Summary
Ce protocole décrit l’extraction de composés organiques volatils à partir d’un échantillon biologique avec la méthode d’extraction par sorbant assistée par vide, la chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse à l’aide du rail de préparation d’échantillon Entech et l’analyse des données. Il décrit également la culture d’échantillons biologiques et le sondage d’isotopes stables.
Abstract
Les composés organiques volatils (COV) provenant d’échantillons biologiques ont des origines inconnues. Les COV peuvent provenir de l’hôte ou de différents organismes de la communauté microbienne de l’hôte. Pour démêler l’origine des COV microbiens, une analyse de l’espace de tête volatile de monocultures et co-cultures bactériennes de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, et un sondage d’isotopes stables dans des échantillons biologiques d’excréments, de salive, d’eaux usées et d’expectorations ont été effectués. Des monocultures et des co-cultures ont été utilisées pour identifier la production volatile d’espèces bactériennes individuelles ou en combinaison avec des sondages isotopiques stables pour identifier le métabolisme actif des microbes à partir des échantillons biologiques.
L’extraction par sorbant assistée par vide (VASE) a été utilisée pour extraire les COV. VASE est une méthode d’extraction de l’espace de tête facile à utiliser, commercialisée et sans solvant pour les composés semi-volatils et volatils. Le manque de solvants et les conditions de quasi-vide utilisées lors de l’extraction rendent le développement d’une méthode relativement facile et rapide par rapport à d’autres options d’extraction telles que la tert-butylation et la microextraction en phase solide. Le flux de travail décrit ici a été utilisé pour identifier des signatures volatiles spécifiques provenant de monocultures et de cocultures. De plus, l’analyse du sondage isotopique stable des échantillons biologiques associés à l’homme a permis d’identifier des COV qui étaient produits de manière courante ou unique. Cet article présente le flux de travail général et les considérations expérimentales de VASE en conjonction avec le sondage isotopique stable de cultures microbiennes vivantes.
Introduction
Les composés organiques volatils (COV) sont très prometteurs pour la détection et l’identification bactériennes, car ils sont émis par tous les organismes et différents microbes ont des signatures COV uniques. Les molécules volatiles ont été utilisées comme mesure non invasive pour détecter diverses infections respiratoires, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique1, la tuberculose2 dans l’urine3 et la pneumonie associée au ventilateur4, en plus de distinguer les sujets atteints de mucoviscidose (FK) des sujets témoins sains 5,6. Des signatures volatiles ont même été utilisées pour distinguer des infections pathogènes spécifiques dans la mucoviscidose (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 et S. aureus vs. P. aeruginosa10). Cependant, avec la complexité de tels échantillons biologiques, il est souvent difficile d’identifier la source de COV spécifiques.
Une stratégie pour démêler les profils volatils de plusieurs microbes infectieux consiste à effectuer une analyse de l’espace de tête des micro-organismes en monoculture et en co-culture11. L’analyse de l’espace de tête examine les analytes émis dans l'« espace de tête » au-dessus d’un échantillon plutôt que ceux incorporés dans l’échantillon lui-même. Les métabolites microbiens ont souvent été caractérisés en monoculture en raison de la difficulté de déterminer l’origine des métabolites microbiens dans des échantillons cliniques complexes. En profilant les substances volatiles provenant de monocultures bactériennes, les types de substances volatiles qu’un microbe produit in vitro peuvent représenter une base de référence de son répertoire de substances volatiles. La combinaison de cultures bactériennes, par exemple la création de co-cultures, et le profilage des molécules volatiles produites peuvent révéler les interactions ou l’alimentation croisée entre les bactéries12.
Une autre stratégie pour identifier l’origine microbienne des molécules volatiles consiste à fournir une source de nutriments marquée avec un isotope stable. Les isotopes stables sont des formes naturelles et non radioactives d’atomes avec un nombre différent de neutrons. Dans une stratégie utilisée depuis le début des années 1930 pour tracer le métabolisme actif chez les animaux13, le micro-organisme se nourrit de la source de nutriments marquée et incorpore l’isotope stable dans ses voies métaboliques. Plus récemment, un isotope stable sous forme d’eau lourde (D2O) a été utilisé pour identifier S. aureus métaboliquement actif dans un échantillon clinique d’expectorations de FK14. Dans un autre exemple, 13glucose marqué C ont été utilisés pour démontrer l’alimentation croisée de métabolites entre les isolats cliniques de M. aeruginosa et Rothia mucilaginosa12 .
Avec l’avancement des techniques de spectrométrie de masse, les méthodes de détection des indices volatils sont passées d’observations qualitatives à des mesures plus quantitatives. En utilisant la spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse (GC-MS), le traitement des échantillons biologiques est devenu à la portée de la plupart des laboratoires ou des milieux cliniques. De nombreuses méthodes d’étude des molécules volatiles ont été utilisées pour profiler des échantillons tels que des aliments, des cultures bactériennes et d’autres échantillons biologiques, ainsi que de l’air et de l’eau pour détecter la contamination. Cependant, plusieurs méthodes courantes d’échantillonnage volatil à haut débit nécessitent un solvant et ne sont pas réalisées avec les avantages fournis par l’extraction sous vide. En outre, des volumes ou des quantités plus importants (supérieurs à 0,5 mL) de matériaux échantillonnés sont souvent nécessaires pour l’analyse 15,16,17,18,19, bien que cela soit spécifique au substrat et nécessite une optimisation pour chaque type d’échantillon et méthode.
Ici, l’extraction par sorbant assistée par vide (VASE) suivie d’une désorption thermique sur un GC-MS a été utilisée pour étudier les profils volatils des monocultures et co-cultures bactériennes et identifier les volatiles produits activement avec des échantillons d’isotopes stables provenant d’échantillons d’excréments humains, de salive, d’eaux usées et d’expectorations (Figure 1). Avec des quantités d’échantillons limitées, les COV ont été extraits d’aussi peu que 15 μL d’expectorations. Les expériences de sondage isotopique avec des échantillons humains ont nécessité l’ajout d’une source d’isotopes stables, tels que le glucose 13C, et de milieux pour cultiver la croissance de la communauté microbienne. La production active de substances volatiles a été identifiée comme une molécule plus lourde par GC-MS. L’extraction de molécules volatiles sous vide statique a permis la détection de molécules volatiles avec une sensibilité accrue 20,21,22.
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Protocol
1. Pen absorbant d’espace de tête (HSP) et considérations d’analyse d’échantillons
REMARQUE: Le HSP contenant le sorbant Tenax TA a été sélectionné pour capturer un large éventail de volatiles. Tenax a une affinité plus faible pour l’eau par rapport à d’autres sorbants, ce qui lui permet de piéger plus de COV à partir d’échantillons plus humides. Tenax a également un faible niveau d’impuretés et peut être conditionné pour la réutilisation. Le choix du sorbant a également été effectué en tenant compte de la colonne installée dans le GC-MS (voir le tableau des matériaux).
- Générez des contrôles négatifs en extrayant des supports et/ou des blancs d’échantillons dans les mêmes conditions que celles utilisées pour l’extraction d’échantillons.
- Analyser un PSH vierge (précédemment confirmé comme étant propre et exempt de fond important) sur le GC-MS avant d’analyser les échantillons extraits. Exécuter des blancs entre les types d’échantillons (p. ex., trois réplicats de monoculture bactérienne, blanc, trois réplicats de co-culture bactérienne, blanc, etc.).
- Limitez l’utilisation d’articles de soins personnels parfumés ou la consommation d’aliments malodorants avant l’extraction et l’analyse des échantillons. Idéalement, préparez les échantillons dans une hotte de biosécurité qui n’a pas été nettoyée par de l’alcool ou d’autres nettoyants volatils pendant au moins 30 minutes. Activez le flux d’air dans la hotte de biosécurité pendant 30 à 60 minutes avant la préparation de l’échantillon.
- Conservez les échantillons sur la glace pour limiter les rejets volatils pendant la préparation des échantillons.
2. Préparation de la monoculture et de la co-culture
- Dans le capot de biosécurité, inoculer des cultures d’A. baumannii, de S. aureus et de P. aeruginosa dans les milieux de croissance de Todd Hewitt. Incuber toute la nuit à 37 °C avec une agitation de 200 tr/min.
- Après l’incubation pendant la nuit, effectuer la manipulation de la culture dans la hotte de biosécurité. Diluer chaque culture à une densité optique de 0,05 à 500 nm.
- Mélanger les cocultures à parts égales et pipeter 200 μL de milieu de contrôle, de monoculture ou de co-culture dans chaque puits d’une plaque de 96 puits, et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 24 h. Préparez une deuxième assiette pour une incubation de 48 heures.
- À la fin de la période d’incubation, préparer les échantillons pour l’extraction à la section 4. Pipette des cultures liquides dans des tubes de microcentrifugation et les stocker à -80 °C.
REMARQUE: À ce stade, les échantillons peuvent être stockés à -80 ° C pour être extraits plus tard si nécessaire.
3. Sondage d’isotopes stables dans la préparation d’échantillons biologiques
REMARQUE: Les échantillons d’excréments et de salive ont été donnés par des donneurs anonymes avec l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Californie à Irvine (HS # 2017-3867). Les eaux usées provenaient de San Diego, en Californie. Les échantillons d’expectorations ont été prélevés sur des sujets atteints de mucoviscidose dans le cadre d’une étude plus vaste approuvée par le Conseil d’examen institutionnel de la faculté de médecine de l’Université du Michigan (HUM00037056).
- Effectuer toutes les préparations d’échantillons biologiques dans la hotte de biosécurité.
- Pour préparer des échantillons fécaux, ajouter 1 mL d’eau désionisée à 100 mg de matières fécales dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et vortex pendant 3 min. Placer sur la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
- À 15 μL de mélange fécal et d’eau, ajouter 485 μL de milieu d’infusion cardiaque cérébrale (BHI) avec 20 mM 13C de glucose, ou BHI avec 30% de deutérium (D2O). S’assurer que le volume final de l’échantillon est de 500 μL. Préparer les échantillons en trois exemplaires techniques.
- Pour préparer des échantillons d’eaux usées, ajouter 500 μL d’eaux usées à 500 μL de BHI avec 20 mM 13C de glucose ou de BHI avec 30% D2O pour un volume total de 1 mL. Préparez les échantillons en trois exemplaires. Placer sur la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
- Pour préparer des échantillons de salive, ajouter 50 μL de salive à 500 μL de BHI avec 20 mM 13C de glucose ou de BHI avec 30% D2O pour un volume total de 550 μL. Préparer les échantillons en triple. Placer sur la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
- Pour préparer des échantillons d’expectorations afin de comparer les substances volatiles présentes dans l’échantillon avant et après la culture, effectuez une première extraction avec 15 μL d’expectorations. Préparez les échantillons en trois exemplaires. Placer sur la glace lorsqu’il n’est pas utilisé. Passer à la section 4 pour l’extraction de l’échantillon et extraire pendant 18 h à 37 °C avec une agitation de 200 tr/min.
- Après l’achèvement de la première extraction des échantillons d’expectorations non cultivés, conservez les flacons avec des expectorations. Ajouter 500 μL de BHI avec 20 mM 13C de glucose aux flacons avec expectorations à partir de 3.5.1. Placer sur la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
- Pour préparer des échantillons fécaux, ajouter 1 mL d’eau désionisée à 100 mg de matières fécales dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et vortex pendant 3 min. Placer sur la glace lorsqu’il n’est pas utilisé.
- Passez à la section 4 pour l’extraction de l’échantillon.
4. Extraction d’échantillons
- Placer les flacons vides d’analyse organique volatile (VOA) (20 mL) sur la plaque froide et placer la plaque froide sur de la glace dans la hotte de biosécurité.
- Allumez l’unité d’extraction du stylo sorbant 5600 (SPEU) et ajustez-la à la température souhaitée selon les besoins pour chaque méthode.
REMARQUE: Pour les expériences de sondage d’isotopes stables à 37 ° C, l’atteinte du point de consigne peut prendre jusqu’à 15 minutes. Pour les expériences de monoculture et de co-culture à 70 °C, atteindre le point de consigne peut prendre jusqu’à 60 min. - Prélever des HSP propres qui sont égaux au nombre d’échantillons préparés, y compris les HSP pour les contrôles de milieux ou d’échantillons.
- Étiquetez les flacons VOA de 20 mL en fonction des échantillons, des répliques et des ID HSP au besoin. Utilisez un marqueur qui résiste à l’eau au cas où de la condensation se formerait à l’extérieur du flacon sur la glace.
- À l’intérieur de la hotte de biosécurité, dévissez le capuchon blanc du flacon, pipetez rapidement l’échantillon dans le flacon et assemblez le capuchon noir, la doublure du couvercle et le HSP.
REMARQUE : Les échantillons ne doivent pas entrer en contact avec le PSS, et le volume de l’échantillon dépendra du type d’échantillon. - Replacez le flacon contenant l’échantillon et le HSP sur la plaque froide.
- Répétez les étapes 4.5 et 4.6 pour chaque échantillon. Effectuez ces étapes par échantillon au lieu de toutes en même temps pour éviter le réchauffement de l’échantillon et, par conséquent, la libération prématurée de substances volatiles.
- Une fois que tous les échantillons ont été préparés dans les flacons en verre, effectuez les étapes suivantes à l’extérieur de la hotte de biosécurité sur le banc. Allumez la pompe à vide, placez les flacons sous vide à 30 mmHg et retirez la source de vide.
REMARQUE: Les flacons n’ont pas besoin d’être sur le plateau froid une fois l’application sous vide terminée. - Vérifiez la pression après avoir placé tous les échantillons sous vide à l’aide du manomètre. Si un flacon a une fuite, assurez-vous que le bouchon est bien vissé et que les joints toriques blancs du HSP et des doublures de couvercle sont correctement en place.
REMARQUE: Un joint compromis peut entraîner une diminution de la détection de volatile par rapport à un flacon sous vide. - Placez les flacons dans le SPEU pour un temps et une température optimisés avec agitation à 200 tr/min. Extraire les cultures pendant 1 h à 70 °C. Extraire des expériences de sondage d’isotopes stables avec des échantillons de matières fécales, d’eaux usées, de salive et d’expectorations pendant 18 h à 37 °C.
- Placer la plaque froide à -80 °C pour l’utiliser une fois la période d’extraction terminée.
- Une fois l’extraction terminée, placez les échantillons sur la plaque froide pendant 15 minutes pour extraire la vapeur d’eau du HSP et de l’espace de tête du flacon.
- Transférez les HSP dans leurs manches.
REMARQUE: L’expérience peut être suspendue ici jusqu’à ~ 1 semaine à température ambiante avant de perdre les composés les plus volatils des HSP.
5. Analyser des échantillons sur la chromatographie en phase gazeuse - spectromètre de masse (GC-MS)
- Utilisez les paramètres GC-MS suivants (voir la table des matériaux) : 35 °C avec une cale de 5 min, une rampe de 10 °C/min à 170 °C et une rampe de 15 °C/min à 230 °C avec un rapport de fractionnement de 20:1 et une durée d’exécution totale de 38 min.
- Réglez la méthode de désorption comme suit: 2 min, préchauffage à 70 °C; 2 min 260 °C de désorption; 34 min, cuisson à 260 °C; et 2 min, 70 °C après la cuisson.
- Configurez la séquence d’échantillons et démarrez l’exécution en fonction de l’instrumentation.
- Pour configurer une séquence sur le logiciel Entech, ouvrez le programme. Dans les options à droite du menu déroulant de l’instrument, sélectionnez 5800 | Séquence.
- Observez la table de séquences du logiciel Entech similaire à celle du logiciel GC-MS. Nommez la colonne ID de l’exemple en fonction du numéro de date_vial actuel. Gardez à l’esprit que Name est analogue à Name dans le tableau de séquence GC-MS et que la méthode 5800 détermine le taux de rampe de température, les temps de maintien, etc. (ouvre un menu pour sélectionner la méthode générée à l’étape 5.2).
- Gardez à l’esprit que les colonnes Plateau et Position déterminent où le rail de préparation des échantillons (SPR) ira chercher les HSP.
- Observez les deux plateaux de 30 points chacun à gauche immédiate, disposés en six colonnes de cinq points chacun. La position du plateau qui est la plus à gauche et la plus proche de l’utilisateur (avant) est la position 1, tandis que la position la plus à droite, la plus éloignée est la position 30.
- Notez que ces plateaux sont HSP A ou B, où HSP B est le plateau le plus proche du SPR (plateau le plus interne), et directement derrière HSP B est HSP Blank. Placez les échantillons extraits dans les plateaux et sélectionnez l’endroit de la séquence en conséquence.
- Enregistrez la table de séquences, sélectionnez Exécuter sur le côté gauche, puis Démarrer avec un blanc dans le désorbeur si le HSP vide se trouve dans le désorbeur (indiqué par un HSP marqué par une étiquette jaune).
- Notez que les HSP seront gérés par le SPR pour chaque échantillon de la séquence. Laissez le SPR se réchauffer, puis un message apparaîtra en haut de l’écran pour confirmer si le blanc est dans le désorbeur. Cliquez sur Ignorer pour confirmer que le stylo est là. Autorisez le SPR à exécuter tous les échantillons automatiquement, et la séquence du côté GC-MS enregistrera automatiquement les données dans des fichiers séparés.
6. Analyse des données
- Données de filtre de qualité sur le logiciel GC-MS (Table des matériaux).
- Passez en revue chaque pic sur le chromatogramme et annotez les pics qui correspondent à la bibliothèque du National Institute of Standards & Technology (NIST) (ou à une autre bibliothèque disponible).
- Ajoutez des pics de chromatogramme annotés à la méthode de traitement. Définissez les critères de sélection des pics pour inclure les composés ayant une probabilité supérieure à 75% et assurez-vous que l’alignement de chaque ion d’identification du composé se trouve au centre du pic.
- Pour ajouter une crête à la méthode de traitement, sélectionnez Calibrer | Modifier les | composés Nom | insérer le composé sous Composé standard externe. Ajoutez le nom du composé, le temps de rétention, l’ion cible du signal quantitatif. Ajoutez les trois plus grands sommets. Pour enregistrer, sélectionnez OK | Méthode | Enregistrer.
- Une fois la méthode de processus configurée, passez à Quantitate | Calculer et afficher | QEdit Quant Result.
- Inspectez chaque composé pour vous assurer que les pics correspondent à leurs temps de rétention prévus et sont au-dessus du bruit de fond.
- Une fois QEdit terminé, sélectionnez Quitter | Oui pour enregistrer les QEdits et revenir au chromatogramme principal. Exportez les intégrations de zone en ouvrant le fichier sur le côté gauche. Sélectionner la | de quantité Générer un rapport.
- Pour exporter des fichiers à utiliser dans DExSI, sélectionnez Fichier | Exporter des données au format AIA | Créez un nouveau répertoire et sélectionnez un emplacement pour le fichier ou Utilisez le répertoire existant.
- Observez une nouvelle fenêtre qui s’ouvre pour sélectionner les fichiers à exporter. Déplacez les fichiers vers le côté droit de la fenêtre et cliquez sur Traiter. Attendez quelques secondes à quelques minutes en fonction du nombre de fichiers convertis.
- Corriger l’abondance des isotopes dans DExSI conformément aux instructions du logiciel DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) et effectuer une analyse avec un logiciel ou un programme favori (par exemple, R). Les scripts utilisés pour générer les chiffres sont situés à https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
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Representative Results
Monocultures et co-cultures de S. aureus, P. aeruginosa et A. baumannii
Les monocultures et co-cultures étaient constituées des espèces bactériennes S. aureus, P. aeruginosa et A. baumannii. Ce sont des agents pathogènes opportunistes courants présents dans les plaies humaines et les infections chroniques. Pour identifier les molécules volatiles présentes dans les monocultures et co-cultures, une courte extraction de 1 h a été réalisée à 70 °C avec une agitation de 200 tr/min. À partir des monocultures et co-cultures à des points de temps de 24 et 48 h, 43 molécules volatiles annotées ont été détectées (Figure 2) parmi lesquelles des aldéhydes, des cétones, des alcools, des composés sulfuriques, des hydrocarbures, des acides ou esters carboxyliques et des aromatiques. Il y avait un petit nombre de molécules volatiles qui n’ont été détectées que dans certaines monocultures ou co-cultures à certains moments. Par exemple, l’acétoïne et l’acétate de 3-hydroxy-2-butanone n’ont été détectés que dans les cultures de S. aureus au point de temps de 48 heures (figure 2).
Le 1-propanol 2-méthyl volatil n’a été détecté que dans la co-culture de P. aeruginosa et d’A. baumannii à 48 h (Figure 2). L’acétate d’éthyle était présent dans des co-cultures d’A. baumannii avec S. aureus ou P. aeruginosa à 48 h (Figure 2). Les métabolites heptane, 2,3-diméthyle et pentane, 2-méthyle n’ont été détectés dans la culture d’A. baumannii qu’à 24 h (Figure 2). L’acétaldéhyde et l’éthanol présentaient des abondances relatives plus élevées dans la coculture d’A. baumannii et de S. aureus au point de temps de 24 heures par rapport à 48 h et dans l’une ou l’autre des souches en culture seule (figure 2). Certains des volatiles étaient plus abondants dans les cultures au point de temps de 24 ou 48 heures. Les acides gras à chaîne courte, y compris l’acide acétique, l’acide butanoïque et l’acide propanoïque, étaient à des abondances relatives élevées dans les cultures à 48 h, mais n’ont pas été détectés dans les cultures de 24 heures (figure 2). L’hexane était plus abondant dans le témoin TH à 24 h qu’à 48 h (figure 2).
Marquage isotopique stable d’échantillons de matières fécales, d’eaux usées et de salive
Pour identifier la production active de molécules volatiles à partir d’un échantillon biologique, une source de nutriments marquée, 13C de glucose ou D2O, et des milieux ont été ajoutés pour soutenir la croissance de la communauté microbienne. Un échantillon unique a été analysé à partir de chacun des différents types d’échantillons de matières fécales, d’eaux usées et de salive en trois exemplaires. Il y a eu plus d’incorporation du 13C dans des molécules volatiles entièrement marquées (figure 3A-D) que d’incorporation avec du deutérium (figure 3E). Le 13C a été incorporé dans la 2-butanone, 3-hydroxy; 2,3-butanedione; acide acétique; et le phénol pour tous les échantillons de matières fécales, d’eaux usées et de salive (figure 3A).
Les autres substances volatiles marquées ont été détectées dans deux ou un type d’échantillon. Par exemple, l’acétone, l’acide butanoïque et l’acide propanoïque ont été détectés comme étant marqués dans la salive et les eaux usées (figure 3B). Les substances volatiles marquées, le trisulfure de diméthyle et le diulfure de diméthyle, ont été enrichies dans des échantillons de matières fécales et de salive (figure 3C). Les substances volatiles, le 1-propanol, la 2-butanone, la benzophénone, l’éthanol et le thiolacétate de méthyle, n’étaient enrichies que dans les eaux usées (figure 3D). Le volatile marqué, la 2,3-pentanedoine, a été enrichi en salive (Figure 3D). Le deutérium a été incorporé dans les substances volatiles, l’acide acétique; benzaldéhyde, 4-méthyle; trisulfure de diméthyle; et le phénol, provenant d’échantillons de salive ou d’eaux usées (figure 3E). En plus des substances volatiles enrichies en isotopes, il y avait des substances volatiles détectées qui ne contenaient pas d’isotopes stables incorporés. Par exemple, des composés de pyrazine, à l’exception de la pyrazine, le 2,5-diméthyle, ont été détectés dans des échantillons de matières fécales, d’eaux usées et de salive, mais n’ont pas été entièrement enrichis en 13°C (figure supplémentaire S1).
Marquage isotopique stable d’échantillons d’expectorations
La stratégie de marquage des isotopes stables a été mise en œuvre pour identifier les substances volatiles produites activement avec des échantillons d’expectorations de sept sujets humains atteints de fibrose kystique. Les substances volatiles de l’échantillon ont été comparées à celles qui ont émergé d’échantillons cultivés avec une étiquette isotopique stable. Chaque composant volatil de chaque échantillon a été analysé deux fois : avant et après sondage isotopique stable avec du glucose et des milieux à 13C. Les échantillons prélevés sur les sujets couvraient trois points temporels ou états cliniques différents : la ligne de base, l’exacerbation et le traitement23. Les substances volatiles détectées comme marquées dans les échantillons d’expectorations cultivées avaient des abondances relatives différentes de celles des volatiles non marqués des échantillons d’expectorations non cultivées. Les conditions de culture dans les expériences de sondage d’isotopes stables avec des expectorations peuvent favoriser la croissance de certains microbes, entraînant des différences dans les abondances relatives de volatiles par rapport aux échantillons d’expectorations non cultivés.
Par exemple, l’acide acétique, le trisulfure de diméthyle, l’acétone et le propanal, le 2-méthyle étaient plus abondants dans les échantillons d’expectorations cultivées que dans les échantillons d’expectorations non cultivées (figure 4). La détection de 13éthanol marqué C, qui peut être présent en quantités variables dans l’air ambiant de fond, fournit des preuves que l’éthanol a été activement produit par le métabolisme microbien à partir du glucose 13C. L’ampleur de la variation a été expliquée par sujet telle qu’évaluée par l’analyse permutationnelle multivariée de la variance (PERMANOVA) et était également différente pour les deux différents ensembles de données volatiles (tableau 1 et figure supplémentaire S2). Pour les 13expectorations cultivées marquées C, 51 % de la variation a été expliquée par le sujet, tandis que 33 % de la variation a été expliquée par le sujet à partir des substances volatiles dans les échantillons d’expectorations non cultivés (tableau 1). La composition de la communauté du microbiome, déterminée par le séquençage de l’amplicon de l’ARNr 16S chez les sept sujets, était unique à chaque sujet (figure supplémentaire S3), et les signatures individuelles ont également été reflétées dans les molécules volatiles d’expectorations cultivées et non cultivées détectées.
Dans les expectorations cultivées, 23 substances volatiles ont été détectées qui ont été entièrement marquées avec 13carbones. Les volatiles enrichis en isotopes (actifs) détectés dans les échantillons d’expectorations étaient différents pour chaque sujet. Les substances volatiles enrichies en isotopes détectées dans les échantillons d’expectorations des sept sujets étaient la 2,3-butanedione; acide acétique; acétone; trisulfure de diméthyle; disulfure, diméthyle; et la pyrazine, 2,5-diméthyle (figure 5). Bien que ces substances volatiles aient été détectées chez tous les sujets, l’enrichissement en isotopes pour chaque sujet variait. Les échantillons du sujet 7 présentaient un enrichissement isotopique plus élevé en disulfure de diméthyle que les six autres sujets (figure 5B). L’acétone était plus élevée chez les sujets 4 et 6 (figure 5). Certains volatiles ont été enrichis de 13C seulement chez certains sujets. Par exemple, le 1-butanol, le 3-méthyle et l’acide propanoïque, le 2-méthyle n’ont été enrichis que dans un sous-ensemble d’échantillons du sujet 2 (figure 5). En plus des substances volatiles enrichies en isotopes, des substances volatiles ont également été détectées comme non marquées provenant des mêmes expectorations cultivées (figure supplémentaire S4). Volatiles 2-pipéridinone; benzaldéhyde, 4-méthyle; benzothiazole; acide butanoïque, 3-méthyle; hexanal; hexane; alcool isopropylique; phénol; acide propanoïque, 2-méthyle; et pyrrolo 1,2-apyrazine-1,4-dione, hexahydro ont été détectés dans les échantillons d’expectorations, mais n’ont pas été enrichis en isotopes (figure supplémentaire S4).
Figure 1 : Schéma du protocole. Un échantillon biologique est placé dans un flacon en verre et assemblé avec la doublure du couvercle et le stylo sorbant Headspace. Un vide est appliqué sur le flacon jusqu’à ce qu’une pression d’environ 30 mmHg soit atteinte. La source de vide est retirée et les flacons sont placés dans l’unité d’extraction du stylo absorbant où une extraction statique est effectuée à l’aide de la chaleur, de l’agitation et du temps. Après l’extraction, les flacons sont placés sur un bloc métallique froid pour éliminer l’eau de l’espace de tête et du HSP. Les HSP sont collectés et exécutés par désorption thermique sur le GC-MS. Les données sont analysées avec ChemStation, DExSI et R. Abréviations: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Carte thermique des monocultures et des cocultures. COV détectés à partir de monocultures et de cocultures à des points de temps de 24 et 48 heures. Les co-cultures sont les combinaisons des lettres représentant chaque souche. Tous les échantillons ont été extraits pendant 1 h à 70 °C avec une agitation de 200 tr/min. Les valeurs d’intensité de la carte thermique sont des scores Z de colonne, normalisés par métabolite. Le score Z a été calculé par la différence de valeur par rapport à la moyenne des valeurs, divisée par l’écart-type des valeurs. Le dendrogramme a été généré avec l’option cluster_cols dans la fonction pheatmap de R. Le dendrogramme représente un regroupement hiérarchique dans lequel les métabolites qui se regroupent ont des scores Z plus similaires sur les échantillons. Abréviations: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (contrôle). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Pourcentage de conversion de 13° C en masse moléculaire volatile dans des échantillons de matières fécales, de salive et d’eaux usées pendant 18 heures d’incubation et d’extraction simultanées. La conversion en % a été calculée pour les composés entièrement marqués en prenant la masse du composé entièrement marqué (M + N) et en la divisant par (M + N) + la masse de la masse volatile non marquée (M), où N est le nombre maximal de carbones possibles (en A-D) ou d’hydrogènes (en E) qui peuvent être marqués dans chaque molécule volatile. Les composés sont considérés comme entièrement étiquetés lorsque tous les carbones du volatile sont remplacés par du 13° C. Lorsque des données sont manquantes, le volatile n’a pas été détecté. Par exemple, en (D), le 1-propanol n’a pas été détecté dans les échantillons de matières fécales ou de salive. Nombre de réplications par échantillon = 3. (A) Les 13substances volatiles marquées C détectées dans tous les types d’échantillons (matières fécales, salive et eaux usées). (B) Les 13substances volatiles marquées C n’ont été détectées que dans des échantillons de salive et d’eaux usées. (C) Les 13substances volatiles marquées C détectées dans des échantillons de matières fécales et de salive. (D) Les 13substances volatiles marquées C détectées dans l’un des trois types d’échantillons différents. (E) Les molécules volatiles marquées au deutérium. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Carte thermique de 13volatiles marqués C provenant d’expectorations cultivées et de molécules volatiles détectées à partir d’expectorations non cultivées. Les substances volatiles marquées proviennent d’expériences de sondage d’isotopes stables où du glucose 13C et du milieu de perfusion cardiaque cérébrale ont été ajoutés aux expectorations pendant l’étape d’extraction pour cultiver la croissance microbienne et capturer la production volatile active. Les molécules volatiles non marquées ont été détectées directement à partir d’échantillons d’expectorations. Les intensités de la carte thermique sont des scores Z comme décrit dans la légende de la figure 2. Cependant, les scores Z ont été calculés dans chaque expérience pour les expériences sur les expectorations cultivées et non cultivées. Le dendrogramme a été généré comme décrit à la figure 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Pourcentage de conversion de 13C en masse moléculaire volatile dans des échantillons d’expectorations de sept sujets atteints de mucoviscidose pendant 18 h d’incubation et d’extraction simultanées. La conversion en % a été calculée comme décrit dans la légende de la figure 3. Les substances volatiles non détectées dans les échantillons sont indiquées par l’absence de données. N = 1-3. (A) Les 13substances volatiles marquées C ont été détectées à un pourcentage de conversion plus élevé dans la majorité des échantillons d’expectorations. (B) Les 13substances volatiles marquées C ont été détectées à un pourcentage de conversion inférieur dans la majorité des échantillons d’expectorations. (C) Les 13substances volatiles marquées C ont été détectées à un pourcentage de conversion inférieur dans une minorité d’échantillons d’expectorations. Abréviations : B = niveau de référence; E = exacerbation; T = traitement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Degrés de liberté | R2 | Valeur P | ||
| Expectorations incultes | Objet | 6 | 0.33 | 0.001 |
| État clinique | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Objet: État clinique | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Expectorations cultivées avec 13C de glucose et milieu | Objet | 6 | 0.51 | 0.001 |
| État clinique | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Objet: état clinique | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tableau 1 : Analyse multivariée permutée de la variance (PERMANOVA) des échantillons d’expectorations. Le PERMANOVA a été généré en utilisant la fonction adonis de l’emballage végétalien dans R.
Figure supplémentaire S1 : Abondance relative des substances volatiles marquées (M+N(max)) et non marquées (M+0) dans les échantillons de matières fécales, de salive et d’eaux usées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S2 : Mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique des expectorations cultivées avec sondage isotopique stable et expectorations non cultivées. (A) Le NMDS des expectorations cultivées avec 13C de glucose et de milieu a été généré avec k = 3 dimensions. La valeur de contrainte était de 0,07. (B) Le NMDS des expectorations incultes a été généré avec k = 3 dimensions. La valeur de contrainte était de 0,13. Abréviations : NMDS = mise à l’échelle multidimensionnelle non métrique ; B = niveau de référence; E = exacerbation; T = traitement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S3 : Composition de la communauté microbienne des échantillons d’expectorations de sujets atteints de mucoviscidose. Évalué par séquençage de l’amplicon de l’ARNr 16S dans le cadre d’une étude plus vaste, d’autres informations sur l’approche trouvées dans Carmody et al. 202019. de sujets atteints de mucoviscidose. Chaque barre empilée est un point temporel différent. Abréviations : B = ligne de base, E = exacerbation, T = traitement. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Figure supplémentaire S4 : Les abondances relatives des substances volatiles marquées (M+N(max)) et non marquées (M+0) dans les échantillons d’expectorations de sept sujets atteints de mucoviscidose. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Pour identifier la production volatile dans les cultures in vitro et les échantillons associés à l’homme, une analyse volatile des monocultures et co-cultures de P. aeruginosa, S. aureus et A. baumanii et un sondage isotopique stable de différents échantillons biologiques ont été effectués. Dans l’analyse des monocultures et co-cultures, les volatiles ont été détectés en effectuant une courte extraction pendant 1 h à 70 °C. L’analyse volatile des monocultures et des co-cultures a permis d’étudier les composés produits à la fois par des espèces individuelles et lors de leurs interactions avec d’autres espèces. Il y avait des différences dans les abondances relatives entre les différents types de culture et les différents points temporels. Dans les expériences de sondage d’isotopes stables, les échantillons biologiques comprenaient des excréments et de la salive de sujets sains, des eaux usées et des expectorations de sujets atteints de mucoviscidose. Le profilage isotopique stable a permis d’identifier des molécules volatiles produites activement en extrayant pendant 18 h à 37 °C. Le long temps d’extraction avec une température plus basse a permis la croissance et le métabolisme des microbes présents dans les échantillons biologiques. La comparaison des enrichissements en glucose 13C et enD2O a montré qu’il y avait un enrichissement isotopique plus étendu avec le 13C marqué.
Lors de l’extraction de différents types d’échantillons, des étapes d’optimisation initiales ont été prises avant de commencer une exécution complète. Tout d’abord, testez différents volumes d’un échantillon à titre d’essai. Pour certains types d’échantillons, les expectorations, par exemple, seuls de petits volumes d’échantillons étaient disponibles. Il est recommandé de commencer par un volume inférieur ou une plus petite quantité d’échantillon d’abord, selon le type d’échantillon et les quantités d’échantillon disponibles. N’extrayez pas un grand volume ou trop de l’échantillon, car cela pourrait submerger la colonne et contaminer le HSP. La surcharge de colonne peut être évidente lorsque les pics du chromatogramme sont saturés ou apparaissent lors d’exécutions ultérieures. Une contamination par le PSS s’est produite si le report est présent lorsque le PSS est réexécuté sur le GC-MS. Dans les expériences de monoculture et de co-culture, 200 μL de culture étaient suffisants pour détecter une variété de substances volatiles. Dans les expériences de sondage d’isotopes stables, selon le type d’échantillon, le volume de chaque expérience variait de 500 μL à 1 mL. Deuxièmement, en fonction du type d’échantillon et des composés d’intérêt, le temps et la température d’extraction ainsi que les méthodes DE GC-MS et de désorption thermique devront être ajustés pour optimiser la détection des volatiles. Ces méthodes ont été jugées appropriées pour les analytes d’intérêt et le type de colonne.
Après avoir optimisé la méthode, les étapes critiques du protocole concernaient les étapes précédant et suivant l’extraction. Pendant la préparation de l’échantillon, les échantillons ont été placés sur de la glace afin que les substances volatiles présentes dans l’échantillon ne s’échappent pas. Il était également important de s’assurer que le joint sous vide était étanche et que le couvercle était bien fermé. Sinon, il y aurait une extraction inefficace et une diminution de la détection des substances volatiles de l’échantillon. Des fuites peuvent provenir des joints toriques autour de la doublure du couvercle ou du HSP. Pour s’assurer que le flacon était sous vide, une jauge a été utilisée avant l’extraction pour s’assurer que les joints toriques étaient toujours fonctionnels. De plus, après l’extraction, des échantillons ont été placés sur le bloc de glace afin que l’eau soit extraite de l’espace de tête pendant une période déterminée. L’eau dans la colonne pourrait entraîner des changements dans les temps de rétention et la suppression de la réponse de la SEP, conduisant ainsi à des résultats non quantitatifs. La possibilité d’extraire tout excès d’eau des HSP avant de le retirer de l’ensemble manchon/flacon sous vide est possible en raison de la nature fermée du processus VASE et de la capacité d’extraire l’eau vers l’endroit le plus froid de ce système d’extraction à l’aide de la plaque froide de -80 °C.
Ces méthodes présentent à la fois des limites et des avantages par rapport aux méthodes alternatives. En évaluant les expériences de monoculture et de co-culture, il y a eu des signatures volatiles détectées qui étaient spécifiques à un microbe ou à une co-culture particulière. Il y a également eu des changements dans les abondances volatiles au fil du temps. En ce qui concerne les expériences de sondage des isotopes stables dans les différents types d’échantillons biologiques, le marquage du deutérium n’a pas donné autant de volatiles enrichis en isotopes que le glucose 13C. Le métabolisme nécessaire pour produire des substances volatiles enrichies en isotopes avec du deutérium peut être plus limité. De plus, des milieux ont été ajoutés aux échantillons biologiques pour améliorer la croissance microbienne, ce qui peut entraîner des changements dans la composition de la communauté microbienne. Les conditions de culture des expériences de sondage d’isotopes stables peuvent être sélectionnées pour la croissance favorisée de certains microbes dans un échantillon biologique. Cela s’opposait à l’extraction courte d’une heure à 70 °C conçue pour détecter les substances volatiles dans l’échantillon de la communauté avant qu’un ou quelques microbes ne commencent à envahir la communauté. La complexité des compositions microbiennes et chimiques des types d’échantillons fécaux, d’eaux usées, de salive et d’expectorations rend difficile l’attribution de signatures chimiques spécifiques à une origine microbienne ou humaine donnée sans analyses supplémentaires telles que le séquençage. Cette méthode a fourni une extraction sous vide à haut débit et sans solvant qui a conduit à une détection plus sensible des échantillons à faible volume. Les volumes utilisés pour ces expériences variaient de 200 μL à 1 mL d’échantillons biologiques cultivés. Dans d’autres cas (données non présentées), des échantillons biologiques (p. ex. expectorations et excréments) aussi bas que 15 μL ou 10 μg ont été extraits.
Pour les applications futures de la méthode, un large éventail de types d’échantillons pourrait être analysé avec des volumes faibles ou limités. Des dizaines d’échantillons pourraient être extraits simultanément, et la durée d’exécution dépendrait des paramètres de l’instrument GC-MS spécifique. Dans le cas du sondage isotopique stable, lorsqu’il est couplé au séquençage métagénomique, il est possible d’identifier les microbes responsables de la production des molécules volatiles. Le métagénome de l’échantillon biologique pourrait être séquencé avant et après l’extraction avec un sondage isotopique stable pour identifier les changements dans la composition de la communauté microbienne. Le séquençage métagénomique permettrait d’identifier les gènes responsables de la production des molécules volatiles enrichies en isotopes. Voici quelques exemples d’exemples d’exemples de types et d’approches qui pourraient être utilisés comme intrants pour le protocole présenté, qui a déjà été établi dans différentes industries. Étant donné que les molécules volatiles sont des indicateurs diagnostiques importants, l’utilisation de ce protocole pourrait être étendue aux laboratoires biologiques et aux établissements de soins de santé cliniques.
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Disclosures
V. L. V et S. J.B. D. étaient d’anciens employés d’Entech Instruments Inc., et K. W. est membre du programme universitaire d’Entech. J. P., J. K. et C. I. R. n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Nous remercions Heather Maughan et Linda M. Kalikin pour l’édition minutieuse de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH NHLBI (subvention 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
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