Summary
यहां हम इंट्रापोर्टल आइलेट प्रत्यारोपण को सफलतापूर्वक निष्पादित करने पर परिष्कृत सर्जिकल प्रक्रियाओं को प्रस्तुत करते हैं, जो चूहों में एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक लेकिन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण सर्जिकल प्रक्रिया है।
Abstract
यद्यपि जिगर को वर्तमान में नैदानिक सेटिंग्स में मानव आइलेट के लिए प्राथमिक प्रत्यारोपण स्थल के रूप में स्वीकार किया जाता है, आइलेट को अधिकांश कृंतक प्रीक्लिनिकल आइलेट प्रत्यारोपण अध्ययनों में गुर्दे के कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपित किया जाता है। इस मॉडल का आमतौर पर उपयोग किया जाता है क्योंकि मुरीन इंट्राहेपेटिक आइलेट प्रत्यारोपण तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है, और चूहों का एक उच्च प्रतिशत सर्जिकल जटिलताओं से मर सकता है, विशेष रूप से इंजेक्शन साइट से रक्तस्राव के बाद प्रत्यारोपण। इस अध्ययन में, दो प्रक्रियाएं जो पोस्ट-इन्फ्यूजन पोर्टल शिरा रक्तस्राव की घटनाओं को कम कर सकती हैं, का प्रदर्शन किया जाता है। पहली विधि इंजेक्शन साइट पर एक अवशोषित हेमोस्टेटिक जिलेटिन स्पंज लागू करती है, और दूसरी विधि में वसा ऊतक के माध्यम से आइलेट इंजेक्शन सुई को पहले और फिर रक्तस्राव को रोकने के लिए एक शारीरिक बाधा के रूप में वसा ऊतक का उपयोग करके पोर्टल नस में प्रवेश करना शामिल है। दोनों विधियां प्रभावी रूप से रक्तस्राव-प्रेरित माउस की मौत को रोक सकती हैं। आइलेट वितरण और आइलेट थ्रोम्बोसिस पोस्ट-ट्रांसप्लांटेशन के सबूत दिखाने वाले पूरे जिगर अनुभाग, इंट्राहेपेटिक आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक विशिष्ट विशेषता, प्रस्तुत किए गए थे। ये बेहतर प्रोटोकॉल इंट्राहेपेटिक आइलेट प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं को परिष्कृत करते हैं और प्रयोगशालाओं को पूर्व-नैदानिक सेटिंग्स में आइलेट अस्तित्व और कार्य का अध्ययन करने के लिए प्रक्रिया स्थापित करने में मदद कर सकते हैं।
Introduction
पोर्टल शिरा के माध्यम से इंट्रापोर्टल आइलेट प्रत्यारोपण (आईआईटी) नैदानिक सेटिंग्स में मानव आइलेट प्रत्यारोपण के लिए सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली विधि है। माउस आईआईटी मॉडल आइलेट प्रत्यारोपण का अध्ययन करने और होनहार इंटरवेंशनल दृष्टिकोणों का परीक्षण करने का एक शानदार अवसर प्रदान करता है जो आइलेट प्रत्यारोपण की प्रभावकारिता को बढ़ा सकता है। IIT को पहली बार 1970 के दशक में वर्णित किया गया था और इसका उपयोग कई समूहों द्वारा किया गया था1,2,3,4,5। इसने वर्ष 20006,7 में मानव आइलेट प्रत्यारोपण में सफलता के बाद लोकप्रियता हासिल की। हालांकि, अधिकांश आइलेट प्रत्यारोपण अध्ययनों ने अपनी आसान सफलता के कारण प्रयोगात्मक आइलेट प्रत्यारोपण के लिए एक पसंदीदा साइट के रूप में गुर्दे के कैप्सूल का उपयोग किया। इसके विपरीत, आईआईटी अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और आइलेट प्रत्यारोपण अध्ययन 8,9 के लिए कम बार उपयोग किया जाता है। आईआईटी के विपरीत, हालांकि, गुर्दे के कैप्सूल के तहत प्रत्यारोपित आइलेट्स तत्काल रक्त-मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया से पीड़ित नहीं होते हैं जो घनास्त्रता, सूजन और यकृत ऊतक इस्केमिया की विशेषता है, और इस प्रकार यकृत में प्रत्यारोपित आइलेट्स की तुलना में बेहतर कार्य होता है। इसलिए, किडनी कैप्सूल मॉडल पूरी तरह से मानव आइलेट प्रत्यारोपण 10,11,12 में आइलेट द्वारा सामना किए गए तनावों की नकल नहीं कर सकता है।
चूहों में आईआईटी की प्रमुख जटिलताओं में से एक प्रत्यारोपण के बाद इंजेक्शन साइट से खून बह रहा है, जो विभिन्न माउस उपभेदों के बीच मृत्यु दर का 10-30% का कारण बन सकता है। इस पेपर में, रक्तस्राव को अधिक तेजी से और सुरक्षित रूप से रोकने और आईआईटी के बाद माउस मृत्यु दर को कम करने के लिए दो परिष्कृत दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं। इन परिष्कृत विवरणों के दृश्य प्रदर्शन से शोधकर्ताओं को इस तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया के प्रमुख चरणों की पहचान करने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, प्राप्तकर्ता के जिगर में आइलेट ग्राफ्ट का स्थान हेमेटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग यकृत ऊतक (पूरे अनुभाग) की हिस्टोलॉजिकल परीक्षा द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसमें प्रत्यारोपित आइलेट्स होते हैं।
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Protocol
सभी प्रक्रियाओं को दक्षिण कैरोलिना के मेडिकल विश्वविद्यालय और चार्ल्सटन में राल्फ एच जॉनसन मेडिकल सेंटर में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों के अनुमोदन के साथ आयोजित किया गया था।
1. मधुमेह प्रेरण streptozotocin (एसटीजेड) का उपयोग कर
- प्राप्तकर्ता चूहों की तैयारी:
- व्यक्तिगत रूप से सभी चूहों वजन।
- ग्लूकोमीटर का उपयोग करके पूंछ की नस रक्त के नमूने से रक्त शर्करा के स्तर की जांच करें।
- तीन अलग-अलग परिदृश्यों के लिए एसटीजेड खुराक निर्धारण:
- फैटी लीवर रोग वाले चूहों के लिए लगातार 5 दिनों के लिए एसटीजेड [40 मिलीग्राम / किग्रा / दिन, इंट्रापेरिटोनियल (आईपी) इंजेक्शन] की एक खुराक इंजेक्ट करें।
- NOD-SCID चूहों के लिए 125 मिलीग्राम / किग्रा एसटीजेड, एकल इंजेक्शन, रात भर उपवास के बाद आई.पी. इंजेक्ट करते हैं।
- C57BL/6 चूहों के लिए 225 मिलीग्राम / किग्रा एसटीजेड, एकल इंजेक्शन, आई.पी.
- एसटीजेड के लिए गणना (13.5 मिलीग्राम / एमएल):
नोट: यह गणना 30 ग्राम के शरीर के वजन के साथ पांच C57BL / 6 चूहों के लिए है:- कुल शरीर के वजन: 5 चूहों x 30 ग्राम / माउस = 150g
- एसटीजेड की आवश्यकता है: 150 ग्राम x 225 मिलीग्राम / 1000g एसटीजेड = 33.75 मिलीग्राम
- एसटीजेड तैयारी:
- पूर्व-गणना की गई खुराक के बाद एसटीजेड का वजन करें।
- वजन एसटीजेड पाउडर को बर्फ पर 10 एमएल बीकर में स्थानांतरित करें।
- एसटीजेड को भंग करने के लिए बीकर में सोडियम साइट्रेट समाधान के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
- अच्छी तरह से मिलाएं, 0.22-μm छिद्र के माध्यम से स्टरलाइज़ करें, और तैयारी के 10 मिनट के भीतर एसटीजेड समाधान का उपयोग करें।
- एसटीजेड इंजेक्शन:
- 1 एमएल सिरिंज में एसटीजेड समाधान (एक माउस के लिए पर्याप्त) की वांछित मात्रा को लोड करें।
- माउस पेट के निचले दाएं चतुर्थांश पर इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन करें।
- इंजेक्शन के बाद 5 मिनट के लिए चूहों का निरीक्षण करें और उन्हें पिंजरों में वापस डालने से पहले समय की इस अवधि के दौरान असुविधा के किसी भी संकेत की जांच करें।
- एसटीजेड इंजेक्शन के बाद दैनिक रूप से ग्लूकोमीटर का उपयोग करके एक पूंछ शिरा रक्त नमूने से रक्त शर्करा के स्तर की निगरानी करें।
नोट: इस प्रयोग में, चूहों को मधुमेह माना जाता है जब गैर-उपवास रक्त ग्लूकोज लगातार दो दिनों के लिए 350 मिलीग्राम / डीएल > होता है।
2. आइलेट तैयारी
नोट: मानव आइलेट्स को सीएमआरएल -1066 मीडिया में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक किया गया था, और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) 10,000 आइलेट समकक्ष संख्या (आईईक्यू) प्रति 100 मिमी सेल संस्कृति डिश 9 के घनत्व पर। माउस आइलेट्स को डीएमईएम में 10% एफबीएस और 1% पी / एस के साथ समान घनत्व 13 के साथ सुसंस्कृत किया गया था। पुरुष NOD-SCID और C57BL / 7 चूहों की उम्र के 6-10 सप्ताह के बीच वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किए गए थे।
- कोमल scratching द्वारा सेल संस्कृति पकवान से सुसंस्कृत islets अलग.
- एक 1सीसी सिरिंज का उपयोग करके आइलेट्स (जैसे, 300-350 आइलेट्स) की वांछित संख्याओं को हाथ से चुनें और उन्हें बर्फ पर बाँझ 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें।
- माइक्रोसेंट्रीफ्यूज का उपयोग करके 10 सेकंड के लिए ट्यूब को स्पिन करें।
- supernatant निकालें, गोली खोने से बचने के लिए कुछ तरल छोड़.
- 0.5% गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) के साथ HBSS के 200 μL में गोली को फिर से निलंबित कर दिया।
- एक 0.5 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज में resuspended islets aspirate.
- सिरिंज को सीधी स्थिति में रखें। आइलेट्स को 1 मिनट के लिए नीचे डूबने दें।
- सभी बुलबुले को हटाने के लिए सिरिंज को पुश करें, लगभग 100-150 μL तरल युक्त आइलेट्स को छोड़ दें।
- सिरिंज सिर को नीचे रखें और धीरे से सिरिंज के किनारे पर टैप करें ताकि आइलेट्स को पूरे तरल में समान रूप से वितरित किया जा सके। आइलेट्स अब इंजेक्शन के लिए तैयार हैं।
3. आइलेट प्रत्यारोपण
- प्रेरित करें और 2% isoflurane के साथ सामान्य संज्ञाहरण के तहत माउस को बनाए रखने. पशु के उचित anesthetization सुनिश्चित करने के लिए पेडल सजगता की कमी के लिए जाँच करें।
- शेव करें और माउस के पेट क्षेत्र में फर को हटा दें।
- Buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा i.p.) की एक एकल पूर्व-ऑपरेटिव खुराक का प्रशासन करें।
- 2% आयोडीन और 75% अल्कोहल के तीन वैकल्पिक पोंछे के साथ सर्जिकल क्षेत्र को कीटाणुरहित करें।
- एक 1-1.5 सेमी चीरा उत्पन्न करने के लिए सूक्ष्म कैंची के साथ एक laparotomy प्रदर्शन।
- एक retractor के साथ पेरिटोनियल गुहा खोलें। या तो विधि ए या विधि बी के साथ पालन करें जैसा कि नीचे विस्तृत है।
4. विधि एक: (जेल फोम, चित्रा 1A के साथ खून बह रहा बंद करो)14,15,16
- माउस तैयारी
- चीरा के चारों ओर एक बाँझ धुंध रखें।
- धीरे से एक संदंश का उपयोग करके आंत को बाहर निकालें और इसे धुंध पर रखें।
- पोर्टल नस को उसके स्थान से पहचानें और इसे अच्छी तरह से उजागर करें।
- पूरी सर्जरी के दौरान आंत को गर्म खारा-गीला धुंध के साथ कवर करें।
- ग्रहणी के पास पोर्टल नस के माध्यम से आइलेट प्रीलोडेड इंसुलिन सिरिंज सुई डालें (चित्रा 1 बी)। ऐसा करने के लिए, छेद (बेवल) के साथ सुई को नीचे की ओर रखें और दीवार के माध्यम से घुसने से पहले पोर्टल शिरा की दीवार के समानांतर खोलने वाली सतह के कोण को रखें।
- पहले आइलेट्स को मिलाने के लिए सिरिंज में कुछ रक्त (20-50 μL) खींचने के लिए प्लंजर को खींचें।
- आइलेट्स को धीरे-धीरे पोर्टल शिरा में डालें, जबकि बार-बार खींचते हैं और डुबकी को धक्का देते हैं।
- इंजेक्शन साइट को कवर करने के लिए जेल फोम (आकार में लगभग 0.5 सेमी x 0.5 सेमी) का एक टुकड़ा रखें।
- पोर्टल नस से सुई को बाहर निकालते समय जेल फोम को कपास की नोक के साथ नीचे दबाएं।
- लगभग 2 मिनट के लिए जेल पर दबाना जारी रखें ताकि यह पुष्टि की जा सके कि कोई सक्रिय रक्तस्राव नहीं है।
- कपास टिप रोलओवर और जेल फोम से दूर यह सुनिश्चित करने के लिए कि जेल फोम पोर्टल शिरा को अच्छी तरह से कवर करता है।
5. विधि बी: (वसा पैड, चित्रा 1C के साथ खून बह रहा बंद करो)17
- पोर्टल नस को अच्छी तरह से उजागर करें।
- बाएं और दाएं दोनों तरफ से उजागर पोर्टल नस को पकड़ने के लिए दो कपास युक्तियों का उपयोग करें।
- ग्रहणी और पोर्टल नस के बीच वसा ऊतक पैड की पहचान करें।
- पोर्टल नस में सुई डालने से पहले वसा पैड के माध्यम से प्रवेश (चित्रा 1 डी).
- विधि A के भाग 4.2.1 और 4.2.2 में ऊपर वर्णित समान प्रक्रिया का पालन करते हुए आइलेट्स को शामिल करें।
- एक कपास टिप के साथ वसा पर नीचे दबाते समय सुई को बाहर निकालें।
- सुई हटाने के बाद 1 मिनट के लिए वसा पैड पर दबाना जारी रखें।
- यह पुष्टि करने के बाद कि पोर्टल नस से कोई रक्तस्राव नहीं हुआ है, धीरे से आंत को अपनी मूल स्थिति में पेरिटोनियल गुहा में वापस कर दें।
- बंद होने से पहले पेट गुहा में गर्म खारा (36-37 डिग्री सेल्सियस) के 0.5 मिलीलीटर छोड़ दें।
नोट: गर्म खारा सर्जरी के बाद आंत आंदोलन और वसूली की सुविधा देता है और आंत परिगलन को रोकता है। - एक 5-0 टांके के साथ मांसपेशियों की परत को बंद करें।
- 4-0 टांके के साथ त्वचा की परत को बंद करें।
- माउस को एक हीटिंग पैड पर एक साफ पिंजरे में रखें जब तक कि संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक न हो जाए।
- एक एनाल्जेसिक (उदाहरण के लिए, buprenorphine 0.1 मिलीग्राम / किग्रा i.p.) हर 12 घंटे और 48 घंटे के बाद सर्जरी के लिए पूरक गर्मी प्रदान करना जारी रखें।
नोट:: आइलेट प्रत्यारोपण प्रक्रिया को पूरा करने के लिए लगभग 15-20 मिनट लगते हैं।
6. एच एंड ई धुंधला और पूरे जिगर अनुभाग की तस्वीर
- जिगर परफ्यूजन
- भाग 3.1 में ऊपर वर्णित के रूप में संज्ञाहरण के तहत माउस रखो.
- ध्यान से पोर्टल नस को उजागर करें और अवर वेना कावा काटें।
- मैन्युअल रूप से लगभग 5 मिनट के लिए पोर्टल शिरा के माध्यम से 10% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 20 मिलीलीटर का उपयोग करके जिगर को पार करना, 25 जी नीडल 18 के साथ 20 एमएल सिरिंज का उपयोग करके।
नोट: जिगर परफ्यूजन जिगर के ऊतकों से रक्त को हटा सकता है और आइलेट ग्राफ्ट को परेशान किए बिना यकृत निर्धारण में सुधार कर सकता है। - अन्य अंगों से पूरे जिगर को विच्छेदित करें।
- 24 घंटे के लिए 10% पैराफॉर्मेल्डिहाइड में परफ्यूज्ड लिवर ऊतक को ठीक करें।
- पैराफिन में ऊतक एम्बेड करें।
- प्रत्येक 5 μm मोटाई के ऊतक वर्गों में कटौती और उन्हें धुंधला करने के लिए एक कांच की स्लाइड पर डाल दिया.
- मानक विधियों 15,16 का उपयोग करके एच एंड ई, इंसुलिन, फाइब्रिन और पॉलीमॉर्फोन्यूक्लियर न्यूट्रोफिल (पीएमएन) स्टेनिंग करें।
- माइक्रोस्कोप के तहत पूरे जिगर अनुभाग को स्कैन करें।
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Representative Results
हमने पोर्टल शिरा के माध्यम से syngeneic और xenogeneic islet प्रत्यारोपण किया। आइलेट ग्राफ्ट फ़ंक्शन दोनों आइलेट प्रत्यारोपण मॉडल में एक खुराक-निर्भर तरीके से देखा गया था। C57BL/6 चूहों का उपयोग करके syngeneic islet प्रत्यारोपण मॉडल में, 250 islets के प्रत्यारोपण ने चूहों के हाइपरग्लाइसेमिया में लौटने से पहले क्षणभंगुर normoglycemia का नेतृत्व किया। 500 आइलेट्स प्राप्त करने वाले चूहे प्रत्यारोपण के बाद 30 दिनों से अधिक समय तक पहुंच गए और नॉर्मोग्लाइसीमिया बनाए रखा (चित्रा 2 ए)। दोनों समूहों में चूहों ने शरीर के वजन में वृद्धि दिखाई (चित्रा 2 बी)।
इसी तरह, मधुमेह NOD-SCID माउस आइलेट प्रत्यारोपण मॉडल के लिए मानव आइलेट में, आइलेट ग्राफ्ट फ़ंक्शन की तुलना तब की गई थी जब 45, 85, या 140 IEQs / किग्रा शरीर के वजन को प्रत्यारोपित किया गया था। Normoglycemia प्राप्त नहीं किया जा सका जब 45 IEQ / g (~ 225-275 islets / माउस) मानव आइलेट्स प्रत्यारोपित किए गए थे। जब आइलेट संख्या 85 IEQ / g (~ 400-450 islets / माउस) तक बढ़ गई, तो प्राप्तकर्ताओं के 35.7% (10/28) ने 60 वें दिन पोस्ट-ट्रांसप्लांटेशन पर normoglycemia (p = 0.02 बनाम 45 IEQ / g समूह) प्राप्त किया। इसके अलावा, प्राप्तकर्ताओं का 83.3% (5/6) जो मानव आइलेट्स के 140 IEQ / g (~ 600-650 islets / माउस) प्राप्त करते हैं, normoglycemia (चित्रा 2 C) तक पहुंच गए। इसके अलावा, अधिकांश चूहों को जो रक्तस्राव कर रहे थे, सर्जरी के बाद मर गए, जबकि रक्तस्राव के बिना चूहे बच गए (चित्रा 2 डी)।
एक बार जब पर्याप्त मानव आइलेट्स को एनओडी-एससीआईडी प्राप्तकर्ताओं के लिए एनग्राफ्ट किया जाता है, तो उनके रक्त शर्करा के स्तर को प्रारंभिक चरण के बाद प्रत्यारोपण में अच्छी तरह से नियंत्रित किया जा सकता है और अध्ययन के अंत तक अच्छी तरह से बनाए रखा जा सकता है। ग्राफ्टेड आइलेट्स को एच एंड ई और इंसुलिन स्टेनिंग द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है। प्रत्यारोपण के बाद 28 दिनों में, प्रत्यारोपित मानव आइलेट्स को पूरे जिगर में समान रूप से वितरित किया गया था, ज्यादातर रक्त वाहिका के आसपास / करीब (चित्रा 3)।
इंट्राहेपेटिक मॉडल का उपयोग तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रदर्शित करने के लिए किया गया था जैसा कि मानव आइलेट प्रत्यारोपण में देखा गया था। हमारे ऊतक अनुभाग में, हमने इंसुलिन की अभिव्यक्ति, और प्रत्यारोपित आइलेट्स में फाइब्रिन और पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स घुसपैठ की उपस्थिति देखी (चित्रा 4 ए-डी)।
चित्रा 1: इंट्राहेपेटिक आइलेट प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं का चित्रण( ए, सी)। विधि A और विधि B. (B, D) में उपयोग किए गए प्रमुख चरणों की योजनाबद्धताएँ. आइलेट्स को सीधे पोर्टल नस (सी) के माध्यम से या अप्रत्यक्ष रूप से वसा पैट (डी) के माध्यम से इंजेक्ट किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: इंट्रापोर्टल आइलेट प्रत्यारोपण के प्रतिनिधि परिणाम। (ए, बी)। Syngeneic माउस आइलेट इंट्रापोर्टल प्रत्यारोपण. C57BL/6 चूहों से अग्नाशयी आइलेट्स (250 या 500) को पुरुष C57BL/6 चूहों में प्रत्यारोपित किया गया था जिन्हें एसटीजेड द्वारा मधुमेह प्रदान किया गया था। (ए) सीरियल रक्त शर्करा के स्तर को मापा गया था। Normoglycemia को लगातार >2 दिनों के लिए ग्लूकोज के स्तर <200 मिलीग्राम / डीएल के रूप में परिभाषित किया गया था। (बी) प्राप्तकर्ता के शरीर के वजन में वृद्धि आइलेट प्रत्यारोपण के बाद देखी गई थी। (सी) मधुमेह एनओडी-एससीआईडी चूहों का प्रतिशत 45 आईईक्यू / जी (एन = 7), 85 आईईक्यू / जी (एन = 28), और 140 आईईक्यू / जी (एन = 6) पर मानव आइलेट की एक अलग संख्या प्राप्त करने वाले चूहों में नॉर्मोग्लाइसीमिया तक पहुंचता है। (d) खून बह रहा है और गैर खून बह रहा चूहों में आईआईटी के बाद जीवित रहने का प्रतिशत (n = 14 प्रत्येक). कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: एच एंड ई एनओडी-एससीआईडी जिगर के जिगर के वर्गों का धुंधला होना 28 दिनों के बाद प्रत्यारोपण पर मानव आइलेट ग्राफ्ट असर। आइलेट्स को काले हलकों द्वारा चिह्नित किया जाता है। प्रत्येक वृत्त का व्यास सकारात्मक रूप से प्रत्येक आइलेट के आकार से मेल खाता है। स्केल बार = 1,000 पूरे जिगर अनुभाग में μm और इनसेट में 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: इंट्रापोर्टल ट्रांसप्लांटेशन के बाद जिगर में इंट्रापोर्टल ट्रांसप्लांट किए गए माउस आइलेट्स के प्रतिनिधि हिस्टोलॉजिकल चित्र 6 घंटे बाद। (ए) एच एंड ई, (बी) इंसुलिन (लाल) (सी) फाइब्रिन, और (डी) पीएमएन दाग। स्केल बार = 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस अध्ययन में, दो बेहतर प्रक्रियाएं जो रक्तस्राव को रोक सकती हैं और माउस आईआईटी के दौरान माउस मृत्यु दर को कम कर सकती हैं, का प्रदर्शन किया गया है। यह अध्ययन शोधकर्ताओं को आइलेट प्रत्यारोपण मॉडल की कल्पना करने में सक्षम बनाता है जो प्रत्यारोपण के बाद तत्काल रक्त मध्यस्थता भड़काऊ प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में अद्वितीय है। आईआईटी मॉडल आइलेट ट्रांसप्लांटेशन 19 के जवाब में आइलेट सेल अस्तित्व और यकृत इस्केमिक चोटों का अध्ययन करने के लिए एक विशिष्ट मॉडल है। यहां, हमने पिछले अध्ययनों के आधार पर प्रक्रिया को परिष्कृत किया और शुरुआती जटिलता-प्रेरित माउस मृत्यु दर को कम कर दिया। दोनों विधि A14,15,16 और विधि B8,9 का उपयोग कई अध्ययनों में किया गया था। हमने दिखाया कि पूरे जिगर के बीच वितरित आइलेट्स, और न्यूट्रोफिल घुसपैठ और घनास्त्रता आमतौर पर आईआईटी से जुड़े प्रत्यारोपण के तुरंत बाद ग्राफ्ट में प्रमुख थे।
माउस हेपेटिक आइलेट प्रत्यारोपण में कई महत्वपूर्ण चरण हैं। क्योंकि मानव और माउस आइलेट दोनों आकार में 200 μm के रूप में बड़े हो सकते हैं, इसलिए आइलेट उत्पादों के सुचारू प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए प्रत्यारोपण के लिए कम से कम 27 G के सुई आकार का उपयोग किया जाना चाहिए। हालांकि, यह पोर्टल नस में एक बड़ा छेद उत्पन्न करेगा जो सुई हटाने के बाद रक्तस्राव का कारण बन सकता है। सही कोण के माध्यम से आइलेट्स को इंजेक्ट करके और वसा ऊतक के माध्यम से इंजेक्शन साइट या इंजेक्शन को अवरुद्ध करने के लिए एक दंत स्पंज का उपयोग करके, रक्तस्राव की संभावना को कम किया जा सकता है, और प्रत्यारोपण के बाद चूहों में उच्च जीवित रहने की दर होती है। ये चरण इस प्रक्रिया को करते समय पोर्टल शिरा रक्त प्रवाह की रुकावट के कारण जिगर के गर्म इस्केमिया-reperfusion चोटों से बचने में भी मदद कर सकते हैं। वे जिगर और आंतों को होने वाले नुकसान को भी कम कर सकते हैं जो सर्जरी के बाद माउस मृत्यु दर में योगदान कर सकते हैं।
मानव आइलेट प्रत्यारोपण सेटिंग की तुलना में माउस इंट्राहेपेटिक आइलेट ट्रांसप्लांटेशन मॉडल की कई सीमाएं भी हैं। सबसे पहले, हम आइलेट जलसेक के दौरान माउस पोर्टल शिरा दबाव की निगरानी नहीं कर सकते हैं जैसा कि हम क्लिनिक सेटिंग्स में करते हैं। दूसरा, चूहों में प्रत्यारोपित की जा सकने वाली मात्रा मानव में प्रत्यारोपित आइलेट उत्पाद की उच्च मात्रा को प्रतिबिंबित नहीं कर सकती है। इसलिए, घनास्त्रता की सीमा अलग हो सकती है। तीसरा, प्रत्यारोपण के बाद माउस आइलेट ग्राफ्ट अस्थायी रूप से हाइपरग्लाइसेमिक वातावरण के संपर्क में होंगे क्योंकि चूहों को कोई इंसुलिन नहीं दिया जाएगा, जबकि मनुष्यों 20 में, ट्रांसप्लांट किए गए आइलेट्स 20 के तनाव को कम करने के लिए पेरी-ट्रांसप्लांटेशन अवधि के दौरान इंसुलिन दिया जाएगा। फिर भी, इंट्राहेपेटिक आइलेट मॉडल एक अद्वितीय पूर्व-नैदानिक मॉडल प्रदान करता है जिसका उपयोग मानव आइलेट प्रत्यारोपण का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
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Disclosures
सभी लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास हितों का टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को दिग्गजों के मामलों के विभाग (VA-ORD BLR &D मेरिट I01BX004536) और राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था # 1R01DK105183, DK120394, DK118529, HW के लिए। हम आपको श्री माइकल ली और सुश्री लिंडसे स्वाबी को भाषा संपादन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral buffered formalin v/v | Fisher Scientific | 23426796 | |
| 1 mL Syringe with needle | AHS | AH01T | |
| 20 mL Syringe | BD | 301031 | |
| 25G x 5/8" hypodermic needles | BD | 305122 | |
| Alcohol prep pads, sterile | Fisher Scientific | 22-363-750 | |
| Animal Anesthesia system | VetEquip, Inc. | 901806 | |
| Buprenorphine hydrochloride, injection | Par Sterile Products, LLC | NDC 42023-179-05 | |
| Centrifuge tubes, 15 mL | Fisher Scientific | 0553859A | |
| CMRL-1066 | Corning | 15110CV | |
| DMEM | Corning | 10013CV | |
| Ethanol, absolute (200 proof), molecular biology grade | Fisher Scientific | BP2818500 | |
| Extra fine Micro Dissecting scissors 4” straight sharp | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5882 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35011CV | |
| FreeStyle Glucose meter | Abbott | Lite | |
| FreeStyle Blood Glucose test strips | Abbott | Lite | |
| Gelfoam (absorbable gelatin sponge, USP) | Pharmacia & Upjohn Company | 34201 | |
| Graefe forceps 4” extra delicate tip | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5136 | |
| Heated pad | Amazon | B07HMKMBKM | |
| Hegar-Baumgartner Needle Holder 5.25” | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-7850 | |
| Insulin syringe with 27-gauge needle | BD | 879588 | |
| Iodine prep pads | Fisher Scientific | 19-027048 | |
| Isoflurane | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| Penicillin/streptomycin (P/S) | HyClone | SV30010 | |
| Polypropylene Suture 4-0 | Med-Vet International | MV-8683 | |
| Polypropylene Suture 5-0 | Med-Vet International | MV-8661 | |
| Sodium chloride, 0.9% intravenous solution | VWR | 2B1322Q | |
| Streptozocin (STZ) | Sigma | S0130 | |
| Surgical drape, sterile | Med-Vet International | DR1826 | |
| Tissue Cassette | Fisher Scientific | 22-272416 |
References
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