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方法論記事

マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

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DOI:

10.3791/62530

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2021年5月10日

 ,  ,  , 

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、マウスにおける門脈内膵島移植(臨床的には関連性はあるが技術的に困難な外科的処置)を成功裏に実施するための洗練された外科的処置を提示する。

要約

肝臓は現在、臨床現場でヒト膵島の主要な移植部位として受け入れられているが、膵島はほとんどのげっ歯類の前臨床膵島移植研究において腎臓カプセルの下に移植される。このモデルは、マウスの肝内膵島移植が技術的に困難であり、高い割合のマウスが外科的合併症、特に移植後の注射部位からの出血で死亡する可能性があるため、一般的に使用される。この研究では、注入後の門脈出血の発生率を最小限に抑えることができる2つの手順が実証されている。第1の方法は、吸収性止血ゼラチンスポンジを注射部位に適用し、第2の方法は、脂肪組織を出血を止めるための物理的障壁として使用することによって、まず脂肪組織を通って膵島注射針を貫通し、次いで門脈に浸透させることを含む。どちらの方法も、出血誘発マウスの死を効果的に防止することができた。肝内膵島移植の代表的な特徴である膵島分布と移植後の膵島血栓症の証拠を示す全肝臓切片が提示された。これらの改善されたプロトコルは、肝内膵島移植手順を改良し、実験室が前臨床環境で膵島の生存と機能を研究するための手順を設定するのに役立つ可能性がある。

概要

門脈を介した門脈内膵島移植(IIT)は、臨床現場でヒト膵島移植に最も一般的に使用される方法である。マウスIITモデルは、膵島移植を研究し、膵島移植の有効性を高めることができる有望な介入アプローチをテストする絶好の機会を提供します1。IITは1970年代に初めて記載され、いくつかのグループ1、2、3、4、5によって使用されました。それは20006,7年にヒト膵島移植のブレークスルーの後に人気を取り戻しました。 しかし、ほとんどの膵島移植研究は、その容易な成功のために実験的な膵島移植のための好ましい部位として腎臓カプセルを使用した。それどころか、IITはより技術的に困難であり、膵島移植研究にはあまり使用されていません8,9。しかし、IITとは異なり、腎臓カプセルの下に移植された膵島は、血栓症、炎症、お....

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プロトコル

すべての手順は、サウスカロライナ医科大学とチャールストンのラルフHジョンソン医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て実施されました。

1. ストレプトゾトシン(STZ)を用いた糖尿病誘導

  1. レシピエントマウス調製:
    1. すべてのマウスを個別に計量する。
    2. グルコメーターを用いて尾静脈血サンプルから血糖値を確認する。
  2. 3つの異なるシナリオに対するSTZ線量決定:
    1. 脂肪肝疾患のマウスの場合、STZ [40mg / kg /日、腹腔内注射]を5日間連続して1回注射する。
    2. NOD-SCIDマウスの場合、一晩絶食した後、125mg / kgのSTZ、単回注射、すなわち注射する。
    3. C57BL / 6マウスの場合、225mg / kgのSTZ、単回注射、i.p.
  3. STZ (13.5 ミリグラム/mL) の計算:
    注:この計算は、体重が30gの5匹のC57BL/6マウスを対象としています。
    1. 総体重:5匹×30g/匹=150g
    2. 必要なSTZ : 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg
  4. STZの準備:
    1. 事前に計算された用量に従ってSTZを計量する。....

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結果

我々は、門脈を介して同系および異系膵島移植を行った。膵島移植機能は、両方の膵島移植モデルにおいて用量依存的に観察された。C57BL/6マウスを用いた同系膵島移植モデルでは、250匹の膵島を移植すると、マウスが高血糖に戻る前に一過性正常血糖が生じた。500膵島を受けたマウスは、移植後30日を超えて正常血糖に達し、維持した(図2A)。両群のマウスは体重の増加を示した(図2B)。

同様に、ヒト膵島対糖尿病NOD-SCIDマウス膵島移植モデルにおいて、体重45、85、または140 IEQs/kgを移植した場合の膵島移植機能を比較した。ノルモ血糖は、45 IEQ/g(〜225-275膵島/マウス)のヒト膵島を移植した場合に達成できなかった。膵島数が85 IEQ/g(~400-450膵島/マウス)に増加したとき、レシピエントの35.7%(10/28)は移植後60日目に正常血糖(p = 0.02対45 IEQ/g群)を達成した。さらに、ヒト膵島140IEQ/g(~600~650.......

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ディスカッション

この研究では、出血を予防し、マウスIIT中のマウス死亡率を低下させる可能性のある2つの改善された手順が実証されている。この研究により、研究者は、移植後の即時血液媒介性炎症反応を研究する上でユニークな膵島移植モデルを視覚化することができます。IITモデルは、膵島移植に応答した膵島細胞の生存と肝虚血傷害を研究するための特徴的なモデルです19。ここでは、以前の研究に基づいて手順を洗練させ、合併症誘発マウスの早期死亡率を低下させた。方法A14,15,16および方法B8,9の両方が複数の研究で使用された。我々は、膵島が肝臓全体に分布していることを示し、移植直後の移植片では、IITに典型的に関連する好中球浸潤および血栓症が顕著であった。

マウス肝.......

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開示事項

すべての著者は、利益相反がないと宣言します。

謝辞

この研究は、退役軍人省(VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536)と国立衛生研究所がHWに#1R01DK105183、DK120394、DK118529を助成した。言語編集のマイケル・リー氏とリンゼイ・スワビー氏に感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10% 中性緩衝ホルマリン v/vフィッシャー・サイエンティフィック23426796
1 mL 針付きシリンジAHSAH01T
20 mL シリンジBD301031
25G x 5/8 インチ皮下注射針BD305122
アルコール調製パッド、滅菌フィッシャー・サイエンティフィック22-363-750
動物麻酔システムVetEquip、株式会社
ブプレノルフィン塩酸塩、注射Par Sterile Products, LLCNDC 42023-179-05
遠心分離管、15 mLFisher Scientific0553859A
CMRL-1066Corning15110CV
DMEMCorning10013CV
エタノール、絶対 (200 プルーフ)、分子生物学グレードFisher Scientific
極細マイクロ解剖はさみ4 "まっすぐで鋭いRoboz Surgical Instrument Co.RS-5882
ウシ胎児血清(FBS)Corning35011CV
FreeStyle グルコースメーターアボットライト
フリースタイル 血糖値テストストリップアボットライト
ゲルフォーム (吸収性ゼラチンスポンジ、USP)ファルマシア &Upjohn Company34201
Graefe鉗子4 "超繊細な先端Roboz Surgical Instrument Co.RS-5136
加熱パッドAmazonB07HMKMBKM
Hegar-Baumgartnerニードルホルダー5.25インチロボズ手術器具株式会社RS-7850
インスリン注射器 27ゲージ針付きBD879588
ヨウ素準備パッドフィッシャーサイエンティフィック19-027048
イソフルランピラマル クリティカルケアNDC 66794-017-25
ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)HyCloneSV30010
ポリプロピレン縫合糸 4-0Med-Vet InternationalMV-8683
ポリプロピレン縫合糸 5-0Med-Vet InternationalMV-8661
塩化ナトリウム、0.9% 静脈内溶液VWR2B1322Q
ストレプトゾシン (STZ)SigmaS0130
外科用ドレープ、滅菌済みMed-Vet InternationalDR1826
組織カセットフィッシャー・サイエンティフィック22-272416
901806BP2818500

参考文献

  1. Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes. Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).
  2. Ballinger, W. F., Lacy, P. E. Transplantation of intact pancreatic islets in rats. Surg....

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