מכתים את הציטופלסמי Ca²⁺ עם פלואו-4/AM בעיסת תפוחים

Summary

פרוטופלסטים מבודדים של תאי עיסת תפוחים היו טעונים עם ריאגנט פלואורסצנטי סידן כדי לזהות ריכוז ציטופלסמי Ca^{2 +} .

Abstract

Cytosolic Ca^{2 +} ממלא תפקיד מפתח בפיתוח הצמח. הדמיית סידן היא השיטה המגוונת ביותר לזיהוי שינויים דינמיים ב- Ca²⁺ בציטופלסמה. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא של תאי עיסת על ידי הידרוליזה אנזימטית. פרוטופלסטים מבודדים דוגרו עם ריאגנט פלואורסצנטי מולקולה קטנה (פלואו-4/AM) במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F). הבדיקות הפלואורסצנטיות הכתימו בהצלחה את Ca²⁺ הציטוזולי, אך לא הצטברו בווליות. La³⁺, חוסם ערוץ Ca²⁺ , ירד עוצמת פלואורסצנטיות ציטופלסמית. תוצאות אלה מציעות כי Fluo-4/AM ניתן להשתמש כדי לזהות שינויים Ca ציטוטוסולי^{2 +} בבשר הפרי. לסיכום, אנו מציגים שיטה לבודד ביעילות פרוטופלסטים מתאי בשר של הפרי ולזהות Ca²⁺ על ידי טעינת ריאגנט סידן פלואורסצנטי במולקולה קטנה בציטופלסמה של תאי עיסת.

Introduction

Ca^{2 +} ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות צמחים ומטבוליזם^1,2. כמו כן, הוא מסדיר תכונות איכות פירות^3,4 , כולל^קשיות,תכולת הסוכר, ורגישות להפרעות פיזיולוגיות במהלך אחסון^5,6. ציטופלסמי Ca²⁺ ממלא תפקיד חשוב בהעברת אותות ומווסת את צמיחת הצמח ופיתוח⁷. הפרעה של הומאוסטזיס סידן הסלולר יכול לגרום לבור מר בתפוחים⁸, מחלת כתם חום באגסים⁹, וריקבון טבור בעגבניות¹⁰, המשפיעים על איכות הפרי וגורמים להפסדים כלכליים חמורים^3,11. להדמיית סידן יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית מספקת והיא שיטה חשובה להתבוננות בדינמיקה Ca²⁺ בתאים חיים^12,13.

נכון לעכשיו, ישנן שתי שיטות עיקריות להדמיית סידן תאי בתאים חיים: האחת משתמשת בבדיקות פלואורסצנטיות קטנות-מולקולריות כימיות¹⁴, והשנייה היא חיישן קידוד הגנים (GECI)^15,16. בהתחשב בקושי להקים מערכת מהונדסת יציבה בעצי פרי ופיתוח פירות ארוך יותר, GECI_S אינו מתאים להדמיית פלואורסצנטיות של פירות Ca²⁺ .

למולקולות פלואורסצנטיות קטנות כגון Fluo-4/AM יש יתרון מסוים: צורת אסתר AM שלהן (נגזרת אסתר אצטוקסימתיל חדיר לתא) יכולה להיות נטענת בקלות בתפזורת לתאים חיים ללא צורך בהדבקה, מה שהופך אותה לגמישה, מהירה ולא ציטוקסית¹⁷. Fluo-4/AM יכול להיות טעון בהצלחה לתוך צינור האבקה של Pyrus pyrifolia¹⁸ ו Petunia,^19, כמו גם לתוך תאי שמירה²⁰ ושיער שורש של Arabidopsis²¹.

נכון לעכשיו, ישנם דיווחים מעטים על הכתמת פלואורסצנטיות סידן של תאי עיסת²². כאלמנט מינרלי חשוב, סידן ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה ובקרת האיכות של פירות עץ כגון תפוחים. עצי תפוח מוכרים ברחבי העולם כמין כלכלי חשוב, ותפוחים נחשבים למזון בריא²³. במחקר זה, השגנו פרוטופלסטים קיימא מעיסת פירות תפוחים דרך הידרוליזה אנזימטית ולאחר מכן העמסנו ריאגנטים פלואורסצנטיים של מולקולות קטנות לתוך הציטופלסמה כדי לזהות Ca^{2 +}.

Protocol

1. מיצוי פרוטופלסט

1. הכן את הפתרון הבסיסי: 20 mM CaCl₂, 5 mM 2-(N-מורפולינו)חומצה אתנולפונית, ו 0.4 M D-סורביטול.
   הערה: ה- pH של הפתרון הבסיסי הותאם ל- 5.8 עם חיץ טריס של 0.1 M, סונן באמצעות מסננים מסיסים במים בגודל 0.22 מיקרומטר ואוחסנו ב- 4 °C (70 °F).
2. הכן את הפתרון אנזימטי: לערבב 0.3%(w/v) Macerozyme R-10 ו 0.5%(w/v) cellulase R-10 עם הפתרון הבסיסי.
3. הוסף 0.5 מ"ל של פתרון אנזימטי לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. בחר תפוח בריא ובשלות. לאחר מכן פורסים את עיסת 10 x 5 x 1 מ"מ³ גודל(איור 1A-1C).
4. מניחים את חתיכות עיסת פירות התפוח לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל פתרון אנזימטי ולאחר מכן לסגור את הצינור(איור 1D).
5. לדגור על הצינור ב 28 °C (50 °F) במשך 1 שעות, רועד ב 70 סל"ד / דקה בשייקר בחושך.
6. לשטוף את חתיכות עיסת. שאף את כל הפתרון אנזימטי ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של הפתרון הבסיסי.
7. צנטריפוגה ב-300 על גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר.
8. כדי להשיג השעיה protoplast, לשאוף את הפתרון מתחתית צינור הצנטריפוגה(איור 1E).

2. כתמי פלואורסצנטיות של יון סידן במולקולה קטנה

1. הכן את פתרון הטעינה פלו-4/AM עם 2 mM Fluo-4/AM, 20% F-127, 10x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS:80 mM Na₂HPO₄, 1.36 M NaCI, 20 mM KH₂PO₄ו 26 מ"מ KCI) ביחס של 1:1:2.
2. הוסף 1 μL של פתרון טעינה Fluo-4/AM 99 μL של השעיית protoplast הנוכחי בצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. ודא כי הריכוז הסופי של צבע פלואורסצנטי הוא 5 מיקרומטר. לערבב את הפתרון ולאחר מכן לסגור את הצינור.
3. La³⁺ טיפול: הכן פתרון 100 μM La³⁺ עם 98 μL של ההשעיה protoplast, 1 μL של 10 mM La^{3 +}, ו 1 μL של פתרון טעינה Fluo-4/AM. מערבבים את הפתרון וסוגר את הצינור.
4. דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בחושך.
5. לשטוף את הפרוטופלסטים על ידי צנטריפוגה ב 300 x g במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. לשאוף 70 μL של הפתרון ולהוסיף 70 μL של הפתרון הבסיסי.
6. לדגור על השעיית protoplast ב 37 °C (37 °F) במשך 30 דקות כדי לבטל לחלוטין את esterify.
7. שאפו 15 μL של השעיית protoplast ולטפטף על שקופית.
8. שימו לב תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי(איור משלים S1).
   הערה: השתמש במצלמת צבע עם רגישות גבוהה, כלומר חיישן CMOS של 3.2 מגה-פיקסל (2048 x 1536) עם רזולוציה של 3.45 מיקרומטר פיקסלים.
9. בחר את ערוץ GFP להדמיה (20x). הגדר את הבהירות ל- 0.5.
   הערה: תאורה היא קוביות תאורת LED בעוצמה מתכווננת עם ערכת מסננים משולבת בציפוי קשיח. אורך גל העירור של פלואו-4/AM הוא 490 ננומטר.

3. בחן הכדאיות של הפרוטופלסט

1. הכן את פתרון מלאי פלואורסין דיקטאט (FDA): להמיס את ה-FDA אצטון עד הריכוז הסופי הוא 1 מ"ג/ מ"ל.
2. הכן את פתרון העבודה של ה-FDA עם 1 μL של פתרון המלאי ו 99 μL של אצטון.
3. הוסף 1 μL של פתרון עבודה ה-FDA 99 μL של השעיית protoplast. מערבבים את הפתרון על ידי צנרת למעלה ולמטה ולאחר מכן לסגור את הצינור.
   הערה: הריכוז הסופי של ה-FDA הוא 100 מיקרוגרם / L.
4. כתם בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות בחושך.
5. הכן את השקופיות והתבונן תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
6. בחר בערוץ GFP להדמיה (איור 1F).

4. ניתוח תמונה

1. נתח את התמונות שנרכשו באמצעות ניתוח תמונות ותוכנות גיליון אלקטרוני (למשל, Image-Pro Plus ו- Excel 2010).
2. בחר שני קטרים אנכיים מהפרוטופלסטים כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות(איור משלים S2). מדד את עוצמת הפלואורסצנטיות של כל הפרוטופלסטים תחת טיפולים שונים נמדד. לעיבוד סופי, השתמש בתוכנת עריכת תמונות.

5. ניתוח סטטיסטי

1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנה סטטיסטית (איור משלים S3). הנתונים מוצגים ב- Mean ± SD. מבחן ה-tשל התלמיד שימש לניתוח ההבדלים בין קבוצות הניסוי.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל, השתמשנו בשיטה אנזימטית כדי להשיג פרוטופלסטים ברי קיימא מהעיסה (איור 1). לחלק מהנורות היו חלילות, בעוד שאחרים לא. בעוד הפרוטופלסטים לא הראו פלואורסצנטיות כאשר מחוון הפלואורסצנטי Ca^{2 +} לא נטען לתוכם. כאשר פלואו-4/AM הועמס לתוך הפרוטופלסטים, הציטופלסמה, אך לא החלול, הפכה לפליאואורסצנטית(איור 2). תוצאה זו הצביעה על כך Fluo-4/AM בהצלחה מוכתם Ca^{2 +} בציטופלסמה וכי לא נצפתה מידור²⁴. פרוטופלסטים היו מוכתמים עם ה-FDA במשך 5 דקות והראו פלואורסצנטיות ציטופלסמית. זה הצביע על כך טמפרטורה גבוהה (37 °C (37 °F) אינו משפיע על הכדאיות protoplast.

La³⁺, סוכן חסימה של Ca 2 + ערוץ^{25, נוסף}כאשר Fluo-4/AM הועמס לתוך protoplasts. ב 100 מיקרומטר, La^{3+ ירד} עוצמת פלואורסצנטיות סידן(איור 3).

איור 1: פרוטופלסטים שהושגו על ידי הידרוליזה אנזימטית. (א)חתיכה נחתכה מתפוח בוגר. (B)פרוטופלסטים חולצו מחתיכות עיסת. (C)העיסה נחתכה ל -10 × 5 × 1 מ"מ³ חתיכות. (D)חתיכות עיסת הונחו צינורות צנטריפוגות המכילים תמיסת אנזימים 0.5 מ"ל. (ה)פרוטופלסטים. ראשי חץ מצביעים על הפרוטופלסט, והחצים מצביעים על החלול בפסגת. (F)פרוטופלסטים היו מוכתמים עם ה- FDA במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. (נתון זה שונה מהפניה ²² [מחקר גננות: טעינת בדיקות פלואורסצנטיות סידן לתוך פרוטופלסטים כדי לזהות סידן בתאי רקמת הבשר של Malus domestica]. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: העמסת פלואו-4/AM ולה³⁺ לפרוטופלסטים. (א)בקרה: פרוטופלסט שלם ללא כל בדיקה פלואורסצנטית טעונה. (B)פרוטופלסטים עמוסים בפלו-4/AM. (C)La^{3 + נוספה} כאשר הפרוטופלסטים היו טעונים עם Fluo- 4 / AM. הריכוז הסופי של La³⁺ היה 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: ניתוח סטטיסטי של עוצמת הפלואורסצנטיות בפרוטופלסטים. ציין הבדל משמעותי לפי מבחן tשל התלמיד (P <0.001). פסים אנכיים מציינים ± SD. כל נקודת נתונים מייצגת את הממוצע של 20 פרוטופלסטים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: מיקרוסקופ פלואורסצנטיות. (A)המראה הכללי של מיקרוסקופ הפלואורסצנטיות. (B)דף הגדרות. בחר מטרה 20x, ערוץ GFP, והתאם באופן אחיד את הבהירות ל- 0.5. (C)אזור עירור פלואורסצנטיות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S2: שלבים המשמשים לחישוב עוצמת הפלואורסצנטיות Ca ²⁺ בפרוטופלסט של תאי פרי. יחידות עוצמת פלואורסצנטיות המשמשות במחקר זה מבוססות על דוחות קודמים^26,27,28,29. תהליך החישוב הוא כדלקמן: (A) פתח את תמונת הפלואורסצנטיות של הפרוטופלסט בתוכנה. לחץ על הכלי מדידה. מהתפריט הנפתח בחר שורת פרופיל. (B)בחר עיגול בחלון פרופיל קו. באמצעות לצייר זה אליפסה על protoplast. (C)בחלון פרופיל שורה בחר כעת קובץ | ייצוא נתונים (D)ודא שהגיליון האלקטרוני הריק נפתח ומייבא נתונים על-ידי לחיצה על ייצוא נתונים. השתמש בפונקציה 'ממוצעת' כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת. כל טיפול חזר על עצמו שלוש פעמים עם יותר מ -20 פרוטופלסטים כל אחד. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S3: סטטיסטיקת נתונים בוצעה באמצעות תוכנת ניתוח סטטיסטית. הדבק את הנתונים בטבלה ולחץ על נתח לניתוח נתונים. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים S4: הפקת פרוטופלסטים מעיסת זנים אחרים של תפוחים. (א)דונן. (ב)דבש פריך. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

במחקר זה, פרוטופלסטים קיימא התקבלו על ידי הידרוליזה אנזימטית. שימו לב כי שיטה זו דורשת תפוחים טריים. הפרוטוקול הנוכחי מאפשר בידוד מהיר של מספר רב של פרוטופלסטים מעיסת פירות לשימוש במחקרים. תחולתה של שיטה זו אינה מוגבלת ל'פוג'י'; את הפרוטופלסטים של עיסת התפוחים של 'Dounan' ו'דבש קריספ' ניתן לחלץ גם באמצעות אותו פרוטוקול (איור משלים S4). הפתרון protoplast לאחר אנזימוליזיס מכיל פסולת תאים, אשר שופרה במקצת בהשוואה לשיטות קודמות. כחומר תאי חיוני, פרוטופלסטים עיסת תפוח יכול לשמש עבור טכנולוגיית ביטוי חלבון התא, רצף תא יחיד, ומחקרים אחרים.

ישנן שיטות רבות לגבי כתמי ריאגנט פלואורסצנטי כימי בתאי צמח³⁰. לדוגמה, Fluo-3/AM נטען בטמפרטורה נמוכה (4 °C (4 °F), כך שהוא ייכנס לתאי קצה השורש³¹. Fluo-3/AM יכול גם להיות טעון בטמפרטורה גבוהה (37 °C (37 °F) לתוך צינור האבקה³². Fluo-4/AM נטען בהצלחה לתוך צינור האבקה של Pyrus pyrifolia (25 °C במשך 15 דקות)¹⁸ ואת שיער השורש של Arabidopsis (4 °C (4 °C(30 דקות)³³. עם זאת, שיטות אלה אינן מתאימות להכתמת פרוטופלסטים עיסת תפוחים. במחקר זה, העמסנו בהצלחה בדיקות פלואורסצנטיות לפרוטופלסטים בטמפרטורה גבוהה (37 מעלות צלזיוס). בנוסף, השיטה הנוכחית פשוטה, מהירה, מדויקת ואינה משפיעה על החיוניות של protoplast. צעד קריטי בשיטה המוצעת הוא לשטוף את הפרוטופלסטים המוכתמים ולדגירה עליהם במשך 30 דקות. לאחר הכתם, יש לשטוף את הפרוטופלסטים. הכביסה תפחית את פלואורסצנטיות הרקע במהלך התצפית, כך שניתן לספור את עוצמת הפלואורסצנטיות של הפרוטופלסטים בצורה מדויקת יותר. דגירה במשך 30 דקות כדי לאפשר בדיקות נוספות להיות טעון לתוך protoplasts. שים לב כי חיוני כדי למנוע חשיפה לאור במהלך הטעינה.

La³⁺ הוא כלי חשוב ללימוד Ca^{2 +}. הוא נקשר לאתר הקטליטי Mg²⁺ בממברנה הציטופלסמית Ca²⁺-ATPase, ובכך מעכב את מחזור המצב היציב של Ca^{2 +}-ATPase וחוסם את Ca^{2 +} transmembrane מתפקד³⁴. La³⁺ טיפול מופחת ציטופלסמי Ca^{2 +}, ו Fluo-4/AM יכול לשקף את השינוי הזה, למעט הפרעה של cations חלוקה אחרת ולוודא את ההיתכנות של ריאגנטים פלואורסצנטיים כימיים.

למרות ששיטת טעינה זו מציעה יתרונות רבים יותר משיטות אחרות, עדיין יש לשפר אותה עוד יותר בהפיכת תוצאות הנתונים. כאן, הערכנו את התוכן הציטופלסמי יחסי Ca²⁺ על ידי זיהוי ערך הפלואורסצנטיות של הפרוטופלסטים, שהם נתונים איכותיים ולא כמותיים. לכן, חשוב במיוחד לתרגם את תוצאות הכתמים לתוכן ספציפי Ca²⁺ במחקרים עתידיים, אשר יכול לספק בסיס מחקרי לניתוח פירות Ca^{2 +} איתות.

לסיכום, השיטה המתוארת כאן יכולה לזהות Ca²⁺ ציטופלסמי בתאי עיסת תפוחים, ובכך לספק תמיכה טכנית למחקרים הקשורים של סידן עיסת פירות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10× phosphate-buffered saline	Solarbio	P1022	PBS (phosphate buffered solution) is a phosphate buffer solution, which can provide a relatively stable ionic environment and pH buffering capacity. It is a buffer salt solution often used in biology for molecular cloning and cell culture. The pH is 7.4.
2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid	Solarbio	M8010	Biological buffer
CaCl2·2H2O	Solarbio	C8370	Calcium chloride dihydrate is a white or gray chemical, mostly in granular form.
Cellulase R-10	Yakult Honsha	MX7352	Degrade plant cell walls.
D-sorbitol	Solarbio	S8090	It has good moisturizing properties, prevents drying, and prevents sugar, salt, etc. from crystallizing.
F-127	Thermo Fisher Scientific	P6867	Pluronic F-127 is a non-ionic, surfactant polyol (molecular weight of approximately 12500 Daltons), which has been found to be beneficial to promote the dissolution of water-insoluble dyes and other materials in physiological media.
FDA	Thermo Fisher Scientific	F1303	FDA is a cell-permeant esterase substrate that can serve as a viability probe that measures both enzymatic activity, which is require to activate its fluorescence, and cell-membrane integrity, which is required for intracellular retention of their fluorescent product.
Fluo-4/AM	Thermo Fisher Scientific	F14201	The green fluorescent calcium indicator Fluo-4/AM is an improved version of the calcium indicator Fluo-3/AM. The Fluo-4/AM loads faster and is brighter at the same concentration. It can be well excited with a 488 nm argon ion laser.
Fluorescence microscope	Thermo Fisher	EVOS Auto 2	Observe the fluorescence image.
Macerozyme R-10	Yakult Honsha	MX7351	Degrade plant tissue to separate single cells.
Tris	Solarbio	T8060	It is widely used in the preparation of buffers in biochemistry and molecular biology experiments.