애플 펄프에서 플루오-4/AM으로 세포질 Ca²⁺ 염색

Summary

사과 펄프 세포의 분리된 전형세포는 세포질 Ca²⁺ 농도를 검출하기 위해 칼슘 형광 시약으로 적재되었다.

Abstract

사이토솔릭 Ca^2+는 식물 개발에 중요한 역할을 합니다. 칼슘 이미징은 세포질에서 Ca^2+의 동적 변화를 감지하는 가장 다양한 방법입니다. 이 연구에서는 효소 가수분해에 의해 펄프 세포의 생존 가능한 전도를 얻었습니다. 격리된 프토프러스트들은 37°C에서 30분 동안 소분자 형광 시약(Fluo-4/AM)으로 배양되었다. 형광 프로브는 성공적으로 염색 된 세포색 Ca^{2 +} 그러나 vacuoles에 축적되지 않았습니다. La^3+,Ca²⁺ 채널 차단제, 세포질 형광 강도 감소. 이러한 결과는 Fluo-4/AM이 과일 육체에서 세포색 Ca^2+의 변화를 감지하는 데 사용될 수 있음을 시사합니다. 요약하자면, 우리는 과일의 살 세포로부터 프톱서를 효과적으로 분리하고 펄프 세포의 세포질에 소분자 칼슘 형광 시약을 적재하여 Ca^2+를 검출하는 방법을 제시한다.

Introduction

Ca²⁺ 식물 신호 변환 및 신진 대사 에 중요 한 역할을^1,2. 또한, 저장^5,6동안 경도, 당도 및 생리장애에 대한 감수성을 포함한 과일 품질 특성^3,4를조절한다. 세포질 Ca²⁺ 신호 변환에 중요 한 역할을 하 고 식물 성장 및 개발을 조절^7. 세포칼슘 항상성의 교란은 사과^8,배^9의갈색 반점 질환,^{토마토(10)의}배부패에 쓰라린 구덩이를 유도할 수 있으며, 과일 품질에 영향을 미치고 심각한 경제적 손실을 유발할 수^{있다 3,11.} 칼슘 이미징은 충분한 공간 적 및 시간적 해상도를 가지며 살아있는 세포^12,13에서Ca²⁺ 역학을 관찰하는 중요한 방법입니다.

현재, 살아있는 세포에서 세포내 칼슘 이미징을 위한 두 가지 주요 방법이 있다: 하나는 화학적 소분자 형광^{프로브(14)를}채택하고, 다른 하나는 유전자 인코딩 센서(GECI)^15,16이다. 과일 나무에 안정적인 형질 전환 시스템을 확립하고 더 긴 과일 발달의 어려움을 감안할 때, GECI_S는 과일 Ca^{2 +} 형광 화상 진찰에 적합하지 않습니다.

플루오-4/AM과 같은 소분자 형광 프로브는 특별한 장점이 있습니다: 그들의 AM 에스테르 형태(세포 투과성 아세톡시메틸 에스테르 유도체)는 형질, 급속및 비 세포독성^17을만드는 형질이 없는 살아있는 세포에 쉽게 대량으로 적재될 수 있다. 플루오-4/AM은 피루스 피리폴리아^18과 페투니아,^19의 꽃가루 튜브에 성공적으로 적재될 수 있을 뿐만 아니라 가드^셀(20)과 아라비도시스(21)의루트 모발에 탑재될 수 있다.

현재, 펄프^{세포(22)의}칼슘 형광 염색에 대한 보고는 거의 없다. 중요한 미네랄 요소로서 칼슘은 사과와 같은 나무 과일의 성장과 품질 관리에 중요한 역할을 합니다. 사과 나무는 전 세계적으로 중요한 경제 종으로 인식되고, 사과는 건강한 음식으로 간주됩니다^23. 이 연구에서는 효소 가수분해를 통해 사과 과일 펄프에서 실행 가능한 전도를 얻은 다음 소분자 형광 시약을 세포질에 로드하여 Ca^2+를검출했습니다.

Protocol

1. 프토플라스트 추출

1. 기본 용액 준비: 20 mM CaCl_2,5 mM 2-(N-morpholino)에탄술포닉산, 0.4 M D-소르비톨.
   참고: 기본 용액의 pH는 0.1M Tris 버퍼로 5.8로 조정되고 0.22 μm 수용성 필터를 통해 여과하고 4°C에 저장하였다.
2. 효소 용액 준비: 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 및 0.5%(w/v) 셀룰라아제 R-10을 기본 솔루션과 함께 혼합합니다.
3. 1.5mL 원심분리기 튜브에 0.5mL의 효소 용액을 추가합니다. 건강하고 잘 익은 사과를 선택하십시오. 그런 다음 펄프를 10 x 5 x 1mm³ 크기(그림 1A-1C)로슬라이스합니다.
4. 사과 과일 펄프 조각을 효소 용액을 함유한 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣은 다음튜브(그림 1D)를닫습니다.
5. 1 h에 대 한 28°C에서 튜브를 배양 하 고 어둠 속에서 셰이커에서 70 rpm/min에서 흔들.
6. 펄프 조각을 씻으시면 됩니다. 모든 효소 솔루션을 흡인한 다음 기본 솔루션의 0.5mL를 추가합니다.
7. 실온에서 2 분 동안 300 x g의 원심 분리기.
8. 프토플라스트 서스펜션을 얻으려면 원심분리관의 바닥에서 용액을 흡인한다(도1E).

2. 소분자 칼슘 이온 형광 염색

1. 플루오-4/AM 로딩 솔루션을 1:1:2비율로 2mM 플루오-4/AM, 20% F-127, 10배 인산완충식(PBS:80m MM Na₂HPO_4,1.36M NaCI, 20mM KH₂PO_4,26mM KCI)으로 준비한다.
2. 플루오-4/AM 로딩 용제 1μL을 1.5mL 원심분리기 튜브에 존재하는 프토플라스트 서스펜션의 99 μL에 추가합니다. 형광염의 최종 농도가 5 μM인지 확인하십시오.
3. La³⁺ 처리: 프토플라스트 서스펜션의 98 μL, 10mM La³⁺ 1 μL, 플루오-4/AM 로딩 솔루션 1μL로 100 μM La³⁺용액을 준비합니다. 용액을 섞고 튜브를 닫습니다.
4. 어둠 속에서 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
5. 상온에서 2 분 동안 300 x g에서 원심 분리로 프토플라스트를 씻으시면 됩니다. 용액의 70 μL을 흡인하고 기본 용액의 70 μL을 추가합니다.
6. 37°C에서 37°C의 프로토프스트 서스펜션을 30분 동안 배양하여 완전히 스테스테리프를 제거합니다.
7. 프토플라스트 서스펜션의 15 μL을 흡인하고 슬라이드에 떨어뜨립니다.
8. 형광 현미경(보충 도서 S1)에서관찰하십시오.
   참고: 3.45 μm 픽셀 해상도의 3.2 MP(2048 x 1536) CMOS 센서와 같은 고감도컬러 카메라를 사용합니다.
9. 이미징(20x)을 위해 GFP 채널을 선택합니다. 밝기를 0.5로 설정합니다.
   참고: 조명은 통합 된 하드 코팅 필터 세트와 조절 강도 LED 라이트 큐브입니다. 플루오-4/AM의 흥분 파장은 490 nm입니다.

3. 확률 성생존 분석

1. 플루오레세인 디아세테이트(FDA) 재고 용액 준비: 최종 농도가 1 mg/mL가 될 때까지 아세톤에 FDA를 용해하십시오.
2. 주식 용액 의 1 μL 및 아세톤의 99 μL로 FDA 작업 솔루션을 준비하십시오.
3. 99 μL의 프토플라스트 서스펜션에 FDA 작동 솔루션 1μL을 추가합니다. 위아래로 파이프팅하여 용액을 섞은 다음 튜브를 닫습니다.
   참고: FDA의 최종 농도는 100 μg/L입니다.
4. 어둠 속에서 5 분 동안 실온에서 얼룩.
5. 슬라이드를 준비하고 형광 현미경으로 관찰하십시오.
6. 이미징을 위한 GFP 채널을 선택합니다(그림1F).

4. 이미지 분석

1. 이미지 분석 및 스프레드시트 소프트웨어(예: 이미지 프로 플러스 및 Excel 2010)를 사용하여 획득한 이미지를 분석합니다.
2. 형광강도(보충 도서 S2)를계산하기 위해 프톱서스트에서 두 개의 수직 직경을 선택합니다. 다른 치료하에서 모든 프토플라스트의 형광 강도를 측정하여 측정했습니다. 최종 처리를 위해 사진 편집 소프트웨어를 사용합니다.

5. 통계 분석

1. 통계소프트웨어(보충 도S3)를사용하여 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 평균 ± SD에 표시됩니다. 학생의 t-시험은실험 그룹 간의 차이점을 분석하는 데 사용되었습니다.

Representative Results

상술한 프로토콜에 따라, 우리는 펄프(도1)로부터실행 가능한 프톱라스트를 얻기 위해 효소 방법을 사용했다. 일부 프톱라스에는 바쿨올레가 있었고, 다른 프로토프라스는 그렇지 않았다. Protoplasts는 Ca²⁺ 형광 표시등이 그(것)들에 로드되지 않았을 때 형광을 전시하지 않았습니다. 플루오-4/AM이 프토플라스트에 적재되었을 때, 세포질은 바쿨올이 아닌 형광이되었다(그림 2). 이 결과는 Fluo-4/AM이 세포질에서 Ca²⁺ 를 성공적으로 염색하고 구획화가 관찰되지 않았다는 것을^24로나타냈습니다. 프토플라스트는 FDA로 5분 동안 염색되었고 세포질 형광을 보였습니다. 이것은 고온 (37 °C)이 확률 생존에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타냈다.

La^3+,Ca²⁺ 채널^25의차단 에이전트, 플루오-4/ AM 프롬서스트에 로드 될 때 추가 되었습니다. 100 μM에서, 라³⁺ 칼슘 형광 강도 감소(그림 3).

도 1: 효소 가수 분해에 의해 얻은 프로토프스트. (A)조각은 성숙한 사과에서 절단되었다. (B)프토플라스트는 펄프 조각에서 추출하였다. (C)펄프는 10× 5 × 1mm^3개로 절단하였다. (D)펄프 조각은 0.5mL 효소 용액을 함유한 원심분리기 튜브에 배치되었다. (E)프토플라스트. 애로우헤드는 프톱서스트를 가리키고 화살표는 프톱서스트의 바쿠올을 나타냅니다. (F)프루프라스는 실온에서 5분 동안 FDA로 염색하였다. (이 수치는 참조 ²² [원예 연구: 말루스 국산의살 조직 세포에서 칼슘을 검출하기 위해 칼슘 형광 프로브를 프토프러스스트로 적재]에서 수정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 플루오-4/AM 및 La^3+를 프토플라스트에 로딩합니다. (A)제어: 적재된 형광 프로브가 없는 그대로 프토플라스트. (B)플루오-4/AM로 로드된 프토플라스트. (C)라³⁺ 프토플라스트플루오-4/AM로드 되었을 때 추가 되었습니다. La^3+의 최종 농도는 100 μM이었습니다.

그림 3: 전도체의 형광 강도의 통계 적 분석. 학생의 t-테스트(P <0.001)에 따라 상당한 차이를 나타냅니다. 세로 막대는 ± SD를 나타냅니다. 각 데이터 포인트는 20개의 프토플라스트의 평균을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도서 S1: 형광 현미경. (A)형광 현미경의 전반적인 출현. (B)설정 페이지. 20배 목표, GFP 채널을 선택하고 밝기를 0.5로 균일하게 조정합니다. (C)형광 암송 영역. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도서 S2: 과일 세포의 프토프라스트에서 Ca²⁺ 형광 강도를 계산하는 데 사용되는 단계. 이 연구에서 사용되는 형광 강도 단위는 이전 보고서^{26,27,28,29에기초한다.} 계산 과정은 다음과 같습니다:(A)소프트웨어에서 프토프스트플루언스 형광 이미지를 엽니다. 측정 도구를 클릭합니다. 드롭다운 메뉴에서 프로필 줄을 선택합니다. (B) 선 프로파일 창에서 원을 선택합니다. 이 것을 사용하여 프톱라스트에서 타원을 그립니다. (C) 선 프로필 창에서 이제 파일 | 선택 내보내기 데이터 (D) 데이터 내보내기를클릭하여 빈 스프레드시트를 열고 데이터를 가져오는지 확인합니다. '평균' 함수를 사용하여 평균 형광 강도를 계산합니다. 각 치료는 각각 20 개 이상의 프토플라스트로 세 번 반복되었다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 S3: 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 데이터 통계가 수행되었습니다. 데이터를 테이블에 붙여넣고 데이터 분석을 위해 분석하려면 클릭합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도면 S4 : 사과의 다른 품종의 펄프에서 프탑서스트의 추출. (A)두난. (B)꿀 크리스프. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구에서는, 생존 성 전도는 효소 가수 분해에 의해 얻어졌다. 이 방법은 신선한 사과를 필요로합니다. 본 프로토콜은 연구 연구에 사용하기 위해 과일 펄프에서 많은 수의 프토플라스트를 신속하게 격리할 수 있게 합니다. 이 방법의 적용가능성은 '후지'에 만전을 기하지 않습니다. '두난'과 '꿀 크리스프'의 사과 펄프의 프톱스트도 동일한프로토콜(보충 도면 S4)을통해 추출할 수 있다. enzymolysis 후 프로토프스트 용액은 세포 파편을 포함, 이는 이전 방법에 비해 다소 향상되었다. 필수 세포 재료로서, 사과 펄프 프롬프는 세포 단백질 발현 기술, 단세포 염기서열 분석 및 기타 연구에 사용될 수 있다.

식물^{세포(30)에서}화학형 성소 시약 염색에 관한 많은 방법이 있다. 예를 들어, 플루오-3/AM은 저온(4°C)으로 적재되어 루트 팁^셀(31)을입력하였다. 플루오-3/AM은 또한 꽃가루^{튜브(32)에}고온(37°C)으로 적재될 수 있다. 플루오-4/AM은 피루스 피리폴리아(25°C 15분)와 아라비도시스의 뿌리 모발(30분 동안 4°C)의 꽃가루튜브에 성공적으로 적재하였다. 그러나, 이러한 방법은 사과 펄프 프롬프스트를 염색하는 데 적합하지 않다. 이 연구에서는 형광 프로브를 고온(37°C)에서 프톱서스트에 성공적으로 적재했습니다. 또한, 본 방법은 간단하고 빠르며 정확하며, 프토프스트 활력에 영향을 미치지 않는다. 제안된 방법의 중요한 단계는 스테인드 프톱을 세척하고 30 분 동안 배양하는 것입니다. 염색 후, 프톱서스트를 세척해야 합니다. 세척은 관찰 중에 배경 형광을 감소하여 프톱서스트의 형광 강도를 보다 정확하게 계산할 수 있습니다. 30분 동안 배양하여 더 많은 프로브를 프톱서스트에 로드할 수 있도록 합니다. 적재 시 광 노출을 방지하는 것이 필수적입니다.

La^3+는 Ca²⁺를 연구하는 중요한 도구입니다. 그것은 Mg에 결합²⁺ 세포질 막 Ca에 촉매 사이트²⁺+ATPase, 따라서 Ca의 꾸준한 상태 회전율을 억제²⁺-ATPase 및 차단 Ca²⁺ transmembrane 기능^34. La³⁺ 치료는 세포질 Ca²⁺감소, 플루오-4/AM은 다른 이원성 양이온의 간섭을 배제하고 화학 형광 시약의 타당성을 확인하는 이 변경을 반영할 수 있었습니다.

이 로딩 방법은 다른 방법보다 더 많은 이점을 제공하지만 데이터 결과를 변환할 때 더 개선되어야 합니다. 여기서, 우리는 상량보다는 질적 데이터인 프루프의 형광 값을 검출하여 상대적인 세포질 Ca²⁺ 함량을 추정했습니다. 따라서, 향후 연구에서 염색 결과를 특정 세포질 Ca²⁺ 콘텐츠로 변환하는 것이 특히 중요하며, 이는 과일 Ca²⁺ 시그널링을 분석하기 위한 연구 기반을 제공할 수 있습니다.

요약하자면, 본원에 기재된 방법은 사과 펄프 세포에서 세포질 Ca^2+를 검출할 수 있으며, 이에 따라 과일 펄프 세포 칼슘의 관련 연구에 대한 기술적 지원을 제공한다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.