام التشوه لمدة 15 دقيقة، يليه الماء deionized (10 دورات على الأقل لتجنب آثار سمية الكحول على القلب).
  5. قياس الوقت والحجم لدورة واحدة من نظام الدورة الدموية perfusate لتحديد عدد ملليلترات من محلول التيرود المؤوكسجين ليتم تحميلها في الخطوة التالية التغلغل.
  6. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الطريقة المطلوبة.
  7. تعيين معدل تدفق نظام التغلغل perfusate في 4 مل / دقيقة.
  8. إعداد اثنين نظيفة 35 مم أطباق بيتري واحد يحتوي على محلول تايرود (بيتري طبق 1)، والآخر يحتوي على حل 1 (طبق بيتري 2).
  9. إعداد حقنة 1 مل مليئة الحل 1 و 20 G إبرة قنية الصلب حادة مع درجة من حيث المسافة هي 1 ملم إلى طرف. إعداد عقدة فضفاضة مع خياطة 3-0 إلى رمح القنية. تنظيم مجال عرض مجسم وضمان أن طرف القنية تحت السطح السائل للطبق بيتري 2.

2. إعداد الحيوان

  1. إعطاء الهيبارين (تركيز، 1000 وحدة IU/mL؛ 0.2 مل/فأر) intraperitoneally إلى الفئران لتجنب جلطات الدم. بعد 10 دقائق، تخدير الفئران مع بنتوباربيتال الصوديوم (50 ملغم/كغ، حقنة I.P. ) وتأكد من أن الفئران تتوقف عن الاستجابة لقرص الذيل / إصبع القدم. إجراء خلع عنق الرحم 20 دقيقة بعد إدارة الهيبارين.
  2. نقل الفئران على المنصة الجراحية، وإصلاح الفئران في موقف سوبين، تعقيم الصدر مع الإيثانول 75٪، وتجفيفه بالشاش أو المنديل.

3. استئصال القلب وعلبة الشريان الأورطي

  1. رفع الجلد من xiphoid مع ملقط الأنسجة وجعل شق الجانبي طفيفة من خلال الجلد مع مقص الأنسجة. إجراء تشريح حاد بين الجلد واللفافة وتوسيع شق الجلد في شكل V نحو axillae على كلا الجانبين.
    1. مواصلة نفس أثر شق من خلال القفص الصدري، ومن ثم، تحويل القفص الصدري صعودا عن طريق لقط القص مع ملقط الأنسجة لفضح تماما القلب والرئتين.
  2. قشر قبالة التامور باستخدام ملقط منحني. المسيل للدموع الغدة الصعترية نحو كلا الجانبين من قبل اثنين من ملقط منحني إذا كان يغطي الأوعية كبيرة. سحب بلطف قاعدة القلب نحو الذيل مع ملقط منحني حتى يمكن رؤية وعاء دموي على شكل "Y" (الشريان الأورطي وشرايين فرعه).
  3. لحجز أطوال مختلفة من الشريان الأورطي للتشبيك والمقارنة، قم بتشخيض الشريان الأورطي في الشريان السباتي المشترك الأيسر (الخط الأخضر في الشكل 2) وقطع الشريان العضدي في نفس الوقت في بعض الفئران. عبر الشريان الأورطي الصاعد في الفئران الأخرى (الخط الأسود في الشكل 2).
    ملاحظة: بالنسبة لأولئك الذين هم جديدة على هذا الإجراء، ويمكن أيضا أن يتم هذه الخطوة تحت المجهر مجسمة.
  4. استئصال القلب، وتزج على الفور في طبق بيتري 1 لغسل وضخ الدم المتبقية.
  5. نقل القلب إلى طبق بيتري 2، وتقليم أي فائض الأنسجة باستخدام مقص القزحية غرامة إذا لزم الأمر. بالنسبة لأولئك الذين هم جديدة على هذا الإجراء، القيام بهذه الخطوة تحت مجسم لتجنب قطع الشريان الأورطي خطأ أو غيرها من هياكل القلب.
  6. دفع الحقنة لطرد فقاعات الهواء قبل علبة الشريان الأورطي. إجراء علبة الشريان الأورطي الرجعية بمساعدة اثنين من ملقط ربط مستقيم (الفكين على نحو سلس) تحت مجسم. تأكد من أن عملية التكنيم بأكملها تحت السطح السائل.
  7. تجنب اختراق الصمامات الأبهري وضبط الأعماق إلى الشريان الأبهري الصاعد (الماوس الذي تم تحويل الشريان الأبهري عند الشريان السباتي المشترك الأيسر) والجذر الأبهري (الماوس الذي تم تحويل الشريان الأبهر عند الشريان الأبهري الصاعد) على التوالي.
    ملاحظة: يتم تعريف عمق تعبق الشريان الأورطي (يشار إليه ببساطة باسم العمق) هنا على أنه الموضع الذي يوجد فيه طرف القنية في الشريان الأورطي أو حيث يتم ربط الشريان الأورطي.
  8. Ligate الشريان الأورطي مع خياطة ما قبل عقدة 3-0 إلى الشق cannula. اضغط بلطف على محتوى الحقنة لشطف الدم المتبقي.
    ملاحظة: سوف يترك الدم الشرايين التاجية ويمسح من الأوردة الظهرية إذا تم وضع العمق بشكل صحيح. القلب والزوائد الأذينية سوف تتوسع وتصبح شاحبة.
  9. إزالة وربط القنية إلى جهاز Langendorff. مرة أخرى، والحرص على تجنب أي فقاعات الهواء دخول القلب.
    ملاحظة: يجب أن تدرك أن الوقت من استئصال الصدر إلى التغلغل الأولي لا ينبغي أن يتجاوز 5 دقائق.

4. تغلغل القلب

  1. أولا، رئيس و perfuse الأوكسجين حل تايرود لحوالي 10 ق (حجم السائل تشغيل 10 ق في النظام المستخدم في هذا البروتوكول هو ما يقرب من 0.7 مل) إذا كان هناك دم المتبقية في الأذين، ومن ثم التحول إلى الحل 1. ومع ذلك، فقط perfuse مع الحل 1 إذا لم يكن هناك دم المتبقية في الأذينين. Perfuse القلب لمدة 2 دقيقة تقريبا.
  2. التبديل إلى الحل 3. تمتص حوالي 2.5 مل من الحل 3 مع واحد استخدام ماصة البولي ايثيلين المعقمة وقبل الحربم في حمام الماء لاستخدامها في وقت لاحق، مع ما تبقى تستخدم لتغلغل لمدة 11-12 دقيقة تقريبا. تجاهل الحل 3 perfused في أول 2 دقيقة. إعادة تدوير الباقي إلى خزانات perfusate بواسطة مضخة التثابير لإعادة استخدامها حتى اكتمال الهضم.
  3. إنهاء الهضم عندما يصبح القلب منتفخة ويتحول شاحب قليلا ومترهل (نسيج إسفنجي) أو بصمة موجودة إذا تم مقروص عضلة القلب بلطف باستخدام ملقط مسنن.

5. عزل الخلايا وإعادة إدخال الكالسيوم

  1. إزالة البطينين والأتريا مع ملقط، ووضعها في أطباق بيتري مختلفة. أضف الحل قبل الحرب 3 إلى أطباق بيتري.
  2. تريتورات الأنسجة في نسيج عكر مع ملقط حادة وماصة بلطف الأنسجة للهضم حتى. تجنب إدخال فقاعات الهواء.
  3. نقل الأنسجة المهضومة العكر مع ماصة في الحل 4 لوقف نشاط الانزيم المتبقية، ومن ثم الطرد المركزي لمدة 20 ق في 192×g. إزالة supernatant وإضافة حل 5 في الرواسب الخلية وماصة لتفريق الخلايا بالتساوي.
  4. إعادة تقديم الكالسيوم بطريقة تدريجية من أجل تجنب مفارقة الكالسيوم والكالسيوم الزائد. أضف تدريجيا ما مجموعه 50 ميكرولتر 100 mM/L CaCl2 (في كل فاصل زمني قدره 5 دقائق من 5 ميكرولتر، 10 ميكرولتر، 15 ميكرولتر، و 20 ميكرولتر، على التوالي) إلى تعليق الخلية.

6. تخزين الخلية

  1. لدراسة المشبك التصحيح، وتخزين الخلايا في حل تايرود. لدراسات خلوية أخرى، تخزين الخلايا في الحل 6.
  2. لضمان دقة الدراسات الوظيفية الحادة '(على سبيل المثال، Ca2 + الشرر، Ca2 + موجات، Ca2 + الافراج، Ca2 + تسرب، والتصحيح تسجيلات المشبك) النتائج، والانتهاء من هذه الأنواع من التجارب الوظيفية في غضون 6 ساعة المقبل.

Representative Results

هذه الورقة، حيث يتم وضع طرف القنية في الشريان الأورطي، والذي يعرف بأنه عمق تعبق الشريان الأورطي (يشار إليه ببساطة باسم العمق)، يمثل أيضا حيث يتم ربط الشريان الأورطي. يتم تمثيل AM و VM المعزولة عن القلب الذي كان cannulated وربطها في الشريان الأورطي الصاعد كما AMAA و VMAA، على التوالي. وعلاوة على ذلك، AM و VM معزولة عن القلب الذي كان cannulated وربطها في الجذر الأبهري يتم تمثيلها كما AMAR وVMAR، على التوالي. يوضح الشكل 2 نظرة عامة على أوضاع الشريان الأورطي ومواضع الأقسام. أيضا، يوضح الشكل 3 الأعماق وأماكن الربط التي تتوافق مع مواقع تحويل الشريان الأورطي. ارتبط العمق مع الزوائد الأذينية والأذية' التخبط. يتم تضخيم كل من الزوائد الأذينية عندما يكون طرف القنية في الشريان الأورطي الصاعد ، مما يشير إلى تغلغل الأذينين الكافي. ومع ذلك ، عندما يكون في الجذر الأبهري ، لا يكون التشوه الأذيني كافيا ويتم تزيين كل من الزوائد الأذينية (الشكل 4). مورفولوجيا CM وقابلية البقاء التي يتم عزلها عن القلوب المعلبة في أعماق مختلفة بعد إعادة إدخال الكالسيوم (الشكل 5). مورفولوجيا الخلايا من AMAA، AMAR، VMAA، وVMAR تحت المجهر confocal قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم. AMs على شكل مغزل، في حين أن VMs على شكل قضيب مع نهايات مستطيلة. وعلاوة على ذلك، تحتوي أنظمة رصد السفن وأجهزة رصد السفن على أغشية سليمة، وملامح واضحة، وساركومير مخطط واضح، وأسطح ناعمة (الشكل 6). تم تقييم صلاحية الخلية عن طريق تلطيخ أزرق تريبان. يمكن للخلايا الطبيعية ذات الأغشية السليمة استبعاد التريبان الأزرق ولن تكون ملطخة ، في حين أن نشاط فقدان الخلايا سيتراكم بسرعة داخل الخلايا الأزرق المثقبي (الشكل 7). تم وضع AMs و VMs في شرائح كائنات مختلفة لإجراء عد الخلايا. تم تحديد إجمالي غلة AM والنسبة المئوية ل CMs القابلة للتطبيق على شكل مغزل (معدل البقاء على قيد الحياة) عن طريق نقل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى شريحة جسم وتم عدها تحت مجهر مقلوب على النقيض من المرحلة عند 4 × 10 مجالات رؤية. واستخدمت نفس الطريقة لتحديد مجموع غلة ال VMs (على شكل قضيب) والنسبة المئوية ل VMs القابلة للتطبيق. ويفضل هذا الأسلوب على استخدام مقياس الدم، لأن CMs لم توزع بسهولة في منطقة العد من مقياس الدم بسبب حجمها وشكلها. يظهر الرسم البياني الشريطي (الشكل 8) معدلات بقاء AMAA وAMAR وVAA وVMAR قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم. تمثل كل قيمة متوسط ± SD من 10 فئران. قبل إعادة إدخال الكالسيوم، تكون معدلات بقاء AMAA أعلى بكثير من معدلات بقاء AMAR (70.9٪ ± 2.8٪ و 41.0٪ ± 5.2٪ على التوالي؛ ص < 0.01). بعد إعادة إدخال الكالسيوم، تكون معدلات بقاء AMAA أعلى بكثير من معدلات بقاء AMAR (69.4٪ ± 3.0٪ و 37.7٪ ± 4.9٪، على التوالي؛ ص < 0.01).

ولم تختلف معدلات بقاء الهيئة عن معدلات بقاء ال VMAR (89.5 في المائة ± 2.7 في المائة مقابل 88.1 في المائة ± 2.6 في المائة على التوالي؛ ص > 0.05) قبل إعادة إدخال الكالسيوم. وبالمثل، لم تختلف معدلات بقاء الهيئة عن معدلات بقاء ال VMAR (82.2 في المائة ± 1.9 في المائة مقابل 82.9 في المائة ± 1.6 في المائة على التوالي؛ ص > 0.05) بعد إعادة إدخال الكالسيوم.

قلب معلبة في العمق كما أوصى هذا البروتوكول (في الشريان الأورطي الصاعد)، و VMs قابلة للحياة و AMs تسفر عن ما يقرب من 4.1 مليون وحوالي 180،000، على التوالي، بعد إعادة إدخال الكالسيوم. يؤكد تسجيل المشبك التصحيحي للخلية الكاملة لتيار الصوديوم (الشكل 9A، B) والكثافة الحالية (الشكل 9C) في AM المعزول و VM أن جودة الخلية قد استوفت متطلبات التجارب الكهربية. يوضح تشريح الشريان الأبهري (الشكل 10) أن أوستيوم الأوعية الأذينية يقع بالقرب من الجذر الأبهري ومجاور ونهر الشريان التاجي (CA). ويبين الجدول 3 المسافة من طرف القنية إلى أوستيوم CA للقلوب المعلبة والمربطة في الشريان الأبهري الصاعد والجذر الأبهري، على التوالي.

Figure 1
الشكل 1 - الأرقام 1- الأرقام 1 مخطط تخطيطي لنظام Langendorff معدل مجمع. هذا النظام هو اقتصادي والمحمولة للمستخدمين. لديها جزأين من أنابيب بلاستيكية واحدة للماء (القطر الداخلي، 8 ملم) وواحد لل perfusate (القطر الداخلي، 1.5 ملم) - منها يتم توصيل نهاية البعيدة إلى STOPCOCK الطبية PE ثلاثية الاتجاه مع قفل لوير. زجاجة تحتوي على الماء ومع شكل سدادة مطاطية كمبادل حراري. يتم ضخ perfusate في أنابيب بلاستيكية في المبادل الحراري من قبل مضخة التثابر ويخرج من stopcock ثلاثية متصلةقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 - الأرقام 2- الأرقام التي تم الشريان الأورطي والأنسجة حولها. بنية الأوعية الدموية على شكل حرف "Y" هي الشريان الأورطي وفروعه: الشريان العضدي (السهم 1) والشريان السباتي المشترك الأيسر (السهم 2). عبر الشريان الأورطي بين الشريان السباتي المشترك الأيسر (الخط الأخضر) وقطع الشريان العضدي في وقت واحد في بعض الفئران. تحويل في الشريان الأورطي التصاعدي (الخط الأسود) في الفئران الأخرى (مجسم 10 × 2 التكبير). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 - الأرقام 3- الأرقام التي يمكن أن منظر أمامي للقلب المعلب. يمثل الخط المنحني الأسود الحافة القاطعة للهرطية التي تم فصلها بين الشريان السباتي المشترك الأيسر. يمثل الخط المنحني الأحمر الحافة القاطعة للهرطية المقوسة عند الشريان الأورطي الصاعد. يمثل الخط المستقيم حيث تم ربط الشريان الأورطي: أسود عند الشريان الأبهري الصاعد وأحمر عند الجذر الأبهري (مجسم 10 × 2 تكبير). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 - الأرقام 4- الأرقام التي تم ال حالة التخثر من القلوب المعلبة. يتم تغلغل الأذينين بما فيه الكفاية ، ويتم نفخ كل من الزوائد الأذينية في القلب (A) غير معلبة ومربطة في الشريان الأورطي الصاعد. ومع ذلك ، يتم تزيين كل من الزوائد الأذينية في القلب (B) غير معلبة ومربطة في الجذر الأبهري ، مما يشير إلى ضعف التشبع الأذيني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 - الأرقام 5- الأرقام التي تم مورفولوجيا الخلايا وتقييم الجدوى بعد إعادة إدخال الكالسيوم. AMs (A) و VMs (B) معزولة عن القلب cannulated وقيدت في الشريان الأورطي التصاعدي يتم تمثيلها كما AMAAs و VMAAs، على التوالي. AMs (C) و VMs (D) معزولة عن القلب cannulated ومقيدة في الجذر الأبهري يتم تمثيلها كما AMARs وVMARs، على التوالي. ال CMs عالية الجودة هادئة ولها أغشية سليمة ، وملامح واضحة ، وساركومير مخطط واضح ، وسطح خلية ناعم. AMs على شكل مغزل، في حين أن VMs هي قضيب أو على شكل لبنة مع نهايات مستطيلة. CMs التي تنقبض تلقائيا أو تحتوي على blebs في الغشاء هي من نوعية رديئة، وتلك التي تتقلص في شكل كروي هي خلايا ميتة. مجال عرض عشوائي (مجهر مضان، 10 × 10 تكبير؛ أشرطة مقياس، 100 ميكرومتر). AM = الخلايا النيبية الأذينية، VM = الخلايا العضلية البطينية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 - الأرقام 6- الأرقام 10 مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر الكونفوجكال قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم. قبل إعادة إدخال الكالسيوم، يتم تشكيل AMAA (A) و AMAR (C) على شكل مغزل مع ملامح واضحة، وساركومير مخطط، وأسطح غشاء ناعمة. بعد إعادة إدخال الكالسيوم، AMAA (B) و AMAR (D) هي أيضا على شكل مغزل مع ملامح واضحة، ساركومير المخطط، وأسطح الأغشية الملساء. قبل إعادة إدخال الكالسيوم، VMAA (E) وVMAR (G) هي قضيب أو الطوب على شكل مع ملامح واضحة، ساركوميرات striate، وأسطح الغشاء السلس مع نهايات مستطيلة. بعد إعادة إدخال الكالسيوم، VMAA (F) وVMAR (H) هي أيضا قضيب أو الطوب على شكل مع ملامح واضحة، ساركومير المخططة، وأسطح الأغشية الملساء مع نهايات مستطيلة (زيت المجهر confocal، 63 × 10 التكبير؛ قضبان مقياس، 50 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7 - الأرقام 7- الأرقام التي تم تقييم صلاحية الخلية. الخلايا التالفة التي تفقد النشاط ملطخة بالتريبان الأزرق. في المقابل، لا يمكن تلوين الخلايا القابلة للحياة عن طريق التريبان الأزرق (المجهر الفلوري، 4 × 10 تكبير؛ أشرطة المقياس، 100 ميكرومتر). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 8
الشكل 8 - الأرقام 8- الأرقام التي تم شريط الرسم البياني تبين معدلات البقاء على قيد الحياة من AMAA، عمار، VMAA، وVMAR قبل وبعد إعادة إدخال الكالسيوم. CR = إعادة إدخال الكالسيوم. تمثل كل قيمة متوسط ± SD من 10 فئران. ص < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

حل المحتويات (التركيز النهائي في mmol/L، إذا لم يتم تحديده بشكل مختلف) لاحظ
حل التغلغل (الحل 1) 113 NaCl، 4.7 KCl، 0.6 KH2PO4، 0.6 Na2HPO4، 1.2 MgSO4، 12 NaHCO3، 10 KHCO3، 10 HEPES، 15 تورين، 5 الجلوكوز، 10 2،3-butanedione monoxime(BDM) والتي يمكن تخزينها لمدة 3 أيام عند 4 °C. يتم إضافة الجلوكوز والتورين وBDM في يوم التجربة. إعداد 200 مل من محلول التغلغل لكل قلب.
حل تايرود (الحل 2) 140 NaCl، 4 KCl، 1 MgCl2، 10 HEPES، 1 CaCl2، 5 الجلوكوز والتي يمكن تخزينها لمدة 3 أيام عند 4 °C. يتم إضافة CaCl2 والجلوكوز في يوم التجربة، وضبط درجة الحموضة إلى 7.3-7.4 مع NaOH المشبعة في درجة حرارة الغرفة (28-30 درجة مئوية) مع متر PH.

الجدول 1 - الجداول حلول لعزل CM الماوس الكبار.

حل المحتويات لاحظ
حل الهضم(الحل 3) 25 مل حل 1, 6μL 100 mM/L CaCl2, 25mg كولاجيناز الثاني, 50μL (2.5 ٪ 10×) تريبسين لكل قلب
إيقاف الحل 1(الحل 4) 9 مل حل 1، 1 مل FBS (مصل الجنين البقري)، 4μL 100 mM/L CaCl2 لكل قلب
إيقاف الحل 2 (الحل 5) محلول 9.5 مل 1، 0.5 مل FBS (مصل الأبقار الجنيني)، 4μL 100 mM/L CaCl2 لكل قلب
حل إعادة الإنفاق الخلوي(الحل 6) 13 مل الحل 1, 7μL 1M/L CaCl2, BSA (الثور مصل الألبومين) بجرعة التي يمكن أن تشكل طبقة رقيقة تغطي سطح السائل لكل قلب

الجدول 2 - الأرباح حلول لعزل الماوس الكبار CM والتخزين.

Figure 9
الشكل 9 - الأرقام 10-199 منحنيات الجهد الحالي لقنوات الصوديوم. تم استخدام تقنيات المشبك التصحيح كامل الخلية لتسجيل تيارات الصوديوم من cardiomyocytes معزولة في وضع المشبك الجهد. يظهر بروتوكول المشبك الجهد في inset. يتم عرض تيارات الصوديوم المسجلة من AM (A) و VM (B). الكثافات الحالية عند إمكانات −45mV، -40mV و−35 mV أعلى بكثير في AM (−32.71 ± 1.597 pA/pF، −31.49 ± 1.820 pA/pF، و−29.34 ± 1.939 pA/pF، على التوالي؛ ن = 10) مقارنة ب VM (−17.66 pA/pF ± 1.976 pA/pF، −21.09 ± 1.560 pA/pF، و−21.86 ± 1.381 pA/pF، على التوالي؛ n = 8؛ ف < 0.05). (ج) تبين منحنيات I-V كثافات تيار الصوديوم التي تم تطبيعها لسعة الخلية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 10
الشكل 10 - الأرقام 10- الأرقام التي تم 1 منشأ وتوزيع السفينة الأذينية. السفينة الأذينية (السهم 1) وCA (السهم 2) في لوحة A. لوحة B هو نظرة فاحصة على السفينة الأذينية (السهم 3). (ج) يوجد أوستيا مختلفة الحجم؛ واحد (السهم 4) يتوافق مع السفينة الأذينية التي ريت الزوائد الأذينية، والآخر (السهم 5) يتوافق مع CA (مجسم 10 × 5 تكبير). CA = الشريان التاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم التسلسلي للفئران 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
عمق علبة الشريان الأورطي في الشريان الأورطي الصاعد 0.5 0.6 0.3 0.4 0.8 0.3 0.8 0.7 0.5 0.7
عمق علبة الشريان الأورطي في الجذر الأبهري 0.2 -0.1 0.1 0 -0.1 0.1 -0.2 0 -0.1 0

الجدول 3 - الأرباح المسافة من طرف القنية إلى أوستيوم الشريان التاجي. استخدمت قلوب الفئران C57BL/6 (ن = 20) ل cannulate وligate الشريان الأورطي في أعماق الشريان الأورطي الصاعد والجذر الأبهري، على التوالي. يتم تشريح الشريان الأورطي ، وتم قياس المسافة من طرف القنية إلى أوستيوم CA. يتم قياس المسافة بالملليمترات، وتمثل العلامات الإيجابية أو السلبية طرف القنية فوق وتحت أوستيوم CA، على التوالي.

Discussion

CM واحد هو أداة قيمة ولا غنى عنها في الدراسات على المستوى الخلوي من وظيفة القلب والأمراض20. ومن ثم، فإن عزل ال CMs القابلة للحياة عن القلوب هو الخطوة الأولية والأكثر أهمية. نوعية الخلية هي واحدة من المحددات الهامة لإجراء التجارب الناجحة، وخاصة في التجارب البصرية والكهربائية. بالمقارنة مع CMs من الحيوانات الأخرى ، فإن CMs القوارض أكثر عرضة لنقص التروية ونقص الأكسيا بسبب تركيز أعلى من أيونات الصوديوم داخل الخلايا ، والتي تفضل تدفق الكالسيوم من خلال تبادل Na +/Ca2+ 21. وعلاوة على ذلك، فإن عدد الأجهزة الآلية أقل بكثير من عدد الأجهزة التي يتم رصدها؛ وبالتالي، من الصعب للغاية تحقيق العزلة الناجحة. طريقة Langendorff ممتازة لعزل الفئران VMs22 ، ولكن معدل النجاح في عزل AMs منخفض ، وتتوفر تقارير قليلة. العمق الصحيح من علبة الشريان الأورطي هو أيضا عامل أساسي في إنتاج VMs مثالية بصرف النظر عن درجة الحرارة، ونشاط الانزيم، PH، ونوعية المياه المستخدمة لإعداد العازلة. يعتمد مبدأ طريقة لانغيندورف على التغلغل الرجعي للقلب. عند التغلغل ، يتم إغلاق الصمام الأبهري . وبالتالي ، يتم إجبار اليرفوسات على الشرايين التاجية ، وتقديم محلول الإنزيم من خلال فروع الأوعية ، ويتم هضم أنسجة عضلة القلب بالتساوي. لتحقيق هذا النوع من نمط الدورة الدموية، يجب أن الشريان الأورطي حجز ما يكفي من طول للتكسير وربط، وأيضا تلميح القنية يجب أن لا تخترق الصمامات الأبهري أو منع OSTIUM CA. وبالتالي، فمن المعقول التكهن بأن يرتبط عمق علبة الشريان الأورطي أيضا مع التثاق الأذينية، مما يؤثر على فعالية الهضم من الأذينين وغلة AM بطريقة مماثلة. وأكد البروتوكول المعروض هنا الفرضية، ويلاحظ أدناه اتخاذ خطوات حاسمة لتحسين إنتاج الخلية جنبا إلى جنب مع الاقتراحات.

في الخطوة 1.9، لتأمين الشريان الأورطي بشكل أفضل، ينصح بقنية حادة 20 G مع درجة (أو أخدود محيطي) من حيث المسافة هي 1 مم إلى الطرف. استنادا إلى تجاربنا، تم العثور على حجم القنية التي هي أكبر قليلا من قطر الشريان الأورطي لمنع طرف القنية من ثقب الصمامات الأبهري أثناء التعويل لأن الشريان الأورطي، والاعتماد على مرونته الجوهرية، يمكن أن تندرج بشكل مريح في القنية وإنتاج الاحتكاك، الذي يعمل كعامل وقائي عند التحرك إلى الأمام أو إلى الوراء ضبط عمق التعقيب. من حيث موقف الشق، والقلب سوف تنزلق بسهولة قبالة أثناء العلبة بسبب الجاذبية إذا كان قريبا جدا من طرف القنية. وعلى العكس من ذلك، فإن مساحة لضبط عمق العلبة ووضع الربط تكون محصورة جدا إذا كانت بعيدة جدا. ونظرا لهذه الظروف، فإن تحويل الشريان الأورطي بين الشريان السباتي المشترك الأيسر (كالخط الأخضر في الشكل 2) لضمان أن الشريان الأورطي طويل بما فيه الكفاية ويمكن تعاويذه وربطه في الشريان الأورطي الصاعد هو أفضل في الخطوة 3.3. في حين أن التحول في الشريان الأورطي التصاعدي ، فإن الطول المحجوز للتشجير على الأقل يمكن أن يؤمن طرف القنية بالقرب من الجذر الأبهري ولن يخترق الصمامات الأبهرية بعد الربط. تشريح الشريان الأورطي وقياس المسافة من طرف القنية إلى أوستيوم CA تشير إلى أن تحويل الشريان الأورطي بين الشريان السباتي المشترك الأيسر هو موقف مثالي لتحقيق عمق قنية الشريان الأورطي السليم.

تم العثور على عمق العلبة أن تكون مرتبطة مع التخثر الأذينية، والتي بدورها بمثابة مؤشر العمق. يوضح الشكل 4 أن التشوش الأذيني جيد عندما يكون العمق في الشريان الأورطي الصاعد ، ويتم تضخيم كل من الزوائد الأذينية. ومع ذلك ، فإن التشوه الأذيني غير كاف عندما يكون العمق في (أو يقترب) من الجذر الأبهري ويتم تزيين كل من الزوائد الأذينية. وكان العدد الإجمالي والصالح للتطبيق ل AM الناتج عن الزوائد الأذينية المتضخمة أعلى (الشكل 8). تشير هذه النتائج إلى أن عمق علبة الشريان الأورطي يمكن أن يؤثر على تخثر وهضم الأذينين والزوائد الأذينية بطريقة معينة ويؤثر في النهاية على غلة AM وجودتها. واستدل على أن غلة ونوعية الإمدادات من ال ATRIA ترتبط بتوزيعها. وقد أظهرت دراسة فرنانديز وآخرون.23 شذوذ مختلف في أصل ومسار الماوس CA. وجدوا أن العظام CAs كانت متغيرة للغاية ولم تكن كلها موجودة في الجيوب الأنفية الأبهري. قد تنشأ بعض CAs بشكل شاذ من فوق الجيوب الأنفية الأبهري ، واسمه عالية الاقلاع ostium. قد تنشأ بعض ال CAs من نفس الجيوب الأنفية الأبهري ، و ostium من وعاء الأذين قريب جدا. كما يتفق تشريح الشريان الأورطي في هذه الدراسة (الشكل 10) مع ما توصل إليه فرنانديز. قد يكون هذا هو السبب في محاولات لعزل AM بواسطة أسلوب Langendorff كانت غير ناجحة إلى حد كبير إذا كان عمق cannulation غير مناسب. وهكذا، فإن طرف القنية لديها فرصة أكبر لمنع أوستيوم السفينة الأذين المجاورة للكا ostium إذا لم يكن هناك مساحة كافية متاحة بين طرف القنية و OSTIUM CA. وعلى النقيض من ذلك، فإن التغلغل وغلة الخلية في البطين لم تتأثر إلا بالكاد طالما لم يتم اختراق الصمامات الأبهرية بواسطة طرف القنية. هذا هو على الارجح لأن CAs التي تزود الدم إلى البطين لديها أكبر ostia والمزيد من الأصول. إذا تم انسداد واحد ostium بواسطة القنية، يمكن تعويض تغلغل البطين عن طريق CA آخر أو الدورة الدموية الجانبية، في حين أن الأوعية الدموية التي تزود الأذين صغيرة نوعا ما وليس لديها بديل. وبالتالي ، فإن تأثير العمق في علبة الشريان الأورطي مهم.

يتم سرد عوامل أخرى جديرة بالملاحظة وصعوبة إطلاق النار في عملية الهضم وتخزين الخلايا على النحو التالي. أولا، النظر في perfusing الأوكسجين حل تايرود في الخطوة 4.1 لجعل العقد العضلات وضخ الدم المتبقية إذا لم يتم نقل الدم في الأذين بعد ربط الشريان الأورطي. وهذا يمكن أن يساعد على تجنب التأثير السلبي للca2 + وغيرها من المواد الصادرة من كريات الدم الحمراء التالفة. ثانيا، يمكن أن يؤدي التغلغل في محلول ca2+-free في وقت مبكر لتفكك الاتصال وتوسيع المسافة بين الخلايا إلى تحسين فعالية هضم الإنزيم لأن الأقراص المتشابكة بين CMs هي تقاطعات بين الخلايا تعتمد على الكالسيوم. ومع ذلك، ينبغي أن يقتصر الوقت على 3-5 دقائق لتجنب ظاهرة مفارقة الكالسيوم24. يوصى بمحلول إنزيم مختلط. كولاجيناز نوع الثاني يعطل شبكة مصفوفة خارج الخلية، والتريبسين يساعد على مسح المواد الحبيبية التي لا تزال على سطح الخلية إذا الكولاجيناز الثاني الهضم غير مكتملة. وهذا يضمن سطح الخلية على نحو سلس، وهو أمر بالغ الأهمية لتشكيل ختم GΩ في تسجيل المشبك التصحيح. ومع ذلك، ينبغي السيطرة على تركيز التريبسين في النطاق المناسب لتجنب أكثر من الهضم وإصابة الخلية لأنه يمكن أن تتحلل بروتين الغشاء. استخدام الكولاجين من النوع الثاني وحده لتحسين غلة الخلايا قد يؤدي في كثير من الأحيان إلى الأنسجة على الهضم، وسوف تكون CMs معزولة عدم تحمل الكالسيوم بعد التعرض الكولاجينز لفترات طويلة25. استخدام 2,3-butanedione monoxime (BDM), مادة تمنع الانكماش التلقائي عن طريق تثبيط ATPase الميوسين ومنع تشكيل عبر الجسر, لا يزال مثيرا للجدل26,27,28,29. وفقا للتجربة السابقة، إضافة BDM ضروري لهذا البروتوكول. يتم إعداد محلول الإنزيم مع الحل 1 على الرغم من أن الحل 1 لا يحتوي على الكالسيوم ، ويتم إضافة الكالسيوم لتنشيط الإنزيم. وتشمل الفائدة من إضافة BDM في حل التغلغل (1) تثبيط تقلص الخلايا العضلية والحد من استهلاك الأكسجين أثناء انزيم حل التخبط و (2) منع myocytes من نقص الأكسيجة وتحسين نوعية خلايا الدم المبتزة معزولة. وأفادت بعض الدراسات أن BDM قد يكون لها تأثير سلبي محتمل على الخصائص الكهربائية الخلوية. ومع ذلك ، فإن نتائج تسجيل المشبك التصحيح كامل الخلية من تيار الصوديوم لا تشير إلى تأثير غير مرغوب فيه. في خطوة تخزين الخلية (الخطوة 6) ، اختارت العديد من الدراسات المخزن المؤقت KB ، وهو محلول تركيز البوتاسيوم الخالي من الكالسيوم ولكن عالي ، حيث يمكن للخلايا الحفاظ على حالة أفضل لأنها في ظروف التمثيل الغذائي المستقطبة والمنخفضة. ومع ذلك ، فإن الجليكوكاليك من غشاء الخلية تنفصل عن طبقة ثنائية الدهون في غياب الكالسيوم الخارجي لفترة معينة من الزمن ، وسوف تزيد نفاذية الغشاء ، مما يؤثر على التحليل الوظيفي اللاحق30،31،32.

يمكن تصنيف جميع تقنيات عزل الخلايا العضلية بشكل أساسي حاليا إلى عملية هضم إما قطعة (قطعة صغيرة من الأنسجة) في محلول أنزيمي أو تشويش CA مع محلول أنزيمي (التشوش Langendorff)22. بالمقارنة مع طريقة Langendorff ، فإن طريقة هضم القطعة أسهل في الأداء وتستخدم أيضا بشكل روتيني لعزل CMs في العديد من المختبرات. ومع ذلك، تنتج هذه الطريقة عادة غلة منخفضة من CMs ذات نوعية رديئة من الأنسجة البالغة22. وعلاوة على ذلك، قد لا تكون الخلايا المعزولة بهذه الطريقة مناسبة لإجراء تجارب مقارنة. على سبيل المثال، عند اختبار آثار المخدرات نوع الخلية الخاصة بين AM و VM، لا يمكن إهمال تأثير ظروف العزل المختلفة أو استبعادها. وذلك لأن عضلة القلب وكثافة الأنسجة في البطين هي أكثر سمكا وكثافة بكثير من الأذين، مما أدى إلى اختلاف أوقات الهضم وتركيزات الانزيم. وعلاوة على ذلك، فإن الانفعالات المفرطة والأنابيب من الأنسجة أثناء الهضم تلف الخلايا وتؤثر بشكل كبير على الدراسات الوظيفية. وعلاوة على ذلك، أظهرت العديد من الدراسات السابقة أن AMs أكثر عرضة للكالسيوم. ومع ذلك، يمكن أن تكون AMs المعزولة من قبل البروتوكول الحالي متسامحة مع إعادة إدخال الكالسيوم المتدرجة ربما لأن الأنسجة من السهل تمزقها في نهاية عملية الهضم. وبالتالي ، فإن الضرر الميكانيكي أقل ، في حين أن الخلايا ستعاني من أضرار ميكانيكية أكثر حيث تحتاج خطوات طريقة القطع إلى تمزق متكرر وطرد مركزي. وفي الآونة الأخيرة، أبلغ آكرز وآخرون.33 عن طريقة مبسطة وخالية من لانغيندورف لعزل الخلايا العضلية القلبية وغير الخلايا غير العضلية القابلة للحياة. يمكن عزل VMs والخلايا الليفية بشكل فعال ، ولكن لم يتم ذكر كمية AMs. ومع ذلك، يحتوي هذا البروتوكول على عدة قيود. أولا، قد يكون توزيع الأوعية الدموية القلب الاختلافات للاختلافات الفردية وسلالة الفئران، وعمق العلبة الموصى بها لا يمكن أن تضمن عزل AMs ناجحة في كل مرة. ثانيا، بالنسبة لأولئك الذين هم جديدة على هذا الإجراء قد يستغرق قدرا معينا من الوقت لممارسة إعادة شفط الشريان الأورطي والتكميل الشريان الأورطي الرجعية. وأخيرا، لم يتم اختبار هذه الطريقة في نماذج أمراض القلب الأخرى إلا في الفئران السليمة والمسنين. وبالتالي ، فإنه يتطلب تعديلات في تركيزات الانزيم ووقت الهضم بسبب مدى تليف القلب. لن يكون عيب ظروف الهضم المختلفة التي تواجهها طريقة قطعة مشكلة في طريقة Langendorff التي يتم توزيع محلول الانزيم بالتساوي على الأنسجة بواسطة أسرة السفينة.

وباختصار، أظهرت بروتوكولات العزل المتزامن للتشكيلة المتزامنة بين AM و VM الموصوفة هنا أن عمق علبة الشريان الأورطي المناسب يمكن أن يحسن بشكل فعال من تغلغل الأذين وغلة AM. و CMs معزولة بهذه الطريقة هي ذات جودة عالية، وتمتلك التسامح الكالسيوم جيدة، وقد تم تطبيقها بنجاح لتسجيل المشبك التصحيح والتعامل مع الكالسيوم (Ca2 + الافراج وقياس موجة Ca2 + من قبل نظام IonOptix) في team34. ومن المتوقع أن بروتوكول العزل يمكن استخدامها لإعداد الخلايا في سلسلة من التحقيقات الخلوية ودون الخلوية، والتي سوف تساعد على تعميق فهم فسيولوجيا القلب وعلم الأمراض. والأهم من ذلك، أنه سيمكن من اكتشاف آليات أكثر ملاءمة سريريا لأمراض القلب وطرق التدخل.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل منح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 81770322، 81870244، 81500254، 81870243، 81470465) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (رقم 7192051). مساهمات المؤلف: قام باي وليو بتصميم المشروع وتصوره. وقدم ون وروان نصائح قيمة للتجارب . قام وو ولينلينغ لى بالعمل التجريبى ولعبا دورا رئيسيا فى الحصول على البيانات وتحليلها وتفسيرها . شارك لى فى تجميع جهاز لانجيندورف . وقد شارك بنغ وتشانغ ووانغ ويانغ فى اعداد الكواشف والحلول قبل التجربة . وو كتب المقال.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2,3-butanedione monoxime (BDM) Sigma-Aldrich 31550
Bull Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Collagenase type II Worthington 43D14160
Excel data acquisition and analysis
Fetal Bovine Serum (FBS) Zhejiang Tianhang Biotechnology 150207
Glucose Sigma-Aldrich G7528
HEPES Sigma-Aldrich H3375
HEPES Sigma-Aldrich H3375
KCl Sigma-Aldrich P9333
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
KHCO3 Sigma-Aldrich 237205
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
MgSO4 Sigma-Aldrich M7506
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S7907
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761
Origin 8.5 OriginLab, Northampton, MA,US data acquisition and analysis
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
Sodium pentobarbital Shanghai Reagent Factory 810923
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Trypan blue Solarbio C0040
Trypsin Invitrogen 15090046
Water bath JULABO ED (v.2)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mahmood, S. S., Levy, D., Vasan, R. S., Wang, T. J. The framingham heart study and the epidemiology of cardiovascular diseases: a historical perspective. Lancet. 383 (9921), London, England. 999-1008 (2014).
  2. Olejnickova, V., Novakova, M., Provaznik, I. Isolated heart models: cardiovascular system studies and technological advances. Medical & Biological Engineering & Computing. 53 (7), 669-678 (2015).
  3. Guinamard, R., Hof, T., Sallé, L. Current recordings at the single channel level in adult mammalian isolated cardiomyocyte. Methods in Molecular Biology. 1183, 291-307 (2014).
  4. Santana, L. F., Kranias, E. G., Lederer, W. J. Calcium sparks and excitation-contraction coupling in phospholamban-deficient mouse ventricular myocyte. The Journal of Physiology. 503, Pt 1 21-29 (1997).
  5. Chou, C. C., et al. Intracellular calcium dynamics and anisotropic reentry in isolated canine pulmonary veins and left atrium. Circulation. 111 (22), 2889-2897 (2005).
  6. Brittsan, A. G., et al. Chronic SR Ca2+-ATPase inhibition causes adaptive changes in cellular Ca2+ transport. Circulation Research. 92 (7), 769-776 (2003).
  7. Mohler, P. J., et al. Ankyrin-B mutation causes type 4 long-QT cardiac arrhythmia and sudden cardiac death. Nature. 421 (6923), 634-639 (2003).
  8. Paigen, K. A miracle enough: the power of mice. Nature medicine. 1 (3), 215-220 (1995).
  9. Ni, L., et al. Atrial-specific gene delivery using an adeno-associated viral vector. Circulation Research. 124 (2), 256-262 (2019).
  10. Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. Mouse models of cardiac arrhythmias. Circulation Research. 123 (3), 332-334 (2018).
  11. Jian, Z., et al. In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models. PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).
  12. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51357 (2014).
  13. Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments JoVE. (79), e50289 (2013).
  14. Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51109 (2014).
  15. Motayagheni, N. Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia. MethodsX. 4, 508-512 (2017).
  16. Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50145 (2013).
  17. Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51823 (2014).
  18. Plačkić, J., Kockskämper, J. Isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes for in vitro studies. Methods in Molecular Biology. 1816, 39-54 (2018).
  19. Andrade, J., Khairy, P., Dobrev, D., Nattel, S. The clinical profile and pathophysiology of atrial fibrillation: relationships among clinical features, epidemiology, and mechanisms. Circulation Research. 114 (9), 1453-1468 (2014).
  20. Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
  21. Bers, D. M. Cardiac Na/Ca exchange function in rabbit, mouse and man: what's the difference. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 34 (4), 369-373 (2002).
  22. Chen, X., O'Connell, T. D., Xiang, Y. K. With or without Langendorff: a new method for adult myocyte isolation to be tested with time. Circulation Research. 119 (8), 888-890 (2016).
  23. Fernández, B., et al. The coronary arteries of the C57BL/6 mouse strains: implications for comparison with mutant models. Journal of Anatomy. 212 (1), 12-18 (2008).
  24. Zimmerman, A. N., Hulsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211 (5049), 646-647 (1966).
  25. Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult ventricular cardiomyocytes: isolation and culture. Methods in Molecular Biology. 290, 305-314 (2005).
  26. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).
  27. Hall, A. R., Hausenloy, D. J. Mitochondrial respiratory inhibition by 2,3-butanedione monoxime (BDM): implications for culturing isolated mouse ventricular cardiomyocytes. Physiological Reports. 4 (1), 12606 (2016).
  28. Scaduto, R. C. Jr, Grotyohann, L. W. 2,3-butanedione monoxime unmasks Ca (2+)-induced NADH formation and inhibits electron transport in rat hearts. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 279 (4), 1839-1848 (2000).
  29. Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na (+)/Ca (2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. British Journal of Pharmacology. 132 (6), 1317-1325 (2001).
  30. Benndorf, K., Boldt, W., Nilius, B. Sodium current in single myocardial mouse cells. European Journal of Physiology. 404 (2), 190-196 (1985).
  31. Fiset, C., Clark, R. B., Larsen, T. S., Giles, W. R. A rapidly activating sustained K+ current modulates repolarization and excitation-contraction coupling in adult mouse ventricle. The Journal of Physiology. 504, Pt 3 557-563 (1997).
  32. Isenberg, G., Klockner, U. Calcium tolerant ventricular myocytes prepared by preincubation in a "KB medium". European Journal of Physiology. 395 (1), 6-18 (1982).
  33. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
  34. Jiang, L., et al. Ibrutinib promotes atrial fibrillation by inducing structural remodeling and calcium dysregulation in the atrium. Heart Rhythm. 16 (9), 1374-1382 (2019).

Tags

الطب، العدد 171، خلايا القلب، العزلة، لانغيندورف، فأرة الكبار، الخلايا العضلية الأذينية، الخلايا العضلية البطينية، التشريح، العلبة، العمق، وضع الربط
تعديلات على طريقة Langendorff لعزل المتزامنة من الخلايا العضلية الأذيني والبطيني من الفئران الكبار
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, K., Li, L. L., Li, Y. K., Peng,… More

Wu, K., Li, L. L., Li, Y. K., Peng, X. D., Zhang, M. X., Liu, K. S., Wang, X. S., Yang, J. X., Wen, S. N., Ruan, Y. F., Liu, N., Bai, R. Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice. J. Vis. Exp. (171), e62514, doi:10.3791/62514 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter