Summary
Приведен подробный протокол методов дифференциального экспрессионного анализа для секвенирования РНК: limma, EdgeR, DESeq2.
Abstract
Секвенирование РНК (RNA-seq) является одной из наиболее широко используемых технологий в транскриптомике, поскольку оно может выявить связь между генетическим изменением и сложными биологическими процессами и имеет большое значение в диагностике, прогностике и терапии опухолей. Дифференциальный анализ данных RNA-seq имеет решающее значение для выявления аберрантных транскрипций, а limma, EdgeR и DESeq2 являются эффективными инструментами для дифференциального анализа. Однако дифференциальный анализ RNA-seq требует определенных навыков владения языком R и умения выбирать соответствующий метод, чего не хватает в учебной программе медицинского образования.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для идентификации дифференциально экспрессированных генов (DEG) между холангиокарциномой (CHOL) и нормальными тканями через limma, DESeq2 и EdgeR, соответственно, и результаты показаны на графиках вулканов и диаграммах Венна. Три протокола limma, DESeq2 и EdgeR похожи, но имеют разные этапы среди процессов анализа. Например, линейная модель используется для статистики в лимме, в то время как отрицательное биномиальное распределение используется в edgeR и DESeq2. Кроме того, нормализованные данные о количестве РНК-seq необходимы для EdgeR и limma, но не нужны для DESeq2.
Здесь мы предоставляем подробный протокол для трех методов дифференциального анализа: limma, EdgeR и DESeq2. Результаты применения трех методов частично перекрываются. Все три метода имеют свои преимущества, и выбор метода зависит только от данных.
Introduction
РНК-секвенирование (RNA-seq) является одной из наиболее широко используемых технологий в транскриптомике со многими преимуществами (например, высокой воспроизводимостью данных) и значительно расширило наше понимание функций и динамики сложных биологических процессов1,2. Идентификация аберратных транскриптов в различных биологических контекстах, которые также известны как дифференциально экспрессированные гены (ДЭГ), является ключевым шагом в анализе РНК-seq. RNA-seq позволяет получить глубокое понимание молекулярных механизмов и биологических функций, связанных с патогенезом. Поэтому дифференциальный анализ был расценен как ценный для диагностики, прогностики и терапии опухолей3,4,5. В настоящее время для дифференциального экспресс-анализа РНК-seq разработано больше пакетов R/Bioconductor с открытым исходным кодом, в частности limma, DESeq2 и EdgeR1,6,7. Однако дифференциальный анализ требует определенных навыков владения языком R и умения выбирать подходящий метод, чего не хватает в учебной программе медицинского образования.
В этом протоколе, основанном на данных о количестве РНК-seq холангиокарциномы (CHOL), извлеченных из Атласа генома рака (TCGA), три наиболее известных метода (limma8,EdgeR9 и DESeq210)были проведены, соответственно, программой R11 для идентификации DEG между CHOL и нормальными тканями. Три протокола limma, EdgeR и DESeq2 похожи, но имеют разные этапы среди процессов анализа. Например, нормализованные данные о количестве РНК-seq необходимы для EdgeR и limma8,9, тогда как DESeq2 использует свои собственные библиотечные расхождения для исправления данных вместо нормализации10. Кроме того, edgeR специально подходит для данных RNA-seq, в то время как limma используется для микрочипов и RNA-seq. Линейная модель принята Limma для оценки DEG12,в то время как статистика в edgeR основана на отрицательных биномиальных распределениях, включая эмпирическую оценку Байеса, точные тесты, обобщенные линейные модели и квазивероятностные тесты9.
Таким образом, мы предоставляем подробные протоколы дифференциального экспрессивного анализа RNA-seq с использованием limma, DESeq2 и EdgeR соответственно. Ссылаясь на эту статью, пользователи могут легко выполнить дифференциальный анализ RNA-seq и выбрать подходящие методы дифференциального анализа для своих данных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Откройте программу R-studio и загрузите R файл "DEGs.R", файл можно получить из Дополнительных файлов/Скриптов.
1. Загрузка и предварительная обработка данных
- Загрузите данные о количестве высокопроизводительного секвенирования (HTSeq) холангиокарциномы (CHOL) из Атласа генома рака (TCGA). Этот шаг может быть легко достигнут с помощью следующего кода R.
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакеты R.
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакеты R.
if(!requireNamespace("BiocManager", quietly=TRUE))
+ install.packages("BiocManager")
BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "SummarizedExperiment")) - Задайте рабочий каталог.
библиотека (TCGAbiolinks)
библиотека(Обобщенныйопыт)
setwd("C:/Пользователи/LIUSHIYI/Рабочий стол") - Выберите тип рака.
< рака - "TCGA-CHOL" - Запустите код R из файла "GDCquery.R", чтобы загрузить данные. Файл "GDCquery.R" можно получить из Дополнительных файлов/Скриптов:
source("Дополнительные файлы/Скрипты/GDCquery.R")
голова (cnt)
##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07
no #ENSG00000000003 4262
No #ENSG00000000005 1
no #ENSG00000000419 1254
No #ENSG00000000457 699
No #ENSG00000000460 239
No #ENSG00000000938 334
ПРИМЕЧАНИЕ: После выполнения данные подсчета CHOLHTSeq будут загружены и названы "cnt", где строки представляют идентификаторы генов ансамбля, а столбцы представляют идентификаторы образцов. Пожалуйста, обратите внимание на цифры на позициях 14-15 в идентификаторах образцов; числа в диапазоне от 01 до 09 указывают на опухоли и в диапазоне от 10 до 19 указывают на нормальные ткани.
- Преобразуйте идентификаторы генов ансамбля в символы генов.
- Импортируйте файл аннотации в R в соответствии с его путем к хранилищу. Файл аннотации (gencode.v22.annotation.gtf) можно получить из дополнительных файлов.
gtf_v22 <- rtracklayer::import('Дополнительные файлы/gencode.v22.annotation.gtf') - Запустите код R из gtf_v22. R", который можно получить из Дополнительных файлов/Скриптов:
source("Дополнительные файлы/Скрипты/gtf_v22. R") - Примените функцию "ann" для преобразования идентификаторов генов ансамбля в символы генов.
cnt=ann(cnt;gtf_v22)
- Импортируйте файл аннотации в R в соответствии с его путем к хранилищу. Файл аннотации (gencode.v22.annotation.gtf) можно получить из дополнительных файлов.
- Фильтрация низко экспрессированных генов
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакет R "edgeR".
BiocManager::install("edgeR") - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакет R "edgeR".
библиотека(edgeR) - Выполните следующий код R, чтобы сохранить гены со значениями количества на миллион (CPM) больше, чем один из по крайней мере двух выборок.
сохранить <- rowSums(cpm(cnt)>1)>=2
cnt <- as.matrix(cnt[keep,])
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение счетчиков на миллион (CPM) используется вместо счетчика считывания для устранения отклонения, вызванного различными глубинами последовательности.
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакет R "edgeR".
2. Дифференциальный экспрессионный анализ через "limma"
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакет R "limma".
BiocManager::install("limma") - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакеты R "limma", "edgeR".
библиотека(лимма)
библиотека(edgeR) - Выполните следующий код R, чтобы создать матрицу проектирования.
группа <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information
группа [группа %in% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue
группа [группа %in% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue
группа <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))- Создайте матрицу проектирования.
проектирование <- model.matrix (~group)
rownames(design) <- colnames(cnt) - Создайте объект DGEList.
dge <- DGEList(counts = cnt, group = group) - Нормализуйте данные.
dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM") - Выполните следующий код R для выполнения анализа дифференциальных выражений на основе метода limma-trend.
дгэ
##An объект класса "DGEList"
##$counts
##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07
no #TSPAN6 4262
#DPM1 1254
No #SCYL3 699
No #C1orf112 239
No #FGR 334 - Рассчитайте значение CPM.
logdge <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3) - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы соответствовать линейной модели для прогнозирования данных или вывода взаимосвязи между переменными.
подходит <- lmFit (бревно, дизайн) - Рассчитайте значение T, значение F и логарифмы коэффициентов на основе байесовского значения.
подходит <- eBayes(fit, trend=TRUE) - Извлеките таблицу результатов.
res_limma<- as.data.frame(topTable(fit;n=Inf))
голова(res_limma)
## logFC AveExpr t P.Value adj. П.Вал Б
##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823
##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656
##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001
##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056
##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704
##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543
#The результат дифференциального экспрессионного анализа сохраняется в «res_limma», который включает в себя идентификатор гена, значение log2-кратного изменения (logFC), средний уровень экспрессии log2 гена в эксперименте (AveExpr), модифицированную статистику t (t), значение relavent p (P.Value), ложное значение обнаружения (FDR), скорректированное значение p (adj. P.Val) и логарифмических шансов дифференциально экспрессированных генов (B)
ПРИМЕЧАНИЕ: Функция "calcNormFactors()" "edgeR" использовалась для нормализации данных с целью устранения влияния, вызванного подготовкой образцов или построением библиотеки и секвенированием. При построении проектной матрицы необходимо сопоставить экспериментальный проект (например, тип ткани: нормальные или опухолевые ткани) с образцом идентификаторов матрицы. limma-trend подходит для данных, глубина секвенирования которых одинакова, в то время как limma-voom подходит: (i) когда размер библиотеки выборки отличается; ii) данные, не нормализованные ТММ; iii) в данных много "шума". Положительный logFC означает, что ген регулируется в эксперименте, в то время как отрицательное число означает, что ген регулируется понижением. - Определите DEG.
res_limma$sig <- as.factor(
ifelse(res_limma$adj. P.Val < 0.05 & abs(res_limma$logFC) > 2,
ifelse(res_limma$logFC > 2 ,'up','down'),'not')) # Значение adj.p < 0.05 и |log2FC| >= 2 — пороговые значения для идентификации ДЭГ
резюме(res_limma$sig)
##down не вверх
##1880 17341 1443 - Выведем таблицу результатов в файл.
запись.csv(res_limma, файл = 'result_limma.csv') - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакет R "ggplot2".
install.packages("ggplot2") - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакет R "ggplot2".
библиотека(ggplot2) - Запустите код R из «вулкана. R" для создания сюжета вулкана. Файл «Вулкан. R" можно получить из дополнительных файлов.
source("Дополнительные файлы/Скрипты/вулкан. R")
вулкан(res_limma,"logFC","adj. П.Вал",2,0.05)
ПРИМЕЧАНИЕ: Гены могут быть отображены в различные позиции в соответствии с их значениями log2FC и adj-p, регулируемые вверх DEG окрашены в красный цвет, а deG с пониженной регулией окрашены в зеленый цвет. - Нажмите «Экспорт», чтобы сохранить график вулкана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Графики вулканов могут быть сгенерированы и загружены в различных форматах (например, pdf, TIFF, PNG, JPEG формат). Гены могут быть отображены в различные позиции в соответствии с их значениями log2FC и adj p, регулируемые deG (log2FC > 2, adj p < 0,05) окрашены в красный цвет, а deG с пониженной регулизией (log2FC < -2, adj p < 0,05) окрашены в зеленый, не-DEG окрашены в серый.
- Создайте матрицу проектирования.
3. Дифференциальный анализ выражений через "edgeR"
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакет R "edgeR".
библиотека(edgeR) - Выполните следующий код R, чтобы создать матрицу проектирования.
группа <-подстрока(colnames(cnt),14,15)
группа [группа %in% "01"] <- "Рак"
группа [группа %in% "11"] <- "Нормальный"
group=factor(группа, уровни = c("Нормальный","Рак"))
проектирование <-model.matrix(~group)
rownames(design) = colnames(cnt) - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы создать объект DGEList.
dge <- DGEList(counts=cnt) - Нормализуйте данные.
dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM") - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы оценить дисперсию значений экспрессии генов.
dge <- estimateDisp(dge, design, robust = T) - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы подогнать модель для подсчета данных.
подходит <- glmQLFit(dge, дизайн) - Проведите статистический тест.
подходит <- glmQLFTest(fit) - Извлеките таблицу результатов. Результат сохраняется в "res_edgeR", который включает в себя значение изменения сгиба журнала, CPM журнала, значение F, p и скорректированное значение fDR p.
res_edgeR=as.data.frame(topTags(fit, n=Inf))
голова(res_edgeR)
## logFC logCPM F PValue FDR
##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21
##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R
##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20
##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20
##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20
##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19
#The результат сохраняется в "res_edgeR", который включает в себя значение изменения сгиба журнала (logFC), CPM журнала, F, значение p и скорректированное значение FDR p - Определите DEG.
res_edgeR$sig = as.factor(
ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2,
ifelse(res_edgeR$logFC > 2 , 'вверх', 'вниз'),'не'))
резюме(res_edgeR$sig)
##down не вверх
##1578 15965 3121 - Выведем таблицу результатов в файл.
запись.csv(res_edgeR, файл = 'res_edgeR.csv') - Создайте сюжет вулкана.
вулкан(res_edgeR,"logFC","FDR",2,0.05) - Нажмите «Экспорт», чтобы сохранить график вулкана.
4. Дифференциальный анализ выражений с помощью "DESeq2"
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакеты R "DESeq2".
BiocManager::install("DESeq2") - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакеты R "DESeq2".
библиотека(DESeq2) - Выполните следующий код R, чтобы определить фактор группировки.
группа <-подстрока(colnames(cnt),14,15)
группа [группа %in% "01"] <- "Рак"
группа [группа %in% "11"] <- "Нормальный"
group=factor(группа, уровни = c("Нормальный","Рак")) - Создайте объект DESeqDataSet.
dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(group), design = ~group)
дд
##class: DESeqDataSet
##dim: 20664 45
##metadata(1): версия
##assays(1): количество
##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... РП11-274Б21.13 ЛИНК01144
##rowData имена(0):
##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ...
##colData имена(1): группа - Выполните анализ.
dds <- DESeq(dds) - Создайте таблицу результатов.
res_DESeq2 <- data.frame(results(dds))
голова(res_DESeq2)
## baseМеанский log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj
##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02
##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03
##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01
##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03
##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01
##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11
ПРИМЕЧАНИЕ: Результат сохраняется в "res_DESeq2", который включает в себя среднее значение нормализованного счетчика чтения (baseMean), значение изменения сгиба журнала (log2FoldChange), стандартную ошибку изменения сгиба журнала (lfcSE), статистику Wald (stat), исходное значение p (pvalue) и исправленное значение p (padj) - Идентификация DEG.
res_DESeq2$sig = as.factor(
ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs(res_DESeq2$log2FoldChange) > 2,
ifelse(res_DESeq2$log2FoldChange > 2 ,'вверх', 'вниз'),'не'))
резюме(res_DESeq2$sig)
##down не вверх
##1616 16110 2938 - Выведем таблицу результатов в файл.
запись.csv(res_DESeq2, файл = 'res_DESeq2.csv') - Создайте сюжет вулкана.
вулкан(res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0.05) - Нажмите «Экспорт», чтобы сохранить график вулкана.
5. Диаграмма Венна
- Нажмите кнопку Выполнить, чтобы установить пакет R "VennDiagram".
install.packages("VennDiagram") - Нажмите кнопку Выполнить, чтобы загрузить пакет R "VennDiagram".
библиотека (ВеннДиаграмма) - Составьте диаграмму Венна из регулируемых DEG.
grid.newpage()
grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_
limma[res_limma$sig=="up",]),
edgeR=имена строк(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]),
DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig==
"вверх",])),
NULL,высота = 3,ширина = 3,единицы = "in",
col="черный",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00",
"#993366"),
alpha=c(0.5, 0.5, 0.5),main = "Up-регулируемые DEG")) - Нажмите кнопку Экспорт, чтобы сохранить диаграмму Венна.
- Составьте диаграмму Венна с пониженными регулируемыми DEG.
grid.newpage()
grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_
limma[res_limma$sig=="down",]),
edgeR=имена строк(res_edgeR[res_edgeR$sig==
"вниз",]),
DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="down",])),
NULL,высота = 3,ширина = 3,единицы = "in",
col="черный",lwd=0.3,fill=c("#FF6666","#FFFF00",
"#993366"),
alpha=c(0.5, 0.5, 0.5),main = "Пониженные регулируемые DEG")) - Нажмите кнопку Экспорт, чтобы сохранить диаграмму Венна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Существуют различные подходы к визуализации результата дифференциального экспрессионного анализа, среди которых особенно используются график вулкана и диаграмма Венна. Лимма идентифицировала 3323 ДЭГ между CHOL и нормальными тканями с |logFC|≥2 и adj. P.Val <0,05 в качестве пороговых значений, среди которых 1880 были понижены в тканях CHOL и 1443 были отрегулированы(рисунок 1a). Между тем, edgeR идентифицировал 1578 пониженных ДЭГ и 3121 ДЭГ с пониженным регулированием(рисунок 1b); DESeq2 определил 1616 пониженных ДЭГ и 2938 ДЭГ с пониженным регулированием(рисунок 1c). Сравнивая результаты этих трех методов, 1431 ДЭГ с пониженным регулированием и 1531 понижаемые ДЭГ были перекрыты(рисунок 2).
Рисунок 1. Идентификация дифференциально экспрессированных генов (ДЭГ) между CHOL и нормальными тканями. (а-с) Вулканические графики всех генов, полученных limma, edgeR и DESeq2, соответственно, значение adj p (-log10) строится против изменения складки (log2), красные точки представляют собой регулируемые DEG (скорректированное значение p<0,05 и log | FC|> 2) и зеленые точки представляют собой пониженные регулируемые DEG (скорректированное значение p< 0,05 и log | ФК|< 2). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Диаграммы Венна показывают перекрытие результатов, полученных из limma, edgeR и DESeq2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительные файлы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обильные аберратные транскрипты при раке могут быть легко идентифицированы с помощью дифференциального анализа RNA-seq5. Однако применение дифференциального экспрессивного анализа RNA-seq часто ограничено, поскольку оно требует определенных навыков владения языком R и способности выбирать соответствующие методы. Для решения этой проблемы мы предоставляем подробное введение в три наиболее известных метода (limma, EdgeR и DESeq2) и учебные пособия по применению дифференциального экспрессивного анализа RNA-seq. Это облегчит понимание сходств и различий между всеми тремя методами, позволит выбрать подходящий метод для отдельных данных и позволит нам понять сложные динамические биологические процессы.
Здесь мы представляем подробный протокол для анализа дифференциальных выражений RNA-seq через limma, edgeR и DESeq2 соответственно, в пять этапов: (i) загрузка и предварительная обработка данных, (ii-iv) дифференциальный анализ выражений через limma, edgeR и DESeq2 соответственно, (v) сравнение результатов этих трех методов через диаграмму Венна.
Эти три метода имеют сходные и различные этапы среди процессов анализа дифференциальных выражений. Для статистики в лимме используется линейная модель, которая применима ко всем технологиям экспрессии генов, включая микрочипы, РНК-seq и количественнуюПЦР 8,13,в то время как edgeR и DESeq2 реализуют ряд статистических методологий, основанных на отрицательном биномиальном распределении9,10,а edgeR и DESeq2 подходят для данных RNA-seq. Кроме того, нормализованные данные о количестве RNA-seq необходимы для EdgeR и limma, тогда как DESeq2 использует свои собственные библиотечные расхождения для исправления данных вместо нормализации, а данные в DESeq2 должны быть целочисленной матрицей. Методы нормализации включают TMM (усеченное среднее M-значений), TMMwsp, RLE (относительное выражение журнала) и верхний квартиль, среди которых TMM является наиболее часто используемым методом нормализации данных RNA-seq. Результаты трех методов показали, что DESeq2 и EdgeR получают больше DEG, чем limma. Причина этой разницы заключается в том, что edgeR и DESeq2 основаны на отрицательной биномиальной модели, которая способствует большому количеству ложных срабатываний. Напротив, limma-voom использует только дисперсионную функцию и не показывает чрезмерных ложных срабатываний, как в случае с дисперсионным стабилизирующим преобразованием с последующим линейным модельным анализом с limma14,15,16.
Все три метода имеют свои преимущества, и выбор просто зависит от типа данных. Например, если есть данные микрочипов, лимма должна быть дана с приоритетом, но когда это данные секвенирования следующего поколения, DESeq2 и EdgeR предпочтительнее9,10,17. Таким образом, мы представляем здесь подробный протокол для анализа дифференциальной экспрессии RNA-seq с R-пакетами limma, edgeR и DESeq2 соответственно. Выходные результаты трех методов частично перекрываются, и эти дифференциальные методы имеют свои соответствующие преимущества. К сожалению, этот протокол не охватывает технические детали для других типов данных (например, данных микрочипов) и методов (например, EBSeq)18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Рукопись не была опубликована ранее и не рассматривается для публикации в другом месте. Все авторы внесли свой вклад в создание этой рукописи для важного интеллектуального содержания и прочитали и одобрили окончательную рукопись. Мы заявляем, что конфликта интересов нет.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 81860276) и Ключевыми проектами Специального фонда Национальной ключевой программы НИОКР (грант No 2018YFC1003200).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R | version 3.6.2 | free software | |
| Rstudio | free software |
References
- Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach. Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).
- Anders, S., et al. Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor. Nature Protocols. 8, 1765-1786 (2013).
- McDermaid, A., Monier, B., Zhao, J., Liu, B., Ma, Q. Interpretation of differential gene expression results of RNA-seq data: review and integration. Briefings in Bioinformatics. 20, 2044-2054 (2019).
- Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool. PloS One. 12, 0190152 (2017).
- Law, C. W., et al. RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR. F1000Research. 5, (2016).
- Varet, H., Brillet-Guéguen, L., Coppée, J. Y., Dillies, M. A. SARTools: A DESeq2- and EdgeR-Based R Pipeline for Comprehensive Differential Analysis of RNA-Seq Data. PloS One. 11, 0157022 (2016).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43, 47 (2015).
- Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics. 26, Oxford, England. 139-140 (2010).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, 550 (2014).
- Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biology. 5, 80 (2004).
- Law, C. W., Chen, Y., Shi, W., Smyth, G. K. voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts. Genome Biology. 15, 29 (2014).
- Smyth, G. K. Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3, (2004).
- Lund, S. P., Nettleton, D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. Detecting differential expression in RNA-sequence data using quasi-likelihood with shrunken dispersion estimates. Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 11, (2012).
- Reeb, P. D., Steibel, J. P. Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments. Frontiers in Genetics. 4, 178 (2013).
- Rocke, D. M., et al. Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data. bioRxiv. , (2015).
- Agarwal, A., et al. Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays. BMC genomics. 11, 383 (2010).
- Leng, N., et al. EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments. Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).
