Summary
يصف هذا البروتوكول استخراج المركبات العضوية المتطايرة من عينة بيولوجية باستخدام طريقة استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ ، وكروماتوغرافيا الغاز إلى جانب قياس الطيف الكتلي باستخدام سكة إعداد العينات Entech ، وتحليل البيانات. كما يصف استزراع العينات البيولوجية وفحص النظائر المستقرة.
Abstract
المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) من العينات البيولوجية لها أصول غير معروفة. قد تنشأ المركبات العضوية المتطايرة من المضيف أو الكائنات الحية المختلفة من داخل المجتمع الميكروبي للمضيف. لفك تشابك أصل المركبات العضوية المتطايرة الميكروبية ، تم إجراء تحليل متطاير لمساحة الرأس للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة للمكورات العنقودية الذهبية ، والزائفة الزنجارية ، و Acinetobacter baumannii ، وفحص النظائر المستقرة في العينات البيولوجية من البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي والبلغم. تم استخدام المزارع الأحادية والمشتركة لتحديد الإنتاج المتطاير من الأنواع البكتيرية الفردية أو بالاشتراك مع فحص النظائر المستقرة لتحديد التمثيل الغذائي النشط للميكروبات من العينات البيولوجية.
تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) لاستخراج المركبات العضوية المتطايرة. VASE هي طريقة سهلة الاستخدام وتجارية وخالية من المذيبات لاستخراج مساحة الرأس للمركبات شبه المتطايرة والمتطايرة. إن نقص المذيبات والظروف شبه الفراغية المستخدمة أثناء الاستخراج تجعل تطوير طريقة سهلة وسريعة نسبيا عند مقارنتها بخيارات الاستخراج الأخرى مثل tert-butylation والاستخراج الدقيق للطور الصلب. تم استخدام سير العمل الموصوف هنا لتحديد توقيعات متقلبة محددة من الثقافات الأحادية والمشتركة. وعلاوة على ذلك، حدد تحليل فحص النظائر المستقرة للعينات البيولوجية المرتبطة بالإنسان المركبات العضوية المتطايرة التي أنتجت إما بشكل شائع أو فريد. تعرض هذه الورقة سير العمل العام والاعتبارات التجريبية ل VASE بالاقتران مع فحص النظائر المستقرة للمزارع الميكروبية الحية.
Introduction
المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) لديها وعد كبير للكشف عن البكتيريا وتحديد هويتها لأنها تنبعث من جميع الكائنات الحية ، والميكروبات المختلفة لها توقيعات فريدة من نوعها المركبات العضوية المتطايرة. تم استخدام الجزيئات المتطايرة كقياس غير جراحي للكشف عن التهابات الجهاز التنفسي المختلفة بما في ذلك مرض الانسداد الرئوي المزمن1 ، والسل2 في البول3 ، والالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الصناعي4 ، بالإضافة إلى التمييز بين الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي (CF) من مواضيع التحكم الصحية 5,6. حتى أن التوقيعات المتطايرة استخدمت للتمييز بين عدوى ممرضة محددة في التليف الكيسي (المكورات العنقودية الذهبية 7 ، والزائفة الزنجارية 8,9 ، و S. aureus مقابل P. aeruginosa10). ومع ذلك ، مع تعقيد هذه العينات البيولوجية ، غالبا ما يكون من الصعب تحديد مصدر المركبات العضوية المتطايرة المحددة.
تتمثل إحدى الاستراتيجيات لفك تشابك الملامح المتطايرة من الميكروبات المصابة المتعددة في إجراء تحليل للكائنات الحية الدقيقة في كل من الزراعة الأحادية والمشتركة11. يفحص تحليل مساحة الرأس التحليلات المنبعثة في "مساحة الرأس" فوق العينة بدلا من تلك المضمنة في العينة نفسها. غالبا ما تتميز المستقلبات الميكروبية في الثقافات الأحادية بسبب صعوبة تحديد أصل المستقلبات الميكروبية في العينات السريرية المعقدة. من خلال تنميط المواد المتطايرة من الثقافات الأحادية البكتيرية ، قد تمثل أنواع المواد المتطايرة التي ينتجها الميكروب في المختبر خط أساس لذخيرته المتطايرة. الجمع بين الثقافات البكتيرية ، على سبيل المثال ، إنشاء مزارع مشتركة ، وتوصيف الجزيئات المتطايرة المنتجة قد يكشف عن التفاعلات أو التغذية المتبادلة بين البكتيريا12.
استراتيجية أخرى لتحديد الأصل الميكروبي للجزيئات المتطايرة هي توفير مصدر غذائي يحمل نظائر مستقرة. النظائر المستقرة هي أشكال غير مشعة من الذرات التي تحدث بشكل طبيعي مع عدد مختلف من النيوترونات. في استراتيجية تم استخدامها منذ أوائل 1930s لتتبع التمثيل الغذائي النشط في الحيوانات13 ، تتغذى الكائنات الحية الدقيقة من مصدر المغذيات المسمى وتدمج النظير المستقر في مساراتها الأيضية. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام نظير مستقر في شكل ماء ثقيل (D2O) لتحديد S. aureus النشط استقلابيا في عينة بلغم CF السريرية14. في مثال آخر ، تم استخدام 13جلوكوز يحمل علامة C لإثبات التغذية المتقاطعة للمستقلبات بين العزلات السريرية CF ل P. aeruginosa و Rothia mucilaginosa12 .
مع تقدم تقنيات قياس الطيف الكتلي ، انتقلت طرق اكتشاف الإشارات المتطايرة من الملاحظات النوعية إلى قياسات أكثر كمية. باستخدام مطياف كتلة كروماتوغرافيا الغاز (GC-MS) ، أصبحت معالجة العينات البيولوجية في متناول معظم البيئات المختبرية أو السريرية. تم استخدام العديد من الطرق لمسح الجزيئات المتطايرة لتحديد ملامح العينات مثل الطعام والثقافات البكتيرية والعينات البيولوجية الأخرى والهواء والماء للكشف عن التلوث. ومع ذلك ، فإن العديد من الطرق الشائعة لأخذ العينات المتطايرة ذات الإنتاجية العالية تتطلب مذيبا ولا يتم تنفيذها بالمزايا التي يوفرها الاستخراج الفراغي. بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما تكون هناك حاجة إلى كميات أو كميات أكبر (أكبر من 0.5 مل) من المواد التي تم أخذ عينات منها للتحليل15،16،17،18،19 ، على الرغم من أن هذا خاص بالركيزة ويتطلب التحسين لكل نوع عينة وطريقة.
هنا ، تم استخدام استخراج المواد الماصة بمساعدة الفراغ (VASE) متبوعا بالامتزاز الحراري على GC-MS لمسح الملامح المتطايرة للمزارع البكتيرية الأحادية والمشتركة وتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع فحص النظائر المستقرة من البراز البشري واللعاب ومياه الصرف الصحي وعينات البلغم (الشكل 1). مع كميات عينات محدودة ، تم استخراج المركبات العضوية المتطايرة من أقل من 15 ميكرولتر من البلغم. تتطلب تجارب فحص النظائر مع العينات البشرية إضافة مصدر نظير مستقر ، مثل الجلوكوز 13C ، والوسائط لزراعة نمو المجتمع الميكروبي. تم تحديد الإنتاج النشط للمواد المتطايرة كجزيء أثقل بواسطة GC-MS. مكن استخراج الجزيئات المتطايرة تحت فراغ ثابت من اكتشاف الجزيئات المتطايرة مع زيادة الحساسية 20،21،22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. القلم الماص Headspace (HSP) واعتبارات تحليل العينات
ملاحظة: تم اختيار HSP الذي يحتوي على مادة Tenax TA الماصة لالتقاط مجموعة واسعة من المواد المتطايرة. لدى Tenax تقارب أقل للمياه مقارنة بالمواد الماصة الأخرى ، مما يمكنه من احتجاز المزيد من المركبات العضوية المتطايرة من عينات الرطوبة العالية. يحتوي Tenax أيضا على مستوى منخفض من الشوائب ويمكن تكييفه لإعادة الاستخدام. كما تم اختيار المواد الماصة مع مراعاة العمود المثبت في GC-MS (انظر جدول المواد).
- قم بإنشاء عناصر تحكم سلبية عن طريق استخراج الوسائط و / أو فراغات العينات بنفس الشروط المستخدمة لاستخراج العينة.
- قم بتحليل HSP فارغ (تم تأكيده سابقا على أنه نظيف وخالي من الخلفية الهامة) على GC-MS قبل تحليل العينات المستخرجة. قم بتشغيل الفراغات بين أنواع العينات (على سبيل المثال ، ثلاثة تكرارات للبكتيريا أحادية الثقافة ، فارغة ، ثلاثة نسخ متماثلة من البكتيريا المشاركة في الزراعة ، فارغة ، إلخ).
- الحد من استخدام مواد العناية الشخصية العطرية أو استهلاك الأطعمة ذات الرائحة الكريهة قبل استخراج العينات وتحليلها. من الناحية المثالية ، قم بإعداد عينات في غطاء السلامة البيولوجية الذي لم يتم تطهيره بواسطة الكحول أو غيره من المنظفات المتطايرة لمدة 30 دقيقة على الأقل. قم بتشغيل تدفق الهواء في غطاء محرك السيارة للسلامة الأحيائية لمدة 30-60 دقيقة قبل إعداد العينة.
- احتفظ بالعينات على الجليد للحد من الإطلاق المتطاير أثناء تحضير العينة.
2. إعداد الثقافة الأحادية والمشتركة
- في غطاء السلامة الأحيائية ، قم بتلقيح ثقافات A. baumannii و S. aureus و P. aeruginosa في وسائط نمو تود هيويت. احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة التحريض.
- بعد الحضانة بين عشية وضحاها، قم بإجراء مناولة الثقافة في غطاء السلامة الأحيائية. قم بتخفيف كل ثقافة إلى الكثافة البصرية 0.05 عند 500 نانومتر.
- امزج الثقافات المشتركة في أجزاء متساوية ، وماصة 200 ميكرولتر من وسائط التحكم ، أحادية اللون ، أو الزراعة المشتركة في كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، وضعها في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. إعداد لوحة ثانية لحضانة 48 ساعة.
- في نهاية فترة الحضانة ، قم بإعداد عينات لاستخراجها في القسم 4. تزرع سائل ماصة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وتخزن عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية لاستخراجها لاحقا إذا لزم الأمر.
3. فحص النظائر المستقرة في إعداد العينات البيولوجية
ملاحظة: تم التبرع بعينات البراز واللعاب من متبرعين مجهولين بموافقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة كاليفورنيا إيرفين (HS# 2017-3867). جاءت مياه الصرف الصحي من سان دييغو ، كاليفورنيا. تم جمع عينات البلغم من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي كجزء من دراسة أكبر وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة ميشيغان (HUM00037056).
- إجراء جميع مستحضرات العينات البيولوجية في غطاء محرك السيارة للسلامة الأحيائية.
- لإعداد عينات من البراز ، أضف 1 مل من الماء منزوع الأيونات إلى 100 ملغ من البراز في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ودوامة لمدة 3 دقائق. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
- إلى 15 ميكرولتر من خليط البراز والماء ، أضف 485 ميكرولتر من وسط تسريب قلب الدماغ (BHI) مع 20 mM 13C glucose ، أو BHI مع 30٪ من الديوتيريوم (D2O). تأكد من أن الحجم النهائي للعينة هو 500 ميكرولتر.
- لإعداد عينات مياه الصرف الصحي ، أضف 500 ميكرولتر من مياه الصرف الصحي إلى 500 ميكرولتر من BHI مع 20 mM 13C glucose أو BHI مع 30٪ D2O لحجم إجمالي قدره 1 مل. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
- لإعداد عينات اللعاب ، أضف 50 ميكرولتر من اللعاب إلى 500 ميكرولتر من BHI مع 20 mM 13C glucose أو BHI مع 30٪ D2O لحجم إجمالي قدره 550 ميكرولتر. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
- لإعداد عينات البلغم لمقارنة المواد المتطايرة الموجودة في العينة قبل وبعد الزراعة ، قم بإجراء استخراج أول باستخدام 15 ميكرولتر من البلغم. تحضير العينات في ثلاثة أضعاف. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام. انتقل إلى القسم 4 لاستخراج العينات ، واستخرج لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية مع إثارة 200 دورة في الدقيقة.
- بعد الانتهاء من الاستخراج الأول لعينات البلغم غير المستزرعة ، احفظ القوارير بالبلغم. أضف 500 ميكرولتر من BHI مع جلوكوز 20 mM 13C إلى القوارير ذات البلغم من 3.5.1. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
- لإعداد عينات من البراز ، أضف 1 مل من الماء منزوع الأيونات إلى 100 ملغ من البراز في أنبوب طرد مركزي دقيق 1.5 مل ودوامة لمدة 3 دقائق. ضعيه على الجليد عندما لا يكون قيد الاستخدام.
- انتقل إلى القسم 4 لاستخراج العينات.
4. استخراج العينات
- ضع قوارير التحليل العضوي المتطاير (VOA) الفارغة (20 مل) على الصفيحة الباردة ، وضع الصفيحة الباردة على الجليد في غطاء السلامة الأحيائية.
- قم بتشغيل وحدة استخراج القلم الماصة 5600 (SPEU)، واضبط درجة الحرارة المطلوبة كما هو مطلوب لكل طريقة.
ملاحظة: بالنسبة لتجارب فحص النظائر المستقرة عند 37 درجة مئوية، قد يستغرق الوصول إلى نقطة الضبط ما يصل إلى 15 دقيقة. بالنسبة لتجارب الزراعة الأحادية والمشتركة عند 70 درجة مئوية ، قد يستغرق الوصول إلى نقطة الضبط ما يصل إلى 60 دقيقة. - اجمع HSPs نظيفة تساوي عدد العينات التي تم إعدادها، بما في ذلك HSPs للوسائط أو عناصر التحكم في العينات.
- قم بتسمية قوارير VOA سعة 20 مل وفقا للعينات والنسخ المتماثلة ومعرفات HSP حسب الحاجة. استخدم علامة تقاوم الماء في حالة تشكل التكثيف على السطح الخارجي للقارورة أثناء وجودها على الجليد.
- داخل غطاء السلامة الأحيائية ، قم بفك الغطاء الأبيض على القارورة ، وقم بسحب العينة بسرعة في القارورة ، وقم بتجميع الغطاء الأسود وبطانة الغطاء و HSP.
ملاحظة: يجب ألا تتلامس العينات مع HSP ، وسيعتمد حجم العينة على نوع العينة. - ضع القارورة التي تحتوي على العينة و HSP مرة أخرى على اللوحة الباردة.
- كرر الخطوتين 4.5 و4.6 لكل عينة. نفذ هذه الخطوات لكل عينة بدلا من كل مرة واحدة لمنع ارتفاع درجة حرارة العينة وبالتالي الإطلاق المتطاير المبكر.
- بمجرد إعداد جميع العينات في القوارير الزجاجية ، قم بتنفيذ الخطوات التالية خارج غطاء السلامة الأحيائية على المقعد. قم بتشغيل مضخة التفريغ ، وضع القوارير تحت الفراغ إلى 30 مم زئبق ، وإزالة مصدر التفريغ.
ملاحظة: لا يلزم أن تكون القوارير على الدرج البارد بعد اكتمال تطبيق التفريغ. - تحقق مرة أخرى من الضغط بعد وضع جميع العينات تحت الفراغ باستخدام مقياس الضغط. إذا كانت القارورة بها تسرب ، فتأكد من أن الغطاء مشدود بإحكام ، وأن حلقات O البيضاء لبطانات HSP والغطاء في مكانها بشكل صحيح.
ملاحظة: يمكن أن يؤدي الختم المخترق إلى انخفاض الكشف عن التطاير مقارنة بالقارورة تحت الفراغ. - ضع القوارير في SPEU للحصول على الوقت ودرجة الحرارة الأمثل مع الإثارة عند 200 دورة في الدقيقة. استخراج الثقافات لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية. استخراج تجارب فحص النظائر المستقرة مع عينات البراز والصرف الصحي واللعاب والبلغم لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- ضع اللوحة الباردة عند -80 درجة مئوية لاستخدامها بعد اكتمال فترة الاستخراج.
- عند اكتمال الاستخراج ، ضع عينات على اللوحة الباردة لمدة 15 دقيقة لسحب بخار الماء من HSP ومساحة رأس القارورة.
- نقل HSPs إلى أكمامهم.
ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا لمدة تصل إلى ~ 1 أسبوع في درجة حرارة الغرفة قبل فقدان المركبات الأكثر تقلبا من HSPs.
5. تحليل العينات على كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة (GC-MS)
- استخدم إعدادات GC-MS التالية (انظر جدول المواد): 35 درجة مئوية مع تعليق لمدة 5 دقائق، ومنحدر من 10 درجات مئوية/دقيقة إلى 170 درجة مئوية، ومنحدر من 15 درجة مئوية/دقيقة إلى 230 درجة مئوية مع نسبة تقسيم 20:1 ووقت تشغيل إجمالي يبلغ 38 دقيقة.
- اضبط طريقة الامتزاز على النحو التالي: 2 دقيقة ، 70 درجة مئوية ؛ 2 دقيقة 260 درجة مئوية الامتزاز. 34 دقيقة ، 260 درجة مئوية خبز ؛ و 2 دقيقة ، 70 درجة مئوية بعد الخبز.
- قم بإعداد تسلسل العينات ، وابدأ التشغيل وفقا للأجهزة.
- لإعداد تسلسل على برنامج Entech، افتح البرنامج. في الخيارات الموجودة على يسار القائمة المنسدلة للأداة، حدد 5800 | التسلسل.
- راقب جدول التسلسل في برنامج Entech المشابه لتلك الموجودة في برنامج GC-MS. قم بتسمية العمود نموذج المعرف وفقا لرقم date_vial الحالي. ضع في اعتبارك أن الاسم مشابه للاسم في جدول تسلسل GC-MS ، ويحدد 5800 Method معدل منحدر درجة الحرارة وأوقات الانتظار وما إلى ذلك (يفتح قائمة لتحديد الطريقة التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.2).
- ضع في اعتبارك أن عمودي الدرج والموضع يحددان المكان الذي ستذهب إليه سكة إعداد العينات (SPR) لالتقاط HSPs.
- راقب الصواني مع 30 بقعة لكل منها إلى اليسار مباشرة ، وضعت على شكل ستة أعمدة مع خمس بقع لكل منهما. موضع الدرج الأكثر يسارا والأقرب إلى المستخدم (الأمامي) هو الموضع 1 ، في حين أن أقصى اليمين والأبعد هو الموضع 30.
- لاحظ أن هذه الصواني هي HSP A أو B ، حيث HSP B هو الدرج الأقرب إلى SPR (الدرج الأعمق) ، وخلف HSP B مباشرة هو HSP فارغ. ضع العينات المستخرجة في الصواني ، وحدد البقعة على التسلسل وفقا لذلك.
- احفظ جدول التسلسل، وحدد تشغيل على الجانب الأيسر، ثم ابدأ بفارغ في desorber إذا كان HSP الفارغ في desorber (يشار إليه ب HSP مميز بتسمية صفراء).
- لاحظ أنه سيتم التعامل مع HSPs بواسطة SPR لكل عينة في التسلسل. دع SPR يسخن ، ثم ستظهر رسالة في الجزء العلوي من الشاشة لتأكيد ما إذا كان الفراغ في desorber. انقر فوق تخطي للتأكد من أن القلم موجود. اسمح ل SPR بتشغيل جميع العينات تلقائيا ، وسيقوم التسلسل الموجود على جانب GC-MS بتسجيل البيانات تلقائيا في ملفات منفصلة.
6. تحليل البيانات
- بيانات تصفية الجودة على برنامج GC-MS (جدول المواد).
- راجع كل قمة على الكروماتوجرام، على القمم التي تتطابق مع مكتبة المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا (NIST) (أو مع مكتبة أخرى متاحة).
- إضافة قمم كروماتوجرام مشروحة إلى طريقة المعالجة. ضع معايير اختيار القمم لتشمل المركبات ذات الاحتمال الأكبر من 75٪ ، وتأكد من أن محاذاة كل أيون تعريف للمركب تقع داخل مركز الذروة.
- لإضافة ذروة إلى طريقة المعالجة، حدد معايرة | تحرير | المجمع الاسم | إدراج مركب ضمن المركب القياسي الخارجي. أضف اسم المركب ، وقت الاحتفاظ ، أيون هدف الإشارة الكمية. أضف أكبر ثلاث قمم. للحفظ، اختر موافق | طريقة | حفظ.
- بمجرد إعداد طريقة العملية ، انتقل إلى تحديد كمية | حساب | وعرضها QEdit النتيجة الكمية.
- افحص كل مركب للتأكد من أن القمم تتماشى مع أوقات الاحتفاظ المتوقعة وأنها أعلى من ضوضاء الخلفية.
- بمجرد اكتمال QEdit ، حدد الخروج | نعم لحفظ QEdits والعودة إلى الكروماتوجرام الرئيسي. تصدير تكاملات المنطقة عن طريق فتح الملف على الجانب الأيسر. حدد تحديد كمية | إنشاء تقرير.
- لتصدير ملفات لاستخدامها في DExSI، حدد ملف | تصدير البيانات إلى تنسيق AIA | إنشاء دليل جديد، وحدد موقعا للملف أو استخدم الدليل الموجود.
- راقب نافذة جديدة تفتح لتحديد الملفات المراد تصديرها. انقل الملفات إلى الجانب الأيمن من النافذة وانقر فوق معالجة. انتظر لبضع ثوان إلى بضع دقائق اعتمادا على عدد الملفات التي يتم تحويلها.
- تصحيح وفرة النظائر في DExSI وفقا لتعليمات برنامج DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) ، وإجراء التحليل باستخدام برنامج أو برنامج مفضل (على سبيل المثال ، R). توجد البرامج النصية المستخدمة لإنشاء الأشكال في https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الثقافات الأحادية والمشتركة ل S. aureus و P. aeruginosa و A. baumannii
تألفت الثقافات الأحادية والمشتركة من الأنواع البكتيرية S. aureus و P. aeruginosa و A. baumannii. هذه هي مسببات الأمراض الانتهازية الشائعة الموجودة في الجروح البشرية والالتهابات المزمنة. لتحديد الجزيئات المتطايرة الموجودة في الثقافات الأحادية والمشتركة ، تم إجراء استخراج قصير لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية مع إثارة 200 دورة في الدقيقة. من الثقافات الأحادية والمشتركة في نقطتي زمنية 24 و 48 ساعة ، تم الكشف عن 43 جزيئا متطايرا مشروحا (الشكل 2) من بينها الألدهيدات والكيتونات والكحول والمركبات الكبريتية والهيدروكربونات والأحماض الكربوكسيلية أو الإسترات والعطريات. كان هناك عدد صغير من الجزيئات المتطايرة التي تم اكتشافها فقط في بعض الثقافات الأحادية أو المشتركة في نقاط زمنية معينة. على سبيل المثال، لم يتم الكشف عن الأسيتوين وأسيتات 3-hydroxy-2-butanone إلا في مزارع S. aureus عند النقطة الزمنية 48-h (الشكل 2).
ولم يكتشف الميثيل المتطاير 1-بروبانول 2-ميثيل إلا في الاستزراع المشترك للبكتيريا P. aeruginosa وA. baumannii في الساعة 48 (الشكل 2). كان خلات الإيثيل موجودة في الثقافات المشتركة A. baumannii مع S. aureus أو P. aeruginosa في 48 h (الشكل 2). تم الكشف عن مستقلبات الهيبتان ، 2,3-dimethyl و pentane ، 2-methyl فقط في ثقافة A. baumannii في 24 h (الشكل 2). كان للأسيتالديهيد والإيثانول وفرة نسبية أعلى في الثقافة المشتركة A. baumannii و S. aureus في النقطة الزمنية 24 ساعة مقارنة ب 48 ساعة وأي من السلالات في الثقافة وحدها (الشكل 2). كانت بعض المواد المتطايرة أكثر وفرة في الثقافات إما في الوقت المحدد 24 أو 48 ساعة. كانت الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة ، بما في ذلك حمض الخليك وحمض البيوتانويك وحمض البروبانويك ، بوفرة نسبية عالية في الثقافات عند 48 ساعة ، ولكن لم يتم اكتشافها في مزارع 24 ساعة (الشكل 2). كان الهكسان أكثر وفرة في التحكم TH عند 24 ساعة مقارنة ب 48 ساعة (الشكل 2).
وضع علامات النظائر المستقرة على عينات البراز ومياه الصرف الصحي واللعاب
لتحديد الإنتاج النشط للجزيئات المتطايرة من عينة بيولوجية ، تمت إضافة مصدر غذائي مسمى ، 13C glucose أو D2O ، ووسائط لدعم نمو المجتمع الميكروبي. تم تحليل عينة فريدة واحدة من كل نوع من أنواع العينات المختلفة من عينات البراز والصرف الصحي واللعاب في ثلاثة أضعاف. كان هناك المزيد من دمج 13C في جزيئات متطايرة موسومة بالكامل (الشكل 3A-D) مقارنة بالدمج مع الديوتيريوم (الشكل 3E). تم دمج 13C في 2-البيوتانون ، 3-هيدروكسي. 2،3-البيوتانديون. حمض الخليك والفينول لجميع عينات البراز والصرف الصحي واللعاب (الشكل 3 أ).
تم الكشف عن المواد المتطايرة الأخرى المسماة في نوعين أو نوع واحد من العينات. على سبيل المثال ، تم الكشف عن الأسيتون وحمض البيوتانويك وحمض البروبانويك على أنها موسومة في اللعاب ومياه الصرف الصحي (الشكل 3B). وتم إثراء المواد المتطايرة الموسومة، ثنائي ميثيل ثلاثي الكبريتيد وثنائي كبريتيد ثنائي ميثيل، في عينات البراز واللعاب على حد سواء (الشكل 3C). تم إثراء المواد المتطايرة ، 1-بروبانول ، 2-بيوتانون ، البنزوفينون ، الإيثانول ، وميثيل ثيولاسيتات ، فقط في مياه الصرف الصحي (الشكل 3D). تم إثراء المتطاير المسمى ، 2,3-pentanedoine ، في اللعاب (الشكل 3D). تم دمج الديوتيريوم في المواد المتطايرة ، حمض الخليك. البنزالدهيد ، 4-ميثيل ؛ ثنائي ميثيل ثلاثي كبريتيد. والفينول، إما من عينات اللعاب أو مياه الصرف الصحي (الشكل 3E). وبالإضافة إلى المواد المتطايرة الغنية بالنظائر، اكتشفت مواد متطايرة لا تحتوي على نظائر مستقرة مدمجة. على سبيل المثال ، تم اكتشاف مركبات البيرازين ، باستثناء البيرازين ، 2,5-dimethyl ، في عينات البراز ومياه الصرف الصحي واللعاب ، ولكن لم يتم تخصيبها بالكامل ب 13درجة مئوية (الشكل التكميلي S1).
وضع العلامات المستقرة على النظائر لعينات البلغم
تم تنفيذ استراتيجية وسم النظائر المستقرة لتحديد المواد المتطايرة المنتجة بنشاط مع عينات البلغم من سبعة أشخاص بشريين مصابين بالتليف الكيسي. تمت مقارنة المواد المتطايرة في العينة مع تلك التي ظهرت من العينات المستزرعة بملصق نظائر مستقر. تم تحليل كل مكون متطاير في كل عينة مرتين: قبل وبعد فحص النظائر المستقرة باستخدام 13درجة مئوية من الجلوكوز والوسائط. امتدت العينات التي تم جمعها من الأشخاص إلى ثلاث نقاط زمنية أو حالات سريرية مختلفة: خط الأساس والتفاقم والعلاج23. كان للمتطايرات التي تم اكتشافها على أنها موسومة في عينات البلغم المستزرع وفرة نسبية مختلفة مقارنة بالمواد المتطايرة غير المصنفة من عينات البلغم غير المستزرعة. قد تفضل ظروف الاستزراع في تجارب فحص النظائر المستقرة مع البلغم نمو بعض الميكروبات ، مما يؤدي إلى اختلافات في الوفرة النسبية للمواد المتطايرة مقارنة بعينات البلغم غير المستزرعة.
على سبيل المثال ، كان حمض الخليك ، ثنائي ميثيل ثلاثي الكبريتيد ، الأسيتون ، والبروبانال ، 2-methyl أكثر وفرة في عينات البلغم المستزرع مقارنة بعينات البلغم غير المستزرعة (الشكل 4). إن الكشف عن 13 إيثانول يحمل علامة C ، والذي يمكن أن يكون موجودا بكميات متغيرة في هواء غرفة الخلفية ، يوفر دليلا على أن الإيثانول تم إنتاجه بنشاط عن طريق التمثيل الغذائي الميكروبي من 13C glucose. تم شرح مقدار التباين حسب الموضوع كما تم تقييمه بواسطة التحليل التباديلي متعدد المتغيرات للتباين (PERMANOVA) وكان مختلفا أيضا بالنسبة لمجموعتين مختلفتين من البيانات المتقلبة (الجدول 1 والشكل التكميلي S2). بالنسبة للبلغم المستزرع ال 13 المسمى C ، تم شرح 51٪ من التباين من قبل الموضوع ، في حين تم شرح 33٪ من التباين حسب الموضوع من المواد المتطايرة في عينات البلغم غير المستزرعة (الجدول 1). كان تكوين مجتمع الميكروبيوم كما هو محدد بواسطة تسلسل أمبليكون 16S rRNA من الموضوعات السبعة فريدا لكل موضوع (الشكل التكميلي S3) ، وانعكست التوقيعات الفردية أيضا في كل من جزيئات البلغم المتطايرة المستزرعة وغير المستزرعة المكتشفة.
في البلغم المستزرع ، تم الكشف عن 23 مادة متطايرة تم تصنيفها بالكامل ب 13كربونا. كانت المواد المتطايرة الغنية بالنظائر (النشطة) المكتشفة من عينات البلغم مختلفة لكل موضوع. وكانت المواد المتطايرة ذات التخصيب النظيري المكتشفة في عينات البلغم من جميع الأشخاص السبعة هي 2,3-butanedione; حمض الخليك الأسيتون. ثنائي ميثيل ثلاثي كبريتيد. ثاني كبريتيد ، ثنائي ميثيل ؛ والبيرازين، 2,5-ثنائي ميثيل (الشكل 5). وعلى الرغم من اكتشاف تلك المواد المتطايرة في جميع المواضيع، فإن التخصيب النظيري لكل موضوع كان مختلفا. وكانت العينات المأخوذة من الموضوع 7 ذات تخصيب نظائر أعلى من ثنائي ميثيل ثاني كبريتيد مقارنة بالأشخاص الستة الآخرين (الشكل 5 باء). كان الأسيتون أعلى في الموضوعين 4 و 6 (الشكل 5). تم إثراء بعض المواد المتطايرة ب 13درجة مئوية فقط في مواضيع معينة. على سبيل المثال ، تم إثراء 1-butanol و 3-methyl و propanoic acid و 2-methyl فقط في مجموعة فرعية من العينات من الموضوع 2 (الشكل 5). وبالإضافة إلى المواد المتطايرة الغنية بالنظائر، اكتشفت أيضا مواد متطايرة على أنها غير مصنفة من نفس البلغم المستزرع (الشكل التكميلي S4). المواد المتطايرة 2-بيبيريدينون. البنزالدهيد ، 4-ميثيل ؛ البنزوثيازول. حمض البيوتانويك ، 3-ميثيل ؛ سداسي الهكسان. كحول الأيزوبروبيل الفينول. حمض البروبانويك ، 2-ميثيل ؛ و pyrrolo 1,2-apyrazine-1,4-dione, hexahydro تم اكتشافها في عينات البلغم، ولكنها لم تكن غنية بالنظائر (الشكل التكميلي S4).
الشكل 1: مخطط البروتوكول. يتم وضع عينة بيولوجية في قارورة زجاجية وتجميعها باستخدام بطانة الغطاء وقلم Headspace Sorbent Pen. يتم تطبيق فراغ على القارورة حتى يتم الوصول إلى ضغط يبلغ حوالي 30 مم زئبق. تتم إزالة مصدر الفراغ ، ويتم وضع القوارير في وحدة استخراج القلم الماصة حيث يتم إجراء استخراج ثابت بمساعدة الحرارة والإثارة والوقت. بعد الاستخراج ، يتم وضع القوارير على كتلة معدنية باردة لإزالة الماء من مساحة الرأس و HSP. يتم جمع HSPs وتشغيلها عن طريق الامتزاز الحراري على GC-MS. يتم تحليل البيانات باستخدام ChemStation و DExSI و R. الاختصارات: HSP = Headspace Sorbent Pen. GC-MS = كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: خريطة حرارية للثقافات الأحادية والمشتركة. تم اكتشاف المركبات العضوية المتطايرة من الثقافات الأحادية والمشتركة في نقاط زمنية 24 و 48 ساعة. الثقافات المشتركة هي مجموعات من الحروف التي تمثل كل سلالة. تم استخراج جميع العينات لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية مع إثارة 200 دورة في الدقيقة. قيم كثافة الخريطة الحرارية هي درجات العمود Z ، يتم تطبيعها بواسطة الأيض. تم حساب درجة Z من خلال فرق القيمة عن متوسط القيم ، مقسوما على الانحراف المعياري للقيم. تم إنشاء مخطط التشعب باستخدام الخيار cluster_cols في وظيفة pheatmap ل R. يمثل مخطط التغصن تجمعا هرميا يكون فيه للمستقلبات التي تتجمع معا درجات Z أكثر تشابها عبر العينات. الاختصارات: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = تود هيويت وسائل الإعلام (السيطرة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: النسبة المئوية لتحويل 13 درجة مئوية إلى كتلة جزيء متطايرة في عينات البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي خلال 18ساعة من الحضانة والاستخراج في وقت واحد. تم حساب النسبة المئوية للتحويل للمركبات المصنفة بالكامل عن طريق أخذ كتلة المركب المسمى بالكامل (M + N) وقسمته على (M + N) + كتلة الكتلة المتطايرة غير المصنفة (M) ، حيث N هو الحد الأقصى لعدد الكربونات الممكنة (في A-D) أو الهيدروجين (في E) التي يمكن تصنيفها في كل جزيء متطاير. تعتبر المركبات موسومة بالكامل عندما يتم استبدال جميع كربونات المتطايرة ب 13 درجةمئوية. وفي حالة فقدان البيانات، لم يتم الكشف عن المتقلبات. على سبيل المثال ، في (D) ، لم يتم الكشف عن 1-propanol في عينات البراز أو اللعاب. عدد النسخ المتماثلة لكل عينة = 3. (أ) المواد المتطايرة ال 13الموسومة بعلامة C المكتشفة في جميع أنواع العينات (البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي). (ب) المواد المتطايرة ال 13الموسومة بعلامة C التي لم تكتشف إلا في عينات اللعاب ومياه الصرف الصحي. (ج) المواد المتطايرة ال 13الموسومة بعلامة C المكتشفة في عينات البراز واللعاب. (دال) المواد المتطايرة ال 13الموسومة بعلامة C المكتشفة في أحد أنواع العينات الثلاثة المختلفة. (ه) الجزيئات المتطايرة المصنفة بالديوتيريوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: خريطة حرارية ل 13مادة متطايرة تحمل علامة C من البلغم المستزرع والجزيئات المتطايرة المكتشفة من البلغم غير المستزرع. تأتي المواد المتطايرة المسماة من تجارب فحص النظائر المستقرة حيث تمت إضافة 13درجة مئوية من الجلوكوز ووسط تسريب قلب الدماغ إلى البلغم أثناء خطوة الاستخراج لزراعة النمو الميكروبي والتقاط الإنتاج المتطاير النشط. تم الكشف عن الجزيئات المتطايرة غير المصنفة مباشرة من عينات البلغم. كثافة الخريطة الحرارية هي درجات Z كما هو موضح في التعليق على الشكل 2. ومع ذلك ، تم حساب درجات Z داخل كل تجربة لتجارب البلغم المستنبتة وغير المستزرعة. تم إنشاء مخطط غضروفي كما هو موضح في الشكل 2. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: النسبة المئوية لتحويل 13 درجة مئوية إلى كتلة جزيء متطايرة في عينات البلغم من سبعة أشخاص مصابين بالتليف الكيسي خلال 18ساعة من الحضانة والاستخراج في وقت واحد. تم حساب النسبة المئوية للتحويل كما هو موضح في التسمية التوضيحية للشكل 3. يشار إلى المواد المتطايرة غير المكتشفة في العينات من خلال عدم وجود بيانات. N = 1-3. (أ) ال 13مادة متطايرة تحمل علامة C تم اكتشافها عند تحويل أعلى في المائة في غالبية عينات البلغم. (ب) ال 13مادة متطايرة تحمل علامة C تم اكتشافها عند تحويل أقل في المائة في غالبية عينات البلغم. (ج) ال 13مادة متطايرة تحمل علامة C تم اكتشافها عند تحويل أقل في المائة في أقلية من عينات البلغم. الاختصارات: B = خط الأساس; E = التفاقم; T = العلاج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| درجات الحرية | آر2 | قيمة P | ||
| البلغم غير المستزرع | موضوع | 6 | 0.33 | 0.001 |
| الحالة السريرية | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| الموضوع: الحالة السريرية | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| البلغم المستزرع مع 13درجة مئوية من الجلوكوز والوسائط | موضوع | 6 | 0.51 | 0.001 |
| الحالة السريرية | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| الموضوع: الحالة السريرية | 12 | 0.11 | 0.194 |
الجدول 1: التحليل المتغير المتعدد المتحور للتباين (PERMANOVA) لعينات البلغم. تم إنشاء PERMANOVA باستخدام وظيفة أدونيس من الحزمة النباتية في R.
الشكل التكميلي S1: الوفرة النسبية للمواد المتطايرة المصنفة (M+N(max)) وغير المصنفة (M+0) عبر عينات البراز واللعاب ومياه الصرف الصحي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S2: التحجيم غير المتري متعدد الأبعاد للبلغم المستزرع مع فحص النظائر المستقرة والبلغم غير المستزرع. (أ) تم إنشاء NMDS من البلغم المستزرع مع 13C الجلوكوز والوسائط مع k = 3 الأبعاد. كانت قيمة الإجهاد 0.07. (ب) تم إنشاء NMDS من البلغم غير المستزرع مع k = 3 أبعاد. كانت قيمة الإجهاد 0.13. الاختصارات: NMDS = التحجيم متعدد الأبعاد غير المتري ؛ B = خط الأساس؛ E = التفاقم; T = العلاج. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S3: تكوين المجتمع الميكروبي لعينات البلغم من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي. تم تقييمه بواسطة تسلسل أمبليكون 16S rRNA كجزء من دراسة أكبر ، مزيد من المعلومات حول النهج الموجود في Carmody et al. 202019. من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي. كل شريط مكدس هو نقطة زمنية مختلفة. الاختصارات: B = خط الأساس ، E = التفاقم ، T = العلاج. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
الشكل التكميلي S4: الوفرة النسبية للمواد المتطايرة الموسومة (M+N(max)) وغير المصنفة (M+0) عبر عينات البلغم من سبعة أشخاص مصابين بالتليف الكيسي. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتحديد الإنتاج المتطاير في الثقافات المخبرية والعينات المرتبطة بالإنسان ، تم إجراء تحليل متطاير للمزارع الأحادية والمشتركة من P. aeruginosa و S. aureus و A. baumanii وفحص النظائر المستقرة لعينات بيولوجية مختلفة. في تحليل الثقافات الأحادية والمشتركة ، تم الكشف عن المواد المتطايرة عن طريق إجراء استخراج قصير لمدة 1 ساعة عند 70 درجة مئوية. سمح التحليل المتقلب للمزارع الأحادية والمشتركة بمسح المركبات التي تنتجها الأنواع الفردية وأثناء تفاعلاتها مع الأنواع الأخرى. كانت هناك اختلافات في الوفرة النسبية عبر أنواع الثقافة المختلفة والنقاط الزمنية. في تجارب فحص النظائر المستقرة ، شملت العينات البيولوجية البراز واللعاب من الأشخاص الأصحاء ، ومياه الصرف الصحي ، والبلغم من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي. مكن التنميط المستقر للنظائر من تحديد الجزيئات المتطايرة المنتجة بنشاط عن طريق الاستخراج لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية. مكن وقت الاستخراج الطويل مع انخفاض درجة الحرارة من نمو واستقلاب الميكروبات الموجودة في العينات البيولوجية. وأظهرت مقارنة التخصيبات بالجلوكوز 13 درجة مئوية و D2O أن هناك تخصيبا للنظائر النظائرية على نطاق أوسع مع تسمية 13درجة مئوية.
عند استخراج أنواع مختلفة من العينات ، كانت هناك خطوات تحسين أولية تم اتخاذها قبل بدء تشغيل كامل. أولا، اختبار أحجام مختلفة من عينة كتشغيل تجريبي. بالنسبة لبعض أنواع العينات ، البلغم ، على سبيل المثال ، كانت أحجام العينات الصغيرة فقط متاحة. يوصى بالبدء بحجم أقل أو كمية أصغر من العينة أولا ، اعتمادا على نوع العينة وكميات العينات المتاحة. لا تستخرج كمية كبيرة أو الكثير من العينة لأنها يمكن أن تطغى على العمود وتلوث HSP. يمكن أن يكون الحمل الزائد للعمود واضحا عندما تكون القمم في الكروماتوجرام مشبعة أو تظهر في عمليات التشغيل اللاحقة. حدث تلوث HSP إذا كان الترحيل موجودا عند إعادة تشغيل HSP على GC-MS. في تجارب الزراعة الأحادية والمشتركة ، كان 200 ميكرولتر من الثقافة كافيا للكشف عن مجموعة متنوعة من المواد المتطايرة. في تجارب فحص النظائر المستقرة، اعتمادا على نوع العينة، تراوح حجم كل تجربة من 500 ميكرولتر إلى 1 مل. ثانيا، اعتمادا على نوع العينة والمركبات ذات الأهمية، يجب تعديل وقت الاستخراج ودرجة الحرارة وكذلك طرق GC-MS والامتزاز الحراري لتحسين الكشف عن التقلبات. تم تحديد هذه الأساليب لتكون مناسبة لتحليلات الاهتمام ونوع العمود.
بعد تحسين الطريقة ، تتعلق الخطوات الحاسمة في البروتوكول بالخطوات التي تسبق الاستخراج وبعده. أثناء تحضير العينة، وضعت العينات على الجليد حتى لا تفلت المواد المتطايرة الموجودة في العينة. كان من المهم أيضا التأكد من أن ختم الفراغ كان ضيقا ، وأن الغطاء مغلق بإحكام. خلاف ذلك ، سيكون هناك استخراج غير فعال وانخفاض الكشف عن المواد المتطايرة من العينة. يمكن أن تنشأ التسريبات من حلقات O حول بطانة الغطاء أو HSP. للتأكد من أن القارورة كانت تحت الفراغ ، تم استخدام مقياس قبل الاستخراج للتأكد من أن الحلقات O لا تزال تعمل. بالإضافة إلى ذلك ، بعد الاستخراج ، تم وضع عينات على كتلة الجليد بحيث تم سحب المياه من مساحة الرأس لفترة محددة. يمكن أن يؤدي الماء الموجود في العمود إلى تغييرات في أوقات الاحتفاظ وقمع استجابة التصلب العصبي المتعدد ، مما يؤدي إلى نتائج غير كمية. إن القدرة على سحب أي مياه زائدة من HSPs قبل إزالتها من مجموعة الأكمام / القارورة المفرغة ممكنة بسبب طبيعة النظام المغلق لعملية VASE ، والقدرة على استخراج المياه مرة أخرى إلى أبرد بقعة داخل نظام الاستخراج هذا باستخدام لوحة التبريد -80 درجة مئوية.
هناك قيود ومزايا لهذه الأساليب فيما يتعلق بالطرق البديلة. وعند تقييم تجارب الزراعة الأحادية والمشتركة، تم اكتشاف بصمات متقلبة كانت خاصة بميكروب معين أو ثقافة مشتركة. كانت هناك أيضا تغييرات في الوفرة المتقلبة عبر الزمن. أما بالنسبة لتجارب فحص النظائر المستقرة في الأنواع المختلفة من العينات البيولوجية، فإن وسم الديوتيريوم لم يسفر عن العديد من المواد المتطايرة الغنية بالنظائر مثل الجلوكوز 13درجة مئوية. قد يكون التمثيل الغذائي المطلوب لإنتاج المواد المتطايرة الغنية بالنظائر مع الديوتيريوم أكثر محدودية. بالإضافة إلى ذلك ، تمت إضافة الوسائط إلى العينات البيولوجية لتعزيز نمو الميكروبات ، مما قد يؤدي إلى تغييرات في تكوين المجتمع الميكروبي. قد تكون ظروف الاستزراع لتجارب فحص النظائر المستقرة هي اختيار النمو المفضل لبعض الميكروبات في عينة بيولوجية. كان هذا يعارض الاستخراج القصير لمدة ساعة واحدة عند 70 درجة مئوية المصمم للكشف عن المواد المتطايرة في عينة المجتمع قبل أن يبدأ واحد أو عدد قليل من الميكروبات في الاستيلاء على المجتمع. إن تعقيد التركيبات الميكروبية والكيميائية لأنواع عينات البراز ومياه الصرف الصحي واللعاب والبلغم يجعل من الصعب تعيين توقيعات كيميائية محددة لأي أصل ميكروبي أو بشري معين دون تحليلات إضافية مثل التسلسل. وفرت هذه الطريقة استخراجا فراغيا عالي الإنتاجية وخاليا من المذيبات أدى إلى اكتشاف أكثر حساسية للعينات منخفضة الحجم. تراوحت الأحجام المستخدمة في هذه التجارب من 200 ميكرولتر إلى 1 مل من العينات البيولوجية المستزرعة. وفي حالات أخرى (لم تظهر البيانات)، تم استخراج عينات بيولوجية (مثل عينات البلغم والبراز) تصل إلى 15 ميكرولتر أو 10 ميكروغرام.
بالنسبة للتطبيقات المستقبلية للطريقة ، يمكن تحليل مجموعة واسعة من أنواع العينات بأحجام صغيرة أو محدودة. ويمكن استخراج عشرات العينات في وقت واحد، وسيعتمد وقت التشغيل على بارامترات أداة GC-MS المحددة. في حالة فحص النظائر المستقرة ، عندما يقترن بالتسلسل الميتاجينومي ، هناك إمكانية لتحديد الميكروبات المسؤولة عن إنتاج الجزيئات المتطايرة. يمكن تسلسل الميتاجينوم للعينة البيولوجية قبل وبعد الاستخراج مع فحص النظائر المستقرة لتحديد التغيرات في تكوين المجتمع الميكروبي. ومن شأن التسلسل الميتاجينومي أن يسمح بتحديد الجينات المسؤولة عن إنتاج الجزيئات المتطايرة الغنية بالنظير. وفيما يلي بعض الأمثلة على أنواع العينات والنهج التي يمكن استخدامها كمدخلات للبروتوكول المعروض، الذي تم إنشاؤه بالفعل في صناعات مختلفة. نظرا لأن الجزيئات المتطايرة هي مؤشرات تشخيصية مهمة ، يمكن توسيع نطاق استخدام هذا البروتوكول ليشمل المختبرات البيولوجية وإعدادات الرعاية الصحية السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
كان V. L. V و S. J.B. D. موظفين سابقين في Entech Instruments Inc. ، و K. W. هو عضو في برنامج جامعة Entech. ج. ب. و ج. ك. و س. إ. ر. ليس لديهم تضارب في المصالح للإعلان.
Acknowledgments
نشكر هيذر موغان وليندا م. كاليكين على التحرير الدقيق لهذه المخطوطة. تم دعم هذا العمل من قبل NIH NHLBI (منحة 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P.
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
