Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Utvikle 3D-organisert humant hjertevev i en mikrofluidisk plattform

Published: June 15, 2021 doi: 10.3791/62539
Automatic Translation
1, 1,2
1School of Biological and Health Systems Engineering, Arizona State University, 2Biodesign Virginia G. Piper Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Summary

Målet med denne protokollen er å forklare og demonstrere utviklingen av en tredimensjonal (3D) mikrofluidisk modell av høyt justert humant hjertevev, sammensatt av stamcelleavledede kardiomyocytter som er dyrket med hjertefibroblaster (CFer) innenfor en biomimetisk, kollagenbasert hydrogel, for anvendelser innen hjertevevsteknikk, legemiddelscreening og sykdomsmodellering.

Abstract

Den ledende dødsårsaken over hele verden vedvarer som kardiovaskulær sykdom (CVD). Men modellering av hjertemuskelens fysiologiske og biologiske kompleksitet, myokardiet, er notorisk vanskelig å oppnå in vitro. Hovedsakelig ligger hindringer i behovet for menneskelige kardiomyocytter (CMs) som enten er voksne eller viser voksenlignende fenotyper og kan med hell gjenskape myokardiets cellulære kompleksitet og intrikate 3D-arkitektur. Dessverre, på grunn av etiske bekymringer og mangel på tilgjengelig primær pasient-avledet menneskelig hjertevev, kombinert med minimal spredning av CMs, har sourcing av levedyktige menneskelige CMs vært et begrensende skritt for hjertevevsteknikk. For dette formål har de fleste undersøkelser gått over til hjertedifferensiering av menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCer) som den primære kilden til menneskelige CMs, noe som resulterer i bred inkorporering av hiPSC-CMs innen in vitro-analyser for hjertevevsmodellering.

Her i dette arbeidet demonstrerer vi en protokoll for å utvikle et 3D-modent stamcelle-avledet menneskelig hjertevev i en mikrofluidisk enhet. Vi forklarer og visuelt produksjonen av en 3D in vitro anisotropisk hjertevev-på-en-chip-modell fra hiPSC-avledede CMs. Vi beskriver først og fremst en renseprotokoll for å velge for CMs, kokulturen av celler med et definert forhold ved å blande CMs med menneskelige CFer (hCFer), og suspensjon av denne medkulturen i kollagenbasert hydrogel. Vi demonstrerer videre injeksjonen av den cellebelastede hydrogelen i vår veldefinerte mikrofluidiske enhet, innebygd med forskjøvet elliptiske mikroposter som tjener som overflatetopografi for å indusere en høy grad av justering av de omkringliggende cellene og hydrogelmatrisen, etterligne arkitekturen til det opprinnelige myokardiet. Vi ser for oss at den foreslåtte 3D-anisotropiske hjertevev-på-chip-modellen er egnet for grunnleggende biologistudier, sykdomsmodellering og, gjennom bruk som screeningverktøy, farmasøytisk testing.

Introduction

Vevsteknikk tilnærminger har blitt mye utforsket, de siste årene, for å følge in vivo kliniske funn i regenerativ medisin og sykdom modellering1,2. Det er spesielt lagt særlig vekt på in vitro hjertevevsmodellering på grunn av de iboende vanskelighetene med å skaffe humant primært hjertevev og produsere fysiologisk relevante in vitro surrogater, noe som begrenser den grunnleggende forståelsen av de komplekse mekanismene for kardiovaskulære sykdommer (CVDs)1,3. Tradisjonelle modeller har ofte involvert 2D monolayer kulturanalyser. Imidlertid har viktigheten av å dyrke hjerteceller i et 3D-miljø for å etterligne både det opprinnelige landskapet i myokardiet og komplekse cellulære interaksjoner blitt omfattende karakterisert4,5. I tillegg har de fleste modeller produsert så langt inkludert en monokultur av CMs differensiert fra stamceller. Imidlertid består hjertet av flere celletyper6 i en kompleks 3D-arkitektur7, som garanterer det kritiske behovet for å forbedre kompleksiteten i vevssammensetningen i 3D in vitro-modeller for bedre å etterligne cellulære bestanddeler av det opprinnelige myokardiet.

Til dags dato har mange forskjellige tilnærminger blitt utforsket for å produsere biomimetiske 3D-modeller av myokardiet8. Disse tilnærmingene spenner fra eksperimentelle oppsett som tillater sanntidsberegning av generert kraft, fra monokultur CMs frøet på tynne filmer (ansett som muskuløse tynne filmer (MTFer))9, til samkulturelle hjerteceller i 3D hydrogelmatriser suspendert blant frittstående cantilevers (ansett konstruert hjertevev (EHTs))10. Andre tilnærminger har fokusert på å implementere mikromolding teknikker for å etterligne myokardanisotropi, fra monokultur CMs i en 3D hydrogel suspendert blant fremspringende mikroposter i en vev patch11, til mono-kultur CMs frø blant innrykkede mikrogroover12,13. Det er iboende fordeler og ulemper ved hver av disse metodene, derfor er det relevant å bruke teknikken som samsvarer med den tiltenkte applikasjonen og det tilsvarende biologiske spørsmålet.

Evnen til å forbedre modningen av stamcelleavledede CMs er avgjørende for vellykket in vitro-prosjektering av voksenlignende myokardvev og oversettelse av påfølgende funn til kliniske tolkninger. For dette formål har metoder for modne CMs blitt mye utforsket, både i 2D og 3D14,15,16. For eksempel fører elektrisk stimulering innlemmet i EHTs, tvungen justering av CMs med overflatetopografi, signalsignaler, vekstfaktorer fra samkultur og / eller 3D-hydrogelforhold, etc., alle til en endring til fordel for CM-modning i minst ett av følgende: cellemorfologi, kalsiumhåndtering, sarkomisk struktur, genuttrykk eller kontraktskraft.

Av disse modellene beholder tilnærmingene som bruker mikrofluidiske plattformer visse fordeler i naturen, for eksempel kontroll av gradienter, begrenset celleinngang og minimale nødvendige reagenser. Videre kan mange biologiske replikeringer genereres samtidig ved hjelp av mikrofluidiske plattformer, som tjener til bedre å dissekere den biologiske interessemekanismen og øke den eksperimentelle prøvestørrelsen til fordel for statistisk kraft17,18,19. I tillegg gjør bruk av fotolitografi i den mikrofluidiske enhet fabrikasjonsprosessen det mulig å lage presise funksjoner (f.eks. topografier) på mikro- og nanonivå, som tjener som mesoskopiske signaler for å forbedre den omkringliggende cellulære strukturen og makronivåvevsarkitekturen18,20,21,22 for forskjellige applikasjoner i vevregenerering og sykdomsmodellering.

Vi har tidligere demonstrert utviklingen av en ny 3D-hjertevevs on-chip-modell som inkorporerer overflatetopografi, i form av medfødte elliptiske mikroposter, for å justere hydrogel-innkapslede kokulturerte hjerteceller i et sammenkoblet, anisotropt vev20. Etter 14 dager med kultur er vevene dannet i mikrofluidisk enhet mer modne i fenotypen, genuttrykksprofilen, kalsiumhåndteringsegenskapene og farmasøytisk respons sammenlignet med monolayer og 3D isotrope kontroller23. Protokollen som er beskrevet her, skisserer metoden for å lage denne 3D-kokulturerte, justerte (dvs. anisotropiske) menneskelige hjertevev i den mikrofluidiske enheten ved hjelp av hiPSC-avledede CMs. Spesielt forklarer vi metodene for å differensiere og rense hiPSCer mot CMs, tilskudd av hCFer med CMs for å produsere en etablert samkulturpopulasjon, innsetting av cellepopulasjonen innkapslet i kollagenhydrgelen i mikrofluidiske enheter, og etterfølgende analyse av 3D-konstruert vev gjennom kontraktile og immunofluoreserende analyser. Det resulterende 3D-konstruerte mikrovevet er egnet for ulike bruksområder, inkludert grunnleggende biologistudier, CVD-modellering og farmasøytisk testing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Utfør all cellehåndtering og reagensforberedelse i et Biosafety Cabinet. Sørg for at alle overflater, materialer og utstyr som kommer i kontakt med celler er sterile (dvs. spray ned med 70% etanol). Celler skal dyrkes i en fuktet 37 °C, 5 % CO 2-inkubator. All hiPSC-kultur og differensiering utføres i 6-brønnsplater.

1. Opprettelse av mikrofluidisk enhet (omtrentlig varighet: 1 uke)

  1. Fotolitografi
    MERK: Masken, designet med CAD-filen (leveres som tilleggsfil 1), inneholder utformingen av den mikrofluidiske kanalen. Skriv ut utformingen på en gjennomsiktig maske. Utfør deretter standard fotolitografi med den negative fotoresisten SU8 2075 på en 4-tommers silisiumskive i et rent rom.
    1. Rengjør en silisiumskive med isopropylalkohol (IPA) og tørk med nitrogen. Stek ved 200 °C i 5 min for dehydrering.
      MERK: Håndter skiven med wafer pinsett.
    2. Plasser skiven i spin-coateren. Sett inn 3-4 ml SU8 i midten av waferen, spinn deretter for å danne et lag på 200 μm (dvs. rampe opp 15 s til 500 rpm, spinn for 10 s, rampe opp 5 s til 1200 rpm, og spinn for 30 s, deretter downspin for 15 s til stoppet).
    3. Fjern skive og myk bake i 7 min ved 65 °C, deretter 45 min ved 95 °C.
    4. Flytt skiven til en maskejustering og plasser den gjennomsiktige masken i maskeholderen med et UV-filter. Utsett skiven for 2 sykluser på 230 mJ/cm2, med 30 s forsinkelse, for en total eksponering på 460 mJ/cm2.
    5. Utfør en bakverk etter eksponering på den eksponerte skiven i en 50 °C ovn over natten.
    6. Slå av ovnen neste morgen, og etter at skiven er avkjølt til romtemperatur, senk den ned i SU8-utvikleren. Fjern skiven fra utvikleren hvert 5.
    7. Etter ca. 20 min, eller når IPA går klart, tørk skiven med luft nitrogen og stek hardt i en ovn satt til 150 °C; så snart ovnen når 150 °C, må du slå den av, men ikke åpne den. La skiven stå i ovnen til den har nådd romtemperatur, og fjern deretter skiven.
    8. Bekreft høyden på SU8 med et profilometer og de optiske funksjonene med et lysmikroskop. Når det er bekreftet, tape skiven inne i en 150 mm plast Petri tallerken.
  2. Myk litografi
    MERK: Skiven, som er teipet på Petri-parabolen, må silaniseres for å forhindre at PDMS overholdes SU8-funksjonene.
    1. Snu skiven (tappet til en plast Petri-tallerken) over en Petri-tallerken av samme størrelse som inneholder 0,4 ml metylklorosilane (MTCS) og utsett skiven for dampene i 4 min. Vri skiven oppreist og legg lokket på Petri-parabolen.
    2. Bland 30 g silikon elastomerbase til herdemiddelet med et forhold på 10:1. Ta lokket av Petri-parabolen og hell polydimetylsiloksan (PDMS) på skiven, og avfett deretter i en tørkemiddel.
    3. Når alle boblene er borte, plasserer du skiven ved 80 °C i 1,5 timer for å kurere PDMS.
    4. Skrell forsiktig av PDMS, og stans innløp og uttak for vevsportene og mediekanalene med henholdsvis en 1 mm og 1,5 mm biopsistans.
    5. Rengjør PDMS-kanalene med tape for å fjerne støv. Deretter suger du dekslene (18 x 18 mm, nr. 1) i 70% etanol i minst 15 minutter. Tørk deretter disse av med vevsservietter.
    6. Sett både dekslene og PDMS-kanalene (funksjonssiden eksponert) mot plasmaet (innstilling på høyt) i 1 min, fest deretter raskt sammen og legg i en 80 °C ovn over natten for å sikre bindingen.
      MERK: Under bindingen er det viktig å påføre mildt trykk på kantene på PDMS-kanalene for å sikre en god forsegling mellom PDMS og glasset, samtidig som kanalen unngås for å forhindre at kanalen kollapser.
  3. Klargjøring av enhet
    1. Senk de limte PDMS-enhetene ned i deionisert vann (DI H2O) og autoklaver med væskesyklusen. Deretter aspirerer du væsken fra enhetene og autoklaverer igjen med tyngdekraften. Deretter dehydrerer du de steriliserte enhetene over natten ved 80 °C.

2. Stamcellekultur (omtrentlig varighet: 1-2 måneder)

  1. hiPSC kultur og vedlikehold
    MERK: HiPSCene må dyrkes i tre påfølgende passasjer etter opptining av in vitro før kryopreservering eller differensiering. hiPSCer dyrkes i enten E8 eller mTeSR1 medium, avhengig av cellelinjen, på kjellermembranmatrisebelagte plater24.
    1. For å belegge plater med hESC-kvalitet kjellermembranmatrise, tine en aliquot av matrisemediet (partiavhengig volum, vanligvis 200-300 μL; lagret ved -80 °C) ved å legge det til 25 ml DMEM/F-12K på is. Dispenser 1 ml av denne suspensjonen i hver brønn på en 6-brønns plate. La platen stå i inkubatoren ved 37 °C i minst 1 time.
    2. Ved opptining må du modifisere E8-mediet for hiPSC-kultur ved å legge til 5 μM Y-2763225 (E8+RI). Bruk dette mediet i 24 timer etterpå, og endre deretter mediet til frisk E8.
      MERK: For rutinemessige medieendringer brukes umodifiserte E8-medier til hiPSC-kultur. For regelmessig vedlikehold må E8-medier skiftes hver dag, ca. 24 timer etter forrige medieskifte.
    3. Passasjeceller på dag 3 eller dag 4, aspirerte medier, vask deretter hver brønn med 1 ml 1x Dulbeccos fosfatbufrede løsning (DPBS).
      MERK: Kontroller at cellene er rundt 70 % sammenfallende. Ikke la dem vokse utover 70% samløp.
    4. Aspirer DPBS, legg deretter 1 ml 0,5 mM EDTA til hver brønn og inkuber ved romtemperatur i 6-7 min.
    5. Aspirer forsiktig EDTA, tilsett 1 ml E8+ RI i hver brønn og spreng mot overflaten med en 1 ml pipette (~ 5-10 ganger for å samle alle cellene). Samle celleopphenget i et 15 ml mikrosenterrør.
    6. Tell celleoppheng og passasje ved ønsket celletetthet (dvs. ~ 200 K per brønn) i E8 + RI.
    7. Bytt medium til E8 (uten RI) 24 timer etter. Ikke la cellene med RI stå i mer enn 24 timer.
      MERK: E8 må ikke varmes opp til 37 °C. La det alltid stå ved romtemperatur for oppvarming før cellekultur.
  2. Kardiomyocytt (CM) rettet differensiering
    MERK: Det er viktig å merke seg eksistensen av heterogenitet mellom forskjellige linjer i hiPSCene26,27, så følgende trinn må kanskje optimaliseres for hver cellelinje. Følg trinnene nedenfor for CM-differensiering.
    1. Forbered RPMI + B27 - insulin ved å tilsette 10 ml B27 minus insulin og 5 ml penicillin/streptomycin (penn/strep) til 500 ml RPMI 1640.
    2. Forbered RPMI + B27 + insulin ved å tilsette 10 ml B27 og 5 ml penn/strep til 500 ml RPMI 1640.
    3. Forbered RPMI minus glukose + B27 + insulin ved å tilsette 10 ml B27, 5 ml penn/strep og 4 mM natriumlaktat til 500 ml RPMI 1640 uten glukose.
    4. Når hiPSCene når 85 % samløp, start differensiering (dag 0) ved å erstatte det gamle mediet med 4 ml RPMI + B27 - insulinmedium som inneholder 10 μM CHIR99021 til hver brønn av en 6-brønns plate (dvs. tilsett 25 μL 10 mM CHIR99021 i 25 ml RPMI + B27 - insulin og tilsett deretter umiddelbart 4 ml per brønn).
      MERK: CHIR99021 er en GSK-hemmer og fører til Wnt-aktivering. Den optimale konsentrasjonen av CHIR99021 og innledende samtidighet varierer for hver cellelinje28. Kontroller alltid en konsentrasjonsgradient på 6-12 μM CHIR99021 og en rekke såddtettheter før selve eksperimentet for å bestemme optimale forhold for å initiere differensiering.
    5. Nøyaktig 24 timer senere (dag 1), aspirer mediet og erstatt med 5 ml forvarsel RPMI + B27 - insulin til hver brønn.
    6. Nøyaktig 72 timer etter CHIR99021 tillegg (dag 3), samle 2,5 ml av det brukte mediet fra hver brønn på 6-brønnsplaten, totalt 15 ml av det brukte mediet i et rør.
    7. Til dette legger du til 15 ml fersk RPMI + B27 - insulinmedium. Tilsett IWP2 i en konsentrasjon på 5 μM i det kombinerte middels røret (dvs. 1 μL IWP2 ved 5 mM per 1 ml kombinert medium eller 30 μL IWP2 i 30 totale ml medier).
    8. Fjern ~1,5 ml av det gjenværende mediet per brønn på platen slik at 1 ml av mediet forblir. Virvle platen kraftig for å sikre tilstrekkelig fjerning av celleavfall. Aspirer deretter resten av det gamle mediet og tilsett 5 ml av det kombinerte mediet som inneholder IWP2 per brønn av platen.
      MERK: Tilsetningen av IWP2 til cellene fører til Wnt-hemming.
    9. På dag 5 aspirerer du mediet fra hver brønn og erstatter det med 5 ml forvarsel RPMI + B27 - insulin.
    10. CM Modning: På dag 7, dag 9 og dag 11 aspirerer du mediet fra hver brønn og erstatter det med 5 ml forhåndsvarslet RPMI + B27 + insulin. Spontan juling bør observeres rundt disse dagene.
    11. CM Rensing: På dag 13 og dag 16, start glukose sult ved å aspirere mediet fra hver brønn, vaske hver brønn med 1 ml 1x DPBS, og tilsett deretter 5 ml forvarselt RPMI minus glukose + B27 + insulin, supplert med 4 mM natriumlaktatat.
    12. På dag 19 aspirerer du det brukte mediet og erstatter det med 5 ml forvarsel RPMI + B27 + insulin til hver brønn for å tillate cellegjenoppretting etter rensing.
    13. På dag 21 skriver du inn celler på nytt ved å følge den nedenfor beskrevne CM-dissosiasjonsprotokollen (trinn 3.3). Ta sikte på å plate 1,5-2 x 106 celler per brønn i en 6-brønns plate. Hvis det for eksempel er en svært effektiv differensiering, er det bra å utvide de 6 brønnene til 9 brønner.
    14. Fra dag 21 på aspirerer du mediet fra hver brønn og erstatter det med 4 ml RPMI + B27 + insulin hver 2-3 dager.
      MERK: HiPSC-CMs er klare for eksperimentell bruk etter dag 23.

3. Opprettelse av 3D-hjertevev i mikrofluidisk enhet: (Omtrentlig varighet: 2-3 t)

  1. hCF-kultur
    1. Kultur humane ventrikulære hjertefibroblaster (hCFer, oppnådd kommersielt fra Lonza) i T75-kolber (ved 250K celler per kolbe) i Fibroblast Growth Media-3 (FGM3). Endre media annenhver dag, og passasje når du er på 70% confluent. Bruk hCF-ene før passering 10, da de kan begynne å skille mellom myofibroblaster ved høye passasjer29.
  2. hCF-dissosiasjon
    1. For å fjerne hCFene, ta først ut kolben fra inkubatoren. Sett kolben inne i biosikkerhetsskapet og begynn å aspirere de brukte mediene fra kolben. Vask deretter T75-kolben med 3 ml 1x DPBS. Lukk hetten og virvle kolben.
    2. Aspirer DPBS. Ta 3 ml forhåndsvarslet 1x Trypsin-EDTA (0,05%) og legg den til kolben. Vipp kolben og virvle for å belegge bunnen. La den stå i en 37 °C inkubator i 4-6 min, kontroller kolben under et mikroskop for å sikre at cellene løsner, som det fremgår av den runde celleformen og flytende celler. Hvis ikke, legg kolben tilbake i inkubatoren i et minutt til.
    3. Nøytraliser trypsin-handlingen ved å legge til 3 ml forhåndsvarslet FGM3 i kolben. Deretter pipetterer du løsningen opp og ned mot bunnen av kolben for å løsne CF-ene.
    4. Samle celleopphenget i et 15 ml mikrosenterrør. Ta 10 μL av celleopphenget og dispenser det i et hemocytometer for å telle cellene med et mikroskop.
    5. Sentrifuger cellesuspensjonen ved 200 x g i 4 min. Aspirer supernatanten som er forsiktig så du ikke forstyrrer cellepellet.
    6. Resuspend pellet i frisk FGM3, for å lage en ønsket 75 x 106 celler / ml. Enten passerer du en del (250K celler per T75 kolbe) eller følger protokollen nedenfor for å generere 3D-hjertevev.
  3. CM-dissosiasjon
    MERK: Etter differensiering og rensing klargjør du CMs for bruk i injeksjonen i mikrofluidiske enheter.
    1. Ta platen med CMs ut av inkubatoren og aspirer mediet. Vask deretter brønnene med 1 ml 1x DPBS per brønn av en 6-brønns plate. Ta 6 ml DPBS og pipette 1 ml per brønn.
    2. Aspirer DPBS forsiktig så du ikke forstyrrer cellene som er festet til platen. Pipette 6 ml varmcelleavløsning (f.eks. TrypLE express) og tilsett 1 ml per brønn. Inkuber cellene i en 37 °C inkubator i 10 min.
    3. Nøytraliser enzymet med et likt volum RPMI + B27+ insulin (dvs. 1 ml per brønn) og fjern cellene mekanisk ved å pipettere opp og ned mot kulturbeholderen med en 1 ml pipette.
    4. Samle CMs i et 15 ml sentrifugerør. Sentrifuge ved 300 x g i 3 min.
    5. Aspirer supernatanten. Resuspend cellepellet i 5 ml RPMI + B27 + insulin. Pipette oppløsningen opp og ned med en 1 ml pipette for å sikre riktig blanding. Ta 10 μL av cellefjæringen og dispenser den i et hemocytometer for å bestemme det totale cellenummeret.
    6. Sentrifuger cellene igjen ved 300 x g i 3 minutter (for å sikre fullstendig fjerning av TrypLE), og aspirer supernatanten. Tilsett deretter et passende volum RPMI + B27 + insulin for å oppnå 75 x 106 celler / ml.
      MERK: Hvis hjertedifferensiering/-seleksjon ikke resulterer i høy CM% (dvs. >80%), som det fremgår av immunstaining eller strømningscytometri for CM-spesifikke proteiner som cTnT, må du ikke betrakte celler som egnet for vevsdannelsen. Differensieringsprosessen bør optimaliseres når dette skjer ved justering av CHIR99021-konsentrasjoner og innledende starttetthet. Hvis CM-rensing trenger forbedring, kan andre metoder brukes, for eksempel sortering for CMs med enten fluorescensaktivert cellesortering (FACS) eller magnetisk aktivert cellesortering (MACS)30,31,32.
  4. Kollagen forberedelse
    MERK: Forbered kollagen fra den høye konsentrasjonen av kollagenbestanden (fra 8-11 mg/ml). Kollagenet som brukes til å lage cell:hydrogelblandingen er på 6 mg/ml, og den endelige konsentrasjonen er 2 mg/ml. Avhengig av antall enheter som skal injiseres, må volumet av kollagenoppløsning som skal gjøres, beregnes på nytt.
    1. Oppbevar alle nødvendige reagenser på is inne i en biosikkerhetshette.
      MERK: Kollagen er en termoresponsiv hydrogel. Derfor må temperaturen forbli lav for å forhindre for tidlig polymerisering.
    2. Ta 75 μL lager kollagen (8 mg/ml) og dispenser det i et mikrocentrifugerør på is. Kollagenoppløsning er veldig viskøs, så sakte aspirere den med en pipette.
    3. Ta 13,85 μL medier (dvs. RPMI + B27 + insulin) og dispenser det i samme rør.
    4. Ta deretter 10 μL fenolrød og legg til blandingen og resuspend.
    5. Til slutt, ta 1,15 μL 1N NaOH og legg til suspensjonen.
    6. Bruk en pipettespiss på 200 μL til å resuspendere suspensjonen.
      MERK: Lagerkollasjen har en sur pH, noe som nødvendiggjør tilsetningen av NaOH for å nøytralisere før du bruker den til å innkapsle hjertecellene. Fenolrød fungerer som en pH-indikator; Legg derfor til dette før NaOH-tillegget. På dette tidspunktet vil kollagenoppløsningen være gul, og betegner surheten. Etter tilsetning av NaOH, bør løsningen bli oransje til lys rosa, noe som indikerer nøytraliseringen.
  5. Hydrogelblanding og celleforberedelse
    MERK: I dette trinnet gjøres innkapslingen av cellene i kollagenbasert hydrogel. Cellene, så vel som alle hydrogelforløpere, bør plasseres på is i de neste trinnene.
    1. På dette tidspunktet, hvis CF-ene ennå ikke er prøvet, lagre CM-suspensjonen i et 15 ml sentrifugerør, med lokket skrudd av for å tillate gassstrøm, innen en 37 ° C inkubator. Parallelt, ta avstand fra CF-ene og samle med en tetthet på 75 x 106 celler / ml for enhetsbelastning.
    2. Bland de suspenderte CMene med CFer med forholdet 4:1. Ta en aliquot på 8 μL CMs og legg til et friskt sentrifugerør på is. Ta deretter 2 μL CFer og legg til cellefjæringen i sentrifugerøret.
    3. Resuspend celle suspensjon, ta 5,6 μL av celle suspensjon, og legg den i en frisk mikrocentrifuge rør.
    4. Ta 4 μL av kollagenet som nettopp er tilberedt i trinnene ovenfor, og legg til en 4:1 CM:CF-blanding. Tilsett 2,4 μL vekstfaktor redusert (GFR) kjellermembranmatrise, noe som gjør den endelige celletettheten som 35 x 106 celler / ml for injeksjonen av enheten. Pipette blandingen opp og ned for å sikre at celleopphenget er homogent.
  6. Innsetting av enhet
    MERK: Når cell:hydrogelblandingen er tilberedt, må den settes inn i enhetene.
    1. Ta autoklavede mikrofluidiske enheter ut av ovnen på 80 °C og sett dem i Biosafety Cabinet i minst 1 time før innsettingen av cellefjæringen slik at enhetene kan avkjøles til romtemperatur samtidig som steriliteten opprettholdes.
    2. Plasser enhetene i 60 x 15 mm Petri-retter, ved 3-4 enheter per tallerken. Fyll en Petri-tallerken på 150 x 15 mm med et tynt lag DI H2O for å holde 3 av de 60 x 15 mm Petri-rettene. Dette trinnet skaper et fuktet miljø rundt mikrofluidiske enheter.
    3. Bruk en ny spiss og resuspend cellen:hydrogel blanding grundig ved å pipetter suspensjonen mens røret forblir på is.
    4. Sett spissen inn i injeksjonsporten på enheten og injiser sakte og jevnt 3 μL av cellen:hydrogelfjæring i vevsområdets innløp av en mikrofluidisk enhet ved hjelp av en 20 μL pipettespiss. Når porten er fylt, stopp injeksjonen og fjern spissen. Gjenta for alle enhetene, eller hele den tilberedte hydrogelfjæringen.
      MERK: Det lille volumet av cell:hydrogelfjæringen varmes opp/avkjøles veldig raskt, så det er relevant å holde suspensjonen på is så lenge som mulig. Ved innsetting, pipette løsningen av isen og sett inn i enheter så raskt som mulig, da hydrogelen kan begynne å polymerisere i pipettespissen. Det er viktig å lage små mengder av cellen: hydrogel suspensjon om gangen, så hvis mange enheter skal injiseres, må cellen: hydrogel suspensjon gjøres frisk for hvert sett med 4 enheter.
    5. Vend enhetene i Petri-rettene med pinsett og legg dem inne i den store Petri-parabolen med vann. Inkuber i en 37 °C inkubator i 9 min for hydrogelpolymerisering.
    6. Ta enhetene ut av inkubatoren, vend enhetene oppreist og inkuber ved 37 °C i 9 minutter for å fullføre hydrogelpolymerisering.
    7. Injiser RPMI + B27 + insulin i flankemediekanalene (~20 μL per enhet). Plasser enhetene tilbake i inkubatoren ved 37 °C. Endre mediet i mediekanalene med fersk RPMI + B27 + insulin hver dag. Enhetene har vist seg å være dyrket fra 14-21 dager20.
      MERK: På grunn av det lille volumet av medier per brikke, for å forhindre fordampning av medier, er det viktig å opprettholde enhetene i en stor Petri-tallerken fylt med DI H2O, som fungerer som et fuktet kammer. I tillegg kan små dråper med overflødig RPMI + B27 + insulin pipettes på toppen av kanalinntakene / uttakene under rutinemessige medieendringer.

4. Vevsanalyse

  1. Levende bildebehandling
    MERK: All levende avbildning bør utføres med en sceneinkubator for å opprettholde 37 °C og 5 % CO2.
    1. Plasser enheter i en miljøkontrollert trinninkubator. Ta opp 30 s videoer av flere steder i hver enhet med maksimal bildefrekvens.
    2. For å vurdere vevskontraktilitet etter å ha trukket ut slagsignalene, bruk den supplerende, spesialskrevne MATLAB-koden til å trekke ut topper (Supplementary File 2) for beregning av variasjoner i intervallet.
    3. Endre medier i enheter i cellekulturhetten, og plasser deretter tilbake i cellekulturinkubatoren.
  2. Immunfluorescerende farging
    1. Forbered PBS-Glycin: Løs opp 100 mM glycin i PBS og tilsett 0,02% NaN3 for langvarig lagring. Juster pH til 7,4.
    2. Forbered PBS-Tween-20: Legg til 0,05% Tween-20 til PBS og legg til 0,02% NaN3 for langsiktig lagring. Juster pH til 7,4.
    3. Klargjør IF-buffer: Legg til 0,2 % Triton X-100, 0,1 % BSA og 0,05 % Tween-20 i PBS, og legg til 0,02 % NaN3 for langtidslagring. Juster pH til 7,4.
    4. Forbered 10% geitserum: Resuspend det lyofiliserte geitserumet i 2 ml PBS for å lage 100% geitserum. Fortynn deretter 2 ml med 18 ml PBS for å lage 10% geitserum.
    5. Fest prøvene ved å tilsette 4% paraformaldehyd (PFA) til vevskanalene og inkubere ved 37 °C i 20 minutter.
    6. Vask cellene ved å legge PBS-Glycin til vevskanalene 2x i 10 min inkubasjon ved romtemperatur.
    7. Vask cellene ved å legge til PBS -Tween-20 i 10 min ved romtemperatur.
    8. Permeabiliser cellene ved å legge til IF-buffer i vevskanalene i 30 minutter ved romtemperatur.
    9. Blokker cellene ved å legge til 10% geitserumløsning til vevskanalene i 1 time ved romtemperatur.
    10. Fortynn de ikke-konjugede primære antistoffene i 10% geitserum ved ønskede konsentrasjoner (se Tilleggsfil 3), legg til vevskanalene, og inkuber prøvene ved 4 °C over natten.
    11. Neste dag, vask prøvene ved å legge PBS-Tween-20 til vevskanaler 3x i 20 minutter hver ved romtemperatur.
      MERK: Fra trinn 4.2.12 på utfører du alle oppgaver i mørket, slik at prøvene er beskyttet mot lys.
    12. Fortynn de sekundære antistoffene i PBS-Tween-20 ved ønskede konsentrasjoner, sentrifuge ved 10.000 x g i 10 minutter for å samle eventuelle utfellinger, og legg deretter til vevskanalene.
    13. Etter 30 min-1 h, vask prøvene med PBS-Tween-20 3x i 10 minutter hver ved romtemperatur.
    14. Tilsett anti-fade eller ønsket monteringsmedium til vevskanalene. Deretter kan prøvene avbildes ved hjelp av fluorescensmikroskopi eller med et konfokalt mikroskop, hvis høyere forstørrelse er ønsket. For å visualisere hele 3D-vevet, kan bilder på forskjellige z-plan stables og rekonstrueres for å danne representative 3D-bilder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å få en svært renset populasjon av CMer fra hiPSCer, brukes en modifisert versjon som involverer en kombinasjon av Lian differensieringsprotokoll33 og Tohyama rensing trinn34 (se figur 1A for eksperimentell tidslinje). HiPSCene må være kolonilignende, ~ 85% sammenfallende, og jevnt spredt gjennom kulturbrønnen 3-4 dager etter passasje, ved utbruddet av CM-differensiering (Figur 1B). Spesielt på dag 0 bør hiPSC-kolonier ha et høyt uttrykk for pluripotenstranskripsjonsfaktorer, inkludert SOX2 og Nanog (Figur 1C). Basert på denne protokollen er bevis på en vellykket stamcelledifferensierings- og rensingsprosess demonstrert i figur 1D, med tette kolonier av CMs som uttrykker sarkomerisk α-aktinin, med minimale omkringliggende ikke-CMer. I tillegg må hCF-ene opprettholde en fibroblastmorfologi med høyt vimentinuttrykk (figur 1E), slik at de skal brukes før P10, da de kan begynne å skille seg fra myofibroblaster ved høyere passasjer29.

For å opprettholde den robuste karakteren av denne protokollen, er det relevant å implementere replating av hiPSC-CMs etter metabolsk rensing. På grunn av tilstedeværelsen av døde celler og rusk som oppstår fra glukose sult, trenger CMs et ytterligere rensetrinn for å maksimere CM renhet og helse før bruk i eksperimentet; Derfor brukes replating da det bidrar til å løsne rusk / døde ikke-CMer (Figur 2A-B, Videoer 1-2). Video 1 viser et eksempel på populasjon av CMer før replating, og presenterer med høy renhet av CMer i flere lag, men med mye rusk til stede på cellene og flytende i media på grunn av implementert rensing. Tilsvarende viser Video 2 den samme populasjonen av CMs umiddelbart etter replating, og presenterer CMs i en monolayer med betydelig mindre rusk, som demonstrerer effekten av vevsfordøyelse og encellet dissosiasjon som oppstår under replating.

Ved innsetting av den celleinbygde hydrogelen i den mikrofluidiske enheten (dvs. chip; innfelt bilde i figur 3), er cellene tette og jevnt fordelt gjennom stolpene. Cellene begynner å spre seg på dag 1 (figur 3A), og etter dag 7 fortsetter de å slå og blir mer synkrone i sine kontraktilmønstre (Figur 3B). I tillegg kondenserer 3D-vevet rundt stolpene for å danne gjentatte elliptiske porer, og cellene forlenger. Ved dag 14 viser det modne vevet en høy grad av anisotropi (dvs. retningsorganisering), sammensatt av celler med langstrakt form (figur 3C, 4A), strikket, justert sarkomere og lokaliserte gapkryss (Figur 4B). Videre er de spontane kontraktile mønstrene til disse vevene svært synkrone (Figur 4C, Video 3) på grunn av hjertecellenes sammenkoblede, justerte natur.

Figure 1
Figur 1: Eksperimentelle skjematiske og representative bilder av cellulær morfologi under forberedelse til enhetsinjeksjon: Skjematisk i protokollen, som beskriver trinn etter mikrofluidisk enhetsfabrikasjon, fra hiPSC-kultur til mikrofluidisk hjertevevsdannelse (A). hiPSCer bør opprettholde en kolonilignende morfologi (B) og høyt uttrykk for pluripotensmarkører (SOX2, grønn; Nanog, rød) (C) ved utbruddet av differensiering. Etter hiPSC-CM differensiering bør det være rikelig, tette flekker av CMs, som farget med sarkomerisk alfa-aktinin (SAA, grønn), med minimale omkringliggende ikke-CMer, som det fremgår av vimentinfarging (vim, rød) (D). hCFer bør presentere med høye nivåer av vimentinuttrykk og opprettholde fibroblastmorfologi (E). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: hiPSC-CM populasjoner i de siste stadiene av differensiering: Renseprosessen forårsaker død av ikke-CMs, produserer rusk i cellekulturen, tilstede før CM replating (A). Etter replating (B), blir rusk og ikke-CMs løsnet, og tjener til å rense CM-befolkningen ytterligere. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Human hjerte-3D-vevsdannelse i mikrofluidisk enhet: Dagen etter injeksjon i enheten (vist i øvre venstre innfelling, ved siden av US Dime for skala), vil cellene begynne å spre seg og vil være tette og homogent fordelt over hele enheten (A). Etter en uke med kultur vil cellene gjenoppta spontant å slå og danne kondensert, justert vev (B). Ved to ukers kultur danner cellene kondensert, justert vev rundt elliptiske stolper (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Representative egenskaper ved humant hjertevev etter kultur i 14 dager i den mikrofluidiske enheten: Cellene har dannet langstrakt, høyt justert vev, som betegnet med aktinfarging (A). Sarcomeres er parallelle og striated, og det er lokalisering av gapkryss som det fremgår gjennom farging for sarkomerisk α-aktinin (SAA) og connexin 43 (CX43), henholdsvis (B). Den spontane sammentrekningen er synkron (C). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Video 1: Spontan sammentrekning av hiPSC-CMs på dag 21 etter laktatrensing og før replating Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: Spontan sammentrekning av hiPSC-CMs på dag 23 etter replating Klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: Synkron, spontan sammentrekning av humant hjertevev i enheten i 14 dager Klikk her for å laste ned denne videoen.

Tilleggsfil 1: AutoCAD-fil for hjerte-på-en-brikke-enhet Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: MATLAB program for å trekke ut topper for å bestemme inter-beat intervallvariabilitet fra slå signaler Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 3: Tabell over primære og sekundære antistoffer Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dannelsen av en in vitro menneskelig hjertevevsmodell med forbedrede cellecelleinteraksjoner og biomimetisk 3D-struktur er avgjørende for grunnleggende kardiovaskulær forskning og tilsvarende kliniske applikasjoner1. Denne skisserte protokollen forklarer utviklingen av 3D humant anisotropisk hjertevev i en mikrofluidisk enhet, ved hjelp av samkultur av stamcelleavledede CMer med bindende CFer innkapslet i en kollagenhydrgel, som tjener til å modellere den komplekse cellesammensetningen og strukturen til det opprinnelige myokardiet. Denne spesifikke protokollen er svært reproduserbar, da den spesielle strukturen til enheten er optimalisert og validert for 3D anisotropisk hjertevevsdannelse fra både rotteavledede hjerteceller og humane stamcelledifferensierte CMer, fra hESCer og to typer hiPSCer (SCVI20 og IMR90-4) som vist i vår nylige publikasjon20. Vi har blant mange andre grupper funnet ut at effektiviteten av CM-differensiering av stamceller varierer mellom cellelinjene35,36. Den implementerte renseprotokollen hjelper til med å øke differensieringsutbyttet; Lengden på rensetiden er imidlertid avhengig av cellelinje og differensieringseffektivitet. Derfor kan den resulterende suksessen i dannelsen av mikrofluidvevet variere mellom cellelinjer.

For å fange opp relevante komponenter i myokardiet, er den cellulære sammensetningen for det demonstrerte vevet hovedsakelig en blanding av CMer og CFer, da CMer kompromitterer det meste av volumet mens CFer beholder mesteparten av cellepopulasjonen i hjertet37. Videre ble det spesielle forholdet mellom 4: 1 CM: CFs omfattende validert i nylig publisert arbeid20 for å resultere i optimal struktur og hjertevevsdannelse i denne plattformen. Fremtidige studier som involverer denne beskrevne plattformen kan videreutvikles i deres kompleksitet ved tilskudd med andre angrende celletyper for bedre å etterligne det innfødte myokardiet. For eksempel har det nylig blitt funnet at bosatte makrofager er integrert i ledningsprosesser i hjertet38, i tillegg til deres veldokumenterte rolle i immunrespons39. Derfor kan makrofager innlemmes i celleblandingen før hydrogelinnkapsling for å modellere bosatte hjertemakrofager. Alternativt kan monocytter leveres gjennom mediekanalene som en rekrutteringsmodell gjennom blodsirkulasjonen, noe som kan føre til en populasjon av inflammatoriske makrofager i hjertevevet.

Det er iboende fordeler ved å bruke en mikrofluidisk enhet som plattform for å konstruere 3D-vevsmodeller. Spesielt kan presise diffusjonsbaserte eksperimenter etableres gjennom nøyaktig kontroll av kjemikalier, molekyler eller gasser som muliggjør konsentrasjonsgradienter over en enhet18,20. I tillegg kan forskjellige sett med celletyper40 og væskestrøm innlemmes for å etterligne dynamiske kulturforhold og gi skjærspenning på frøceller41. Sistnevnte kan være spesielt nyttig i studiet av et inkorporert vaskulært system i brikken, da endotelceller kan frøes i de tilstøtende mediekanalene (som vi tidligere har demonstrert ved hjelp av denne enheten for å modellere astrocytter-på-en-chip23), og konstant væskestrøm for å etterligne kapillærer kan lett innlemmes via en vakuumbasert eller tyngdekraftbasert pumpe.

En annen fordel med den mikrofluidiske enheten er materialet (dvs. PDMS) som brukes til å fremstille enhetskanalene. Spesielt er PDMS en gjennomsiktig, billig og biokompatibel polymer42 med lett justerbar stivhet. Det begrensende trinnet i fabrikasjonen av disse enhetene ligger i fotolitografien, da teknikken krever tilgang til et rent rom og oppkjøp av den tilknyttede ferdigheten. Men når waferen er fabrikkert, kan den brukes til å lage hundrevis av enheter gjennom den rett frem myke litografiprosessen for å lage PDMS-kanalene og den enkle handlingen med plasmabinding for å forsegle kanalene til deksler. I fremtidige studier, hvis enheten skulle endres for å inkludere evnen til å måle vevets elektriske egenskaper i sanntid, måtte et ekstra trinn for å montere enheten med elektroder og ledende komponenter innlemmes i fabrikasjonsprosessen. Bruken av PDMS for å fremstille kanalen kan beholde begrensninger, spesielt hvis den brukes i konstruksjoner for legemiddelresponsstudier, da PDMS har vist seg å adsorbere små hydrofobemolekyler 43,44,45. Derfor kan andre materialer, for eksempel termoplast46,47, undersøkes som alternativer til PDMS under den myke litografiprosessen.

Et kritisk trinn i denne skisserte protokollen er trinn 3.6.4 som beskriver cell:hydrogelinnsetting i mikrofluidiske enheter. Noen få nøkkelvariabler må kontrolleres for å sikre suksess, inkludert temperatur, tid og riktig håndtering. Hvis enten hydrogelbestandsløsningene eller den tilberedte cell:hydrogelløsningen når romtemperatur, er de i fare for delvis polymerisering, noe som er irreversibel, noe som gjør løsningen viskøs og nesten umulig å injisere i enheten uten lekkasje i mediekanaler. På den annen side kan cellen: hydrogeloppløsningen ikke fryse, da cellene vil dø; Løsningen må derfor opprettholdes innenfor dette smale temperaturvinduet. På samme måte er tiden som går mellom celle: hydrogelpreparat og enhetsinjeksjon direkte relatert til å øke temperaturen på den tilberedte løsningen. Spesielt, så snart løsningen er laget og aliquot (dvs. 3 μL) er oppnådd, må pipetten som holder aliquoten omplasseres, slik at spissen er inne i enhetsportene, og aliquoten skal sakte og jevnt settes inn i enheten. Gjennom denne overgangen er det lille volumet innenfor en pipettespiss som er ved romtemperatur, derfor øker løsningen raskt temperaturen fra isen den ble tilberedt på (dvs. -20 °C), noe som krever en ganske rask injeksjonsprosess. Hvis temperaturfølsomheten til den kollagenbaserte hydrogelen blir en nøkkelfaktor under injeksjon av enheter, kan inkorporering av andre hydrogeler48, for eksempel fotocrosslinkable hydrogeler (dvs. GelMA)47,49,50,51 eller enzymatisk krysskoblede hydrogeler (dvs. fibrin)11,52,53, utforskes.

Utformingen av den mikrofluidiske enheten som er inkludert i denne protokollen, gjør det mulig å etablere et anisotropt vev på grunn av tilstedeværelsen av de forskjøvet, fremspringende elliptiske stolpene i hovedvevskanalen20. Denne funksjonen er fordelaktig i forhold til andre metoder, for eksempel ECM-kontaktutskrift, fordi den ikke krever et håndteringstrinn for å opprette topografien som kan føre til variasjon mellom eksempler på grunn av stempeldeformasjon eller trykkdiffusjon54. Men som nevnt tidligere, er det ofte vanskeligheter med injeksjon av en celle: hydrogel suspensjon i en enhetskanal, spesielt i en kanal med medfødte stolper. For det formål er håndteringstrykket for innsetting av enheter ganske følsomt. Injeksjonsprosessen må være jevn, ved et konsistent og relativt lavt trykk for å unngå lekkasje i mediekanalene.

I tillegg kan bobler ikke innføres enten under utarbeidelsen av løsningen eller under innsetting av enheten, da bobler vil forårsake lekkasje fra hovedvevskanalen inn i mediekanalene. Dermed er riktig omsorg nødvendig for å kontrollere håndtering, temperatur og tidspunkt for cellen: hydrogelinjeksjon for å sikre suksess i dannelsen av 3D homogent fordelt vev. Derfor kan praksis i håndtering av mikrofluidiske enheter før cellekultureksperimenter være gunstige. Vedlikehold deretter av vev i mikrofluidiske enheter er ganske enkelt, noe som bare nødvendiggjør en daglig medieendring på 20 μL volum, og dekslene på enheten gjør praktisk håndtering under sanntidsavbildning.

Oppsummert benytter protokollen som er beskrevet her, en kombinasjon av mikromoldingsteknikker, inkludert fotolitografi og myk litografi, for å skape en intrikat arkitektur i en mikrofluidisk enhet som induserer høye nivåer av 3D-vevsanisotropi, med robuste biologiske teknikker, inkludert stamcelledifferensiering, primær menneskelig cellekultur og hydrogelbaserte biomaterialer. Sluttresultatet av den skisserte protokollen er et justert, 3D-kokulturert hjertevev i en mikrofluidisk brikke med en moden fenotype, som gjentatte ganger har blitt validert for flere forskjellige celletyper og linjer20, noe som gjør det egnet for sykdomsmodellering og nedstrøms prekliniske applikasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi vil takke NSF CAREER Award #1653193, Arizona Biomedical Research Commission (ABRC) New Investigator Award (ADHS18-198872) og Flinn Foundation Award for å ha gitt finansieringskilder til dette prosjektet. HiPSC-linjen, SCVI20, ble hentet fra Joseph C. Wu, MD, PhD ved Stanford Cardiovascular Institute finansiert av NIH R24 HL117756. HiPSC-linjen, IMR90-4, ble hentet fra WiCell Research Institute55,56.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.65 mL centrifuge tubes VWR 87003-290
1 mm Biopsy punch VWR 95039-090
1.5 mm Biopsy punch VWR 95039-088
15 mL Falcon tubes VWR 89039-670
18x18mm coverslips VWR 16004-308 The coverslips should be No.1, to allow for high magnification imaging
4% paraformaldehyde ThermoFisher 101176-014
6-well flat botttom tissue-culture plates VWR 82050-844
B27 minus insulin LifeTech A1895602
B27 plus insulin LifeTech 17504001
CHIR99021 VWR 10188-030
Collagen I, rat tail Corning 47747-218
DMEM F12 ThermoFisher 11330057
DPBS ThermoFisher 21600069
E8 ThermoFisher A1517001 can also be made in house
EDTA VWR 45001-122
Ethanol
FGM3 VWR 10172-048
GFR-Matrigel VWR 47743-718
Glycine Sigma G8898-500G
Goat serum VWR 10152-212
hESC-Matrigel Corning BD354277
IPA
IWP2 Sigma I0536-5MG
Kimwipes VWR 82003-820
MTCS Sigma 440299-1L
NaN3 Sigma S2002-25G
NaOH Sigma S5881-500G
Pen/Strep VWR 15140122
Petri dish (150x15mm) VWR 25384-326
Petri dish (60x15mm) VWR 25384-092
Phenol Red Sigma P3532-5G
RPMI 1640 ThermoFisher MT10040CM
RPMI 1640 minus glucose VWR 45001-110
Silicon Wafers (100mm) University Wafer 1196
Sodium lactate Sigma L4263-100ML
SU8 2075 Microchem Y111074 0500L1GL
SU8 Developer ThermoFisher NC9901158
Sylgard Elastomer Essex Brownell DC-184-1.1
T75 flasks VWR 82050-856
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
TrypLE ThermoFisher 12604021
Trypsin-EDTA (0.5%) ThermoFisher 15400054
Tween20 Sigma P9416-50ML
Y-27632 Stem Cell Technologies 72304
EVG620 Aligner EVG
Plasma cleaner PDC-32G Harrick Plasma
Zeiss AxioObserver Z1 microscope Nikon
Leica SP8 Confocal microscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Savoji, H., et al. Cardiovascular disease models: A game changing paradigm in drug discovery and screening. Biomaterials. 198, 3-26 (2019).
  2. Patino-Guerrero, A., Veldhuizen, J., Zhu, W., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional scaffold-free microtissues engineered for cardiac repair. Journal of Materials Chemistry B. 8, 7571-7590 (2020).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).
  4. Pontes Soares, C., et al. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PLoS One. 7, 38147 (2012).
  5. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2d to 3d cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 00033 (2020).
  6. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circulation Research. 118, 400-409 (2016).
  7. LeGrice, I., Pope, A., Smaill, B. Interstitial Fibrosis in Heart Failure. 253, Springer. Parts of the Developments in Cardiovascular Medicine book series 3-21 (2005).
  8. Veldhuizen, J., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Three-dimensional microengineered models of human cardiac diseases. Journal of Biological Engineering. 13, 29 (2019).
  9. Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies. Lab Chip. 13, 3599-3608 (2013).
  10. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PLoS One. 6, 26397 (2011).
  11. Zhang, D., et al. Tissue-engineered cardiac patch for advanced functional maturation of human ESC-derived cardiomyocytes. Biomaterials. 34, 5813-5820 (2013).
  12. Rao, C., et al. The effect of microgrooved culture substrates on calcium cycling of cardiac myocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34, 2399-2411 (2013).
  13. Navaei, A., et al. Electrically conductive hydrogel-based micro-topographies for the development of organized cardiac tissues. RSC Advances. 7, 3302-3312 (2017).
  14. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: Current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41, 613-621 (2018).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114, 511-523 (2014).
  16. Kharaziha, M., Memic, A., Akbari, M., Brafman, D. A., Nikkhah, M. Nano-enabled approaches for stem cell-based cardiac tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 5, 1533-1553 (2016).
  17. Ellis, B. W., Acun, A., Can, U. I., Zorlutuna, P. Human iPSC-derived myocardium-on-chip with capillary-like flow for personalized medicine. Biomicrofluidics. 11, 024105 (2017).
  18. Mathur, A., et al. Human iPSC-based cardiac microphysiological system for drug screening applications. Scientific Reports. 5, 8883 (2015).
  19. Mastikhina, O., et al. Human cardiac fibrosis-on-a-chip model recapitulates disease hallmarks and can serve as a platform for drug testing. Biomaterials. 233, 119741 (2020).
  20. Veldhuizen, J., Cutts, J., Brafman, D. A., Migrino, R. Q., Nikkhah, M. Engineering anisotropic human stem cell-derived three-dimensional cardiac tissue on-a-chip. Biomaterials. 256, 120195 (2020).
  21. Truong, D., et al. Human organotypic microfluidic tumor model permits investigation of the interplay between patient-derived fibroblasts and breast cancer cells. Cancer Research. 7, 3139-3151 (2019).
  22. Benam, K. H., et al. Engineered in vitro disease models. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 10, 195-262 (2015).
  23. Karamanova, N., et al. Endothelial immune activation by medin: Potential role in cerebrovascular disease and reversal by monosialoganglioside-containing nanoliposomes. Journal of the American Heart Association. 9, 014810 (2020).
  24. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8, 424-429 (2011).
  25. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).
  26. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121, 1217-1221 (2011).
  27. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14, 357-368 (2013).
  28. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by GSKB inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10, (2018).
  29. Rupert, C. E., Kim, T. Y., Choi, B. R., Coulombe, K. L. K. Human cardiac fibroblast number and activation state modulate electromechanical function of hiPSC-cardiomyocytes in engineered myocardium. Stem Cells International. 2020, 9363809 (2020).
  30. Ban, K., Bae, S., Yoon, Y. S. Current strategies and challenges for purification of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Theranostics. 7, 2067-2077 (2017).
  31. Uosaki, H., et al. Efficient and scalable purification of cardiomyocytes from human embryonic and induced pluripotent stem cells by VCAM1 surface expression. PLoS One. 6, 23657 (2011).
  32. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29, 1011-1082 (2011).
  33. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8, (2013).
  34. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12, 127-137 (2013).
  35. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10, 16-28 (2012).
  36. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  37. Radisic, M., et al. Biomimetic approach to cardiac tissue engineering. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B Biological Science. 362, 1357-1368 (2007).
  38. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169, 510-522 (2017).
  39. Frantz, S., Nahrendorf, M. Cardiac macrophages and their role in ischaemic heart disease. Cardiovascular Research. 102, (2014).
  40. Truong, D., et al. A three-dimensional (3D) organotypic microfluidic model for glioma stem cells - Vascular interactions. Biomaterials. 198, 63-77 (2019).
  41. Shao, J., et al. Integrated microfluidic chip for endothelial cells culture and analysis exposed to a pulsatile and oscillatory shear stress. Lab Chip. 9, 3118-3125 (2009).
  42. Leclerc, E., Sakai, Y., Fujii, T. Cell culture in 3-dimensional microfluidic structure of PDMS (polydimethylsiloxane). Biomedical Microdevices. 5, 109-114 (2003).
  43. Mukhopadhyay, R. When PDMS isn't the best. What are its weaknesses, and which other polymers can researchers add to their toolboxes. Analytical Chemistry. 79, 3248-3253 (2007).
  44. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochemical and Biophysical Research Communication. 482, 323-328 (2017).
  45. Berthier, E., Young, E. W., Beebe, D. Engineers are from PDMS-land, Biologists are from Polystyrenia. Lab Chip. 12, 1224-1237 (2012).
  46. Chuchuy, J., et al. Integration of electrospun membranes into low-absorption thermoplastic organ-on-chip. ACS Biomaterials Science & Engineering. , (2021).
  47. Soucy, J. R., et al. Reconfigurable microphysiological systems for modeling innervation and multitissue interactions. Advanced Biosystems. 4, 2000133 (2020).
  48. Cutts, J., Nikkhah, M., Brafman, D. A. Biomaterial approaches for stem cell-based myocardial tissue engineering. Biomarker Insights. 10, 77-90 (2015).
  49. Navaei, A., et al. Gold nanorod-incorporated gelatin-based conductive hydrogels for engineering cardiac tissue constructs. Acta Biomaterialia. 41, 133-146 (2016).
  50. Navaei, A., et al. The influence of electrically conductive and non-conductive nanocomposite scaffolds on the maturation and excitability of engineered cardiac tissues. Biomaterial Sciences. 7, 585-595 (2019).
  51. Saini, H., Navaei, A., Van Putten, A., Nikkhah, M. 3D cardiac microtissues encapsulated with the co-culture of cardiomyocytes and cardiac fibroblasts. Advanced Healthcare Materials. 4, 1961-1971 (2015).
  52. Shadrin, I. Y., et al. Cardiopatch platform enables maturation and scale-up of human pluripotent stem cell-derived engineered heart tissues. Nature Communications. 8, 1825 (2017).
  53. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  54. Perl, A., Reinhoudt, D. N., Huskens, J. Microcontact Printing: Limitations and Achievements. Advanced Materials. 21, 2257-2268 (2009).
  55. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  56. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).

Tags

Bioingeniør Utgave 172 stamcelle hjertevev mikromiljø myokardi mikrofluidiske chips
Utvikle 3D-organisert humant hjertevev i en mikrofluidisk plattform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Veldhuizen, J., Nikkhah, M.… More

Veldhuizen, J., Nikkhah, M. Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (172), e62539, doi:10.3791/62539 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter