Summary
Målet med denne protokol er at forklare og demonstrere udviklingen af en tredimensionel (3D) mikrofluidisk model af højt justeret humant hjertevæv, der består af stamcelle-afledte kardiomyocytter, der er co-dyrket med hjertefibroblaster (CF'er) inden for en biomimetisk, kollagenbaseret hydrogel til applikationer i hjertevævsteknik, lægemiddelscreening og sygdomsmodellering.
Abstract
Den hyppigste dødsårsag på verdensplan fortsætter som hjerte-kar-sygdomme (CVD). Men modellering af den fysiologiske og biologiske kompleksitet af hjertemusklen, myokardiet, er notorisk svært at opnå in vitro. Hovedsageligt ligger forhindringer i behovet for menneskelige kardiomyocytter (CMs), der enten er voksne eller udviser voksenlignende fænotyper og med succes kan replikere myokardiets cellulære kompleksitet og indviklede 3D-arkitektur. Desværre, på grund af etiske bekymringer og mangel på tilgængelige primære patient-afledte humane hjertevæv, kombineret med den minimale spredning af CMs, sourcing af levedygtige menneskelige PM'er har været et begrænsende skridt for hjertevæv engineering. Til dette formål har de fleste forskning overgået til hjerte differentiering af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSCs) som den primære kilde til menneskelige CMs, hvilket resulterer i en bred inkorporering af hiPSC-CMs i in vitro assays for hjertevæv modellering.
Her i dette arbejde demonstrerer vi en protokol for udvikling af et 3D-modent stamcelleafledt humant hjertevæv i en mikrofluidisk enhed. Vi forklarer og demonstrerer specifikt produktionen af en 3D in vitro anisotropisk hjertevæv-on-a-chip model fra hiPSC-afledte CMs. Vi beskriver primært en renselsesprotokol til udvælgelse af CMs, co-kultur af celler med et defineret forhold via blanding CMs med menneskelige FSR (hF'er), og suspension af denne co-kultur inden for kollagen-baserede hydrogel. Vi demonstrerer yderligere injektionen af den cellebelastede hydrogel i vores veldefinerede mikrofluidiske enhed, indlejret med forskudte elliptiske mikropæle, der tjener som overfladetopografi for at fremkalde en høj grad af tilpasning af de omgivende celler og hydrogelmatrixen, der efterligner arkitekturen i det indfødte myokardie. Vi forestiller os, at den foreslåede 3D-anisotropiske hjertevæv-on-chip-model er egnet til grundlæggende biologistudier, sygdomsmodellering og gennem dets anvendelse som screeningsværktøj farmaceutisk testning.
Introduction
Vævstekniske tilgange er blevet undersøgt bredt i de senere år for at ledsage in vivo kliniske fund i regenerativ medicin og sygdomsmodellering1,2. Der er især blevet lagt betydelig vægt på in vitro-hjertevævsmodellering på grund af de iboende vanskeligheder med at indkøbe humant primært hjertevæv og producere fysiologisk relevante in vitro-surrogater, hvilket begrænser den grundlæggende forståelse af de komplekse mekanismer for hjerte-kar-sygdomme (CVD'er)1,3. Traditionelle modeller har ofte involveret 2D monolayer kultur assays. Men vigtigheden af at dyrke hjerteceller i et 3D-miljø for at efterligne både det indfødte landskab af myokardiet og komplekse cellulære interaktioner er i vid udstrækning karakteriseret4,5. Derudover har de fleste modeller produceret hidtil inkluderet en mono-kultur af CMs differentieret fra stamceller. Hjertet består dog af flere celletyper6 inden for en kompleks 3D-arkitektur7, der berettiger det kritiske behov for at forbedre kompleksiteten af vævssammensætningen inden for 3D in vitro-modeller for bedre at efterligne cellulære bestanddele af det oprindelige myokardiium.
Til dato er mange forskellige tilgange blevet udforsket for at producere biomimetiske 3D-modeller af myocardium8. Disse tilgange spænder fra eksperimentelle opsætninger, der giver mulighed for realtidsberegning af genereret kraft, fra monokultur-CMs seedet på tynde film (anses for muskuløse tynde film (MTF'er))9, til co-kultur hjerteceller i 3D hydrogel matricer suspenderet blandt fritstående cantilevers (anses manipuleret hjertevæv (EHTs))10. Andre tilgange har fokuseret på at gennemføre micromolding teknikker til at efterligne myokardie anisotropi, fra mono-kultur CMs i en 3D hydrogel suspenderet blandt fremspringende mikropæle i et væv plaster11, til mono-kultur CMs seedet blandt indrykkede mikrogrooves12,13. Der er iboende fordele og ulemper ved hver af disse metoder, derfor er det relevant at bruge den teknik, der flugter med den påtænkte anvendelse og det tilsvarende biologiske spørgsmål.
Evnen til at forbedre modningen af stamcelle-afledte PM'er er afgørende for en vellykket in vitro engineering af voksen-lignende myokardievæv og oversættelse af efterfølgende resultater til kliniske fortolkninger. Til dette formål er metoder til at modne PM'er blevet bredt udforsket, både i 2D og 3D14,15,16. For eksempel fører elektrisk stimulation indarbejdet i EHT'er, tvungen tilpasning af CM'er med overfladetopografi, signaleringssignaler, vækstfaktorer fra co-kultur og / eller 3D hydrogelforhold osv., alle til en ændring til fordel for CM-modning i mindst en af følgende: cellemorfologi, calciumhåndtering, sarkomerisk struktur, genekspression eller kontraktil kraft.
Af disse modeller bevarer de tilgange, der bruger mikrofluidiske platforme, visse fordele i naturen, såsom kontrol af gradienter, begrænset celleinput og minimale nødvendige reagenser. Desuden kan mange biologiske replikater genereres på én gang ved hjælp af mikrofluidiske platforme, der tjener til bedre at dissekere den biologiske mekanisme af interesse og øge den eksperimentelle prøvestørrelse til fordel for statistisk effekt17,18,19. Derudover gør brugen af fotolitografi i mikrofluidisk enhedsfremstillingsproces det muligt at skabe præcise funktioner (f.eks. topografier) på mikro- og nanoniveau, der tjener som mesoskopiske signaler til at forbedre den omgivende cellulære struktur og vævsarkitektur på makroniveau18,20,21,22 til forskellige anvendelser i vævsregenerering og sygdomsmodellering.
Vi har tidligere demonstreret udviklingen af en ny 3D-hjertevæv on-chip model, der inkorporerer overfladetopografi i form af medfødte elliptiske mikropæle for at tilpasse hydrogelindkapslede co-dyrkede hjerteceller til et sammenkoblet, anisotropisk væv20. Efter 14 dages kultur er vævene dannet i den mikrofluidiske enhed mere modne i deres fænotype, genekspressionsprofil, calciumhåndteringskarakteristika og farmaceutisk respons sammenlignet med monolag og 3D-isotropisk kontrol23. Den protokol, der er beskrevet heri, skitserer metoden til oprettelse af dette 3D-kokulturerede, justerede (dvs. anisotropiske) humane hjertevæv i den mikrofluidiske enhed ved hjælp af hiPSC-afledte CMs. Specifikt forklarer vi metoderne til at differentiere og rense hiPSC'er mod CMs, tilskud af hCF'er med CMs til at producere en etableret co-kultur befolkning, indsættelse af cellepopulationen indkapslet i kollagen hydrogel i mikrofluidiske enheder, og efterfølgende analyse af 3D konstrueret væv gennem kontraktil og immunofluorescerende assays. De resulterende 3D-manipulerede mikrovæv er velegnede til forskellige anvendelser, herunder grundlæggende biologistudier, CVD-modellering og farmaceutisk testning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Udfør al cellehåndtering og reagensforberedelse i et biosikkerhedsskab. Sørg for, at alle overflader, materialer og udstyr, der kommer i kontakt med celler, er sterile (dvs. spray ned med 70% ethanol). Cellerne skal dyrkes i en befugtet 37 °C, 5% CO2 inkubator. Al hiPSC-kultur og differentiering udføres i 6-brønds plader.
1. Oprettelse af mikrofluidiske enheder (omtrentlig varighed: 1 uge)
-
Fotolitografi
BEMÆRK: Masken, der er designet ved hjælp af CAD-filen (leveres som supplerende fil 1), indeholder designet af den mikrofluidiske kanal. Udskriv designet på en gennemsigtig maske. Udfør derefter standard fotolitografi med den negative fotoresist SU8 2075 på en 4-tommer silicium wafer i et renrum.- Rengør en siliciumskiver med isopropylalkohol (IPA) og tør med nitrogen. Bages ved 200 °C i 5 min for dehydrering.
BEMÆRK: Håndter waferen med wafer pincet. - Placer wafer i spin-coater. Depositum 3-4 mL SU8 i midten af wafer, derefter spin til at danne et lag på 200 μm (dvs. rampe op 15 s til 500 rpm, spin for 10 s, rampe op 5 s til 1.200 omdrejninger i minuttet, og spin i 30 s, derefter downspin for 15 s indtil stoppet).
- Wafer og blød bages i 7 min ved 65 °C, derefter 45 min ved 95 °C.
- Flyt waferen til en maske og placer den gennemsigtige maske i maskeholderen med et UV-filter. Udsæt waferen til 2 cyklusser på 230 mJ/cm2med 30 s forsinkelse for en samlet eksponering på 460 mJ/cm2.
- Udfør en bagning efter eksponering på den udsatte wafer i en ovn på 50 °C natten over.
- Sluk for ovnen næste morgen, og efter wafer er afkølet til stuetemperatur, nedsænke det i SU8-udvikler. Fjern wafer fra bygherren hver 5 min og vask med IPA, og læg den derefter tilbage i udvikleren.
- Efter ca. 20 minutter, eller når IPA løber frit, tørres waferen med luft nitrogen og bages hårdt i en ovn, der er indstillet til 150 °C. Så snart ovnen når 150 °C, skal du slukke den, men ikke åbne den. Lad vaflen stå i ovnen, indtil den har nået stuetemperatur, og fjern derefter waferen.
- Bekræft højden af SU8 med et profilometer og de optiske funktioner med et let mikroskop. Når det er bekræftet, tapes waferen inde i en 150 mm plast petriskål.
- Rengør en siliciumskiver med isopropylalkohol (IPA) og tør med nitrogen. Bages ved 200 °C i 5 min for dehydrering.
-
Blød litografi
BEMÆRK: Waferen, der er tapet fast til petriskålen, skal dæmpes for at forhindre, at PDMS klæber til SU8-funktionerne.- Vend wafer (tappet til en plastik petriskål) over et glas Petri parabol af samme størrelse, der indeholder 0,4 ml methyltrichlorosilane (MTCS) og udsætte wafer til dampe i 4 min. Vend vaflen oprejst og læg låget på petriskålen.
- Bland 30 g silikoneelastomerbase til hærdningsmidlet i et forhold på 10:1. Tag låget af petriskålen og hæld polydimethylsiloxan (PDMS) på waferen, og afgas derefter i en ekssikkator.
- Når alle bobler er væk, skal du placere waferen ved 80 °C i 1,5 timer for at helbrede PDMS.
- Skræl forsigtigt PDMS og punch indløb og afsætningsmuligheder for vævsporte og mediekanaler med henholdsvis en 1 mm og 1,5 mm biopsipunch.
- Rengør PDMS-kanalerne med tape for at fjerne støv. Derefter lægges coverslips (18 x 18 mm, no.1) i 70% ethanol i mindst 15 min. Tør dem derefter af med vævsservietter.
- Understøt både coverlips og PDMS-kanaler (funktionsside udsat) for plasmaet (sat højt) i 1 minut, derefter hurtigt bindes sammen og placeres i en 80 °C ovn natten over for at sikre bindingen.
BEMÆRK: Under limning er det vigtigt at lægge et mildt tryk på PDMS-kanalernes kanter for at sikre en god forsegling mellem PDMS og glasset, samtidig med at man undgår selve kanalen for at forhindre kanalkollaps.
-
Forberedelse af enhed
- Nedsænk de bundne PDMS-enheder i deioniseret vand (DI H2O) og autoklave med væskecyklussen. Derefter suges væsken fra enhederne og autoklaver igen med tyngdekraftscyklussen. Derefter dehydreres de steriliserede enheder natten over ved 80 °C.
2. Stamcellekultur (omtrentlig varighed: 1-2 måneder)
- hiPSC kultur og vedligeholdelse
BEMÆRK: HiPSC'erne skal dyrkes i tre på hinanden følgende passager efter optøning in vitro før kryopræservering eller differentiering. hiPSC'er dyrkes i enten E8- eller mTeSR1-mediet, afhængigt af cellelinjen, på kælderens membranmatrixbelagte plader24.- For at belægge plader med kældermembranmatrix af hESC-kvalitet skal du optø en aliquot af matrixmediet (partiafhængigt volumen, normalt 200-300 μL; opbevaret ved -80 °C) ved at lægge det til 25 mL DMEM/F-12K på is. Dispenser 1 mL af denne suspension i hver brønd af en 6-brønds plade. Pladen efterlades i inkubatoren ved 37 °C i mindst 1 time.
- Ved optøning skal E8-mediet modificeres til hiPSC-kultur ved at tilføje 5 μM Y-2763225 (E8+RI). Brug dette medie i 24 timer bagefter, og skift derefter mediet til frisk E8.
BEMÆRK: Til rutinemæssige medieændringer bruges uændrede E8-medier til hiPSC-kultur. For regelmæssig vedligeholdelse skal E8-medier ændres hver dag, ca. 24 timer efter den forrige medieændring. - Passage celler på Dag 3 eller Dag 4, aspirat medier, derefter vaske hver brønd med 1 ml 1x Dulbecco's fosfat-buffered løsning (DPBS).
BEMÆRK: Sørg for, at cellerne er omkring 70% sammenflydende. Lad dem ikke vokse ud over 70% sammenløb. - Aspirere DPBS, derefter tilføje 1 mL af 0,5 mM EDTA til hver brønd og inkubere ved stuetemperatur i 6-7 min.
- Aspirér forsigtigt EDTA, tilsæt 1 mL E8+RI i hver brønd og spræng mod overfladen med en 1 mL pipette (~5-10 gange for at samle alle cellerne). Celleaffjedringen opsamles i et 15 mL mikrocentrifugerør.
- Tæl celleaffjedringen og passagen ved den ønskede celletæthed (dvs. ~200 K pr. brønd) i E8+RI.
- Skift medie til E8 (uden RI) 24 timer efter. Efterlad ikke cellerne med RI i mere end 24 timer.
BEMÆRK: E8 må ikke opvarmes til 37 °C. Efterlad det altid ved stuetemperatur til opvarmning før cellekultur.
- Cardiomyocyte (CM) rettet differentiering
BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke eksistensen af heterogenitet blandt forskellige linjer i hiPSCs26,27, så følgende trin skal muligvis optimeres for hver cellelinje. Følg nedenstående trin for cm differentiering.- Forbered RPMI + B27 - insulin ved at tilsætte 10 ml B27 minus insulin og 5 ml penicillin/streptomycin (pen/strep) til 500 ml RPMI 1640.
- Forbered RPMI + B27 + insulin ved at tilføje 10 mL B27 og 5 mL pen/strep til 500 mL RPMI 1640.
- Forbered RPMI minus glukose + B27 + insulin ved at tilsætte 10 mL B27, 5 mL pen/ strep og 4 mM natriumlaktat til 500 mL RPMI 1640 uden glukose.
- Når hiPSC'erne når 85% sammenløb, skal du begynde differentiering (dag 0) ved at erstatte det gamle medium med 4 mL af RPMI + B27 - insulinmedium, der indeholder 10 μM CHIR99021, til hver brønd af en 6-brønds plade (dvs. der tilsættes 25 μL på 10 mM CHIR99021 til 25 mL RPMI + B27 - insulin og tilsættes derefter straks 4 mL pr. brønd).
BEMÆRK: CHIR99021 er en GSK-hæmmer og fører til Wnt-aktivering. Den optimale koncentration af CHIR99021 og den oprindelige sammenløb varierer for hver cellelinje28. Kontroller altid en koncentrationsgradient på 6-12 μM CHIR99021 og en række såningstætheder før selve forsøget for at bestemme de optimale betingelser for igangsættelse af differentiering. - Præcis 24 timer senere (dag 1), indsug mediet og erstatte med 5 mL forvarmet RPMI + B27 - insulin til hver brønd.
- Præcis 72 timer efter CHIR99021 tilføjelse (Dag 3), indsamle 2,5 mL af det brugte medium fra hver brønd af 6-brønds plade, i alt 15 mL af det brugte medium i et rør.
- Til dette tilsættes 15 mL frisk RPMI + B27 - insulinmedium. IWP2 tilsættes en koncentration på 5 μM til det kombinerede mediumrør (dvs. 1 μL IWP2 ved 5 mM pr. 1 mL kombineret medium eller 30 μL IWP2 i 30 mL-medier i alt).
- Fjern ~ 1,5 mL af det resterende medium pr. brønd af pladen, så 1 mL af mediet forbliver. Slyng pladen kraftigt for at sikre tilstrækkelig fjernelse af cellerester. Derefter indsug resten af det gamle medium og tilsæt 5 mL af det kombinerede medium, der indeholder IWP2 pr. brønd af pladen.
BEMÆRK: Tilsætningen af IWP2 til cellerne fører til Wnt-hæmning. - På dag 5 suges mediet fra hver brønd og erstattes med 5 mL forvarmet RPMI + B27 - insulin.
- CM Modning: På dag 7, dag 9 og dag 11 aspirerer mediet fra hver brønd og erstatter det med 5 mL forvarmet RPMI + B27 + insulin. Spontan slå bør observeres omkring disse dage.
- CM Rensning: På dag 13 og dag 16 skal du starte glukose sult ved at suge mediet fra hver brønd, vaske hver godt med 1 mL 1x DPBS og derefter tilføje 5 mL forvarmet RPMI minus glukose + B27 + insulin, suppleret med 4 mM natriumlaktat.
- På dag 19 suges det brugte medium og erstattes med 5 mL forvarmet RPMI + B27 + insulin til hver brønd for at give mulighed for cellegendannelse efter rensning.
- På dag 21 skal du omdeler celler efter den nedenstående beskrevne CM-dissociationsprotokol (trin 3.3). Tilstræbe at plade 1,5-2 x 106 celler per brønd i en 6-brønds plade. For eksempel, hvis det er en meget effektiv differentiering, generelt udvide 6 brønde i 9 brønde er god.
- Fra dag 21 aspireres mediet fra hver brønd og erstattes med 4 mL RPMI + B27 + insulin hver 2-3 dage.
BEMÆRK: HiPSC-CMs er klar til eksperimentel brug efter dag 23.
3. Oprettelse af 3D-hjertevæv i den mikrofluidiske anordning: (Omtrentlig varighed: 2-3 timer)
- hCF kultur
- Kultur humane ventrikikulære hjertefibroblaster (hCF'er; fremstillet kommercielt fra Lonza) i T75-kolber (ved 250K celler pr. kolbe) i Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Skift medierne hver anden dag, og passage, når på 70% sammenfald. Brug hCF'erne før passage 10, da de kan begynde at differentiere sig til myofibroblasts ved høje passager29.
- afkobling af hCF
- For at adskille hCF'erne skal kolben først tages ud af inkubatoren. Sæt kolben inde i biosikkerhedsskabet og begynd at suge det brugte medie fra kolben. Derefter vaskes T75 kolben med 3 mL 1x DPBS. Luk hætten og svirr kolben.
- Indsug DPBS. Tag 3 mL af prewarmed 1x Trypsin-EDTA (0,05%) og tilsæt det til kolben. Vip kolben og hvirvel for at belægge bunden. Den skal anbringes i en 37 °C inkubator i 4-6 min. Hvis ikke, sættes kolben tilbage i inkubatoren i endnu et minut.
- Trypsin-handlingen neutraliseres ved at tilføje 3 mL førkriget FGM3 til kolben. Derefter pipetter opløsningen op og ned mod bunden af kolben for at løsne FSR.
- Celleaffjedringen opsamles i et 15 mL mikrocentrifugerør. Tag 10 μL af celleaffjedringen og dispenser den i et hæmocytometer for at tælle cellerne med et mikroskop.
- Centrifuge celleaffjedringen ved 200 x g i 4 min. Aspirere supernatanten og pas på ikke at forstyrre cellepillen.
- Genbrug pellet i frisk FGM3, at gøre en ønsket 75 x 106 celler / mL. Enten passage en portion (250K celler pr T75 kolbe) eller følg nedenstående protokol til at generere 3D-hjertevæv.
- Cm-dissociation
BEMÆRK: Efter differentiering og rensning skal CMs forberedes til brug i injektionen i mikrofluidiske anordninger.- Tag pladen af CMs ud af inkubatoren og indsug medierne. Vask derefter brøndene med 1 mL 1x DPBS pr. brønd af en 6-brønds plade. Tag 6 mL DPBS og pipette 1 mL pr. brønd.
- Indsug DPBS, og pas på ikke at forstyrre de celler, der er fastgjort til pladen. Pipetter 6 ml varm celleløsning (f.eks. TrypLE-ekspres) og tilsæt 1 ml pr. brønd. Cellerne inkuberes i en 37 °C inkubator i 10 min.
- Enzymet neutraliseres med et tilsvarende volumen RPMI + B27+ insulin (dvs. 1 mL pr. brønd) og dissocieres cellerne mekanisk ved at pipette op og ned mod dyrkningsbeholderen med en 1 mL pipette.
- Saml CMs i et 15 mL centrifugerør. Centrifuge ved 300 x g i 3 min.
- Aspirate supernatant. Resuspend cellepillen i 5 mL RPMI + B27 + insulin. Afpipetter opløsningen op og ned med en 1 mL pipette for at sikre korrekt blanding. Tag 10 μL af celleaffjedringen og dispenser den i et hæmocytometer for at bestemme det samlede cellenummer.
- Centrifuge cellerne igen ved 300 x g i 3 min (for at sikre fuldstændig fjernelse af TrypLE), og indsug supernatanten. Derefter tilsættes en passende mængde RPMI + B27 + insulin for at opnå 75 x 106 celler / mL.
BEMÆRK: Hvis hjertedifferentiering/udvælgelse ikke resulterer i høj CM% (dvs. >80%), som det fremgår af immunostaining eller flowcytometri for CM-specifikke proteiner som cTnT, skal du ikke betragte celler som egnede til vævsdannelsen. Differentieringsprocessen bør optimeres, når dette sker ved justering af CHIR99021-koncentrationer og indledende starttæthed. Hvis CM-rensning skal forbedres, kan andre metoder anvendes,f.eks.
- Kollagen forberedelse
BEMÆRK: Forbered kollagen fra den høje koncentration af kollagen lager (spænder fra 8-11 mg / mL). Kollagen, der bruges til at skabe cellen:hydrogelblandingen, er på 6 mg/mL, og den endelige koncentration er 2 mg/mL. Afhængigt af antallet af enheder til at injicere, mængden af kollagen løsning, der skal foretages, skal tilbage beregnes.- Opbevar alle de nødvendige reagenser på is inde i en biosikkerhedshætte.
BEMÆRK: Kollagen er en termoresponsiv hydrogel. Derfor skal temperaturen forblive lav for at forhindre for tidlig polymerisering. - Der tages 75 μL lagerkollagen (8 mg/mL) og dispenseres i et mikrocentrifugerør på is. Kollagenopløsningen er meget tyktflydende, så langsomt indsug den med en pipette.
- Tag 13,85 μL medier (dvs. RPMI + B27 + insulin) og dispenser det i samme rør.
- Derefter tages 10 μL phenolrød og tilsættes til blandingen og genbruges.
- Endelig skal du tage 1,15 μL af 1N NaOH og tilføje til suspensionen.
- Ved hjælp af en 200 μL pipettespids blev suspensionen genbrugt.
BEMÆRK: Bestanden kollagen har en sur pH, der nødvendiggør tilsætning af NaOH at neutralisere, før du bruger det til at indkapsle hjertecellerne. Phenolrød fungerer som en pH-indikator; Hertil kommer derfor før NaOH-tilføjelsen. På dette tidspunkt vil kollagenopløsningen være gul og betegne dens surhedsgrad. Efter tilsætning af NaOH skal opløsningen blive orange til lyserød, hvilket indikerer dens neutralisering.
- Opbevar alle de nødvendige reagenser på is inde i en biosikkerhedshætte.
- Hydrogel blanding og celleforberedelse
BEMÆRK: I dette trin udføres indkapslingen af cellerne i den kollagenbaserede hydrogel. Cellerne, såvel som alle hydrogelprækursorer, skal placeres på is i løbet af de næste trin.- Hvis FSR endnu ikke er blevet afprøvet, skal CM-suspensionen opbevares i et 15 mL centrifugerør, hvor låget er skruet af for at tillade gasstrøm, inden for en inkubator på 37 °C. Parallelt hermed adskilles FSR og opsamles med en densitet på 75 x 106 celler/mL til indlæsning af enheder.
- Bland de suspenderede CMs med CF'er i et 4:1-forhold. Tag en aliquot på 8 μL CMs og tilsæt til en frisk centrifuge rør på is. Derefter tages 2 μL FSR og tilsættes celleaffjedringen i centrifugerøret.
- Resuspend celle suspensionen, grab 5,6 μL af celle suspensionen, og læg det i en frisk mikrocentrifuge rør.
- Tag 4 μL af kollagen netop forberedt i ovenstående trin og tilføje til en 4:1 CM: CF blanding. Der tilsættes en 2,4 μL reduceret kældermembranmatrix (GFR), hvilket gør den endelige celletæthed til 35 x 106 celler/mL til indsprøjtning af enheden. Pipetter blandingen op og ned for at sikre, at celleaffjedringen er homogen.
- Indsætning af enhed
BEMÆRK: Når cellen:hydrogelblandingen er forberedt, skal den indsættes i enhederne.- Tag mikrofluidiske enheder, der er autoklaveret, ud af 80 °C-ovnen, og sæt dem i biosikkerhedsskabet i mindst 1 time før indføringen af celleaffjedringen, så enhederne kan køle af til stuetemperatur, samtidig med at steriliteten opretholdes.
- Placer enhederne i 60 x 15 mm petriskåle ved 3-4 enheder pr. Skål. Fyld en 150 x 15 mm petriskål med et tyndt lag DI H2O for at holde 3 af de 60 x 15 mm petriskåle. Dette trin skaber et befugtet miljø omkring de mikrofluidiske enheder.
- Brug en ny spids og genbrug cellen:hydrogel blandingen grundigt ved pipetter suspensionen, mens røret forbliver på is.
- Spidsen indsættes i enhedens injektionsport, og der tilfør langsomt og støt 3 μL af cellen:hydrogelaffjedring i vævsområdets indløb af en mikrofluidisk anordning ved hjælp af en 20 μL pipettespids. Når porten er fyldt, skal du stoppe injektionen og fjerne spidsen. Gentag for alle enheder, eller hele forberedt hydrogel suspension.
BEMÆRK: Den lille mængde af cellen:hydrogel suspension opvarmer / køler ned meget hurtigt, så det er relevant at holde suspensionen på is så længe som muligt. Ved indføring pipetter opløsningen af isen og indsættes i enheder så hurtigt som muligt, da hydrogelen kan begynde at polymerisere i pipettespidsen. Det er vigtigt at skabe små mængder af cellen:hydrogel suspension ad gangen, så hvis mange enheder skal injiceres, cellen:hydrogel suspension skal gøres frisk for hvert sæt af 4 enheder. - Vend enhederne i deres petriskåle med pincet og læg dem inde i den store petriskål med vand. Inkuber i en 37 °C inkubator i 9 min. til hydrogelpolymerisering.
- Tag enhederne ud af inkubatoren, vend enhederne oprejst og inkubat ved 37 °C i 9 minutter for at fuldføre hydrogelpolymerisering.
- RPMI + B27 + insulin injiceres i de flankerende mediekanaler (~20 μL pr. enhed). Anordningerne anbringes i inkubatoren ved 37 °C. Skift mediet i mediekanalerne med frisk RPMI + B27 + insulin hver dag. Enhederne har vist sig at være dyrket fra 14-21 dage20.
BEMÆRK: På grund af den lille mængde medier pr. chip er det vigtigt at opretholde enhederne i en stor petriskål fyldt med DI H2O, der fungerer som et befugtet kammer for at forhindre fordampning af medier. Derudover kan små dråber overskydende RPMI + B27 + insulin pipetteres på toppen af kanalens indløb / forretninger under rutinemæssige medieændringer.
4. Vævsanalyse
-
Live Imaging
BEMÆRK: Alle levende billedbehandlinger skal udføres med en sceneinkubator for at opretholde 37 °C og 5% CO2.- Placer enheder i en miljøkontrolleret faseinkubator. Optag 30 s videoer af flere steder i hver enhed med maksimal billedhastighed.
- For at vurdere vævskontraktiliteten efter udvinding af slagsignalerne skal du bruge den supplerende specialskrevne MATLAB-kode til at udtrække toppe (Supplerende fil 2) til beregning af variabilitet mellem slagintervallet.
- Skift medie i enheder i cellekulturhætten, og placer derefter tilbage i cellekulturinkubatoren.
-
Immunfluorescerende farvning
- Forbered PBS-Glycin: Opløs 100 mM glycin i PBS og tilsæt 0,02% NaN3 til langtidsopbevaring. Juster pH-ind til 7,4.
- Forbered PBS-Tween-20: Tilføj 0,05% Tween-20 til PBS og tilsæt 0,02% NaN3 til langtidsopbevaring. Juster pH-ind til 7,4.
- Forbered IF-buffer: Tilføj 0,2% Triton X-100, 0,1% BSA og 0,05% Tween-20 til PBS, og tilføj 0,02% NaN3 til langtidsopbevaring. Juster pH-ind til 7,4.
- Forbered 10% gedeserum: Resuspend det lyofile gedeserum i 2 mL PBS for at lave 100% gedeserum. Derefter fortyndes 2 mL med 18 mL PBS for at lave 10% gedeserum.
- Prøverne fastgøres ved at tilsætte 4 % paraformaldehyd (PFA) til vævskanalerne og inkuberes ved 37 °C i 20 min.
- Vask cellerne ved at tilsætte PBS-Glycine til vævskanalerne 2x i 10 min inkubation ved stuetemperatur.
- Vask cellerne ved at tilføje PBS-Tween-20 i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Gennemtræng cellerne ved at tilføje IF-buffer til vævskanalerne i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Bloker cellerne ved at tilføje 10% gedeserumopløsning til vævskanalerne i 1 time ved stuetemperatur.
- De ikke-konjugerede primære antistoffer fortyndes i 10% gedeserum ved de ønskede koncentrationer (se supplerende fil 3), føjes til vævskanalerne og inkuberes prøverne ved 4 °C natten over.
- Den følgende dag vaskes prøverne ved at tilføje PBS-Tween-20 til vævskanalerne 3x i 20 minutter hver ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Udfør alle opgaver i mørke fra trin 4.2.12, så prøverne er beskyttet mod lys. - Fortynd de sekundære antistoffer i PBS-Tween-20 ved de ønskede koncentrationer, centrifuge ved 10.000 x g i 10 minutter for at indsamle eventuelle udfældninger, og tilsæt derefter til vævskanalerne.
- Efter 30 min-1 timer vaskes prøverne med PBS-Tween-20 3x i 10 minutter hver ved stuetemperatur.
- Tilføj anti-fade eller ønskede montering medium til vævskanaler. Derefter kan prøverne afbildes ved hjælp af fluorescensmikroskopi eller med et konfokalt mikroskop, hvis der ønskes højere forstørrelse. For at visualisere hele 3D-vævet kan billeder på forskellige z-planer stables og rekonstrueres for at danne repræsentative 3D-billeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at opnå en meget renset population af CMs fra hiPSC'er anvendes en modificeret version, der involverer en kombination af Lian differentieringsprotokol33 og Tohyama rensningstrin34 (se figur 1A for eksperimentel tidslinje). HiPSC'erne skal være kolonilignende, ~ 85% sammenflydende og jævnt fordelt over hele kulturen godt 3-4 dage efter passage ved starten af CM differentiering (Figur 1B). Specifikt bør hiPSC-kolonier på dag 0 have et højt udtryk for flerkonsekvenstransskriptionsfaktorer, herunder SOX2 og Nanog (Figur 1C). Baseret på denne protokol, beviser for en vellykket stamcelle differentiering og rensning proces er påvist i figur 1D, med tætte kolonier af CMs udtrykke sarkomeriske α-actinin, med minimal omkringliggende ikke-CMs. Derudover skal HCF'erne opretholde en fibroblastmorfologi med højt vimentinudtryk (Figur 1E), så de skal bruges før P10, da de kan begynde at differentiere sig til myofibroblaster ved højere passager29.
For at opretholde denne protokols robuste karakter er det relevant at implementere replating af hiPSC-CMs efter metabolisk rensning. På grund af tilstedeværelsen af døde celler og snavs, der opstår fra glukose sult, CMs brug for en yderligere rensning skridt for at maksimere CM renhed og sundhed før brug i forsøget; derfor replating bruges som det hjælper med at løsne snavs / døde ikke-CMs(Figur 2A-B, Videoer 1-2). Video 1 viser et eksempel befolkning af CMs før replating, præsenterer med en høj renhed af CMs i flere lag, dog med meget snavs til stede på cellerne og flyder i medierne på grund af den gennemførte rensning. Tilsvarende video 2 viser den samme population af PM'er umiddelbart efter replating, præsentere DM'er i et monolayer med betydeligt mindre snavs, der viser virkningerne af væv fordøjelsen og enkelt-celle dissociation, der opstår under replating.
Ved indsættelse af den celleinddelede hydrogel i den mikrofluidiske enhed (dvs. chip; indsat billede i figur 3) er cellerne tætte og jævnt fordelt over stolperne. Cellerne begynder at sprede sig på dag 1 (Figur 3A), så ved dag 7, de genoptage slå og blive mere synkrone i deres kontraktile mønstre (Figur 3B). Derudover kondenserer 3D-vævene omkring stolperne for at danne gentagne elliptiske porer, og cellerne forlænges. På dag 14 udviser de modne væv en høj grad af anisotropi (dvs. retningsbestemt organisation), der består af celler med langstrakt form (Figur 3C, 4A), striated, justerede sarkomenter og lokaliserede mellemrumskryds (Figur 4B). Desuden er disse vævs spontane kontraktile mønstre meget synkrone (figur 4C, video 3) på grund af hjertecellernes indbyrdes forbundne, justerede karakter.
Figur 1: Eksperimentelle skematiske og repræsentative billeder af cellulær morfologi under forberedelse til indsprøjtning af udstyr: Skematisk over protokollen, der beskriver trin efter fremstilling af mikrofluidiske enheder, fra hiPSC-kultur til mikrofluidisk hjertevævsdannelse (A). hiPSC'er bør opretholde en kolonilignende morfologi (B) og et højt udtryk for pluripotencymarkører (SOX2, grøn; Nanog, rød) (C) ved begyndelsen af differentiering. Efter hiPSC-CM differentiering, bør der være rigelige, tætte pletter af CMs, som farves med sarkomerisk alfa-actinin (SAA, grøn), med minimal omkringliggende ikke-CMs, som det fremgår af vimentin farvning (vim, rød) (D). hR'er bør være til stede med et højt vimentinudtryk og opretholde fibroblastmorfologi (E). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: populationer af hiPSC-CM i de sidste faser af differentiering: Rensningsprocessen forårsager ikke-CMs død, der producerer snavs i cellekulturen, til stede før CM replating (A). Efter replating (B), er snavs og ikke-CMs løsnet, tjener til yderligere at rense CM befolkning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Humant hjerte 3D-vævsdannelse i den mikrofluidiske anordning: Dagen efter injektionen i enheden (vist i øverste venstre indsat, ved siden af us dime for skala), vil cellerne begynde at sprede sig og vil være tætte og homogent fordelt over hele enheden (A). Efter en uges kultur genoptages cellerne spontant slå og danne kondenseret, justeret væv (B). Ved to ugers kultur danner cellerne kondenseret, justeret væv omkring de elliptiske stillinger (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative egenskaber ved humant hjertevæv efter dyrkning i 14 dage i mikrofluidisk anordning: Cellerne har dannet aflange, stærkt justerede væv, som angivet ved actin farvning (A). Sarkomerne er parallelle og striated, og der er lokalisering af gap knudepunkter som det fremgår gennem farvning for sarkomeriske α-actinin (SAA) og connexin 43 (CX43), henholdsvis (B). Den spontane sammentrækning er synkron (C). Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Spontan sammentrækning af hiPSC-CMs på dag 21 efter laktatrensning og før du replaterer Klik her for at downloade denne video.
Video 2: Spontan sammentrækning af hiPSC-CMs på dag 23 efter replating Klik her for at downloade denne video.
Video 3: Synkron, spontan sammentrækning af humant hjertevæv i enheden i 14 dage Klik her for at downloade denne video.
Supplerende sag 1: AutoCAD-fil til hjerte-on-a-chip-enhed Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 2: MATLAB program til at udtrække toppe til at bestemme inter-beat interval variation fra at slå signaler Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende sag 3: Tabel over primære og sekundære antistoffer Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dannelsen af en in vitro human hjertevævsmodel med forbedrede cellecelleinteraktioner og biomimetisk 3D-struktur er afgørende for grundlæggende kardiovaskulær forskning og tilsvarende kliniske anvendelser1. Denne skitserede protokol forklarer udviklingen af 3D humant anisotropisk hjertevæv i en mikrofluidisk enhed ved hjælp af co-kultur af stamcelle-afledte CMs med bindeled CF'er indkapslet i en kollagen hydrogel, der tjener til at modellere den komplekse celle sammensætning og struktur af den indfødte myokardie. Denne specifikke protokol er meget reproducerbar, da enhedens særlige struktur er optimeret og valideret til 3D-anisotropisk hjertevævsdannelse fra både rotte-afledte hjerteceller og humane stamcelledifferentierede CMs fra HESC'er og to typer hiPSC'er (SCVI20 og IMR90-4), som det fremgår af vores nyligepublikation 20. Vi har blandt mange andre grupper konstateret, at effektiviteten af CM-differentiering af stamceller varierer mellem cellelinjer35,36. Den gennemførte rensningsprotokol støtter med hensyn til at øge differentieringsudbyttet; Rensningstidens længde afhænger dog af cellelinjen og differentieringseffektiviteten. Derfor kan den resulterende succes i dannelsen af mikrofluidiske væv variere mellem cellelinjer.
For at fange relevante komponenter i myokardiet er cellesammensætningen for de påviste væv hovedsageligt en blanding af CMs og CF'er, da CMs kompromitterer det meste af volumenet, mens FSR bevarer det meste af cellepopulationen i hjertet37. Desuden blev det særlige forhold på 4:1 CM:CF'er grundigt valideret i nyligt offentliggjort arbejde20 for at resultere i optimal struktur og hjertevævsdannelse inden for denne platform. Fremtidige undersøgelser, der involverer denne beskrevne platform, kan fremmes yderligere i deres kompleksitet ved at supplere med andre angrende celletyper for bedre at efterligne det indfødte myokardie. For eksempel er det for nylig blevet konstateret, at bosiddende makrofager er integreret i ledningsprocesser i hjertet38, ud over deres veldokumenterede rolle i immunrespons39. Derfor kan makrofager indarbejdes i celleblandingen før hydrogelindkapsling til model residente hjertemakrofager. Alternativt kan monocytter leveres gennem mediekanalerne som en model for rekruttering gennem blodcirkulationen, hvilket kan føre til en population af inflammatoriske makrofager i hjertevævet.
Der er iboende fordele ved at bruge en mikrofluidisk enhed som en platform til at konstruere 3D-vævsmodeller. Især kan præcise diffusionsbaserede eksperimenter etableres gennem nøjagtig kontrol af kemikalier, molekyler eller gasser, der muliggør koncentrationsgradienter på tværs af en enhed18,20. Derudover kan forskellige sæt celletype40 og væskeflow indarbejdes for at efterligne dynamiske kulturforhold og give forskydningsbelastning på seedede celler41. Sidstnævnte kan være til særlig nytte i undersøgelsen af et indbygget vaskulært system i chippen, da endotelceller kan sås i de tilstødende mediekanaler (som vi tidligere har påvist ved hjælp af denne enhed til at modellere astrocytter-on-a-chip23), og konstant væskestrøm til at efterligne kapillærer kan let indarbejdes via en vakuumbaseret eller tyngdekraftsbaseret pumpe.
En anden fordel ved den mikrofluidiske enhed er det materiale (dvs. PDMS), der bruges til at fremstille enhedskanalerne. Konkret er PDMS en gennemsigtig, billig og biokompatibel polymer42 med let justerbar stivhed. Det begrænsende trin i fremstillingen af disse enheder ligger i fotolitografien, da teknikken kræver adgang til et renrum og erhvervelse af den tilknyttede færdighed. Men når wafer er fremstillet, kan det bruges til at gøre hundredvis af enheder gennem straight-forward blød litografi proces for at skabe PDMS kanaler og den simple handling plasma limning at forsegle kanalerne til coverslips. I fremtidige undersøgelser, hvis enheden skulle ændres til at omfatte evnen til at måle elektriske egenskaber af vævet i realtid, et ekstra skridt for montering af enheden med elektroder og ledende komponenter skulle indarbejdes i fremstillingsprocessen. Brugen af PDMS til fremstilling af kanalen kan bevare begrænsninger, især hvis det anvendes i konstruktioner til lægemiddelresponsundersøgelser, da PDMS har vist sig at adsorbere små hydrofobe molekyler43,44,45. Derfor kan andre materialer, såsom termoplast46,47, undersøges som alternativer til PDMS under den bløde litografiproces.
Et kritisk skridt i denne skitserede protokol er trin 3.6.4, der beskriver celle:hydrogelindsættelse i de mikrofluidiske enheder. Et par vigtige variabler skal styres for at sikre succes, herunder temperatur, tid og korrekt håndtering. Hvis enten hydrogellageropløsningerne eller den forberedte celle:hydrogelopløsning når stuetemperatur, er de i fare for delvis polymerisering, hvilket er irreversibelt, hvilket gør opløsningen tyktflydende og næsten umulig at injicere i enheden uden lækage i mediekanaler. På den anden side kan cellen:hydrogelopløsningen ikke fryse, da cellerne vil dø; derfor skal opløsningen holdes inden for dette smalle temperaturvindue. På samme måde vedrører den tid, der går mellem celle:hydrogelforberedelse og indsprøjtning af udstyr, direkte den forberedte opløsnings stigende temperatur. Specielt, så snart opløsningen er lavet, og aliquot (dvs. 3 μL) er opnået, pipetten holder aliquot skal flyttes, så spidsen er inde i enheden porte, og aliquot skal langsomt og støt indsættes i enheden. Under hele denne overgang er det lille volumen inden for en pipettespids, der er ved stuetemperatur, derfor øger opløsningen hurtigt temperaturen fra den is, den blev forberedt på (dvs. -20 °C), hvilket kræver en ret hurtig injektionsproces. Hvis temperaturfølsomheden af den kollagenbaserede hydrogel bliver en nøglefaktor under injektionen af enheden, kan inkorporering af andre hydrogeler48, såsom fotocrosslinkable hydrogels (dvs. GelMA)47,49,50,51 eller enzymatisk-crosslinked hydrogels (dvs. fibrin)11,52,53, udforskes.
Udformningen af den mikrofluidiske anordning, der er inkluderet i denne protokol, gør det muligt at etablere et anisotropisk væv på grund af tilstedeværelsen af de forskudte, fremspringende elliptiske stillinger inden for hovedvævskanalen20. Denne funktion er fordelagtig i forhold til andre metoder, f.eks. Men som tidligere nævnt er der ofte vanskeligheder forbundet med injektion af en celle:hydrogel suspension i en enhedskanal, især i en kanal med medfødte stillinger. Til dette formål er håndteringstrykket for indføring af enheden ret følsomt. Injektionsprocessen skal være stabil ved et ensartet og relativt lavt tryk for at undgå lækage i mediekanalerne.
Derudover kan bobler ikke indføres hverken under forberedelsen af opløsningen eller under indføring af enheden, da bobler vil forårsage lækage fra hovedvævskanalen i mediekanalerne. Således er der behov for ordentlig pleje for at kontrollere håndtering, temperatur og timing af cellen:hydrogelindsprøjtning for at sikre succes i dannelsen af 3D homogent fordelt væv. Derfor kan praksis med håndtering af mikrofluidiske enheder før cellekulturforsøg være gavnlig. Derefter er vedligeholdelse af væv i mikrofluidiske anordninger ganske ligetil, hvilket blot kræver en daglig medieændring på 20 μL volumen, og enhedens coverlip-base gør praktisk håndtering under realtidsbilleder.
Sammenfattende bruger den protokol, der er beskrevet heri, en kombination af mikromoldingteknikker, herunder fotolitografi og blød litografi, til at skabe en indviklet arkitektur i en mikrofluidisk enhed, der fremkalder høje niveauer af 3D-vævs anisotropi, med robuste biologiske teknikker, herunder stamcelledifferentiering, primær menneskelig cellekultur og hydrogelbaserede biomaterialer. Slutresultatet af den skitserede protokol er et justeret, 3D-kokultureret hjertevæv i en mikrofluidisk chip med en moden fænotype, der gentagne gange er blevet valideret for flere forskellige celletyper og linje20, hvilket gør det velegnet til sygdomsmodellering og downstream-prækliniske applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) og Flinn Foundation Award for at yde finansieringskilder til dette projekt. HiPSC-linjen, SCVI20, blev hentet fra Joseph C. Wu, MD, ph.d. ved Stanford Cardiovascular Institute finansieret af NIH R24 HL117756. HiPSC-linjen, IMR90-4, blev hentet fra WiCell Research Institute55,56.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.65 mL centrifuge tubes | VWR | 87003-290 | |
| 1 mm Biopsy punch | VWR | 95039-090 | |
| 1.5 mm Biopsy punch | VWR | 95039-088 | |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 89039-670 | |
| 18x18mm coverslips | VWR | 16004-308 | The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging |
| 4% paraformaldehyde | ThermoFisher | 101176-014 | |
| 6-well flat botttom tissue-culture plates | VWR | 82050-844 | |
| B27 minus insulin | LifeTech | A1895602 | |
| B27 plus insulin | LifeTech | 17504001 | |
| CHIR99021 | VWR | 10188-030 | |
| Collagen I, rat tail | Corning | 47747-218 | |
| DMEM F12 | ThermoFisher | 11330057 | |
| DPBS | ThermoFisher | 21600069 | |
| E8 | ThermoFisher | A1517001 | can also be made in house |
| EDTA | VWR | 45001-122 | |
| Ethanol | |||
| FGM3 | VWR | 10172-048 | |
| GFR-Matrigel | VWR | 47743-718 | |
| Glycine | Sigma | G8898-500G | |
| Goat serum | VWR | 10152-212 | |
| hESC-Matrigel | Corning | BD354277 | |
| IPA | |||
| IWP2 | Sigma | I0536-5MG | |
| Kimwipes | VWR | 82003-820 | |
| MTCS | Sigma | 440299-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-25G | |
| NaOH | Sigma | S5881-500G | |
| Pen/Strep | VWR | 15140122 | |
| Petri dish (150x15mm) | VWR | 25384-326 | |
| Petri dish (60x15mm) | VWR | 25384-092 | |
| Phenol Red | Sigma | P3532-5G | |
| RPMI 1640 | ThermoFisher | MT10040CM | |
| RPMI 1640 minus glucose | VWR | 45001-110 | |
| Silicon Wafers (100mm) | University Wafer | 1196 | |
| Sodium lactate | Sigma | L4263-100ML | |
| SU8 2075 | Microchem | Y111074 0500L1GL | |
| SU8 Developer | ThermoFisher | NC9901158 | |
| Sylgard Elastomer | Essex Brownell | DC-184-1.1 | |
| T75 flasks | VWR | 82050-856 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| TrypLE | ThermoFisher | 12604021 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | ThermoFisher | 15400054 | |
| Tween20 | Sigma | P9416-50ML | |
| Y-27632 | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| EVG620 Aligner | EVG | ||
| Plasma cleaner PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Zeiss AxioObserver Z1 microscope | Nikon | ||
| Leica SP8 Confocal microscope | Leica |
References
- Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
- Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
- Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
- Pinto, A. R., et al.
- LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, Springer. Parts of the Developments in Cardiovascular Medicine book series 3-21 (2005).
- Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
- Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
- Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
- Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
- Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
- Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
- Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
- Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
- Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
- Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
- Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
- Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
- Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
- Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
- Benam, K. H., et al.
- Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
- Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
- Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
- Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
- Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
- Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
- Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
- Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
- Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
- Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
- Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
- Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
- Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
- Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
- Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
- Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
- Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
- Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
- Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
- Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
- Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
- Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
- Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
- Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
- Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
- Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
