Summary
Aqui apresentamos procedimentos cirúrgicos refinados na realização com sucesso do transplante de ilhotas intraportais, um procedimento cirúrgico clinicamente relevante, mas tecnicamente desafiador, em camundongos.
Abstract
Embora o fígado seja atualmente aceito como o principal local de transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos, as ilhotas são transplantadas sob a cápsula renal na maioria dos estudos de transplante de ilhotas pré-clínicas de roedores. Este modelo é comumente usado porque o transplante de ilhotas intrahpáticas de murina é tecnicamente desafiador, e uma alta porcentagem de camundongos pode morrer de complicações cirúrgicas, especialmente sangrando do local de injeção pós-transplante. Neste estudo, são demonstrados dois procedimentos que podem minimizar a incidência de sangramento venoso do portal pós-infusão. O primeiro método aplica uma esponja de gelatina hemostática absorvível no local da injeção, e o segundo método envolve penetrar a agulha de injeção de ilhotas através do tecido adiposo primeiro e depois na veia portal usando o tecido adiposo como uma barreira física para parar o sangramento. Ambos os métodos poderiam efetivamente prevenir a morte do rato induzido pelo sangramento. Toda a seção hepática que mostra distribuição de ilhotas e evidências de trombose de ilhotas pós-transplante, característica típica do transplante de ilhotas intrahpáticas, foram apresentadas. Esses protocolos aprimorados refinam os procedimentos de transplante de ilhotas intrahpáticas e podem ajudar os laboratórios a configurar o procedimento para estudar a sobrevida de ilhotas e funcionar em ambientes pré-clínicos.
Introduction
O transplante de ilhotas intraportais (IIT) através da veia portal é o método mais utilizado para transplante de ilhotas humanas em ambientes clínicos. O modelo de IIT do camundongo oferece uma grande oportunidade de estudar transplante de ilhotas e testar abordagens intervencionistas promissoras que podem aumentar a eficácia do transplante de ilhotas1. O IIT foi descrito pela primeira vez na década de 1970 e usado por vários grupos1,2,3,4,5. Recuperou popularidade após o avanço no transplante de ilhotas humanas no ano de 20006,7. No entanto, a maioria dos estudos de transplante de ilhotas usou a cápsula renal como local preferido para transplante experimental de ilhotas devido ao seu fácil sucesso. Pelo contrário, o IIT é mais desafiador tecnicamente e menos frequentemente utilizado para estudos de transplante de ilhotas8,9. Ao contrário do IIT, no entanto, as ilhotas transplantadas sob a cápsula renal não sofrem da reação inflamatória mediada pelo sangue imediata caracterizada por trombose, inflamação e isquemia de tecido hepático, e, portanto, têm melhor função do que as ilhotas transplantadas no fígado. O modelo de cápsula renal, portanto, não pode imitar totalmente as tensões encontradas pelas ilhotas no transplante de ilhotas humanas10,11,12.
Uma das principais complicações do IIT em camundongos é o sangramento do local da injeção após o transplante, o que poderia causar 10-30% de mortalidade entre diferentes cepas de camundongos12. Neste artigo, duas abordagens refinadas foram desenvolvidas para parar o sangramento de forma mais rápida e segura e reduzir a mortalidade de camundongos após uma IIT. A demonstração visual desses detalhes refinados ajudará os pesquisadores a identificar os principais passos deste procedimento tecnicamente desafiador. Além disso, a localização dos enxertos de ilhotas no fígado do receptor foi determinada por exame histológico da Hematoxilina e Eosin (H&E) com ilhotas transplantadas.
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Protocol
Todos os procedimentos foram conduzidos com a aprovação dos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais na Universidade Médica da Carolina do Sul e do Ralph H Johnson Medical Center em Charleston.
1. Indução de diabetes usando estreptozotocina (STZ)
- Preparação de ratos receptores:
- Pesar todos os ratos individualmente.
- Verifique os níveis de glicose no sangue de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um glucometer.
- Determinação da dose STZ para três cenários diferentes:
- Para camundongos com doença hepática gordurosa, injete uma dose de STZ [40 mg/kg/dia, injeção intraperitoneal (i.p.) por 5 dias consecutivos.
- Para ratos NOD-SCID injetar 125 mg/kg de STZ, injeção única, i.p. após o jejum durante a noite.
- Para C57BL/6 camundongos injetam 225 mg/kg de STZ, injeção única, i.p.
- Cálculos para STZ (13,5 mg/mL):
NOTA: Este cálculo é para cinco camundongos C57BL/6 com pesos corporais de 30 g:- Peso corporal total: 5 ratos x 30 g/mouse = 150g
- STZ necessário: 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33,75 mgs
- Preparação stz:
- Pese o STZ seguindo a dose pré-calculada.
- Transfira o pó STZ pesado para um béquer de 10 mL no gelo.
- Adicione 3 mL de solução de citrato de sódio ao béquer para dissolver o STZ.
- Misture bem, filtre esterilizar através de um poro de 0,22 μm e use a solução STZ dentro de 10 minutos de preparação.
- Injeção de STZ:
- Carregue a quantidade desejada de solução STZ (suficiente para um mouse) em seringa de 1 mL.
- Realize a injeção intraperitoneal no quadrante inferior direito do abdômen do rato.
- Observe os camundongos por 5 minutos após a injeção e verifique se há sinais de desconforto durante este período de tempo antes de colocá-los de volta nas gaiolas.
- Monitore o nível de glicose no sangue de uma amostra de sangue da veia da cauda usando um glucometer diariamente após a injeção de STZ.
NOTA: Neste experimento, os camundongos são considerados diabéticos quando a glicemia não em jejum é > 350 mg/dL por dois dias consecutivos.
2. Preparação de ilhotas
NOTA: As ilhotas humanas foram cultivadas em mídia CMRL-1066 suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina (P/S) a uma densidade de 10.000 ilhotas equivalente (IEQ) por 100 mm de cultura celular dish9. As ilhotas do rato foram cultivadas em DMEM com 10% de FBS e 1% P/S com a mesma densidade13. Os camundongos NOD-SCID masculinos e C57BL/7 entre 6 e 10 semanas de idade foram obtidos de fontes comerciais.
- Desprender ilhotas cultivadas do prato de cultura celular por arranhões suaves.
- Escolha a dedo números desejados de ilhotas (por exemplo, 300-350 ilhotas) usando uma seringa de 1cc e coloque-as em tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL estéreis no gelo.
- Gire o tubo por 10 segundos usando o microcentrifuuge.
- Remova o supernasce, deixando algum líquido para evitar perder a pelota.
- Resuspense a pelota em 200 μL de HBSS com albumina de soro bovino de 0,5% (BSA).
- Aspire as ilhotas resuspended em uma seringa de insulina de 0,5 mL.
- Coloque a seringa na posição vertical. Deixe as ilhotas afundarem por 1 min.
- Empurre a seringa para remover todas as bolhas, deixando cerca de 100-150 μL de líquido contendo ilhotas.
- Coloque a cabeça da seringa para baixo e bata suavemente no lado da seringa para deixar as ilhotas distribuirem igualmente por todo o líquido. Ilhotas estão prontas para injeção.
3. Transplante de ilhotas
- Induzir e manter o rato sob anestesia geral com 2% de isoflurane. Verifique a falta de reflexos do pedal para garantir a anestesia adequada do animal.
- Raspe e remova a pele na área do abdômen do rato.
- Administrar uma única dose pré-operatória de Buprenorfina (0,1 mg/kg i.p.).
- Desinfete a área cirúrgica com três lenços alternados de 2% de iodo e 75% de álcool.
- Faça uma laparotomia com micro tesoura para gerar uma incisão de 1-1,5 cm.
- Abra a cavidade peritoneal com um retrátil. Siga com o método A ou o método B conforme detalhado abaixo.
4. Método A: (pare de sangrar com espuma de gel, Figura 1A)14,15,16
- Preparação do rato
- Coloque uma gaze estéril ao redor da incisão.
- Puxe suavemente o intestino usando um fórceps e mantenha-o na gaze.
- Identifique a veia do portal por sua localização e exponha-a bem.
- Cubra o intestino com uma gaze salina quente durante toda a cirurgia.
- Insira a ilhota agulha de seringa de insulina pré-carregada através da veia portal perto do duodeno (Figura 1B). Para isso, segure a agulha com o orifício (bisel) voltado para baixo e posicione o ângulo da superfície de abertura paralela à parede da veia do portal antes de penetrar através da parede.
- Puxe o êmbolo para extrair um pouco de sangue (20-50 μL) na seringa para misturar as ilhotas primeiro.
- Infunda as ilhotas na veia do portal lentamente enquanto puxa e empurra repetidamente o mergulho.
- Coloque um pedaço de espuma de gel (cerca de 0,5 cm x 0,5 cm de tamanho) para cobrir o local da injeção.
- Pressione a espuma de gel para baixo com uma ponta de algodão enquanto puxa a agulha da veia do portal.
- Continue pressionando o gel por cerca de 2 minutos para confirmar que não há sangramento ativo.
- Enrole a ponta de algodão para cima e para longe da espuma de gel para ter certeza de que a espuma de gel cobre bem a veia do portal.
5. Método B: (pare de sangrar com almofada de gordura, Figura 1C)17
- Exponha bem a veia do portal.
- Use duas pontas de algodão para segurar a veia do portal exposto tanto do lado esquerdo quanto do direito.
- Identifique a almofada de tecido adiposo entre o duodeno e a veia portal.
- Penetre através da almofada de gordura antes de inserir a agulha na veia portal (Figura 1D).
- Infundir as ilhotas, seguindo o procedimento semelhante descrito acima nas partes 4.2.1 e 4.2.2 do Método A.
- Puxe a agulha enquanto pressiona a gordura com uma ponta de algodão.
- Continue pressionando a almofada de gordura por 1 minuto depois de remover a agulha.
- Após confirmar que não há sangramento da veia portal, retorne suavemente o intestino à cavidade peritoneal em sua posição original.
- Deixe 0,5 mL de soro fisiológico quente (36-37 °C) na cavidade abdominal antes do fechamento.
NOTA: O soro fisiológico quente facilita o movimento e a recuperação do intestino pós-cirurgia e previne a necrose intestinal. - Feche a camada muscular com uma sutura 5-0.
- Feche a camada de pele com uma sutura 4-0.
- Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento até que esteja totalmente recuperado da anestesia.
- Continue fornecendo um analgésico (por exemplo, buprenorfina 0,1 mg/kg i.p.) a cada 12h e calor suplementar para 48 h pós-cirurgia.
NOTA: O procedimento de transplante de ilhotas leva aproximadamente 15-20 minutos para ser concluído.
6. Mancha h&E e fotografia de toda a seção hepática
- Perfusão hepática
- Coloque o rato sob anestesia como descrito acima na parte 3.1.
- Exponha cuidadosamente a veia do portal e corte a veia cava inferior.
- Perfumar manualmente o fígado usando 20 mL de 10% de paraformaldeído através da veia portal por cerca de 5 minutos, utilizando uma seringa de 20 mL com agulha 25G18.
NOTA: A perfusão hepática pode remover sangue do tecido hepático e melhorar a fixação hepática sem perturbar os enxertos de ilhotas. - Dissecar o fígado inteiro perfumado de outros órgãos.
- Fixar o tecido hepático perfumado em 10% paraformaldeído por 24 h.
- Incorpore o tecido em parafina.
- Corte seções de tecido de 5 μm de espessura cada e coloque-as em uma lâmina de vidro para coloração.
- Realize a coloração de H&E, insulina, fibrina e nêutrons polimorfonuclear (PMN) utilizando métodos padrão15,16.
- Escaneie a seção hepática inteira sob um microscópio.
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Representative Results
Realizamos transplantes de ilhotas sinténicas e xenogênicas através da veia portal. A função do enxerto de ilhota foi observada de forma dependente de dose em ambos os modelos de transplante de ilhotas. No modelo de transplante de ilhotas sinténicas usando camundongos C57BL/6, o transplante de 250 ilhotas levou à normolicemia transitória antes que os camundongos retornassem à hiperglicemia. Camundongos que receberam 500 ilhotas alcançaram e mantiveram a normolicemia além de 30 dias após o transplante (Figura 2A). Camundongos em ambos os grupos apresentaram aumento de peso corporal (Figura 2B).
Da mesma forma, nas ilhotas humanas para o modelo diabético de transplante de ilhotas de camundongos NOD-SCID, a função do enxerto de ilhota foi comparada quando 45, 85 ou 140 IEQs/kg de pesos corporais foram transplantados. A normoglicemia não pôde ser alcançada quando 45 IEQ/g (~225-275 ilhotas/camundongos) foram transplantadas. Quando o número de ilhotas aumentou para 85 IEQ/g (~ 400-450 ilhotas/mouse), 35,7% (28/10) dos receptores alcançaram a normoglicemia (p =0,02 vs. 45 grupo IEQ/g) no dia 60 pós-transplante. Além disso, 83,3% (5/6) dos beneficiários que receberam 140 IEQ/g (~ 600-650 ilhotas/camundongos) de ilhotas humanas atingiram a normolícemia (Figura 2C). Além disso, a maioria dos camundongos que tinham sangramento morreu após a cirurgia, enquanto os camundongos sem sangramento sobreviveram (Figura 2D).
Uma vez que ilhotas humanas suficientes sejam mal-grafadas para receptores DE NOD-SCID, seus níveis de glicose no sangue podem ser bem controlados no estágio inicial pós-transplante e bem mantidos até o final do estudo. As ilhotas enxertadas podem ser facilmente identificadas por H&E e manchas de insulina. Aos 28 dias após o transplante, as ilhotas humanas transplantadas foram distribuídas uniformemente por todo o fígado, principalmente ao redor/perto de um vaso sanguíneo (Figura 3).
O modelo intrahpático foi usado para demonstrar reação inflamatória mediada pelo sangue instantâneo, como visto no transplante de ilhotas humanas. Em nossa seção tecidual, observamos expressão de insulina, e presença de infiltração de leucócitos fibrinas e polimorfonucleares em ilhotas transplantadas (Figura 4A-D).
Figura 1: Ilustração de procedimentos de transplante de ilhotas intrahpáticas. (A, C). Esquemas de passos-chave utilizados no Método A e Método B. (B, D). As ilhotas foram injetadas diretamente pela veia portal (C) ou indiretamente via pat de gordura (D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos do transplante de ilhotas intraportais. (A, B). Transplante intraportal de ilhotas de camundongos síndicos. Ilhotas pancreáticas (250 ou 500) de camundongos C57BL/6 foram transplantadas em camundongos C57BL/6 machos que foram tornados diabéticos pela STZ. a Os níveis de glicemia em série foram medidos. A normoglicemia foi definida como níveis de glicose <200 mg/dL por >2 dias consecutivos. (B) Observou-se aumento do peso corporal dos receptores no pós transplante de ilhotas. (C) Percentual de camundongos DIAbéticos NOD-SCID que atingem a normolicemia em camundongos que recebem um número diferente de ilhotas humanas a 45 IEQ/g (n=7), 85 IEQ/g (n=28) e 140 IEQ/g (n=6). (D) Percentual de sobrevivência após iIT em camundongos sangrando e não sangrando (n=14 cada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Mancha de H&E de seções hepáticas de fígado com enxerto de ilhota humana com enxerto de ilhota humana aos 28 dias após o transplante. Ilhotas são marcadas por círculos negros. O diâmetro de cada círculo corresponde positivamente com o tamanho de cada ilhota. Barra de escala =1.000 μm em seção hepática inteira e 100 μm no inset. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imagens histológicas representativas de ilhotas de camundongos transplantadas intraportal no fígado 6h após transplante intraportal. (A) H&E, (B) insulina (vermelha) (C) Fibrin e (D) manchas de PMN. Barra de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Neste estudo, dois procedimentos aprimorados que podem prevenir sangramento e reduzir a mortalidade do rato durante o IIT do camundongo foram demonstrados. Este estudo permite que os pesquisadores visualizem o modelo de transplante de ilhotas que é único no estudo da resposta inflamatória mediada pelo sangue instantâneo após o transplante. O modelo IIT é um modelo distinto para estudar a sobrevivência das células ilhotas e lesões isquêmicas hepáticas em resposta ao transplante de ilhotas19. Aqui, refinamos o procedimento com base em estudos anteriores e reduzimos a mortalidade precoce de camundongos induzidos por complicações. Ambos os métodos A14,15,16 e o método B8,9 foram utilizados em múltiplos estudos. Mostramos que as ilhotas distribuídas entre todo o fígado, e a infiltração de neutrófilos e trombose tipicamente associadas ao IIT foram proeminentes no enxerto imediatamente após o transplante.
Existem vários passos-chave no transplante de ilhotas hepáticas do rato. Como tanto as ilhotas humanas quanto as de camundongos podem ter tamanho de 200 μm, um tamanho de agulha de pelo menos 27G deve ser usado para transplante para garantir o fluxo suave dos produtos de ilhotas. No entanto, isso geraria um grande buraco na veia portal que pode causar sangramento após a remoção da agulha. Injetando ilhotas através do ângulo correto e usando uma esponja dentária para bloquear o local de injeção ou injeção através do tecido adiposo, a chance de sangramento pode ser minimizada, e os camundongos têm maiores taxas de sobrevivência após o transplante. Essas etapas também podem ajudar a evitar lesões de isperfusão de isquemia quente do fígado causadas pelo bloqueio do fluxo sanguíneo da veia portal ao realizar este procedimento19. Eles também podem reduzir os danos ao fígado e aos intestinos que podem contribuir para a mortalidade do camundongo após a cirurgia.
Há também várias limitações do modelo de transplante de ilhotas intrahápticas do camundongo em comparação com a configuração de transplante de ilhotas humanas. Primeiro, não podemos monitorar a pressão da veia do portal do mouse durante a infusão de ilhotas como fazemos nas configurações clínicas. Em segundo lugar, o volume que pode ser transplantado nos camundongos pode não refletir a alta quantidade de produto ilhota transplantado em um humano. Portanto, a extensão da trombose pode ser diferente. Em terceiro lugar, os enxertos de ilhotas de camundongos após o transplante serão temporariamente expostos a um ambiente hiperglicêmico, uma vez que nenhuma insulina será dada aos camundongos, enquanto em humanos20, a insulina seria dada durante o período de peri-transplante para reduzir o estresse das ilhotas transplantadas20. No entanto, o modelo de ilhotas intraepépticas oferece um modelo pré-clínico único que pode ser usado para estudar transplante de ilhotas humanas.
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Disclosures
Todos os autores declaram que não têm conflito de interesses.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Departamento de Assuntos dos Veteranos (VA-ORD BLR&D Mérito I01BX004536), e pelo Instituto Nacional de Saúde concede # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, à HW. Gostaríamos de agradecer ao Sr. Michael Lee e à Sra. Lindsay Swaby pela edição de linguagem
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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