Summary
提供了RNA测序的微分表达分析方法的详细协议：伽利马、EdgeR、DESeq2。
Abstract
RNA测序（RNA-seq）是转录学中最广泛使用的技术之一，因为它可以揭示基因改变与复杂的生物过程之间的关系，在肿瘤的诊断、预后和治疗方面具有重要价值。RNA-seq 数据的微分分析对于识别异常转录至关重要，而 limma、EdgeR 和 DESeq2 是微分分析的有效工具。然而，RNA-seq差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。
在此，我们提供详细的协议，以确定胆管癌 （CHOL） 和正常组织之间通过伽马， DESeq2 和 EdgeR 的差异表达基因 （DEG）， 结果在火山地块和维恩图中显示。伽马、DESeq2 和 EdgeR 这三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，线性模型用于伽马体的统计，而负二元分布用于边缘R和DESeq2。此外，正常化的RNA-seq计数数据对于 EdgeR 和 limma 是必要的，但对于 DESeq2 来说不是必要的。
在这里，我们为三种微分分析方法提供了详细的协议：伽利马、EdgeR 和 DESeq2。这三种方法的结果是部分重叠的。这三种方法都有各自的优势，方法的选择只取决于数据。
Introduction
RNA测序（RNA-seq）是转录学中应用最广泛的技术之一，具有许多优点（例如，高数据可重复性），并极大地增进了我们对复杂生物过程1、2的功能和动力学的理解。在不同的生物背景下识别异常记录（也称为微分表达基因 ）是RNA-seq分析的关键步骤。RNA-seq 使深入了解发病机制相关的分子机制和生物功能成为可能。因此，差异分析被认为是有价值的诊断，预后和治疗肿瘤3，4，5。目前，更多的开源R/生物导体包已经开发为RNA-seq差分表达分析，特别是利马，DESeq2和EdgeR 1，6，7。然而，差异分析需要一定的R语言技能和选择适当方法的能力，这是医学教育课程所缺乏的。
在本协议中，根据从癌症基因组图集 （TCGA） 中提取的胆管癌 （CHOL） RNA-seq 计数数据，R 程序11分别执行了三种最已知的方法（limma8、EdgeR9和 DESeq210），以确定 CHOL 和正常组织之间的 DEG。伽马、EdgeR 和 DESeq2 的三种方案相似，但在分析过程中有不同的步骤。例如，EdgeR 和 limma8、9需要规范化的 RNA-seq 计数数据，而 DESeq2 则使用自己的库差异来更正数据，而不是校正10。此外，edgeR 特别适用于 RNA-seq 数据，而 limma 则用于微阵列和 RNA-seq。Limma 采用线性模型来评估 DEG12，而 edgeR 中的统计数据基于负二元分布，包括经验贝叶估计、精确测试、通用线性模型和准可能性测试9。
总之，我们分别使用 limma、DESeq2 和 EdgeR 提供 RNA-seq 差分表达分析的详细协议。通过引用本文，用户可以轻松地执行 RNA-seq 差分分析，并为其数据选择适当的差分分析方法。
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Protocol
注：打开 R 工作室程序并加载 R 文件"DEGs.R"，该文件可以从补充文件/脚本中获取。
1. 数据的下载和预处理
- 从癌症基因组图集 （TCGA） 下载胆管癌 （CHOL） 的高通量测序 （HTSeq） 计数数据。此步骤可以通过以下 R 代码轻松实现。
- 单击 "运行" 以安装 R 包。
- 单击 "运行" 以加载 R 包。
如果 （！ 需要命名空间 （"生物经理"， 悄悄地] 真实））
• 安装.包（"生物经理"）
生物管理器：：安装（c（"TCGAbiolinks"、"总结经验"）） - 设置工作目录。
图书馆（TCGAbiolinks）
图书馆（总结经验）
设置（"C：/用户/LIUSHIYI/桌面"） - 选择癌症类型。
癌症< - "Tcga - chol" - 运行来自"GDCquery.R"文件的 R 代码以下载数据。文件"GDCquery.R"可以从补充文件/脚本中获取：
来源（"补充文件/脚本/GDCquery.R"）
头 （cnt）
##TCGA-3X-AAVA-01A-11r-A41I-07
##ENSG00000000003 4262
##ENSG00000000005 1
##ENSG00000000419 1254
##ENSG00000000457 699
##ENSG00000000460 239
##ENSG00000000938 334
注：执行后，将下载 CHOLHTSeq 计数数据并命名为"cnt"，其中行表示合奏基因 ID，列代表样本 ID。请注意样本 ID 中 14-15 位置的数字;数字从01到09表示肿瘤，从10到19表示正常组织。
- 将合奏基因 ID 转换为基因符号。
- 根据存储路径将注释文件导入 R 中。注释文件（基因代码.v22.注释.gtf）可以从补充文件中获取。
gtf_v22 <-跟踪层：：进口（'补充文件/基因代码.v22.注释.gtf'） - 从"gtf_v22运行 R 代码。R" 文件，可从补充文件/脚本中获取：
来源（"补充文件/脚本/gtf_v22。R") - 应用功能"ann"将合奏基因 ID 转换为基因符号。
cnt=ann （gtf_v22）
- 根据存储路径将注释文件导入 R 中。注释文件（基因代码.v22.注释.gtf）可以从补充文件中获取。
- 过滤低表达基因
- 单击 "运行 "以安装 R 包"边缘"。
生物管理器：：安装（"边缘"） - 单击 "运行 "以加载 R 包"边缘"。
库（边缘） - 运行以下 R 代码，使基因的计数值达到百万分之一（CPM），至少两个样本中的一个以上。
保持<排（cpm（cnt）>1）>+2
cnt < - 矩阵 （cnt [保持]）
注：使用每百万（CPM）值的计数，而不是读数，以消除不同测序深度造成的偏差。
- 单击 "运行 "以安装 R 包"边缘"。
2. 通过"利马"进行差异表达分析
- 单击 "运行 "以安装 R 包"limma"。
生物管理器：：安装（"利玛"） - 单击 "运行 "以加载 R 包"limma"、"边缘"。
图书馆（利玛）
库（边缘） - 运行以下 R 代码以创建设计矩阵。
群 <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information
组 [组百分比在% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue
组 [组百分比在% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue
群 <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))- 创建设计矩阵。
设计<-模型.矩阵（+组）
行名（设计）<-结名（cnt） - 创建 DGE 列表对象。
dge < - Dgelist （计数 = cnt， 组 = 组） - 使数据正常化。
dge < - 钙计算器 （dge， 方法 = "Tmm"） - 运行以下 R 代码以执行基于利马趋势方法的差分表达分析。
dge
##An类"DGEList"的对象
#$counts
##TCGA-3X-AAVA-01A-11r-A41I-07
##TSPAN6 4262
##DPM1 1254
##SCYL3 699
##C1orf112 239
##FGR 334 - 计算 CPM 值。
日志< - cpm （dge， 日志 = 真实， 前。 - 单击 "运行" 以适合线性模型以预测数据或推断变量之间的关系。
适合<-lmFit（日志，设计） - 根据贝叶斯计算 T 值、F 值和日志赔率。
适合<- 易趣 （适合， 趋势+ 真实） - 提取结果表。
res_limma<- 数据. 框架 （顶部表 （适合， n = Inf））
头（res_limma）
## 日志开发 t P. 价值 adj.P.瓦尔 B
##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823
##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656
##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001
##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056
##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704
##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543
差异表达分析的#The结果保存在"res_limma"中，其中包括基因 ID、日志 2 倍变化值 （logFC）、实验中基因的平均日志 2 表达水平 （AveExpr）、修改的 t 统计 （t）、重新变现 p 值 （P.Value）、错误发现率 （FDR） 更正 p 值 （adj） 。P.Val）和微分表达基因的日志奇数（B）
注：使用"边缘"的函数"钙定量（）"使数据正常化，以消除样品制备或库构建和测序的影响。在设计矩阵的构造中，有必要将实验设计（例如组织类型：正常组织或肿瘤组织）与矩阵的 ID 样本进行匹配。limma 趋势适用于测序深度相同的数据，而 limma-voom 则适合：（i） 样本库大小不同时：（二） TMM 未正常化的数据;（三） 数据中有很多"噪音"。正日志FC意味着基因在实验中受到调节，而负数意味着基因被调节。 - 识别 DEG。
res_limma美元西格< - 作为因素 （
伊菲尔斯（res_limma美元）P. Val < 0.05 = 腹肌 （res_limma $logfc） > 2，
ifelse （res_limma $logFC > 2 ， '向上'， '向下'）， '不是'） * 季< p 值 0.05 和 |log2FC|>= 2 是识别 DEG 的阈值
摘要（res_limma美元）
##down不起来
##1880 17341 1443 - 将结果表输出到文件。
写.csv （res_limma， 文件 = "result_limma.csv"） - 单击 "运行 "以安装 R 包"ggplot2"。
安装.包（"ggplot2"） - 单击 "运行 "以加载 R 包"ggplot2"。
图书馆（ggplot2） - 运行"火山"中的 R 代码。R"创建火山图。文件"火山。R" 可从补充文件中获取。
来源（"补充文件/脚本/火山。R")
火山（res_limma，"日志"，"阿杰。P.瓦尔"，2，0.05）
注：基因可以根据其 log2FC 和 adj-p 值映射到不同位置，向上调节的 DEG 以红色着色，向下调节的 DEG 以绿色着色。 - 单击 "导出 "以保存火山图。
注：火山地块可以以不同格式生成和下载（例如，pdf、TIFF、PNG、JPEG 格式）。基因可以根据其 log2FC 和 adj p 值映射到不同位置，向上调节的 DEG（日志 2FC > 2，adj p < 0.05）为红色，向下调节的 DEG（log2FC < -2，adj p < 0.05）为绿色，非 DEG 为灰色。
- 创建设计矩阵。
3. 通过"边缘"进行差异表达分析
- 单击 "运行 "以加载 R 包"边缘"。
库（边缘） - 运行以下 R 代码以创建设计矩阵。
组<子弦（同名（cnt），14，15）
组 [组百分比在% "01"] < - "癌症"
组 [组百分比在% "11"] < - "正常"
组=因子（组，级别 = c（"正常"，"癌症"））
设计<模型.矩阵（+组）
行名（设计）= 共名（cnt） - 单击 "运行 "以创建 DGEList 对象。
dge < - Dgelist （计数= cnt） - 使数据正常化。
dge < - 钙计算器 （dge， 方法 = "Tmm"） - 单击 "运行" 以估计基因表达值的分散性。
dge <估计放款 （dge， 设计， 坚固 = T） - 单击 "运行 "以适合模型以计数数据。
适合< - glmqlfit （dge， 设计） - 进行统计测试。
适合< - 格姆克洛夫特 （适合） - 提取结果表。结果保存在"res_edgeR"中，其中包括日志折叠更改值、日志 CPM、F、p 值和 FDR 更正 p 值。
res_edgeR=数据.帧（顶部塔格（适合，n=Inf））
头（res_edgeR）
## 日志日志下午 F 价值 Fdr
##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21
##MSMO1 -3.761400 7.52111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R
##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20
##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20
##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20
##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19
#The结果保存在"res_edgeR"中，其中包括日志折叠更改值（日志FC）、日志 CPM、F、p 值和 FDR 更正 p 值 - 识别 DEG。
res_edgeR美元 = 作为因素
> 2， res_edgeR $Fdr < 0.05 + 腹肌 （res_edgeR $logfc）
如果（res_edgeR$logFC>2，'向上'，'向下'），'不'））
摘要（res_edgeR美元）
##down不起来
##1578 15965 3121 - 将结果表输出到文件。
写.csv （res_edgeR， 文件 = "res_edgeR.csv"） - 创建火山图。
火山 （res_edgeR，"日志"，"FDR"，2，0.05） - 单击 "导出 "以保存火山图。
4. 通过"DESeq2"进行差异表达分析
- 单击 "运行 "以安装 R 包"DESEq2"。
生物管理器：：安装（"DESEq2"） - 单击 "运行 "以加载 R 包"DESEq2"。
图书馆（德塞Q2） - 运行以下 R 代码以确定分组因子。
组<子弦（同名（cnt），14，15）
组 [组百分比在% "01"] < - "癌症"
组 [组百分比在% "11"] < - "正常"
组=因子（组，级别 = c（"正常"，"癌症"）） - 创建解答数据集对象。
dds < - 德塞克数据集从矩阵 （cnt， 数据框架 （组）， 设计 + 组）
dds
##class： 德塞克数据集
##dim： 20664 45
##metadata （1）： 版本
##assays （1）： 计数
##rownames （20664）： TSPAN6 DPM1...RP11-274B21.13 LINC01144
##rowData名称 （0）：
##colnames （45）： TCGA-3X-AAVA-01A-11r-A41I-07...
##colData名称 （1）： 组 - 执行分析。
dds < - 德塞克 （dds） - 生成结果表。
res_DESeq2 <-数据.框架（结果（dds））
头（res_DESeq2）
## 基础米恩日志 2 折叠改变 lfcse 统计价值帕杰
##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02
##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03
##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01
##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03
##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01
##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11
注：结果保存在"res_DESeq2"中，其中包括规范化读数（基数）、日志折叠更改值（日志 2 折叠更改）、日志折叠更改标准错误 （lfcSE）、Wald 统计（统计）、原始 p 值（pvalue）和更正 p 值 （padj） 的均值 - 识别 DEG。
res_DESeq2美元 = 作为因素 （
res_DESeq2 $padj < 0.05 + 腹肌 （res_DESeq2 $log2 折叠改变） > 2，
如果（res_DESeq2$log2foldchange>2，'向上'，'向下'），'不'））
摘要（res_DESeq2美元）
##down不起来
##1616 16110 2938 - 将结果表输出到文件。
写.csv （res_DESeq2， 文件 = "res_DESeq2.csv"） - 创建火山图。
火山 （res_DESeq2，" 日志 2 折叠变化"， 帕杰，2，0.05） - 单击 "导出 "以保存火山图。
5. 维恩图
- 单击 "运行 "以安装 R 包"文图"。
安装.包（"文图"） - 单击 "运行 "以加载 R 包"文图"。
图书馆（文图） - 制作一个向上调节的 DEG 的 Venn 图。
网格.新页面（）
网格.绘制（文.图（列表（利马+行名（res_
利玛 [res_limma美元] "向上"，
边缘+行名（res_edgeR[res_edgeR美元="向上"，]），
德塞克2=行名（res_DESeq2[res_DESeq2美元]]
"向上"，[））
NULL， 高度 = 3， 宽度 = 3， 单位 = "在"，
col="黑色"，lwd=0.3，填充=c（"#FF6666"，"#FFFF00"，
"#993366"),
阿尔法+c （0.5， 0.5， 0.5），主 = "向上调节的 DEG"） - 单击 "导出 "以保存 Venn 图。
- 制作向下调节的 DEG 的 Venn 图。
网格.新页面（）
网格.绘制（文.图（列表（利马+行名（res_
利玛 [res_limma美元] "向下"，
边缘+ 行名 （res_edgeR [res_edgeR美元]
"向下"，]）
DESeq2=行名（res_DESeq2[res_DESeq2美元="向下"，]）
NULL， 高度 = 3， 宽度 = 3， 单位 = "在"，
col="黑色"，lwd=0.3，填充=c（"#FF6666"，"#FFFF00"，
"#993366"),
alpha=c （0.5， 0.5， 0.5），主 = "向下调节的 DEG"） - 单击 "导出 "以保存 Venn 图。
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Representative Results
有各种方法可视化差异表达分析的结果，其中火山图和维恩图特别使用。利马用|logFC|≥2和adj识别了 CHOL 和正常组织之间的 3323 个 DEG。P.Val<0.05作为阈值，其中1880个在CHOL组织中被降低调节，1443个被调高（图1a）。同时，EdgeR 确定了 1578 个下监管 DEG 和 3121 个向上监管的 DEG（图 1b）：DESeq2 确定了 1616 个下行监管的 DEG 和 2938 个向上监管的 DEG（图 1c）。比较这三种方法的结果，1431个上调的DEG和1531个下调节的DEG是重叠的（图2）。
图1。在 CHOL 和正常组织之间识别不同表达的基因 （DEG）。 （a-c）由伽马、边缘和DESeq2获得的所有基因的火山图，分别根据折叠变化（日志2）绘制 ， 红点表示受调节的DEG（调整后 的p 值<0.05和日志|FC|> 2） 和绿点表示向下调节的 DEG（调整后 的 p 值< 0.05 和日志|FC|< 2）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。Venn 图显示从 limma、边缘和 DESeq2 中得出的结果之间重叠。请单击此处查看此图的较大版本。
补充文件。请点击这里下载此文件。
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Discussion
丰富的癌症异常记录可以通过RNA-seq差分分析5轻松识别。但是，RNA-seq 差分表达分析的应用往往受到限制，因为它需要具有某些 R 语言技能和选择适当方法的能力。为了解决这个问题，我们提供了三种最已知的方法（limma、EdgeR 和 DESeq2）的详细介绍，以及应用 RNA-seq 差分表达分析的教程。这将促进理解所有三种方法的相似性和差异，使选择适合单个数据的方法，并使我们能够了解复杂的动态生物过程。
在这里，我们分别通过 limma、边缘R 和 DESeq2 提出通过 RNA-seq 差分表达分析的详细协议，分为五个阶段：（i） 数据的下载和预处理：（ii-iv） 通过 limma、边缘和 DESeq2 进行差分表达分析，（v） 分别通过 Venn 图对这三种方法的结果进行比较。
这三种方法在差异表达分析过程中具有相似和不同的步骤。线性模型用于伽马体的统计，适用于所有基因表达技术，包括微阵列、RNA-seq和定量PCR8、13，而边缘和DESeq2则根据负二元分布9、10和边缘R和DESeq2实施一系列统计方法，适用于RNA-seq数据。此外，正常化的RNA-seq计数数据对于 EdgeR 和 limma 是必要的，而 DESeq2 使用自己的库差异来校正数据而不是规范化，DESeq2 中的数据必须是一个整数矩阵。规范化方法包括 TMM（M 值的修剪平均值）、TMMwsp、RLE（相对日志表达）和上四分位数，其中 TMM 是 RNA-seq 数据最常用的规范化方法。这三种方法的结果表明，DESeq2和EdgeR获得的DEG比伽利马多。造成这种差异的原因是 EdgeR 和 DESeq2 基于负二元模型，该模型导致大量误报。相反，limma-voom只使用方差函数，不显示过多的误报，就像方差稳定转换的情况一样，然后是线性模型分析与伽马14、15、16。
这三种方法都有其自身的优势，选择仅取决于数据类型。例如，如果有微阵列数据，应该优先考虑利马，但当是下一代测序数据时，DESeq2 和 EdgeR 优先选择 9、10、17。总之，我们在这里提供了一个详细的协议RNA-seq微分表达分析与R包利马，边缘R和DESeq2，分别。这三种方法的输出结果部分重叠，这些差异化方法各有优势。不幸的是，此协议不包括其他数据类型（例如微阵列数据）和方法（例如 EBSeq）18的技术详细信息。
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Disclosures
该手稿以前没有出版过，也没有考虑在其他地方出版。所有作者都为撰写这份重要知识内容的手稿作出了贡献，并阅读并批准了最终手稿。我们宣布没有利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金（81860276号赠款）和国家重点研发计划重点专项资金项目（2018YFC1003200号赠款）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R | version 3.6.2 | free software | |
| Rstudio | free software |
References
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