Summary
在这里，我们介绍了在小鼠中成功进行门内胰岛移植的精细外科手术，这是一种临床相关但技术上具有挑战性的外科手术。
Abstract
虽然肝脏目前在临床环境中被接受为人类胰岛的主要移植部位，但在大多数啮齿动物临床前胰岛移植研究中，胰岛被移植到肾囊下。该模型是常用的，因为小鼠肝内胰岛移植在技术上具有挑战性，并且很大比例的小鼠可能死于手术并发症，特别是移植后注射部位的出血。在这项研究中，证明了两种可以最大限度地减少输注后门静脉出血发生率的程序。第一种方法将可吸收的止血明胶海绵应用于注射部位，第二种方法涉及首先穿透胰岛注射针穿过脂肪组织，然后通过使用脂肪组织作为物理屏障进入门静脉以止血。这两种方法都可以有效防止出血引起的小鼠死亡。介绍了胰岛分布和移植后胰岛血栓形成证据的整个肝脏切片，这是肝内胰岛移植的典型特征。这些改进的方案改进了肝内胰岛移植程序，并可能有助于实验室建立程序，以研究胰岛存活率和临床前功能。
Introduction
通过门静脉进行门静脉门内胰岛移植 （IIT） 是临床环境中最常用的人胰岛移植方法。小鼠IIT模型为研究胰岛移植和测试可以提高胰岛移植疗效的有希望的介入方法提供了很好的机会1。IIT在20世纪70年代首次被描述，并被几个团体使用1，2，3，4，5。在20006年人类胰岛移植取得突破后，它重新流行起来，7。 然而，大多数胰岛移植研究使用肾胶囊作为实验性胰岛移植的首选部位，因为它很容易成功。相反，IIT在技术上更具挑战性，用于胰岛移植研究的频率较低8，9。然而，与IIT不同的是，移植在肾囊下的胰岛不会立即发生以血栓形成，炎症和肝组织缺血为特征的血液介导的炎症反应，因此比移植到肝脏中的胰岛具有更好的功能。因此，肾胶囊模型可能无法完全模仿胰岛移植中胰岛遇到的应激10，11，12。
小鼠IIT的主要并发症之一是移植后注射部位出血，这可能导致不同小鼠品系死亡率的10-30%12。在本文中，已经开发了两种改进的方法，以更快，更安全地止血并降低IIT后的小鼠死亡率。这些精致细节的视觉演示将帮助研究人员确定这一技术上具有挑战性的程序的关键步骤。此外，通过对含移植胰岛的苏木精和曙红（H&E）染色的肝组织（整个切片）的组织学检查来确定胰岛移植物在受体肝脏中的位置。
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Protocol
所有程序均在南卡罗来纳医科大学和查尔斯顿拉尔夫·约翰逊医疗中心的机构动物护理和使用委员会的批准下进行。
1. 使用链脲佐菌素（STZ）诱导糖尿病
- 受体小鼠制剂：
- 单独称量所有小鼠的体重。
- 使用血糖仪检查尾静脉血液样本中的血糖水平。
- 三种不同场景的 STZ 剂量测定：
- 对于患有脂肪肝疾病的小鼠，连续5天注射一剂STZ [40mg / kg /天，腹膜内（ip）注射]。
- 对于NOD-SCID小鼠，注射125mg / kg STZ，单次注射，在过夜禁食后ip。
- 对于C57BL / 6小鼠注射225mg / kg STZ，单次注射，ip。
- STZ（13.5 毫克/毫升）的计算：
注意：此计算适用于体重为30克的五只C57BL / 6小鼠：- 总重量：5只小鼠x 30克/只老鼠=150克
- 所需自温区：150克×225毫克/1000克标准筋=33.75毫克
- STZ准备：
- 按照预先计算的剂量称量STZ。
- 将称重的STZ粉末转移到冰上的10 mL烧杯中。
- 向烧杯中加入3mL柠檬酸钠溶液以溶解STZ。
- 充分混合，过滤灭菌，通过0.22μm孔，并在制备后10分钟内使用STZ溶液。
- STZ注入：
- 将所需量的STZ溶液（足够一只鼠标）加载到1 mL注射器中。
- 在小鼠腹部右下象限进行腹膜内注射。
- 注射后观察小鼠5分钟，并在将小鼠放回笼子之前检查在此期间是否有任何不适迹象。
- STZ注射后，每天使用血糖仪监测尾静脉血液样本的血糖水平。
注意：在本实验中，当非空腹血糖连续两天>350 mg / dL时，小鼠被认为是糖尿病患者。
2. 胰岛准备
注意：将人胰岛培养在补充有10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素（P / S）的CMRL-1066培养基中培养，密度为每100mm细胞培养皿10，000胰岛当量数（IEQ）9。在DMEM中以10%FBS和1%P / S培养小鼠胰岛，具有相同的密度13。从商业来源获得6-10周龄的雄性NOD-SCID和C57BL / 7小鼠。
- 通过轻轻刮擦将培养的胰岛从细胞培养皿中分离出来。
- 使用1cc注射器手工挑选所需数量的胰岛（例如，300-350个小岛），并将它们放入冰上的无菌1.5 mL微量离心管中。
- 使用微量离心机旋转管子10秒钟。
- 除去上清液，留下一些液体以避免丢失沉淀。
- 将沉淀重悬于200μLHBSS与0.5%牛血清白蛋白（BSA）中。
- 将重悬的胰岛吸入0.5 mL胰岛素注射器中。
- 将注射器直立放置。让胰岛沉入1分钟。
- 推动注射器除去所有气泡，留下约100-150μL含有胰岛的液体。
- 将注射器头朝下，轻轻敲击注射器的侧面，使胰岛均匀分布在整个液体中。胰岛现在已准备好注射。
3. 胰岛移植
- 用2%异氟醚在全身麻醉下诱导和维持小鼠。检查是否缺乏踏板反射，以确保对动物进行适当的麻醉。
- 剃掉并去除鼠标腹部区域的皮毛。
- 给予单次术前剂量的丁丙诺啡（0.1mg / kg ip）。
- 用三块2%碘和75%酒精交替擦拭消毒手术区域。
- 用微型剪刀进行剖腹手术，以产生1-1.5厘米的切口。
- 用牵开器打开腹膜腔。请遵循方法 A 或方法 B，详见下文。
4. 方法A：（用凝胶泡沫止血，图1A）14，15，16
- 小鼠制备
- 在切口周围放置无菌纱布。
- 用镊子轻轻拉出肠道，并将其保持在纱布上。
- 通过门静脉的位置识别门静脉，并使其暴露良好。
- 在整个手术过程中，用温盐湿纱布覆盖肠道。
- 将胰岛预装胰岛素注射器针头插入十二指肠附近的门静脉（图1B）。为此，请握住针，使孔（斜面）朝下，并将开口表面的角度与门静脉壁平行，然后再穿透壁。
- 拉动柱塞将一些血液（20-50μL）抽入注射器以首先混合胰岛。
- 将胰岛缓慢注入门静脉，同时反复拉动和推动跳水。
- 放置一块凝胶泡沫（约0.5厘米×0.5厘米大小）以覆盖注射部位。
- 用棉头压下凝胶泡沫，同时从门静脉中拔出针头。
- 继续按压凝胶约2分钟，以确认没有活动性出血。
- 将棉质翻盖并远离凝胶泡沫，以确保凝胶泡沫很好地覆盖门静脉。
5. 方法B：（用脂肪垫止血，图1C）17
- 彻底暴露门静脉。
- 使用两个棉质尖端从左侧和右侧固定暴露的门静脉。
- 识别十二指肠和门静脉之间的脂肪组织垫。
- 在将针头插入门静脉之前穿透脂肪垫（图1D）。
- 按照上述方法 A 的第 4.2.1 和 4.2.2 部分中描述的类似步骤注入胰岛。
- 拔出针头，同时用棉签压脂肪。
- 取出针头后继续按压脂肪垫1分钟。
- 在确认门静脉没有出血后，轻轻地将肠放回腹膜腔的原始位置。
- 在闭合前将0.5毫升温盐水（36-37°C）留在腹腔中。
注意：温盐水有助于手术后的肠道运动和恢复，并防止肠道坏死。 - 用5-0缝合线关闭肌肉层。
- 用4-0缝合线关闭皮肤层。
- 将鼠标放在加热垫上的干净笼子中，直到从麻醉中完全恢复。
- 继续每 12 小时提供镇痛药（例如丁丙诺啡 0.1 mg/kg ip），并在术后 48 小时补充供热。
注意：胰岛移植程序大约需要15-20分钟才能完成。
6. H&E染色和全肝切片照片
- 肝脏灌注
- 将鼠标置于麻醉状态，如上文第3.1部分所述。
- 小心地暴露门静脉并切下腔静脉。
- 使用20 mL注射器和25G针头18，使用20 mL 10%多聚甲醛通过门静脉手动灌注肝脏约5分钟。
注意：肝脏灌注可以从肝脏组织中去除血液并改善肝脏固定，而不会干扰胰岛移植物。 - 从其他器官中解剖灌注的整个肝脏。
- 将灌注的肝脏组织固定在10%多聚甲醛中24小时。
- 将组织嵌入石蜡中。
- 切下每个5μm厚度的组织切片，并将它们放在载玻片上进行染色。
- 使用标准方法进行H&E，胰岛素，纤维蛋白和多形核中性粒细胞（PMN）染色15，16。
- 在显微镜下扫描整个肝脏切片。
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Representative Results
我们通过门静脉进行了同源和异种胰岛移植。在两种胰岛移植模型中都以剂量依赖性方式观察到胰岛移植物功能。在使用C57BL / 6小鼠的同源胰岛移植模型中，移植250个小岛导致小鼠恢复到高血糖之前暂时性正常血糖。接受500个胰岛的小鼠在移植后30天后达到并保持正常血糖（图2A）。两组小鼠均显示体重增加（图2B）。
同样，在人胰岛到糖尿病NOD-SCID小鼠胰岛移植模型中，当移植45，85或140 IEQs / kg体重时，比较胰岛移植功能。移植45 IEQ/g（~225-275个胰岛/小鼠）人胰岛时，无法达到正常血糖。当胰岛数增加到85 IEQ / g（〜400-450个胰岛/小鼠）时，35.7%（10/28）的受体在移植后第60天达到正常血糖（p = 0.02 vs. 45 IEQ / g组）。此外，接受140 IEQ / g（〜600-650胰岛/小鼠）的接受者中有83.3%（5/6）达到正常血糖（图2C）。此外，大多数出血的小鼠在手术后死亡，而没有出血的小鼠存活 下来（图2D）。
一旦将足够的人类胰岛移植到NOD-SCID受体上，他们的血糖水平就可以在移植后的早期阶段得到很好的控制，并保持良好，直到研究结束。移植的胰岛可以通过H&E和胰岛素染色轻松识别。在移植后28天，移植的人胰岛均匀分布在整个肝脏中，主要在血管周围/附近（图3）。
肝内模型用于演示在人胰岛移植中看到的即时血液介导的炎症反应。在我们的组织切片中，我们观察到胰岛素的表达，以及移植胰岛中存在纤维蛋白和多形核白细胞浸润（图4A-D）。
图1：肝内胰岛移植程序的图示（A，C）。方法 A 和方法 B（B、D）中使用的关键步骤示意图。胰岛直接通过门静脉（C）注射，或通过脂肪拍（D）间接注射。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：门内胰岛移植的代表性结局。（A、B）。 同源小鼠胰岛门内移植。将来自C57BL / 6小鼠的胰岛（250或500）移植到雄性C57BL / 6小鼠中，这些小鼠通过STZ呈现糖尿病。（A）连续测量血糖水平。正常血糖被定义为连续>2天<200 mg / dL的葡萄糖水平。（B）在胰岛移植后观察到受者体重的增加。（C）在45 IEQ / g（n = 7），85 IEQ / g（n = 28）和140 IEQ / g（n = 6）接受不同数量人类胰岛的小鼠中，糖尿病NOD-SCID小鼠达到正常血糖的百分比。（D）出血和非出血小鼠IIT后存活率（各n = 14）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：移植后28天NOD-SCID肝部人胰岛移植物肝脏切片的H&E染色。 小岛以黑色圆圈为标志。每个圆的直径与每个小岛的大小成正比。比例尺 =1，000 μm 在整个肝脏切片和 100 μm 在插图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：门内移植后6小时肝内移植小鼠胰岛的代表性组织学图片。 （A）H&E，（B）胰岛素（红色）（C）纤维蛋白和（D）PMN染色。比例尺 = 100 μm。请点击此处查看此图的放大版本。
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Discussion
在这项研究中，已经证明了两种改进的程序，可以预防出血并可能降低小鼠IIT期间的小鼠死亡率。这项研究使研究人员能够可视化胰岛移植模型，该模型在研究移植后血液介导的即时炎症反应方面是独一无二的。IIT模型是研究胰岛细胞存活和胰岛移植引起的肝缺血性损伤的独特模型19。在这里，我们根据以前的研究改进了程序，并降低了早期并发症诱导的小鼠死亡率。方法A14，15，16和方法B8，9 都用于多项研究。我们发现胰岛分布在整个肝脏中，通常与IIT相关的中性粒细胞浸润和血栓形成在移植后立即在移植物中突出。
小鼠肝胰岛移植有几个关键步骤。由于人类和小鼠胰岛的大小都可以大至200μm，因此必须使用至少27G的针头尺寸进行移植，以确保胰岛产品的平稳流动。然而，这将在门静脉中产生一个大孔，可能导致拔针后出血。通过正确的角度注射胰岛并使用牙科海绵阻塞注射部位或通过脂肪组织注射，可以最大限度地减少出血的机会，并且小鼠在移植后具有更高的存活率。在执行此手术时，这些步骤还可能有助于避免由门静脉血流阻塞引起的肝温缺血再灌注损伤19。它们还可以减少对肝脏和肠道的损害，这些损害可能导致手术后小鼠死亡率。
与人类胰岛移植设置相比，小鼠肝内胰岛移植模型也存在一些局限性。首先，我们不能像在诊所环境中那样监测胰岛输注期间的小鼠门静脉压力。其次，可以移植到小鼠体内的体积可能无法反映移植到人体体内的大量胰岛产物。因此，血栓形成的程度可能不同。第三，移植后的小鼠胰岛移植物将暂时暴露在高血糖环境中，因为不会给小鼠注射胰岛素，而在人类20中，将在移植期给予胰岛素以减轻移植胰岛的压力20。然而，肝内胰岛模型提供了一种独特的临床前模型，可用于研究人胰岛移植。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了退伍军人事务部（VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536）和美国国立卫生研究院拨款#1R01DK105183，DK120394，DK118529，HW的支持。我们要感谢Michael Lee先生和Lindsay Swaby女士的语言编辑
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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