Summary
Denne protokollen er ment å være et verktøy for å studere steatose og molekylære, biokjemiske, cellulære endringer produsert ved overeksponering av hepatocytter til lipider in vitro.
Abstract
Metabolsk dysfunksjon-assosiert fettleversykdom (MAFLD), tidligere kjent som alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), er den mest utbredte leversykdommen over hele verden på grunn av forholdet til fedme, diabetes type 2 og dyslipidemi. Leversteatose, akkumulering av lipiddråper i leverparenchyma, er et sentralt trekk ved sykdommen før betennelsen observert i steatohepatitt, fibrose og end-stage leversykdom. Lipidakkumulering i hepatocytter kan forstyrre riktig metabolisme av xenobiotika og endogene molekyler, samt å indusere cellulære prosesser som fører til sykdomsforløpet. Selv om den eksperimentelle studien av steatose kan utføres in vivo, in vitro tilnærminger til studiet av steatose er komplementære verktøy med forskjellige fordeler. Hepatocyttkultur i lipid overbelastningskondisjonerte medium er et utmerket reproduserbart alternativ for studiet av leversteatose som tillater identifisering av cellulære prosesser relatert til lipidakkumulering, for eksempel oksidative og retikulære stress, autofagi, spredning, celledød, etcetera, samt andre tester, inkludert legemiddeleffektivitet og toksikologiske tester, blant mange andre mulige applikasjoner. Her var det rettet mot å beskrive metodikken til hepatocyttcellekultur i lipid overbelastningskondisjonerte medium. HepG2 celler ble dyrket i RMPI 1640 medium betinget med natrium palmitate og natrium oleate. Viktigst, forholdet mellom disse to lipidene er avgjørende for å favorisere lipiddråpeakkumulering, samtidig som celleproliferasjon og moderat dødelighet opprettholdes, som forekommer i leveren under sykdommen. Metodikken, fra utarbeidelsen av lipidoppløsningsbestandene, vises blanding, tillegg til mediet og hepatocyttkulturen. Med denne tilnærmingen er det mulig å identifisere lipiddråper i hepatocyttene som er lett observerbare av oljerød O-farging, samt kurver av spredning / dødelighet.
Introduction
Fettlever forbundet med metabolsk dysfunksjon er svært utbredt over hele verden1,2; Det anslås at opptil 25% av befolkningen påvirkes3. Denne sykdommen tidligere kjent som alkoholfri fettleversykdom (NAFLD), har oppdatert sin nomenklatur til metabolsk dysfunksjon assosiert fettleversykdom (MAFLD) for å nøyaktig reflektere patogenesen relatert til fedme, insulinresistens, diabetes type 2 og dyslipidemi, samt mulige styringer av sykdommen3,4.
Uansett navn inneholder sykdommen et bredt spekter av histopatologiske endringer preget av unormalt høy akkumulering av lipider i leveren (>5% fett i hepatocyttene5) og kan utvikle seg gjennom lipidakkumulering som vanligvis finnes i enkel steatohepatitt, noe som igjen kan føre til utvikling av fibrose, skrumplever, hepatocellulært karsinom og leversvikt5,6,7,8. På grunn av sin økende utbredelse forventes MAFLD å bli den første indikasjonen på levertransplantasjon og den ledende årsaken til hepatocellulært karsinom9.
Selv om det har blitt ansett som en godartet eller mild form for fettleversykdom, er leversteatose faktisk den metabolske nøkkelen i MAFLD10. Ulike metabolske veier påvirkes av lipidakkumulering i leveren, inkludert, men ikke begrenset til lipidsyntese, eksport og metabolisme10. Insulinresistens, oksidativt stress, retikulært stress og cellulær dysfunksjon er sterkt forbundet med leverletoksisitet11,12. På den annen side er fete hepatocytter målet for reaktive oksygenarter, noe som gjør metabolitter som lipidperoksider, proteinkarbonyler og addukter av nukleinsyrer13. På cellenivå kan fett hepatocytter gjennomgå mitokondrieskade14, cellulær senescence15, apoptose16, pyroptose12og autofagi17, blant andre hendelser.
Hepatocytter er svært ansvarlige for metabolisme, avgiftning og syntese av et bredt spekter av molekyler. Mange av disse funksjonene kan bli kompromittert av lipidakkumulering observert ved steatose. Derfor er det av stor betydning å ha reproduserbare verktøy som tillater en nøyaktig evaluering av steatose. I denne forstand er in vitro-modeller lett anvendelige og svært reproduserbare. Steatose in vitro har blitt brukt med forskjellige mål16,18,19. HepG2-cellene er mye brukt som hepatocyttcellelinje. Det har fordeler som å være lett å kultur og godt karakterisert. Kanskje er den eneste ulempen ved HepG2-celler det faktum at det er en kreftfremkallende cellelinje, så dette må vurderes når du analyserer resultatene. Her vises anvendelsen av en blanding av fettsyrer som er mye brukt i cellekulturen: palmittsyre (PA) og oljesyre (OA). Både PA og OA tilbyr forskjellige resultater i kultur20. PA (C 16:0) er den vanligste mettede fettsyren oppnådd fra dietten16. PA regnes som en biomarkør for de-novo lipogenese, et avgjørende skritt i utviklingen av NAFLD21. PA er vist å være svært giftig22; Derfor kan det ikke anbefales å indusere steatose in vitro. OA (C 18:1) er en enumettet fettsyre. I motsetning til PA har OA blitt foreslått å ha antiinflammatoriske og antioksidantegenskaper, og kunne motvirke PA12. Både PA og OA er de viktigste fettsyrene som er tilstede i triglyseridene, uavhengig av tilstanden til helse eller sykdom16. Tabell 1 inneholder eksempler på hepatocyttkulturen med PA, OA og deres blanding, i tillegg til resultatene som er rapportert12,23,24,25,26,27. Andre fettsyrer har også blitt brukt i hepatocyttkultur, inkludert stearinsyre (C 18:0)28,29,30, linolsyre (C 18:1)28,30,31 og dens konjugater (CLA)28,32, palmitoleinsyre (C 16:1)29. Imidlertid er deres bruk minst ofte rapportert i litteraturen, kanskje fordi deres lever overflod er lavere enn PA og OA16.
I forbindelse ligner begge fettsyrene steatose in vitro, gir proliferating celler, med økt celledød og lavere levedyktighet sammenlignet med kontrollforhold. Det er verdt å nevne at de respektive saltene til disse fettsyrene er tilgjengelige og også kan brukes. Et av hovedproblemene ved vurdering av lipidoverbelastning i hepatocytcellekultur er gitt i differensiering mellom toksikologiske modeller og en modell som best representerer steatose. Mange modeller kan redegjøres i det første tilfellet. Faktisk kan bruken av PA alene vurderes blant dem, og den høye dødeligheten er det mest åpenbare utfallet12,16,23,24,25,26,27. Bruk av høye doser selv ved OA kan også betraktes som en toksikologisk modell. Protokollen som vises her er i høyere samsvar med steatoseutvikling siden den viser lav dødelighet sammenlignet med den som er observert i andre modeller og gjør at den kan følges i løpet av flere dager med progressiv lipidakkumulering som det forekommer i NAFLD. Muligheten til å vurdere mild og alvorlig steatose gjennom eksperimentelle forhold regnes som en annen fordel.
| Fettsyrer | Betingelser | Resultater | Referanse | ||
| PA | Konsentrasjon: 200 μM | Lipid akkumulering | Yan et al, 201925. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | Hepatocyte skade | ||||
| Transaminaser høyde | |||||
| PA | Konsentrasjon: 50, 100 og 200 μM | Lipid akkumulering | Xing et al, 201924. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | |||||
| PA | Konsentrasjon: 250 μM, 500 μM, 750 μM og 1000 μM | Lipid akkumulering | Wang et al, 202026. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | Progressiv reduksjon av celle levedyktighet | ||||
| Blanding av OA/PA | Konsentrasjon: 1 mM | Lipid akkumulering | Xiao et al, 202027. | ||
| Tidseksponering: 24 timer | Rapporterer ikke liptoksisitet | ||||
| Hastighet: 2OA:1PA | |||||
| Blanding av OA/PA | Første stimulering med 200 μM og 400 μM PA og deretter andre stimulering med 200 μM OA | Lipid akkumulering. | Zeng et al, 202012. | ||
| Konsentrasjon: 400 μM PA: 200 μM OA | Tegn på lipotoksisitet indusert av PA ble redusert ved stimulering av OA. | ||||
| Pris: 2PA:1OA | |||||
| Tidseksponering: 24 timer | |||||
| Blanding av OA/PA | Konsentrasjon: 400 μM PA: 200 μM OA | Lipid akkumulering | Chen et al, 201823. | ||
| Pris: 2PA:1OA | |||||
| Tidseksponering: 24 timer | |||||
| Blanding av OA/PA | Konsentrasjon : 50 og 500 μM | Generering av to typer steatose: mild steatose og alvorlig steatose. |
Campos og Guzmán 2021 | ||
| Pris: 2PA:1OA | Simulerer kronisk utstilling av lipidoverbelastning | ||||
| Tidseksponering: 24 timer, 2 dager, 3 dager og 4 dager. | |||||
Tabell 1. Hepatocyttkultur i steatogene forhold. Tabellen presenterer typen fettsyre som brukes, forholdene opprettholdes og de observerte resultatene i hepatocyttkulturen. Palmitisk syre. OA: Oljesyre.
Til slutt gjelder denne modellen ikke bare for studiet av steatose og fettlever, men også for levermetabolismen, syntetiske og avgiftningsveiene i sammenheng med steatose. Også in vitro indusert steatose kan gi bevis for identifisering av potensielle markører av sykdommen samt terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Standard og betinget medium forberedelse
- For å forberede standard RPMI 1640, supplere RPMI 1640 kulturmedium med 10% (v / v) foster bovint serum (FBS, tidligere varmeinaktivert) og 1% (v / v) av Penicillin-Streptomycin løsning. Oppbevar mediet ved 4 °C.Steriliser ved hjelp av 0,22 μm filtre.
- For å forberede palmitate lagerløsning, lag en 50 mM løsning av palmitate i standard RPMI 1640 tidligere supplert med 1% bovint serumalbumin (lipidfri). Et volum på 5-10 ml av dette lageret vil være tilstrekkelig. Steriliser lagerløsningen ved å bruke 0,22 μm filtre. Oppbevars ved 4 °C beskyttet mot lys i opptil 1 måned.
- For å forberede oleate lagerløsning, lag en 50 mM løsning av oleate i standard RPMI 1640 tidligere supplert med 1% bovint serumalbumin (lipidfri). Et volum på 10 ml vil være tilstrekkelig. Steriliser lagerløsningen ved å bruke 0,22 μm filtre. Oppbevars ved -20 °C beskyttet mot lys i opptil 1 måned.
- For å forberede steatogene medier fra de tidligere forberedte bestandene, lag et 1-dels palmitat: 2-delt oleatsteatogene medium på to mulige nivåer: mild og alvorlig steatose.
- Mild Steatose: Forbered 100 ml av et 1-delt palmitat: 2-delt oleatblanding (50 μM) i standard RPMI 1640. Steriliser ved hjelp av 0,22 μm filtre. Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Alvorlig Steatose: Forbered 100 ml av et 1-delt palmitat: 2-delt oleat (500 μM) blanding i standard RPMI 1640. Steriliser ved hjelp av 0,22 μm filtre. Oppbevares ved 4 °C i opptil 1 uke.
- Alternativ forberedelse til lagerløsningene.
- Forbered begge lagerløsningene ved hjelp av de respektive fettsyrene ved å bruke gratis lipidalbumin som angitt ovenfor.
- Når du mangler gratis lipidalbumin, bruk palmitate og oleate salter.
- Løs opp enten palmitate eller oleate i 2 ml absolutt etanol og bland deretter i det endelige volumet av standard RPMI 1640 (5-10 ml). Løs opp oleate direkte ved omrøring i standard RPMI 1640 kulturmedium.
- Tillat fordampning av etanol ved å inkubere i et vannbad ved 70 °C; blande grundig.
- I alle tilfeller steriliserer du begge lagerløsningene ved hjelp av 0,22 μm filtre. Oppbevar palmitat lageroppløsning ved 4 °C og oljeoppløsning ved - 20 °C. Beskytt begge løsningene mot lys. Disse løsningene er stabile i 1 måned.
2. Førkultur
- Frø 100.000 HepG2 celler per brønn i en 24-brønns plate. Tilsett 1 ml standard RPMI 1640.
- For-inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer, slik at celletilbehøret kan festes.
3. Steatogen kultur
- Etter prekultur, kast standard RPMI 1640 medium og legg til detsteatogene mediet tilsvarende.
- Kast supernatanten og tilsett fersksteatogent medium hver 24.
4. Levedyktighets- og dødelighetsvurdering
- Frø 100.000 HepG2 celler per brønn i en 24-brønns plate. Tilsett 1 ml standard RPMI 1640.
- Pre-inkubere i 24 timer ved 37 °C og 5 % CO2.
- Endre standard RPMI 1640 medium for det steatogene mediet.
- Inkuber i 24 timer, 2 dager, 3 dager og 4 dager forfriskende det steatogene mediet hver 24.
- Etter riktig tid, kast supernatanten.
- Løsne celler fra brønnen ved å legge til 500 μL 0,05% Trypsin-EDTA. Inkuber i 5 min ved 37 °C og 5 % CO2.
- Samle de resuspenderte cellene i et mikrorør.
- Sentrifuge ved 300 x g og kast supernatanten.
- Tilsett 200 μL standard RPMI 1640 og bruk cellene på nytt.
- Tilsett 15 μL 0,4% Trypan blå oppløsning i et friskt mikrorør. Bland med 15 μL av forrige celleoppheng.
- Tell de fargede og ikke-fargede cellene i et hemocytometer.
- Beregn levedyktigheten og dødeligheten tilsvarende.
Levedyktighet =
Dødelighet =
5. Lipidfarging med oljerød O
- Sett en cellekultur coverlip i hver brønn i en 24-brønns plate.
- Frø 100.000 HepG2 celler per brønn. Tilsett 1 ml standard RPMI 1640.
- For-inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 24 timer.
- Endre standard RPMI 1640 medium for det steatogene mediet.
- Inkuber i 24 timer, 2 dager, 3 dager og 4 dager, forfriskende det steatogene mediet hver 24.
- Etter riktig tid, kast supernatanten.
- Vask med 1 ml fosfatbufret saltvann (PBS). Kast supernatanten.
- Fest med 1 ml 4% paraformaldehyd i PBS.
- Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
- Kast overflødig paraformaldehyd.
- Skyll cellene med 1 ml destillert vann.
- Tilsett 1 ml 70% isopropanol og inkuber i 5 min.
- Kast overflødig isopropanol. En PBS-vask er ikke nødvendig på dette tidspunktet.
- Tilsett 1 ml oljerød O-oppløsning og inkuber i 30 min.
- Kast overskuddet av den oljerøde O-oppløsningen.
- Skyll med 1 ml destillert vann.
- Tilsett 500 μL hematoksylinoppløsning. Inkuber i 3 min.
- Kast overflødig hematoksylinoppløsning.
- Skyll med 1 ml destillert vann.
- Vær oppmerksom under mikroskopet ved en forstørrelse på 400x (mål 40x, okulær 10x).
6. Morfometrisk vurdering av lipidinnhold
- Velg og ta bilder av 10 optiske felt tilfeldig fra hele brønnområdet. Gjenta for hver brønn.
- Vurder prosentandelen av rødt farget område ved hjelp av Fargeterskel-verktøyet i ImageJ-programvaren i henhold til Ferreira og Rasband33.
- Sammenlign det fargede området med hele området av det optiske feltet ved hjelp av analysepartikler-verktøyet i ImageJ-programvaren i henhold til Ferreira og Rasband33.
- Beregn gjennomsnittsprosenten for hver brønn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hepatocytter dyrket i den steatogene medium displayveksten over hele overflaten av brønnen; Imidlertid viser fete hepatocytter lavere vekstrate sammenlignet med celler dyrket i kontrollmedium. Det foreslåtte forholdet og konsentrasjonen av OA og PA garanterer celleoverlevelse under kultur. Såing 1 x 105 celler per brønn i 24-brønnsplater gir optimal samløp som vist i figur 1.
Levedyktigheten i dyrkede celler var lavere i desteatogene gruppene Mild og Alvorlig, sammenlignet med kontrollforholdene. Faktisk ble levedyktigheten gradvis redusert etter hvert som kulturens tid økte, og nådde den laveste av 60% ved 4 dager ved alvorlig steatose (figur 2A). Følgelig var dødeligheten høyere i hepatocytter dyrket under desteatogene forholdene, og den økte gradvis med eksponeringstidspunktet for lipider (figur 2B). Celletallene økte gradvis som følge av spredning (Figur 2C). Imidlertid var spredningsraten lavere i Mild steatose på 3 dager og 4 dager. Derimot var alvorlig steatose forbundet med lavere spredning fra 24 timer.
HepG2-celler dyrket i den foreslåtte protokollen viser det viktigste trekk ved steatose, intracellulær lipidakkumulering. Farging av celler med oljerød O tillot å observere minst en to ganger økning av lipiddråper i celler dyrket under steatogene forhold som vist i figur 3 og figur 4. Intracellulært fett økte i henhold til tidspunktet for eksponering av kultur i det steatogene mediet (Figur 3). Ved mildsteatose ble lipidinnholdet økt fra dag 2, mens de i alvorlig steatose var betydelig høye fra 24 timer.
Figur 1: Cellevekst. HepG2 hepatocytterer kultur i kontroll (Figur 1A-D) og mildesteatogene forhold (Figur 1E-H). Fotografier viser vekst fra 1-4 dager med kultur. Skalalinje = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Levedyktighet og dødelighet. (A) Levedyktighet. (B) Dødelighet. (C) Cellenummer. HepG2 hepatocytter kultur i kontroll og steatogene forhold ble vurdert for levedyktighet og dødelighet ved trypan blå farging. Gjennomsnittlig ± SD. To uavhengige eksperimenter i triplikat per kulturtid. Sirkler: kontrollbetingelser; Firkanter: mild steatose; Trekanter: alvorlig steatose. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne mellom forhold og kulturtid for samme tilstand. p < 0,05 ble ansett som signifikant: "*"- kontroll vs alvorlig steatose; "§"- kontroll vs mild steatose; ""- mild vs alvorlig steatose.*. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Lipidakkumulering. HepG2 hepatocytter kultur i kontroll og steatogene forhold ble vurdert for lipidinnhold av oljerød O farging etterfulgt av en morfometrisk analyse ved hjelp av ImageJ programvare (NIH, USA). Prosentandelen lipider refererer til prosentandelen av arealet farget av Oljerød O (lipider) vurderer 100% som det komplette området av hvert optisk felt analysert. Gjennomsnittlig ± SD. To uavhengige eksperimenter i triplikat per kulturtid. Sirkler: kontrollbetingelser; Firkanter: mild steatose; Trekanter: alvorlig steatose. Enveis ANOVA ble brukt til å sammenligne mellom forhold og kulturtid for samme tilstand. p < 0,05 ble ansett som signifikant: "*"- kontroll vs alvorlig steatose; "§"- kontroll vs mild steatose; ""- mild vs alvorlig steatose.*. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Steatose in vitro. HepG2 hepatocytter kultur i kontroll (Figur 4A-D), mildsteatogene (Figur 4E-H), og alvorlige steatogene (Figur 4I-L) forhold ble vurdert for lipidinnhold ved oljerød O-farging. Fotografier viser hepatocyte lipiddråper fra 24 timer til 4 dager. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen er ment å gi en strategi for å studere steatose in vitro. Cellekultur er et kraftig verktøy for å studere cellulære, molekylære, biokjemiske og toksikologiske aspekter av cellene utsatt for forskjellige forhold. Med denne tilnærmingen kan steatose visualiseres ikke bare som et stadium av den komplekse sykdommen som er MAFLD, men også som hepatocyt overeksponering til lipider og mulige utfall som følge av slik eksponering. Derfor er søknaden ikke begrenset til fysiopatologien til MAFLD, men til det faktum at pasienter med fettlever er utsatt for terapeutiske legemidler, forurensninger, blant andre forhold som kan bli påvirket av steatose. Dermed har denne protokollen potensielle anvendelser innen toksikologi, farmakologi og identifisering av terapeutiske mål for behandling av sykdommen.
Ved utvikling av denne protokollen er et av de mest kritiske trinnene forberedelsen av densteatogene blandingen: 1 del av palmitat: 2 deler oleat, som induserer steatose fra dag 2 (Figur 3, figur 4), slik at hepatocytter kan spre seg til tross for en beskjeden reduksjon i levedyktighet og økt dødelighet (Figur 2). Redusert levedyktighet bør imidlertid ikke overstige 30% -40%, siden det kan representere en giftig effekt i stedet for en som kan følges på lang sikt. Leversteatose er et resultat av en langsiktig overeksponering for lipider. I denne forstand akkumuleres lipider i begynnelsen med milde følelser på hepatocyttene, som observert i denne modellen. En annen funksjon er lipiddråpeprofilen. Ved mild steatose observeres en økt størrelse i lipiddråper under utviklingen av kulturen (Figur 4E-H). Ved alvorlig steatose er dråpestørrelsen betydelig høyere sammenlignet med mild steatose (Figur 4I-L), mens kontroller ikke viser endringer i lipiddråpestørrelse (Figur 4A-D).
Det er å foretrekke å lagre både milde og alvorlige steatogene medier ved 4 °C i opptil en uke. Etterpå anbefales det å forberede frisksteatogent medium. Imidlertid kan OA-bestanden bevares ved -20 °C i opptil en måned, mens PA-lageret kan lagres ved 4 °C i opptil en måned. Bruk av disse lagerløsningene etter den foreslåtte tiden kan utgjøre en risiko for nedbrytning av fettsyrene. For å sikre riktig konsentrasjon av løsningene før hver bruk, anbefales det å måle fettsyrekonsentrasjoner av et ikke-esterifisert fettsyrer (NEFA) analysesett.
PA og OA, så vel som deres respektive salter, har blitt brukt separat for å indusere lipidakkumulering; Det observeres imidlertid forskjeller for hver fettsyre16,20. På den ene siden er palmitat som brukes alene en god induktor av steatose. Det induserer celledød, leverinsulinresistens, mitokondrie dysfunksjon, retikulært stress16,34,35,36. Imidlertid er palmitat svært giftig16,34, og resultatene som forventes å bruke det alene i kulturen inkluderer lavere levedyktighet og høyere dødelighet sammenlignet med blandingen av PA og OA16,20. På den annen side induserer oleate også steatose. Det induserer de novo lipogenese, insulinresistens37,38og hyperproliferasjon38. Imidlertid er resultatene observert med oleat ofte mildere sammenlignet med palmitate og blandingen16,20. Dette kan være relatert til dens beskyttende rolle. Oleate er den viktigste komponenten i olivenolje, en nøkkelbestanddel i Middelhavsdietten, en av de kjente vellykkede strategiene mot MAFLD39.
Denne protokollen kan betraktes som et fint verktøy for å studere steatose på grunn av reproduserbarheten og den korte tiden det tar å oppnå resultater. Dette er i sammenligning med bruk av eksperimentelle modeller av MAFLD, og legger til det faktum at det ikke innebærer de etiske problemene som er forbundet med å bruke gnagermodeller. Denne protokollen tillater å bli fulgt i flere dager, forutsatt at steatogent medium oppdateres hver 24. Denne modellen er også kostnadseffektiv og har et bredt spekter av applikasjoner. Det kan også justeres til andre cellelinjer, ikke bare hepatocytter, men et bredt spekter av celler påvirket av lipidovereksponering under fedme. En av begrensningene i denne protokollen er bruken av HepG2-celler. Siden dette er en kreftfremkallende cellelinje, kan den skjule eller øke noen resultater. Imidlertid er anvendelsen av HepG2-celler i disse typer studier allment akseptert på grunn av likheten i lipidmetabolismen til sunne hepatocytter40. Bruken av blandingen PA: 2OA kan også vise seg å være kontroversiell siden den ikke ligner profilene til NEFA observert i blodet til NAFLD / MAFLD-pasienter41. Andre fettsyrer, inkludert linolensyrer eller stearinsyrer, kan inngå i ytterligere modifikasjoner og forbedringer av denne protokollen. En annen begrensning er det faktum at bare en celletype, hepatocytter, studeres, mangler interaksjon med andre leverceller som er tilstede i leveren, inkludert sinusformet endotel, Kupffer, lever stellate celler, etc., som er engasjert i utviklingen av MAFLD. Videre er dette en modell for å indusere steatose utelukkende, uten progresjon til steatohepatitt og fibrose.
Til slutt gir studien en in vitro-protokoll av hepatocyttsteatose som er lett å implementere, reproduserbar, og med et bredt spekter av applikasjoner i studiet av steatose samt hepatocyttfunksjonen i sammenheng med fettlever.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt, CB-221137). Adriana Campos er doktorgradsstudent ved Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, og ble støttet av Conacyt (CVU: 1002502).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biosafety cabinet | ESCO Airstream | AC2-452+C2:C26 | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet |
| Bottle top filter | Corning, US | 430513 | Non-pyrogenic, polystyrene, sterile. 1 filter/Bag. 0.22 μm, 500 mL. |
| Bovine serum albimun (BSA) | Gold Biotechnology, US | A-421-10 | BSA Fatty Acid Free for cell culture |
| Culture media RPMI 1640 | ThermoFisher-Gibco, US | 31800-022 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher-Gibco, US | A4766801 | - |
| Hemocytometer | Marienfeld, DE | 640010 | - |
| HepG2 cell line | ATCC, US | HB-8065 | Hepatocellular carcinoma human cells. |
| Humidified incubator | Thermo Electronic Corporation,US | Model: 3110 | Temperature (37 °C ± 1 °C), humidity (90% ± 5%) , CO2 (5% ± 1%) |
| Inverted microscope Eclipse | NIKON, JPN | Model: TE2000-S | - |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich, US | I9030-4L | - |
| Oil Red O Kit | Abcam, US | ab150678 | Kit for histological visualization of neutral fat. |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, US | P6148-500G | - |
| Penicillin/streptomycin | ThermoFisher-Gibco, US | 15140-122 | Antibiotics 10,000 U/mL Penicillin, 10,000 μg/mL Streptomycin |
| pH meter | Beckman, US | Model: 360 PH/Temp/MV Meter | - |
| Phosphate buffered saline | ThermoFisher-Gibco, US | 10010-023 | - |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1253.001 | Non-pyrogenic, sterile, 5 mL |
| Serological Pipettes | Sarstedt, AUS | 86.1254.001 | Non-pyrogenic, sterile, 10 mL |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, US | S5761-1KG | Preparation of culture media |
| Sodium oleate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215879A | - |
| Sodium palmitate | Santa Cruz Biotechnology, US | sc-215881 | - |
| Syring filter | Corning, US | 431219 | Non-pyrogenic, sterile, 28 mm, 0.2 μm. |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich, US | T6146-25G | - |
| Trypsin 0.05% /EDTA 0.53 mM | Corning, US | 25-052-Cl | - |
| 24 well cell culture cluster | Corning, US | 3524 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
| 96 well cell culture cluster | Corning, US | 3599 | Flat bottom with lid. Tissue culture treated. Nonpyrogenic, polystyrene, sterile. 1/Pack. |
References
- Younossi, Z. M. Non-alcoholic fatty liver disease - a global public health perspective. Journal of Hepatology. 70 (3), 531-544 (2019).
- Younossi, Z., et al. Global perspectives on nonalcoholic fatty liver disease and nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology. 69 (6), 2672-2682 (2019).
- Eslam, M., et al. A new definition for metabolic dysfunction-associated fatty liver disease: An international expert consensus statement. Journal of Hepatology. 73 (1), 202-209 (2020).
- Eslam, M., Sanyal, A. J., George, J. MAFLD: A consensus-driven proposed nomenclature for metabolic associated fatty liver disease. Gastroenterology. 158 (7), 1999-2014 (2020).
- Chalasani, N., et al. The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American association for the study of liver diseases. Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).
- Calzadilla Bertot, L., Adams, L. A. The natural course of non-alcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Science. 17 (5), 774 (2016).
- Reccia, I., et al. Non-alcoholic fatty liver disease: A sign of systemic disease. Metabolism. 72, 94-108 (2017).
- Tomita, K., et al. Free cholesterol accumulation in hepatic stellate cells: Mechanism of liver fibrosis aggravation in nonalcoholic steatohepatitis in mice. Hepatology. 59 (1), 154-169 (2014).
- Byrne, C. D., Targher, G. Nafld: A multisystem disease. Journal of Hepatology. 62, 1 Suppl 47-64 (2015).
- Ipsen, D. H., Lykkesfeldt, J., Tveden-Nyborg, P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (18), 3313-3327 (2018).
- Diehl, A. M., Day, C. Cause, pathogenesis, and treatment of nonalcoholic steatohepatitis. New England Journal of Medicine. 377 (21), 2063-2072 (2017).
- Zeng, X., et al. Oleic acid ameliorates palmitic acid induced hepatocellular lipotoxicity by inhibition of ER stress and pyroptosis. Nutrition and Metabolism. 17, London. 11 (2020).
- Ore, A., Akinloye, O. A. Oxidative stress and antioxidant biomarkers in clinical and experimental models of non-alcoholic fatty liver disease. Medicina (Kaunas). 55 (2), 26 (2019).
- Paradies, G., Paradies, V., Ruggiero, F. M., Petrosillo, G. Oxidative stress, cardiolipin and mitochondrial dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease. World Journal of Gastroenterology. 20 (39), 14205-14218 (2014).
- Aravinthan, A., et al. Hepatocyte senescence predicts progression in non-alcohol-related fatty liver disease. Journal of Hepatology. 58 (3), 549-556 (2013).
- Gomez, M. J., et al. A human hepatocellular in vitro model to investigate steatosis. Chemico Biological Interactions. 165 (2), 106-116 (2007).
- Wu, W. K. K., Zhang, L., Chan, M. T. V. Autophagy, NAFLD and NAFLD-related HCC. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1061, 127-138 (2018).
- Levy, G., Cohen, M., Nahmias, Y. In vitro cell culture models of hepatic steatosis. Methods in Molecular Biology. 1250, 377-390 (2015).
- Kanuri, G., Bergheim, I. In vitro and in vivo models of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD). International Journal of Molecular Science. 14 (6), 11963-11980 (2013).
- Ricchi, M., et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 24 (5), 830-840 (2009).
- Lee, Y., et al. Serial biomarkers of de novo lipogenesis fatty acids and incident heart failure in older adults: The cardiovascular health study. Journal of the American Heart Association. 9 (4), 014119 (2020).
- Alnahdi, A., John, A., Raza, H. Augmentation of glucotoxicity, oxidative stress, apoptosis and mitochondrial dysfunction in Hepg2 cells by palmitic acid. Nutrients. 11 (9), 1979 (2019).
- Chen, X., et al. Oleic acid protects saturated fatty acid mediated lipotoxicity in hepatocytes and rat of non-alcoholic steatohepatitis. Life Sciences. 203, 291-304 (2018).
- Xing, J. H., et al. NLRP3 inflammasome mediate palmitate-induced endothelial dysfunction. Life Sciences. 239, 116882 (2019).
- Yan, H., et al. Insulin-like Growth Factor Binding Protein 7 accelerates hepatic steatosis and insulin resistance in non-alcoholic fatty liver disease. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 46 (12), 1101-1110 (2019).
- Wang, J., Hu, R., Yin, C., Xiao, Y. Tanshinone IIA reduces palmitate-induced apoptosis via inhibition of endoplasmic reticulum stress in Hepg2 liver cells. Fundamental and Clinical Pharmacology. 34 (2), 249-262 (2020).
- Xiao, Z., Chu, Y., Qin, W. IGFBP5 modulates lipid metabolism and insulin sensitivity through activating ampk pathway in non-alcoholic fatty liver disease. Life Sciences. 256, 117997 (2020).
- Avila, G., et al. In vitro effects of conjugated linoleic acid (CLA) on inflammatory functions of bovine monocytes. Journal of Dairy Science. 103 (9), 8554-8563 (2020).
- Malhi, H., Bronk, S. F., Werneburg, N. W., Gores, G. J. Free fatty acids induce JNK-dependent hepatocyte lipoapoptosis. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 12093-12101 (2006).
- Oh, J. M., et al. Effects of palmitic acid on TNF-alpha-induced cytotoxicity in SK-Hep-1 cells. Toxicology In Vitro: An International Journal Published in Association with BIBRA. 26 (6), 783-790 (2012).
- Stellavato, A., et al. In vitro assessment of nutraceutical compounds and novel nutraceutical formulations in a liver-steatosis-based model. Lipids in Health and Disease. 17 (1), 24 (2018).
- Pachikian, B. D., et al. Implication of trans-11, trans-13 conjugated linoleic acid in the development of hepatic steatosis. PLoS One. 13 (2), 0192447 (2018).
- Ferreira, T., Rasband, W. Analyze. ImageJ User Guide. , Ch. 30 132-135 (2012).
- Geng, Y., Wu, Z., Buist-Homan, M., Blokzijl, H., Moshage, H. Hesperetin protects against palmitate-induced cellular toxicity via induction of GRP78 in hepatocytes. Toxicology and Applied Pharmacology. , 404 (2020).
- Geng, Y., et al. Protective effect of metformin against palmitate-induced hepatic cell death. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1866 (3), 165621 (2020).
- Sarnyai, F., et al. Effect of cis- and trans-monounsaturated fatty acids on palmitate toxicity and on palmitate-induced accumulation of ceramides and diglycerides. International Journal of Molecular Science. 21 (7), 2626 (2020).
- Chen, J. W., et al. Tetrahydrocurcumin ameliorates free fatty acid-induced hepatic steatosis and improves insulin resistance in HepG2 cells. Journal of Food and Drug Analysis. 26 (3), 1075-1085 (2018).
- Burhans, M. S., et al. Hepatic oleate regulates adipose tissue lipogenesis and fatty acid oxidation. Journal of Lipid Research. 56 (2), 304-318 (2015).
- Abenavoli, L., Milanovic, M., Milic, N., Luzza, F., Giuffre, A. M. Olive oil antioxidants and non-alcoholic fatty liver disease. Expert Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 13 (8), 739-749 (2019).
- Nagarajan, S. R., et al. Lipid and glucose metabolism in hepatocyte cell lines and primary mouse hepatocytes: A comprehensive resource for in vitro studies of hepatic metabolism. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 316 (4), 578-589 (2019).
- Hodson, L., Skeaff, C. M., Fielding, B. A. Fatty acid composition of adipose tissue and blood in humans and its use as a biomarker of dietary intake. Progress in Lipid Research. 47 (5), 348-380 (2008).
