Summary
פרוטוקול זה נועד להיות כלי לחקר סטאטוזיס ואת השינויים המולקולריים, הביוכימיים, התאיים המיוצרים על ידי חשיפה יתר של hepatocytes שומנים במבחנה.
Abstract
מחלת כבד שומני (MAFLD), הידועה בעבר כמחלת כבד שומני לא אלכוהולית (NAFLD), היא מחלת הכבד השכיחה ביותר בעולם בשל הקשר שלה עם השמנת יתר, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה. סטאטוזיס כבד, הצטברות של טיפות שומנים בדם בפרנצ'ימה בכבד, היא תכונה מרכזית של המחלה שקדמה לדלקת שנצפו בteatohepatitis, פיברוזיס, ומחלת כבד סופנית. הצטברות שומנים בדם בהפטוציטים עלולה להפריע לחילוף חומרים תקין של קסנוביוטיקה ומולקולות אנדוגניות, כמו גם לגרום לתהליכים תאיים המובילים להתקדמות המחלה. למרות המחקר הניסיוני של steatosis יכול להתבצע vivo, במבחנה גישות לחקר steatosis הם כלים משלימים עם יתרונות שונים. תרבות hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים היא אפשרות רבייה מצוינת לחקר הסטאטוזיס הכבד המאפשר זיהוי של תהליכים תאיים הקשורים הצטברות שומנים, כגון לחצים חמצוניים ורשתית, autophagia, התפשטות, מוות תאים, וכו ', כמו גם בדיקות אחרות כולל יעילות סמים, ובדיקות טוקסיקולוגיות, בין יישומים אפשריים רבים אחרים. כאן, הוא נועד לתאר את המתודולוגיה של תרבית התא hepatocyte במדיום מותנה עומס יתר שומנים. תאי HepG2 היו בתרבית RMPI 1640 בינוני מותנה עם נתרן פלמיטט ונתרן oleate. חשוב לציין, היחס של שני שומנים אלה חיוני כדי להעדיף הצטברות טיפת שומנים בדם, תוך שמירה על התפשטות התאים ושיעור תמותה מתון, כפי שקורה בכבד במהלך המחלה. המתודולוגיה, מהכנת מלאי פתרון השומנים, תערובת, תוספת לתרבות הבינונית וההפטוציט מוצגת. עם גישה זו, ניתן לזהות טיפות שומנים בדם בהפטוציטים שניתן להבחין בהם בקלות על ידי כתמי O אדומים שמן, כמו גם עקומות של שיעורי התפשטות / תמותה.
Introduction
כבד שומני הקשורים בתפקוד המטבולי נפוץ מאוד ברחבי העולם1,2; ההערכה היא כי עד 25% מהאוכלוסייה מושפע3. מחלה זו הידועה בעבר בשם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עדכנה את המינוח שלה לתפקוד מטבולי הקשור למחלת כבד שומני (MAFLD) כדי לשקף במדויק את הפתוגנזה הקשורה להשמנת יתר, תנגודת לאינסולין, סוכרת מסוג 2, ודיסליפידמיה, כמו גם את ההנהלות האפשריות של המחלה3,4.
ללא קשר לשם, המחלה כוללת קשת רחבה של שינויים היסטופתולוגיים המאופיינת בהצטברות גבוהה באופן חריג של שומנים בכבד (>5% מהשומן בהפטוציטים5) ועשויה להתקדם דרך הצטברות השומנים שנמצאת בדרך כלל בסטאטוזיס פשוט לסטיאטוהפטיטיס, אשר בתורו עלולה להוביל להתפתחות של פיברוזיס, שחמת הכבד, קרצינומה hepatocellular, ואי ספיקת כבד5,6,7,8. בשל שכיחותו הגוברת, MAFLD צפוי להיות האינדיקציה הראשונה להשתלת כבד והגורם המוביל לקרצינומה hepatocellular9.
למרות שזה נחשב כצורה שפירה או קלה של מחלת כבד שומני, סטאטוזיס כבד הוא למעשה המפתח המטבולי ב- MAFLD10. מסלולים מטבוליים שונים מושפעים הצטברות שומנים בדם בכבד, כולל אך לא מוגבל סינתזה שומנים בדם, ייצוא, חילוף החומרים10. תנגודת לאינסולין, עקה חמצונית, מתח רשתית, תפקוד לקוי הסלולר קשורים מאוד ליפוטוקסיות בכבד11,12. מצד שני, הפטוסיטים שומניים הם המטרה של מינים חמצן תגובתי, עיבוד מטבוליטים כמו מי חמצן שומנים, קרבונילים חלבון, ותוספים של חומצות גרעין13. ברמה התאית, hepatocytes שומני עלול לעבור נזק מיטוכונדריאלי14, senescence הסלולר15, אפופטוזיס16, pyroptosis12, ו autophagia17, בין שאר האירועים.
Hepatocytes אחראים מאוד על חילוף החומרים, detoxification, וסינתזה של מגוון רחב של מולקולות. רבים של פונקציות אלה עלולים להיות בסכנה על ידי הצטברות השומנים שנצפו בסטאטוזיס. לכן, יש חשיבות רבה יש כלים לשחזור המאפשרים הערכה מדויקת של סטאטוזיס. במובן זה, מודלים במבחנה ישימים בקלות וניתן לשחזר מאוד. סטאטוזיס במבחנה שימש עם מטרות שונות16,18,19. תאי HepG2 נמצאים בשימוש נרחב כקו תאים hepatocyte. יש לו יתרונות כגון להיות קל לתרבות ומאופיין היטב. אולי, החיסרון היחיד של תאי HepG2 הוא העובדה שזה קו תאים מסרטן, ולכן זה חייב להילקח בחשבון בעת ניתוח התוצאות. כאן, היישום של תערובת של חומצות שומן בשימוש נרחב בתרבות התא: חומצה פלמיטית (PA) וחומצה אולאית (OA) מוצג. הן הרשות הפלסטינית והן OA מציעות תוצאות שונות בתרבות20. PA (C 16:0) היא חומצת השומן הרווי הנפוצה ביותר המתקבלת מהתזונה16. הרשות הפלסטינית נחשבת סמנים ביולוגיים של דה נובו ליפוגנזה, צעד מכריע בהתפתחות NAFLD21. הרשות הפלסטינית מוצגת כבעלת22רעילים ביותר ; לכן, זה לא יכול להיות מומלץ לגרום סטאטוזיס במבחנה. OA (C 18:1) היא חומצת שומן חד בלתי רוויה. בניגוד לרשות הפלסטינית, הוצע ל-OA להחזיק בתכונות אנטי דלקתיות ונוגדי חמצון, להיות מסוגל לנטרל את PA12. הן PA והן OA הן חומצות השומן העיקריות הקיימות בטריגליצרידים, ללא קשר למצב הבריאות אוהמחלה 16. טבלה 1 מספקת דוגמאות לתרבות ההפטוציטים עם הרשות הפלסטינית, OA והתערובת שלהם, כמו גם התוצאות שדווחו12,23,24,25,26,27. חומצות שומן אחרות שימשו גם בתרבות הפטוציט, כולל חומצה קאירית (C 18:0)28,29,30, חומצה לינולאית (C 18:1)28,30,31 וההצמדות שלה (CLA)28,32, חומצה פלמיטולאית (C 16:1)29. עם זאת, השימוש בהם מדווח לעתים קרובות ביותר בספרות, אולי בגלל שפע הכבד שלהם נמוך יותר מאשר הרשות הפלסטינית ו OA16.
בשילוב, שתי חומצות השומן דומות לסטיאטוזיס במבחנה, ומספקות תאים מתרבים, עם מוות מוגבר של תאים וכדאיות נמוכה יותר בהשוואה לתנאי בקרה. ראוי להזכיר כי המלחים המתאימים של חומצות שומן אלה זמינים וניתן להשתמש בהם גם כן. אחת הבעיות העיקריות בעת הערכת עומס יתר שומנים בתרבית התא hepatocyte ניתנת בהבחנה בין מודלים טוקסיקולוגיים מודל המייצגים הטוב ביותר סטאטוזיס. מודלים רבים ניתן להסביר במקרה הראשון. למעשה, השימוש ברשות הפלסטינית לבדה עשוי להיחשב ביניהם, והתמותה הגבוהה היא התוצאה הברורה ביותר12,16,23,24,25,26,27. השימוש במינונים גבוהים גם במקרה של OA יכול להיחשב גם כמודל toxicologic. הפרוטוקול המוצג כאן הוא גבוה יותר בהתאם להתפתחות סטאטוזיס שכן הוא מראה תמותה נמוכה לעומת זה שנצפה במודלים אחרים ומאפשר לו להיות אחריו במשך מספר ימים עם הצטברות שומנים מתקדמת כפי שהוא מתרחש ב NAFLD. האפשרות להעריך סטאטוזיס קל וחמורה באמצעות תנאי ניסוי נחשבת יתרון נוסף.
| חומצות שומן | תנאים | תוצאות | הפניה | ||
| אבא | ריכוז: 200 מיקרומטר | הצטברות שומנים בדם | יאן ואח', 201925. | ||
| חשיפה לזמן: 24 שעות | נזקי הפטוצייט | ||||
| גובה טרנסמינאס | |||||
| אבא | ריכוז: 50, 100 ו 200 מיקרומטר | הצטברות שומנים בדם | Xing et al, 201924. | ||
| חשיפה לזמן: 24 שעות | |||||
| אבא | ריכוז: 250 מיקרומטר , 500 מיקרומטר , 750 מיקרומטר ו 1,000 מיקרומטר | הצטברות שומנים בדם | וואנג ואח', 202026. | ||
| חשיפה לזמן: 24 שעות | הפחתה הדרגתית של הכדאיות בתא | ||||
| תערובת של OA/PA | ריכוז: 1 מ"מ | הצטברות שומנים בדם | שיאו ואח', 202027. | ||
| חשיפה לזמן: 24 שעות | אינו מדווח על ליפוטוקסיות | ||||
| מחיר: 2OA:1PA | |||||
| תערובת של OA/PA | גירוי ראשון עם 200 מיקרומטר ו 400 מיקרומטר של PA ולאחר מכן גירוי שני עם 200 מיקרומטר של OA | הצטברות שומנים בדם. | זנג ואח', 202012. | ||
| ריכוז:400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA | ראיות של ליפוטוקסיות הנגרמת על ידי הרשות הפלסטינית צומצמה על ידי גירוי של OA. | ||||
| תעריף: 2PA:1OA | |||||
| חשיפה לזמן: 24 שעות | |||||
| תערובת של OA/PA | ריכוז: 400 מיקרומטר PA: 200 מיקרומטר OA | הצטברות שומנים בדם | חן ואח', 201823. | ||
| תעריף: 2PA:1OA | |||||
| חשיפה לזמן: 24 שעות | |||||
| תערובת של OA/PA | ריכוז :50 ו 500 מיקרומטר | דור של שני סוגים של סטאטוזיס: סטאטוזיס קל ו סטאטוזיס חמור. |
קמפוס וגוזמן 2021 | ||
| תעריף: 2PA:1OA | מדמה תערוכה כרונית של עומס שומנים | ||||
| חשיפה לזמן: 24 שעות, יומיים,3 ימים ו-4 ימים. | |||||
טבלה 1. תרבות הפטוצייט בתנאים סטטוגניים. הטבלה מציגה את סוג חומצת השומן המשמשת, את התנאים נשמרים, ואת התוצאות שנצפו בתרבות hepatocyte. חומצה פלמיטית. חומצה אולאית.
לבסוף, מודל זה ישים לא רק על המחקר של סטאטוזיס וכבד שומני, אלא גם על מסלולי חילוף החומרים הכבד, סינתטי, ו detoxification בהקשר של סטאטוזיס. כמו כן, בסטאטוזיס המושרה במבחנה עשוי לספק ראיות לזיהוי סמנים פוטנציאליים של המחלה, כמו גם מטרות טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה בינונית סטנדרטית ומותנית
- כדי להכין RPMI 1640 סטנדרטי, תוספת RPMI 1640 תרבות בינוני עם 10% (v/ v) של סרום בקר עוברי (FBS, בעבר חום מומת) ו 1% (v/v) של פתרון פניצילין-סטרפטומיצין. לאחסן את המדיום ב 4 °C.עיקור באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר.
- להכנת פתרון מלאי פלמיטט, להכין פתרון 50 mM של פלמיטט RPMI 1640 סטנדרטי בעבר בתוספת עם 1% אלבומין סרום בקר (ללא שומנים). נפח של 5-10 מ"ל של מלאי זה יהיה מספיק. לחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (50°F) המוגנים מפני אור למשך עד חודש אחד.
- כדי להכין פתרון מלאי oleate, להכין פתרון 50 mM של oleate RPMI 1640 סטנדרטי בתוספת בעבר עם 1% אלבומין סרום בקר (ללא שומנים). נפח של 10 מ"ל יספיק. לחטא את פתרון המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-20 °C (50°F) המוגן מפני אור למשך עד חודש אחד.
- כדי להכין מדיום סטטוגני מהמלאי שהוכן בעבר, הכינו פלמיטט בן חלק אחד: מדיום סטאטוגני 2 חלקים בשתי רמות אפשריות: סטאטוזיס קל וקשה.
- סטאטוזיס קל: הכן 100 מ"ל של פלמיטט חלק אחד: תערובת oleate 2 חלקים (50 מיקרומטר) ב RPMI 1640 סטנדרטי. לחטא באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (7%).
- סטאטוזיס חמור: הכן 100 מ"ל של פלמיטט חלק אחד: תערובת oleate 2 חלקים (500 מיקרומטר) ב RPMI 1640 סטנדרטי. לחטא באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן ב-4 °C (7%).
- הכנה חלופית לפתרונות המלאי.
- הכן את שני פתרונות המלאי באמצעות חומצות השומן המתאימות באמצעות אלבומין שומנים חינם כפי שצוין לעיל.
- כאשר חסר אלבומין שומנים חינם, להשתמש מלחי פלמיטט ו oleate.
- להמיס או palmitate או oleate ב 2 מ"ל של אתנול מוחלט ולאחר מכן לערבב בנפח הסופי של RPMI סטנדרטי 1640 (5-10 מ"ל). להמיס oleate ישירות על ידי ערבוב במדיום תרבות RPMI 1640 סטנדרטי.
- אפשר אידוי של אתנול על ידי דגירה באמבט מים ב 70 °C (70 °F); מערבבים היטב.
- בכל מקרה, לחטא את שני פתרונות המלאי באמצעות מסנני 0.22 מיקרומטר. יש לאחסן את תמסת המלאי של פלמיטט ב-4 °C (5°F) ופתרון מלאי oleate ב- - 20 °C (50 °F). הגן על שני הפתרונות מפני אור. פתרונות אלה יציבים למשך חודש אחד.
2. טרום תרבות
- זרע 100,000 תאי HepG2 לבאר בצלחת 24-well. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 סטנדרטי.
- לפני הדגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2 עבור 24 שעות, המאפשר חיבור לתא.
3. תרבות סטטוגנית
- לאחר טרום-תרבות, להשליך את RPMI 1640 סטנדרטי בינוני ולהוסיף את המדיום steatogenic בהתאם.
- יש להשליך את הסופר-נט ולהוסיף מדיום סטטוגני טרי כל 24 שעות.
4. הערכת כדאיות ותמותה
- זרע 100,000 תאי HepG2 לבאר בצלחת 24-well. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 סטנדרטי.
- לפני הדגירה עבור 24 שעות ב 37 °C (5% CO2).
- שנה RPMI 1640 בינוני סטנדרטי למדיום סטטוגני.
- דגירה במשך 24 שעות, 2 ימים, 3 ימים, ו 4 ימים מרענן את מדיום steatogenic כל 24 שעות.
- לאחר הזמן המתאים, להשליך את supernatant.
- לנתק תאים מהבאר על ידי הוספת 500 μL של 0.05% טריפסין-EDTA. דגירה במשך 5 דקות ב 37 °C (5% CO2).
- לאסוף את התאים respended במיקרו-Tube.
- צנטריפוגה ב-300 על גרם ותשליך את הסופר-טבעי.
- הוסף 200 μL של RPMI 1640 סטנדרטי ו resuspend התאים.
- הוסף 15 μL של 0.4% פתרון כחול טריפן במיקרו-Tube טרי. לערבב עם 15 μL של ההשעיה התא הקודם.
- תספור את התאים המוכתמים והלא מוכתמים בהמוציטומטר.
- חשב את שיעורי הכדאיות והתמותה בהתאם.
כדאיות =
תמותה =
5. כתמי שומנים בדם עם שמן אדום O
- שים כיסוי תרבית תא בכל באר בצלחת 24-well.
- זרע 100,000 תאי HepG2 לבאר. הוסף 1 מ"ל של RPMI 1640 סטנדרטי.
- לפני הדגירה ב 37 °C (5% CO2 עבור 24 שעות.
- שנה RPMI 1640 בינוני סטנדרטי למדיום סטטוגני.
- דגירה במשך 24 שעות, 2 ימים, 3 ימים, ו 4 ימים, מרענן את מדיום steatogenic כל 24 שעות.
- לאחר הזמן המתאים, להשליך את supernatant.
- לשטוף עם 1 מ"ל של תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS). זרוק את סופר-טבעי.
- תקן עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב- PBS.
- דגירה במשך שעה בטמפרטורת החדר.
- להשליך את עודף paraformaldehyde.
- לשטוף את התאים עם 1 מ"ל של מים מזוקקים.
- יש להוסיף 1 מ"ל של 70% איזופרופנול ודגרה למשך 5 דקות.
- להשליך את עודף איזופרופנול. אין צורך בשטיפת PBS בשלב זה.
- הוסיפו 1 מ"ל של תמיסה O אדומה ושמן ודגרה למשך 30 דקות.
- להשליך את עודף של תמיסה O שמן אדום.
- יש לשטוף במ"ל אחד של מים מזוקקים.
- הוסף 500 μL של פתרון המטוקסילין. דגירה במשך 3 דקות.
- להשליך את עודף של פתרון המטוקסילין.
- יש לשטוף במ"ל אחד של מים מזוקקים.
- צפה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של 400x (אובייקט 40x, עינית 10x).
6. הערכה מורפומטרית של תכולת השומנים
- בחר ולכוד באופן אקראי תצלומים של 10 שדות אופטיים מהאזור המלא של הבאר. חזור על הפעולה על כל באר.
- להעריך את אחוז השטח המוכתם האדום באמצעות הכלי סף צבע בתוכנת ImageJ על פי פריירה ו Rasband33.
- השווה את האזור המוכתם עם האזור המלא של השדה האופטי באמצעות הכלי לנתח חלקיקים בתוכנת ImageJ על פי פריירה ו Rasband33.
- חשב את האחוז הממוצע של כל באר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocytes מתורבת בצמיחת התצוגה הבינונית steatogenic על פני השטח של הבאר; עם זאת, hepatocytes שומן להראות שיעור צמיחה נמוך יותר בהשוואה לתאים בתרבית בינונית שליטה. היחס והריכוז המוצעים של OA ו- PA, מבטיחים הישרדות תאים במהלך התרבות. זריעת 1 x 105 תאים לבאר בלוחות של 24 בארות מספקת מפגש אופטימלי כפי שמוצג באיור 1.
הכדאיות בתאים בתרבית הייתה נמוכה יותר בקבוצות steatogenic, מתון וקשה, בהשוואה לתנאי הבקרה. למעשה, הכדאיות פחתה בהדרגה ככל שזמן התרבות גדל, והגיע לנמוך ביותר של 60% ב 4 ימים בסטאטוזיס חמור (איור 2A). בהתאם לכך, שיעור התמותה היה גבוה יותר בהפטוציטים בתרבית בתנאים הסטיטוגניים, והוא גדל בהדרגה עם זמן החשיפה לשומנים(איור 2B). מספר התאים גדל בהדרגה כתוצאה מהתפשטות(איור 2C). עם זאת, שיעור ההתפשטות היה נמוך יותר בסטאטוזיס מתון ב 3 ימים ו 4 ימים. לעומת זאת, סטאטוזיס חמור היה קשור עם התפשטות נמוכה מ 24 שעות.
תאי HepG2 בתרבית בפרוטוקול המוצע מראים את התכונה החשובה ביותר של סטאטוזיס, הצטברות שומנים תאיים. הכתמת תאים עם שמן אדום O מותרת להתבונן לפחות עלייה של פי שניים של טיפות שומנים בתאים בתרבית בתנאים סטאטוגניים כפי שמוצג באיור 3 ובאיור 4. שומן תאי גדל בהתאם לזמן החשיפה של התרבות במדיום steatogenic(איור 3). בסטאטוזיס קל, תכולת השומנים גדלה מהיום השני, ואילו בסטאטוזיס חמור, הם היו גבוהים באופן משמעותי מ 24 שעות.
איור 1: צמיחת תאים. תרבות הפטוציטים HepG2 בשליטה (איור 1A-D) ובתנאים סטטוגניים קלים(איור 1E-H). תצלומים מראים צמיחה מ 1-4 ימים של תרבות. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: שיעורי הכדאיות והתמותה. (ב)תמותה. (C)מספר תא. HepG2 hepatocytes תרבות בשליטה ותנאים steatogenic הוערך עבור שיעורי הכדאיות והתמותה על ידי מכתמים כחולים טריפן. ממוצע ± אס.די. שני ניסויים עצמאיים משולשים בכל זמן של תרבות. עיגולים: תנאי בקרה; ריבועים: סטאטוזיס קל; משולשים: סטאטוזיס חמור. ANOVA חד כיווני שימש להשוואה בין תנאים וזמן של תרבות לאותו מצב. p < 0.05 נחשב משמעותי: "*"- שליטה לעומת סטאטוזיס חמור; "§"- שליטה לעומת סטאטוזיס קלה; "¶"- סטאטוזיס קל לעומת חמור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הצטברות שומנים בדם. HepG2 hepatocytes תרבות בשליטה ותנאים steatogenic הוערך עבור תוכן השומנים על ידי שמן אדום O כתמים ואחריו ניתוח מורפומטרי באמצעות תוכנת ImageJ (NIH, ארה"ב). אחוז השומנים מתייחס לאחוז השטח המוכתם על ידי שמן אדום O (שומנים) בהתחשב 100% כמו השטח המלא של כל שדה אופטי נותח. ממוצע ± אס.די. שני ניסויים עצמאיים משולשים בכל זמן של תרבות. עיגולים: תנאי בקרה; ריבועים: סטאטוזיס קל; משולשים: סטאטוזיס חמור. ANOVA חד כיווני שימש להשוואה בין תנאים וזמן של תרבות לאותו מצב. p < 0.05 נחשב משמעותי: "*"- שליטה לעומת סטאטוזיס חמור; "§"- שליטה לעומת סטאטוזיס קלה; "¶"- סטאטוזיס קל לעומת חמור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: סטאטוזיס במבחנה. תרבות הפטוציטים HepG2 בשליטה (איור 4A-D), סטטוגנית קלה (איור 4E-H),ותנאי סטטוגניקה חמורים(איור 4I-L)הוערכו עבור תכולת השומנים על ידי כתמי O אדומים שמן. תצלומים מראים טיפות שומנים hepatocyte מ 24 שעות עד 4 ימים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה נועד לספק אסטרטגיה לחקר סטאטוזיס במבחנה. תרבית התאים היא כלי רב עוצמה לחקר היבטים תאיים, מולקולריים, ביוכימיים וטוקסיקולוגיים של התאים החשופים לתנאים שונים. עם גישה זו, ניתן לדמיין סטאטוזיס לא רק כשלב של המחלה המורכבת שהיא MAFLD, אלא גם כמו חשיפת יתר hepatocyte שומנים ואת התוצאות האפשריות הנובעות מחשיפה כזו. לכן, היישום שלה אינו מוגבל לפיזיופתולוגיה של MAFLD, אלא לעובדה כי חולים עם כבד שומני חשופים תרופות טיפוליות, מזהמים, בין תנאים אחרים שעלולים להיות מושפעים סטאטוזיס. לכן, פרוטוקול זה יש יישומים פוטנציאליים טוקסיקולוגיה, פרמקולוגיה, וזיהוי של מטרות טיפוליות לטיפול במחלה.
בהתפתחות פרוטוקול זה, אחד הצעדים הקריטיים ביותר הוא הכנת התמהיל הסטיטוגני: חלק אחד של פלמיטט: 2 חלקים של oleate, אשר גורם לסטיאטוזיס מהיום 2 (איור 3, איור 4),המאפשר להפטוציטים להתרבות - למרות ירידה צנועה בשיעור הכדאיות ושיעור תמותה מוגבר (איור 2). עם זאת, ירידה בכדאיות לא יעלה על 30%-40%, שכן זה עשוי לייצג אפקט רעיל ולא אחד שניתן לעקוב בטווח הארוך. סטאטוזיס בכבד הוא תוצאה של חשיפת יתר לטווח ארוך שומנים. במובן זה, שומנים מצטברים, בהתחלה, עם חיבה קלה על hepatocytes, כפי שנצפו במודל זה. תכונה נוספת היא פרופיל טיפת השומנים. בסטאטוזיס קל, גודל מוגבר בטיפות שומנים נצפה במהלך התקדמות התרבות (איור 4E-H). בסטאטוזיס חמור, גודל הטיפה גבוה בהרבה בהשוואה לסטיאטוזיס קל (איור 4I-L),בעוד פקדים אינם מראים שינויים בגודל טיפת השומנים ( איור4A-D).
עדיף לאחסן הן את התקשורת סטטוגנית קלה וחמורה ב 4 °C (70 °F) עד שבוע. לאחר מכן, מומלץ להכין מדיום סטטוגני טרי. עם זאת, ניתן לשמר את מלאי OA ב -20 °C (70 °F) עד חודש, בעוד מלאי הרשות הפלסטינית ניתן לאחסן ב 4 °C (70 °F) עד חודש. שימוש בפתרונות מלאי אלה לאחר הזמן המוצע עשוי לייצג סיכון של השפלה של חומצות השומן. כדי להבטיח את הריכוז הנכון של הפתרונות לפני כל שימוש, מומלץ למדוד ריכוזי חומצות שומן על ידי ערכת בדיקת חומצות שומן לא אסטרליות (NEFA).
PA ו OA, כמו גם המלחים שלהם בהתאמה, שימשו בנפרד כדי לגרום הצטברות שומנים; עם זאת, הבדלים נצפים עבור כל חומצתשומן 16,20. מצד אחד, פלמיטט המשמש לבד הוא משרן טוב של סטאטוזיס. זה גורם למוות תאים, תנגודת לאינסולין בכבד, תפקוד מיטוכונדריאלי, מתח רשתית16,34,35,36. עם זאת, פלמיטט רעיל מאוד16,34, ואת התוצאות הצפויות להשתמש בו לבד בתרבות כוללים כדאיות נמוכה יותר ותמותה גבוהה יותר בהשוואה לתערובת של PA ו OA16,20. מצד שני, oleate גם גורמת לסטיאטוזיס. זה גורם דה נובו lipogenesis, תנגודת לאינסולין37,38, ו hyperproliferation38. עם זאת, התוצאות שנצפו עם oleate הם לעתים קרובות מתון יותר בהשוואה פלמיטט ואת התערובת16,20. זה עשוי להיות קשור לתפקיד המגן שלה. Oleate הוא המרכיב העיקרי בשמן זית, מרכיב מרכזי בתזונה הים תיכונית, אחת האסטרטגיות המוצלחות הידועות נגד MAFLD39.
פרוטוקול זה עשוי להיחשב ככלי נחמד ללמוד סטאטוזיס בשל הרבייה שלה ואת הזמן הקצר שלוקח להשיג תוצאות. זאת בהשוואה לשימוש במודלים ניסיוניים של MAFLD, מה שמוסיף את העובדה שזה לא מרמז על הסוגיות האתיות הטמונות בשימוש במודלים של מכרסמים. פרוטוקול זה מאפשר לעקוב במשך מספר ימים, בתנאי כי מדיום steatogenic הוא רענן כל 24 שעות. מודל זה הוא גם חסכוני ובעל מגוון רחב של יישומים. זה יכול להיות מותאם גם קווי תאים אחרים, לא רק hepatocytes, אבל מגוון רחב של תאים מושפעים חשיפת יתר של שומנים במהלך השמנת יתר. אחת המגבלות של פרוטוקול זה היא השימוש בתאי HepG2. מאז זהו קו תאים מסרטן, זה עלול להסתיר או להגדיל כמה תוצאות. עם זאת, היישום של תאי HepG2 בסוגים אלה של מחקרים מקובל בשל הדמיון שלה חילוף החומרים השומנים hepatocytes בריא40. השימוש בתערובת PA:2OA עשוי גם להתברר שנוי במחלוקת שכן הוא אינו דומה לחלוטין לפרופילים של NEFA שנצפו בדם של חולי NAFLD / MAFLD41. חומצות שומן אחרות, כולל חומצות לינולנית או סטרית, עשויות להיכלל בשינויים ושיפורים נוספים של פרוטוקול זה. מגבלה נוספת היא העובדה כי רק סוג תא אחד, hepatocytes, נחקר, חסר אינטראקציה עם תאים כבד אחרים נוכח בכבד, כולל אנדותל סינוסואידלי, קופפר, תאי סטלה כבד, וכו ', העוסקים בהתקדמות של MAFLD. יתר על כן, זהו מודל כדי לגרום סטאטוזיס באופן בלעדי, ללא התקדמות steatohepatitis ופיברוזיס.
לסיכום, המחקר מספק פרוטוקול במבחנה של פטוצית כי הוא קל ליישם, לשחזור, עם מגוון רחב של יישומים בחקר סטאטוזיס, כמו גם את הפונקציה hepatocyte בהקשר של כבד שומני.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). אדריאנה קמפוס היא דוקטורנטת ב-Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, באוניברסיטת נאסיונאל אוטונומה דה מקסיקו, ונתמכה על ידי קונאסיאט (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G. Nafld: A multisystem disease. Journal of Hepatology. 62, 1 Suppl 47-64 (2015).
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
