Summary
Denne protokol beskriver ekstraktionen af flygtige organiske forbindelser fra en biologisk prøve med den vakuumassisterede sorbentekstraktionsmetode, gaskromatografi kombineret med massespektrometri ved hjælp af Entech Sample Preparation Rail og dataanalyse. Det beskriver også dyrkning af biologiske prøver og stabil isotopsondering.
Abstract
Flygtige organiske forbindelser (VOC'er) fra biologiske prøver har ukendt oprindelse. VOC'er kan stamme fra værten eller forskellige organismer fra værtslandets mikrobielle samfund. For at adskille oprindelsen af mikrobielle VOC'er blev der udført flygtig headspace-analyse af bakterielle mono- og co-kulturer af Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa og Acinetobacter baumannii og stabil isotopundersøgelse i biologiske prøver af afføring, spyt, spildevand og sputum. Mono- og co-kulturer blev brugt til at identificere flygtig produktion fra individuelle bakteriearter eller i kombination med stabil isotop-sondering for at identificere mikrobernes aktive metabolisme fra de biologiske prøver.
Vakuumassisteret sorbentekstraktion (VASE) blev anvendt til at udvinde VOC'erne. VASE er en brugervenlig, kommercialiseret, opløsningsmiddelfri headspace-ekstraktionsmetode til halvflygtelige og flygtige forbindelser. Manglen på opløsningsmidler og de nærvakuumbetingelser, der anvendes under ekstraktionen, gør det relativt let og hurtigt at udvikle en metode sammenlignet med andre ekstraktionsmuligheder såsom tert-butylering og mikroekstraktion i fast fase. Den arbejdsgang, der er beskrevet her, blev brugt til at identificere specifikke flygtige signaturer fra mono- og co-kulturer. Desuden identificerede analyse af den stabile isotopsondering af humane associerede biologiske prøver VOC'er, der enten var almindeligt eller unikt produceret. Dette papir præsenterer den generelle arbejdsgang og eksperimentelle overvejelser af VASE i forbindelse med stabil isotop sondering af levende mikrobielle kulturer.
Introduction
Flygtige organiske forbindelser (VOC'er) har et stort løfte om bakteriel påvisning og identifikation, fordi de udsendes fra alle organismer, og forskellige mikrober har unikke VOC-signaturer. Flygtige molekyler er blevet anvendt som en ikke-invasiv måling til påvisning af forskellige luftvejsinfektioner, herunder kronisk obstruktiv lungesygdom1, tuberkulose2 i urin3 og respiratorassocieret lungebetændelse4, ud over at skelne forsøgspersoner med cystisk fibrose (CF) fra raske kontrolpersoner 5,6. Flygtige signaturer er endda blevet brugt til at skelne mellem specifikke patogeninfektioner i CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 og S. aureus vs. P. aeruginosa10). Men med kompleksiteten af sådanne biologiske prøver er det ofte vanskeligt at lokalisere kilden til specifikke VOC'er.
En strategi til at adskille de flygtige profiler fra flere inficerende mikrober er at udføre headspace-analyse af mikroorganismer i både mono- og co-kultur11. Headspace-analyse undersøger de analytter, der udsendes i "headspace" over en prøve i stedet for dem, der er indlejret i selve prøven. Mikrobielle metabolitter er ofte blevet karakteriseret i monokulturer på grund af vanskeligheden ved at bestemme oprindelsen af mikrobielle metabolitter i komplekse kliniske prøver. Ved at profilere flygtige stoffer fra bakterielle monokulturer kan de typer flygtige stoffer, som en mikrobe producerer in vitro , udgøre en basislinje for dens flygtige repertoire. Kombination af bakteriekulturer, f.eks. skabelse af co-kulturer og profilering af de flygtige molekyler, der produceres, kan afsløre interaktionerne eller krydsfodring mellem bakterierne12.
En anden strategi til identifikation af flygtige molekylers mikrobielle oprindelse er at tilvejebringe en næringskilde, der er mærket med en stabil isotop. Stabile isotoper er naturligt forekommende, ikke-radioaktive former for atomer med et andet antal neutroner. I en strategi, der er blevet brugt siden begyndelsen af 1930'erne til at spore aktiv metabolisme hos dyr13, føder mikroorganismen ud af den mærkede næringskilde og inkorporerer den stabile isotop i sine metaboliske veje. For nylig er en stabil isotop i form af tungt vand (D2O) blevet anvendt til at identificere metabolisk aktiv S. aureus i en klinisk CF-sputumprøve14. I et andet eksempel er 13C-mærket glucose blevet anvendt til at demonstrere krydsfodring af metabolitter mellem CF kliniske isolater af P. aeruginosa og Rothia mucilaginosa12 .
Med udviklingen af massespektrometriteknikker har metoder til påvisning af flygtige signaler flyttet sig fra kvalitative observationer til mere kvantitative målinger. Ved at anvende gaskromatografi massespektrometri (GC-MS) er behandling af biologiske prøver blevet inden for rækkevidde for de fleste laboratorie- eller kliniske indstillinger. Mange metoder til at undersøge flygtige molekyler er blevet brugt til at profilere prøver som mad, bakteriekulturer og andre biologiske prøver og luft og vand til at detektere forurening. Imidlertid kræver flere almindelige metoder til flygtig prøveudtagning med høj gennemstrømning opløsningsmiddel og udføres ikke med de fordele, der tilvejebringes ved vakuumekstraktion. Derudover kræves der ofte større mængder eller mængder (større end 0,5 ml) af udtagne materialer til analyse 15,16,17,18,19, selv om dette er substratspecifikt og kræver optimering for hver prøvetype og metode.
Her blev vakuumassisteret sorbentekstraktion (VASE) efterfulgt af termisk desorption på en GC-MS anvendt til at undersøge de flygtige profiler af bakterielle mono- og co-kulturer og identificere aktivt producerede flygtige stoffer med stabil isotopundersøgelse fra humane afføring, spyt, spildevand og sputumprøver (figur 1). Med begrænsede prøvemængder blev VOC'er ekstraheret fra så lidt som 15 μL sputum. Isotopundersøgelsesforsøg med humane prøver krævede tilsætning af en stabil isotopkilde, såsom 13C glucose, og medier til at dyrke væksten i det mikrobielle samfund. Den aktive produktion af flygtige stoffer blev identificeret som et tungere molekyle af GC-MS. Ekstraktion af flygtige molekyler under et statisk vakuum muliggjorde påvisning af flygtige molekyler med øget følsomhed 20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Headspace Sorbent Pen (HSP) og overvejelser om prøveanalyse
BEMÆRK: HSP'en, der indeholder sorbent tenax TA, blev valgt til at fange en bred vifte af flygtige stoffer. Tenax har en lavere affinitet for vand sammenlignet med andre sorbenter, hvilket gør det muligt at fange flere VOC'er fra prøver med højere fugtighed. Tenax har også et lavt niveau af urenheder og kan konditioneres til genbrug. Sorbentvalg blev også foretaget i betragtning med kolonnen installeret i GC-MS (se materialetabellen).
- Generer negative kontroller ved at udtrække medie- og/eller prøveemner med de samme betingelser, der anvendes til prøveekstraktion.
- Analyser en tom HSP (tidligere bekræftet at være ren og fri for betydelig baggrund) på GC-MS, før du analyserer ekstraherede prøver. Kør emner mellem prøvetyper (f.eks. tre replikater af bakteriemonokultur, blank, tre replikater af bakteriesamkultur, blank osv.).
- Begræns brugen af duftende personlige plejeartikler eller forbrug af ildelugtende fødevarer inden prøveekstraktion og analyse. Ideelt set skal du forberede prøver i en biosikkerhedshætte, der ikke er blevet renset med alkohol eller andre flygtige rengøringsmidler i mindst 30 minutter. Tænd for luftstrømmen i biosikkerhedshætten i 30-60 minutter før prøveforberedelse.
- Opbevar prøver på is for at begrænse flygtig frigivelse under prøveforberedelsen.
2. Forberedelse af mono- og samkultur
- I biosikkerhedshætten podes kulturer af A. baumannii, S. aureus og P. aeruginosa i Todd Hewitt vækstmedier. Inkuber natten over ved 37 °C med 200 o/min omrøring.
- Efter inkubation natten over skal du udføre kulturhåndtering i biosikkerhedshætten. Fortynd hver kultur til optisk densitet 0,05 ved 500 nm.
- Co-kulturer blandes i lige store dele og pipettes 200 μL kontrolmedier, mono- eller samkultur i hver brønd på en plade med 96 brønde, og der anbrings i 37 °C-inkubator i 24 timer. Forbered en anden plade til en 48-timers inkubation.
- Ved inkubationsperiodens udløb udredes prøver til ekstraktion i punkt 4. Flydende pipetter i mikrocentrifugerør og opbevares ved -80 °C.
BEMÆRK: På dette tidspunkt kan prøver opbevares ved -80 °C for at ekstrahere senere, hvis det er nødvendigt.
3. Stabil isotop sondering i biologiske prøver forberedelse
BEMÆRK: Afføring og spytprøver blev doneret fra anonyme donorer med godkendelse fra University of California Irvine Institutional Review Board (HS # 2017-3867). Spildevandet kom fra San Diego, Californien. Sputumprøverne blev indsamlet fra personer med cystisk fibrose som en del af en større undersøgelse godkendt af University of Michigan Medical School Institutional Review Board (HUM00037056).
- Udfør alle biologiske prøvepræparater i biosikkerhedshætten.
- For at forberede fækale prøver tilsættes 1 ml deioniseret vand til 100 mg afføring i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og hvirvel i 3 minutter. Læg på is, når den ikke er i brug.
- Til 15 μL fækal og vandblanding tilsættes 485 μL Brain Heart Infusion (BHI) medium med 20 mM 13C glucose eller BHI med 30% deuterium (D2O). Sørg for, at prøvens endelige volumen er 500 μL. Forbered prøver i tekniske triplicater.
- For at forberede spildevandsprøver tilsættes 500 μL spildevand til 500 μL BHI med 20 mM 13C glucose eller BHI med 30%D2O for et samlet volumen på 1 ml. Forbered prøver i tre eksemplarer. Læg på is, når den ikke er i brug.
- For at forberede spytprøver tilsættes 50 μL spyt til 500 μL BHI med 20 mM 13C glucose eller BHI med 30%D2O for et samlet volumen på 550 μL. Forbered prøver i tre eksemplarer. Læg på is, når den ikke er i brug.
- For at forberede sputumprøver til sammenligning af de flygtige stoffer, der er til stede i prøven før og efter dyrkning, udføres en første ekstraktion med 15 μL sputum. Forbered prøver i tre eksemplarer. Læg på is, når den ikke er i brug. Fortsæt til punkt 4 for prøveekstraktion og ekstraktion i 18 timer ved 37 °C med 200 o / min omrøring.
- Efter afslutningen af den første ekstraktion af de ukultiverede sputumprøver, gem hætteglassene med sputum. Tilsæt 500 μL BHI med 20 mM 13C glucose til hætteglassene med sputum fra 3.5.1. Læg på is, når den ikke er i brug.
- For at forberede fækale prøver tilsættes 1 ml deioniseret vand til 100 mg afføring i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og hvirvel i 3 minutter. Læg på is, når den ikke er i brug.
- Fortsæt til punkt 4 for prøveudtrækning.
4. Prøveekstraktion
- Anbring tomme flygtige organiske analysehætteglas (VOA) (20 ml) på den kolde plade, og læg den kolde plade på is i biosikkerhedshætten.
- Tænd for 5600 sorbent pen-udsugningsenheden (SPEU), og juster til den ønskede temperatur efter behov for hver metode.
BEMÆRK: For stabile isotopsonderingsforsøg ved 37 °C kan det tage op til 15 minutter at nå setpunktet. For mono- og co-kulturforsøg ved 70 °C kan det tage op til 60 minutter at nå setpunktet. - Indsaml rene HSP'er, der er lig med antallet af forberedte prøver, herunder HSP'er til medie- eller prøvekontroller.
- Mærk 20 ml VOA-hætteglas i henhold til prøver, replikater og HSP-id'er efter behov. Brug en markør, der modstår vand, hvis der dannes kondens på ydersiden af hætteglasset, mens du er på is.
- Inde i biosikkerhedshætten skrues den hvide hætte på hætteglasset af, pipetteres prøven hurtigt i hætteglasset, og saml den sorte hætte, lågforingen og HSP.
BEMÆRK: Prøver bør ikke komme i kontakt med HSP, og prøvevolumen afhænger af prøvetype. - Anbring hætteglasset, der indeholder prøven og HSP, tilbage på den kolde plade.
- Gentag trin 4.5 og 4.6 for hver prøve. Udfør disse trin pr. prøve i stedet for alle på én gang for at forhindre prøveopvarmning og dermed for tidlig flygtig frigivelse.
- Når alle prøver er fremstillet i glashætteglassene, udføres følgende trin uden for biosikkerhedshætten på bænken. Tænd vakuumpumpen, anbring hætteglassene under vakuum til 30 mmHg, og fjern vakuumkilden.
BEMÆRK: Hætteglassene behøver ikke at være på kølebakken, når vakuumpåføringen er afsluttet. - Dobbelttjek trykket efter at have placeret alle prøver under vakuum ved hjælp af manometeret. Hvis et hætteglas har en lækage, skal du sørge for, at hætten er skruet godt på, og at de hvide O-ringe på HSP og lågforinger er korrekt på plads.
BEMÆRK: En kompromitteret tætning kan resultere i nedsat flygtig detektion sammenlignet med et hætteglas under vakuum. - Anbring hætteglas i SPEU'en for den optimerede tid og temperatur med omrøring ved 200 o / min. Uddrag kulturer i 1 time ved 70 °C. Uddrag stabile isotopundersøgelsesforsøg med fækale, spildevand, spyt og sputumprøver i 18 timer ved 37 ° C.
- Den kolde plade anbrings ved -80 °C til brug, når ekstraktionsperioden er afsluttet.
- Når ekstraktionen er afsluttet, anbringes prøverne på den kolde plade i 15 minutter for at trække vanddamp ud af HSP og hætteglassets hovedrum.
- Overfør HSP'erne til ærmerne.
BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her i op til ~ 1 uge ved stuetemperatur, før det mister de mere flygtige forbindelser fra HSP'erne.
5. Analyser prøver på gaskromatografien - massespektrometeret (GC-MS)
- Brug følgende GC-MS-indstillinger (se materialetabellen): 35 °C med et hold på 5 minutter, en rampe på 10 °C/min til 170 °C og en rampe på 15 °C/min til 230 °C med et splitforhold på 20:1 og en samlet driftstid på 38 minutter.
- Indstil desorptionsmetoden som følger: 2 min, 70 °C forvarmning; 2 min 260 °C desorption; 34 min, 260 °C bakeout; og 2 min, 70 °C efter bagning.
- Konfigurer sekvensen af prøver, og start kørslen i henhold til instrumentering.
- For at oprette en sekvens på Entech-softwaren skal du åbne programmet. Vælg 5800 | Rækkefølge.
- Overhold sekvenstabellen i Entech-softwaren svarende til den i GC-MS-softwaren. Navngiv kolonnen Eksempel-id i henhold til Aktuelt date_vial nummer. Husk, at Navn er analogt med Navn i GC-MS-sekvenstabellen, og 5800-metoden bestemmer temperaturrampens hastighed, holdetider osv. (åbner en menu for at vælge den metode, der genereres i trin 5.2).
- Husk, at kolonnerne Bakke og Position bestemmer, hvor SPR (Sample Preparation Rail) skal hen for at afhente HSP'erne.
- Overhold de to bakker med 30 pletter hver til venstre, der er lagt ud som seks kolonner med fem pletter hver. Den bakkeposition, der er mest til venstre og tættest på brugeren (foran), er position 1, mens den længst til højre, længst væk er position 30.
- Bemærk, at disse bakker er HSP A eller B, hvor HSP B er bakken tættere på SPR (inderste bakke), og lige bag HSP B er HSP Blank. Anbring de ekstraherede prøver i bakkerne, og vælg stedet på sekvensen i overensstemmelse hermed.
- Gem sekvenstabellen, vælg Kør i venstre side, og start derefter med tom i desorber , hvis den tomme HSP er i desorberen (betegnet med en HSP markeret med gul etiket).
- Bemærk, at HSP'er håndteres af SPR for hver prøve i sekvensen. Lad SPR varme op, så vises en meddelelse øverst på skærmen for at bekræfte, om emnet er i desorberen. Klik på Spring over for at bekræfte, at pennen er der. Tillad SPR at køre alle prøver automatisk, og sekvensen på GC-MS-siden registrerer automatisk dataene i separate filer.
6. Analyse af data
- Kvalitetsfilterdata på GC-MS-software (Table of Materials).
- Gennemgå hver top på kromatogrammet, og kommenter toppe, der matcher National Institute of Standards & Technology (NIST) biblioteket (eller med et andet tilgængeligt bibliotek).
- Føj kommenterede kromatogramtoppe til behandlingsmetoden. Indstil kriterierne for udvælgelse af toppe til at omfatte forbindelser med større end 75% sandsynlighed, og sørg for, at justeringen af hver identificerende ion af forbindelsen ligger inden for midten af toppen.
- Hvis du vil føje en top til behandlingsmetoden, skal du vælge Kalibrer | Rediger sammensatte | Navn | indsæt forbindelse under ekstern standardforbindelse. Tilføj navnet på forbindelsen, retentionstid, Quant Signal Target Ion. Tilføj de tre største toppe. Vælg ok | for at gemme Metode | Gem.
- Når procesmetoden er konfigureret, skal du fortsætte til Quantitate | Beregn og se | QEdit Quant Resultat.
- Undersøg hver forbindelse for at sikre, at toppe stemmer overens med deres forventede retentionstider og er over baggrundsstøj.
- Når QEdit er fuldført, skal du vælge Afslut | Ja for at gemme QEdits og vende tilbage til hovedkromatogrammet. Eksporter områdeintegrationerne ved at åbne filen i venstre side. Vælg | Generer rapport.
- Hvis du vil eksportere filer til brug i DExSI, skal du vælge Filer | Eksportér data til AIA-format | Opret ny mappe, og vælg en placering til filen eller Brug eksisterende mappe.
- Overhold et nyt vindue, der åbnes for at vælge filer til eksport. Flyt filerne til højre side af vinduet, og klik på Proces. Vent et par sekunder til et par minutter afhængigt af antallet af filer, der konverteres.
- Korrigere for isotopoverflod i DExSI i henhold til instruktionerne til DExSI-softwaren (https://github.com/DExSI/DExSI), og udfør analyse med en favoritsoftware eller et yndlingsprogram (f.eks. R). Scripts, der bruges til at generere tallene, er placeret på https://github.com/joannlp/
VOC_SIP .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mono- og co-kulturer af S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii
Mono- og samkulturerne bestod af bakteriearterne S. aureus, P. aeruginosa og A. baumannii. Disse er almindelige opportunistiske patogener, der findes i menneskelige sår og kroniske infektioner. For at identificere de flygtige molekyler, der er til stede i mono- og co-kulturerne, blev der udført en kort 1-timers ekstraktion ved 70 °C med 200 o / min omrøring. Fra mono- og co-kulturer ved 24- og 48-timers tidspunkter blev der påvist 43 kommenterede flygtige molekyler (figur 2), blandt hvilke der var aldehyder, ketoner, alkoholer, svovlforbindelser, carbonhydrider, carboxylsyrer eller estere og aromater. Der var et lille antal flygtige molekyler, der kun blev påvist i visse mono- eller co-kulturer på bestemte tidspunkter. For eksempel blev acetoin og 3-hydroxy-2-butanonacetat kun påvist i S. aureus-kulturerne ved 48-timers tidspunktet (figur 2).
Flygtig 1-propanol 2-methyl blev kun påvist i P. aeruginosa og A. baumannii co-kultur ved 48 timer (figur 2). Ethylacetat var til stede i A. baumannii-kulturer med enten S. aureus eller P. aeruginosa ved 48 timer (figur 2). Metabolitterne heptan, 2,3-dimethyl og pentan, 2-methyl blev kun påvist i A. baumannii-kulturen ved 24 timer (figur 2). Acetaldehyd og ethanol havde højere relative forekomster i A. baumannii og S. aureus co-kulturen på 24-timers tidspunktet sammenlignet med 48 timer og en af stammerne i kultur alene (figur 2). Nogle af de flygtige stoffer var mere rigelige i kulturer på enten 24- eller 48-timers tidspunktet. Kortkædede fedtsyrer, herunder eddikesyre, butansyre og propansyre, havde store relative forekomster i kulturer ved 48 timer, men blev ikke påvist i 24-timers kulturerne (figur 2). Hexan var mere rigeligt i TH-kontrollen ved 24 timer sammenlignet med 48 timer (figur 2).
Stabil isotopmærkning af fækale, spildevands- og spytprøver
For at identificere aktiv produktion af flygtige molekyler fra en biologisk prøve blev der tilsat en mærket næringskilde, 13C glucose ellerD2O og medier for at understøtte væksten i det mikrobielle samfund. En unik prøve blev analyseret fra hver af de forskellige prøvetyper af fækale, spildevand og spytprøver i tre eksemplarer. Der var mere inkorporering af de 13C i fuldt mærkede flygtige molekyler (figur 3A-D) sammenlignet med inkorporering med deuterium (figur 3E). De 13C blev inkorporeret i 2-butanon, 3-hydroxy; 2,3-butanedion; eddikesyre; og phenol til alle fækale, spildevands- og spytprøver (figur 3A).
De andre mærkede flygtige stoffer blev påvist i enten to eller en prøvetype. For eksempel blev acetone, butansyre og propansyre påvist som mærket i spyt og spildevand (figur 3B). De mærkede flygtige stoffer, dimethyltrisulfid og disulfiddimethyl, blev beriget i både fækale og spytprøver (figur 3C). Flygtige stoffer, 1-propanol, 2-butanon, benzophenon, ethanol og methylthiolacetat, blev kun beriget i spildevand (figur 3D). Den mærkede flygtige, 2,3-pentanedoin, blev beriget med spyt (figur 3D). Deuterium blev inkorporeret i flygtige stoffer, eddikesyre; benzaldehyd, 4-methyl; dimethyltrisulfid; og phenol fra enten spyt- eller spildevandsprøver (figur 3E). Ud over de isotopberigede flygtige stoffer blev der påvist flygtige stoffer, der ikke indeholdt inkorporerede stabile isotoper. For eksempel blev pyrazinforbindelser, bortset fra pyrazin, 2,5-dimethyl, påvist i fækale, spildevands- og spytprøver, men blev ikke fuldt beriget med 13C (supplerende figur S1).
Stabil isotopmærkning af sputumprøver
Den stabile isotopmærkningsstrategi blev implementeret til identifikation af aktivt producerede flygtige stoffer med sputumprøver fra syv mennesker med cystisk fibrose. De flygtige stoffer i prøven blev sammenlignet med dem, der opstod fra prøver dyrket med en stabil isotopetiket. Hver flygtig komponent i hver prøve blev analyseret to gange: før og efter stabil isotopsondering med 13C glucose og medier. Prøverne indsamlet fra forsøgspersonerne strakte sig over tre forskellige tidspunkter eller kliniske tilstande: baseline, forværring og behandling23. De flygtige stoffer, der blev påvist som mærket i de dyrkede sputumprøver, havde forskellige relative mængder sammenlignet med de umærkede flygtige stoffer fra de ukultiverede sputumprøver. Dyrkningsbetingelser i de stabile isotopundersøgelsesforsøg med sputum kan favorisere væksten af visse mikrober, hvilket fører til forskelle i relative mængder af flygtige stoffer sammenlignet med de ukultiverede sputumprøver.
For eksempel var eddikesyre, dimethyltrisulfid, acetone og propanal, 2-methyl mere rigelige i de dyrkede sputumprøver sammenlignet med de ukultiverede sputumprøver (figur 4). Påvisning af 13C-mærket ethanol, som kan være til stede i variable mængder i baggrundsrumsluften, giver bevis for, at ethanolen blev aktivt produceret ved mikrobiel metabolisme fra 13C glucose. Variationsmængden blev forklaret af emnet som vurderet ved permutationel multivariat analyse af varians (PERMANOVA) og var også forskellig for de to forskellige flygtige datasæt (tabel 1 og supplerende figur S2). For de 13C-mærkede dyrkede sputum blev 51% af variationen forklaret af emnet, mens 33% af variationen blev forklaret af emne fra de flygtige stoffer i de ukultiverede sputumprøver (tabel 1). Mikrobiomsamfundets sammensætning som bestemt ved 16S rRNA-ampliconsekventering fra de syv forsøgspersoner var unik for hvert emne (supplerende figur S3), og de individuelle signaturer blev også afspejlet i både de dyrkede og ukultiverede sputum flygtige molekyler, der blev påvist.
I dyrket sputum blev der påvist 23 flygtige stoffer, der var fuldt mærket med 13kulstof. De isotopberigede (aktive) flygtige stoffer, der blev påvist fra sputumprøverne, var forskellige for hvert emne. De flygtige stoffer med isotopberigelse, der blev påvist i sputumprøverne fra alle syv forsøgspersoner, var 2,3-butanedion; eddikesyre; acetone; dimethyltrisulfid; disulfid, dimethyl; og pyrazin, 2,5-dimethyl (figur 5). Selvom disse flygtige stoffer blev påvist hos alle forsøgspersoner, varierede isotopberigelsen for hvert emne. Prøver fra forsøgsperson 7 havde højere isotopberigelse af disulfiddimethyl sammenlignet med de øvrige seks forsøgspersoner (figur 5B). Acetone var højere i forsøgspersoner 4 og 6 (figur 5). Nogle flygtige stoffer blev kun beriget med 13C i visse emner. For eksempel blev 1-butanol, 3-methyl og propansyre, 2-methyl kun beriget i en delmængde af prøver fra forsøgsperson 2 (figur 5). Ud over de isotopberigede flygtige stoffer blev der også påvist flygtige stoffer som umærkede fra det samme dyrkede sputum (supplerende figur S4). Flygtige stoffer 2-piperidin; benzaldehyd, 4-methyl; benzothiazol; butansyre, 3-methyl; hexanal; hexan; isopropylalkohol; phenol; propansyre, 2-methyl; og pyrrolo 1,2-apyrazin-1,4-dione, hexahydro blev påvist i sputumprøverne, men var ikke isotopberigede (supplerende figur S4).
Figur 1: Protokolskematisk. En biologisk prøve anbringes i et hætteglas af glas og samles med lågforingen og Headspace Sorbent Pen. Et vakuum påføres hætteglasset, indtil et tryk på ca. 30 mmHg er nået. Vakuumkilden fjernes, og hætteglassene placeres i sorbentpenneekstraktionsenheden, hvor en statisk ekstraktion udføres ved hjælp af varme, omrøring og tid. Efter ekstraktion placeres hætteglas på en kold metalblok for at fjerne vand fra headspace og HSP. HSP'erne opsamles og køres via termisk desorption på GC-MS. Dataene analyseres med ChemStation, DExSI og R. Forkortelser: HSP = Headspace Sorbent Pen; GC-MS = gaskromatografi-massespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Heatmap over mono- og co-kulturer. VOC'er detekteret fra mono- og co-kulturer ved 24- og 48-timers tidspunkter. Co-kulturerne er kombinationerne af bogstaverne, der repræsenterer hver stamme. Alle prøver blev ekstraheret i 1 time ved 70 °C med 200 omrøring omdr./min. Heatmapintensitetsværdier er kolonne Z-scores, normaliseret af metabolit. Z-scoren blev beregnet ved forskellen i værdi fra gennemsnittet af værdier divideret med standardafvigelsen af værdier. Dendrogram blev genereret med cluster_cols i pheatmap-funktionen af R. Dendrogram repræsenterer hierarkisk klyngedannelse, hvor metabolitter, der klynger sig sammen, har flere ens Z-scorer på tværs af prøver. Forkortelser: A = A. baumanii; P = P. aeruginosa; S = S. aureus; TH = Todd Hewitt media (kontrol). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Procent omdannelse af 13C til flygtig molekylemasse i fækale, spyt- og spildevandsprøver under 18 timers samtidig inkubation og ekstraktion. Procentkonverteringen blev beregnet for fuldt mærkede forbindelser ved at tage massen af den fuldt mærkede forbindelse (M + N) og dividere den med (M + N) + massen af den umærkede flygtige masse (M), hvor N er det maksimale antal mulige carbonatomer (i A-D) eller hydrogener (i E), der kan mærkes i hvert flygtigt molekyle. Forbindelser anses for at være fuldt mærket, når alle carbonatoly af det flygtige erstattes af 13C. Hvor der mangler data, blev den flygtige ikke opdaget. For eksempel blev der i (D) ikke påvist 1-propanol i fækale eller spytprøver. Antal replikater pr. prøve = 3. (A) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der påvises i alle prøvetyper (afføring, spyt og spildevand). (B) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der kun påvises i spyt- og spildevandsprøver. (C) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der er påvist i afføring og spytprøver. D) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der er påvist i en af de tre forskellige prøvetyper. (E) De deuteriummærkede flygtige molekyler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Heatmap over 13C-mærkede flygtige stoffer fra dyrket sputum og flygtige molekyler detekteret fra ukultiveret sputum. De mærkede flygtige stoffer kommer fra de stabile isotopundersøgelseseksperimenter, hvor 13C glucose og Brain Heart Infusion medium blev tilsat til sputum under ekstraktionstrinnet for at dyrke mikrobiel vækst og fange aktiv flygtig produktion. De umærkede flygtige molekyler blev påvist direkte fra sputumprøver. Heatmapintensiteterne er Z-scorer som beskrevet i billedteksten til figur 2. Z-scorerne blev imidlertid beregnet inden for hvert eksperiment for de dyrkede og ukultiverede sputumeksperimenter. Dendrogram blev genereret som beskrevet i figur 2. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Procentomdannelse af 13C til flygtig molekylemasse i sputumprøver fra syv forsøgspersoner med cystisk fibrose under 18 timers samtidig inkubation og ekstraktion. Procentkonverteringen blev beregnet som beskrevet i billedteksten til figur 3. Flygtige stoffer, der ikke påvises i prøver, er indikeret ved fravær af data. N = 1-3. (A) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der påvises ved en højere procentkonvertering i de fleste sputumprøver. (B) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der påvises ved en lavere procentkonvertering i de fleste sputumprøver. (C) De 13C-mærkede flygtige stoffer, der påvises ved en lavere procentkonvertering i et mindretal af sputumprøverne. Forkortelser: B = baseline; E = forværring; T = behandling. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Frihedsgrader | R2 | P-værdi | ||
| Ukultiveret sputum | Emne | 6 | 0.33 | 0.001 |
| Klinisk tilstand | 2 | 0.01 | 0.46 | |
| Om: klinisk tilstand | 12 | 0.12 | 0.092 | |
| Kultiveret sputum med 13C glucose og medier | Emne | 6 | 0.51 | 0.001 |
| Klinisk tilstand | 2 | 0.02 | 0.095 | |
| Om: klinisk tilstand | 12 | 0.11 | 0.194 |
Tabel 1: Permuteret multivariat analyse af varians (PERMANOVA) af sputumprøver. PERMANOVA blev genereret ved hjælp af adonis-funktionen fra den veganske pakke i R.
Supplerende figur S1: De relative forekomster af mærkede (M + N (max)) og umærkede (M + 0) flygtige stoffer på tværs af fækale, spyt og spildevandsprøver. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Ikke-metrisk flerdimensionel skalering af dyrket sputum med stabil isotopsondering og ukultiveret sputum. (A) NMDS af dyrket sputum med 13C glucose og medier blev genereret med k = 3 dimensioner. Stressværdien var 0,07. (B) NMDS af ukultiveret sputum blev genereret med k = 3 dimensioner. Stressværdien var 0,13. Forkortelser: NMDS = ikke-metrisk flerdimensionel skalering; B = basislinje E = forværring; T = behandling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Mikrobiel samfundssammensætning af sputumprøver fra personer med cystisk fibrose. Vurderet ved 16S rRNA amplicon sekventering som en del af en større undersøgelse, yderligere information om tilgang fundet i Carmody et al. 202019. fra personer med cystisk fibrose. Hver stablet bjælke er et andet tidspunkt. Forkortelser: B = baseline, E = forværring, T = behandling. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S4: De relative forekomster af mærkede (M + N (max)) og umærkede (M + 0) flygtige stoffer på tværs af sputumprøver fra syv personer med cystisk fibrose. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at identificere flygtig produktion i in vitro-kulturer og humant associerede prøver blev der udført flygtig analyse af mono- og co-kulturer af P. aeruginosa, S. aureus og A. baumanii og stabil isotop-sondering af forskellige biologiske prøver. I analysen for mono- og co-kulturer blev der påvist flygtige stoffer ved at udføre en kort ekstraktion i 1 time ved 70 °C. Den flygtige analyse af mono- og co-kulturer tillod undersøgelsen af de forbindelser, der produceres både af individuelle arter og under deres interaktioner med andre arter. Der var forskelle i relative overflod på tværs af de forskellige kulturtyper og tidspunkter. I de stabile isotopundersøgelsesforsøg omfattede de biologiske prøver afføring og spyt fra raske forsøgspersoner, spildevand og sputum fra personer med cystisk fibrose. Stabil isotopprofilering gjorde det muligt at identificere aktivt fremstillede flygtige molekyler ved ekstraktion i 18 timer ved 37 °C. Den lange ekstraktionstid med en lavere temperatur muliggjorde vækst og metabolisme af mikrober, der var til stede i de biologiske prøver. Sammenligning af 13C glucose og D2O berigelser viste, at der var mere omfattende isotop berigelse med mærket 13C.
Ved udtrækning af forskellige prøvetyper blev der taget indledende optimeringstrin, inden du startede en fuld kørsel. Først skal du teste forskellige mængder af en prøve som en prøvekørsel. For nogle prøvetyper var sputum, for eksempel kun små prøvevolumener tilgængelige. Det anbefales at starte med et lavere volumen eller mindre mængde prøve først, afhængigt af prøvetype og tilgængelige prøvemængder. Udtræk ikke et stort volumen eller for meget af prøven, da det kan overvælde søjlen og forurene HSP. Kolonneoverbelastning kan være tydelig, når toppe i kromatogrammet er mættede eller vises i efterfølgende kørsler. HSP-kontaminering har fundet sted, hvis der er fremført overførsel, når HSP'en køres igen på GC-MS. I mono- og co-kulturforsøgene var 200 μL kultur tilstrækkelig til at detektere en række flygtige stoffer. I de stabile isotopsonderingsforsøg varierede volumenet for hvert forsøg afhængigt af prøvetypen fra 500 μL til 1 ml. For det andet, afhængigt af prøvetypen og forbindelserne af interesse, skal ekstraktionstiden og -temperaturen samt GC-MS- og termisk desorptionsmetoder justeres for at optimere flygtig detektion. Disse metoder blev bestemt til at være egnede til analytter af interesse og kolonnetype.
Efter optimering af metoden vedrørte de kritiske trin i protokollen trinnene før og efter ekstraktion. Under prøveforberedelsen blev prøverne anbragt på is, så de flygtige stoffer, der var til stede i prøven, ikke slap ud. Det var også vigtigt at sikre, at vakuumforseglingen var tæt, og låget var forsvarligt lukket. Ellers ville der være en ineffektiv ekstraktion og nedsat påvisning af de flygtige stoffer fra prøven. Lækager kan opstå fra O-ringene omkring lågforingen eller HSP'en. For at sikre, at hætteglasset var under vakuum, blev der brugt en måler inden ekstraktionen for at sikre, at O-ringene stadig var funktionelle. Derudover blev der efter udsugningen lagt prøver på isblokken, så der blev trukket vand ud af hovedrummet i en bestemt periode. Vand i kolonnen kan føre til ændringer i retentionstider og undertrykkelse af medlemsstaternes respons og dermed føre til ikke-kvantitative resultater. Evnen til at trække overskydende vand ud af HSP'erne, inden det fjernes fra vakuummuffen/hætteglassamlingen, er mulig på grund af VASE-processens lukkede systemkarakter og evnen til at trække vand tilbage til det koldeste sted i dette ekstraktionssystem ved hjælp af den kolde plade -80 °C.
Der er både begrænsninger og fordele ved disse metoder med hensyn til alternative metoder. Evaluering af mono- og co-kultureksperimenterne blev der påvist flygtige signaturer, der var specifikke for en bestemt mikrobe eller co-kultur. Der var også ændringer i flygtige overflod over tid. Hvad angår de stabile isotop-sonderingsforsøg i de forskellige typer biologiske prøver, resulterede deuteriummærkning ikke i så mange isotopberigede flygtige stoffer som 13C glucose. Den metabolisme, der kræves for at producere isotopberigede flygtige stoffer med deuterium, kan være mere begrænset. Derudover blev der tilsat medier til de biologiske prøver for at forbedre mikrobiel vækst, hvilket kan føre til ændringer i den mikrobielle samfundssammensætning. Dyrkningsbetingelser for stabile isotopundersøgelsesforsøg kan vælges til den begunstigede vækst af visse mikrober i en biologisk prøve. Dette var i modsætning til den korte ekstraktion i en time ved 70 ° C designet til at detektere de flygtige stoffer i samfundsprøven, før en eller få af mikroberne begynder at overtage samfundet. Kompleksiteten af de mikrobielle og kemiske sammensætninger af fækal-, spildevands-, spyt- og sputumprøvetyperne gør det vanskeligt at tildele specifikke kemiske signaturer til en given mikrobiel eller menneskelig oprindelse uden yderligere analyser såsom sekventering. Denne metode tilvejebragte en højgennemstrømning, opløsningsmiddelfri vakuumekstraktion, der førte til mere følsom påvisning af prøver med lavt volumen. De volumener, der blev anvendt til disse eksperimenter, varierede fra 200 μL til 1 ml dyrkede biologiske prøver. I andre tilfælde (data ikke vist) blev biologiske prøver (f.eks. sputum og fækale prøver) så lave som 15 μL eller 10 μg ekstraheret.
Til fremtidige anvendelser af metoden kan en bred vifte af prøvetyper analyseres med små eller begrænsede mængder. Snesevis af prøver kunne ekstraheres samtidigt, og køretiden ville afhænge af parametrene for det specifikke GC-MS-instrument. I tilfælde af stabil isotopsondering, når den kombineres med metagenomisk sekventering, er der mulighed for at identificere de mikrober, der er ansvarlige for produktionen af de flygtige molekyler. Metagenomet i den biologiske prøve kunne sekventeres før og efter ekstraktion med stabil isotopsondering for at identificere ændringer i mikrobiel samfundssammensætning. Metagenomisk sekventering ville gøre det muligt at identificere gener, der er ansvarlige for produktionen af de isotopberigede flygtige molekyler. Fremhævet her er et par eksempler på de prøvetyper og tilgange, der kan bruges som input til den præsenterede protokol, som allerede er etableret i forskellige brancher. Fordi flygtige molekyler er vigtige diagnostiske indikatorer, kan brugen af denne protokol udvides til biologiske laboratorier og kliniske sundhedsindstillinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
V. L. V og S. J.B. D. var tidligere ansatte i Entech Instruments Inc., og K. W. er medlem af Entechs universitetsprogram. J. P., J. K. og C. I. R. har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi takker Heather Maughan og Linda M. Kalikin for omhyggelig redigering af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af NIH NHLBI (tilskud 5R01HL136647-04).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C glucose | Sigma-Aldrich | 389374-1G | |
| 2-Stg Diaph Pump | Entech Instruments | 01-10-20030 | |
| 20 mL VOA vials | Fisher Scientific | 5719110 | |
| 24 mm Black Caps with hole, no septum | Entech Instruments | 01-39-76044B | holds lid liner in place on vial |
| 24 mm vial liner for sorbent pens | Entech Instruments | SP-L024S | allows pens to make a vacuum seal at top of vial |
| 5600 Sorbent pen extraction unit (SPEU) | Entech Instruments | 5600-SPES | 5600 Sorbent Pen Extraction Unit -120 VAC |
| 96-well assay plates | Genesee | 25-224 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) media | Sigma-Aldrich | 53286-500G | |
| ChemStation Stofware | Agilent | ||
| DB-624 column | Agilent | 122-1364E | 60 m, 0.25 mm ID, 1.40 micron film thickness, in GC-MS |
| Deuterium oxide | Sigma-Aldrich | 151882-1L | |
| Dexsi sofware | Dexsi (open source) | ||
| GC-MS (7890A GC and 5975C inert XL MSD with Triple-Axis Detector) | Agilent | 7890A GC and 5975C inert XL MSD with triple-axis detector | |
| Headspace Bundle HS-B01, 120VA | Entech Instruments | SP-HS-B01 | Items for running headspace extraction included in bundle |
| Headspace sorbent pen (HSP) - blank | Entech Instruments | SP-HS-0 | |
| Headspace sorbent pen (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh) | Entech Instruments | SP-HS-T3560 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | VWR | 53550-792 | |
| O-rings | Entech Instruments | SP-OR-L024 | |
| Sample Preparation Rail | Entech Instruments | ||
| Sorbent pen thermal conditioner | Entech Instruments | 3801-SPTC | |
| Todd Hewitt (TH) media | Sigma | T1438-500G |
References
- Van Berkel, J. J. B. N., et al. A profile of volatile organic compounds in breath discriminates COPD patients from controls. Respiratory Medicine. 104 (4), 557-563 (2010).
- Nakhleh, M. K., et al. Detecting active pulmonary tuberculosis with a breath test using nanomaterial-based sensors. European Respiratory Journal. 43 (5), 1522-1525 (2014).
- Lim, S. H., et al. Rapid diagnosis of tuberculosis from analysis of urine volatile organic compounds. ACS Sensors. 1 (7), 852-856 (2016).
- Schnabel, R., et al. Analysis of volatile organic compounds in exhaled breath to diagnose ventilator-associated pneumonia. Scientific Reports. 5, 17179 (2015).
- Paff, T., et al. Exhaled molecular profiles in the assessment of cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia. Journal of Cystic Fibrosis. 12 (5), 454-460 (2013).
- Robroeks, C. M. H. H. T., et al. Metabolomics of volatile organic compounds in cystic fibrosis patients and controls. Pediatric Research. 68 (1), 75-80 (2010).
- Neerincx, A. H., et al. Hydrogen cyanide emission in the lung by Staphylococcus aureus. European Respiratory Journal. 48 (2), 577-579 (2016).
- Goeminne, P. C., et al. Detection of Pseudomonas aeruginosa in sputum headspace through volatile organic compound analysis. Respiratory Research. 13, 87 (2012).
- Joensen, O., et al. Exhaled breath analysis using Electronic Nose in cystic fibrosis and primary ciliary dyskinesia patients with chronic pulmonary infections. PLOS ONE. 9 (12), 115584 (2014).
- Nasir, M., et al. Volatile molecules from bronchoalveolar lavage fluid can 'rule-in' Pseudomonas aeruginosa and 'rule-out' Staphylococcus aureus infections in cystic fibrosis patients. Scientific Reports. 8 (1), 826 (2018).
- Tyc, O., Zweers, H., de Boer, W., Garbeva, P.
- Gao, B., et al. Tracking polymicrobial metabolism in cystic fibrosis airways: Pseudomonas aeruginosa metabolism and physiology are influenced by Rothia mucilaginosa-derived metabolites. mSphere. 3 (2), 00151 (2018).
- Schoenheimer, R., Rittenberg, D. Deuterium as an indicator in the study of intermediary metabolism. Science. 82 (2120), 156-157 (1935).
- Neubauer, C., et al. Refining the application of microbial lipids as tracers of Staphylococcus aureus growth rates in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 200 (24), 00365 (2018).
- Cordell, R. L., Pandya, H., Hubbard, M., Turner, M. A., Monks, P. S. GC-MS analysis of ethanol and other volatile compounds in micro-volume blood samples-quantifying neonatal exposure. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 405 (12), 4139-4147 (2013).
- Mayor, A. S. R. Optimisation of sample preparation for direct SPME-GC-MS analysis of murine and human faecal volatile organic compounds for metabolomic studies. Journal of Analytical & Bioanalytical Techniques. 5 (2), 184 (2014).
- Camarasu, C. C. Headspace SPME method development for the analysis of volatile polar residual solvents by GC-MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 23 (1), 197-210 (2000).
- Charry-Parra, G., DeJesus-Echevarria, M., Perez, F. J. Beer volatile analysis: optimization of HS/SPME coupled to GC/MS/FID. Journal of Food Science. 76 (2), 205-211 (2011).
- Bicchi, C., Cordero, C., Liberto, E., Rubiolo, P., Sgorbini, B. Automated headspace solid-phase dynamic extraction to analyse the volatile fraction of food matrices. Journal of Chromatography A. 1024 (1), 217-226 (2004).
- Trujillo-Rodríguez, M. J., Anderson, J. L., Dunham, S. J. B., Noad, V. L., Cardin, D. B. Vacuum-assisted sorbent extraction: An analytical methodology for the determination of ultraviolet filters in environmental samples. Talanta. 208, 120390 (2020).
- Mollamohammada, S., Hassan, A. A., Dahab, M. Immobilized algae-based treatment of herbicide-contaminated groundwater. Water Environment Research. 93 (2), 263-273 (2021).
- Psillakis, E. The effect of vacuum: an emerging experimental parameter to consider during headspace microextraction sampling. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (24), 5989-5997 (2020).
- Carmody, L. A., et al. The daily dynamics of cystic fibrosis airway microbiota during clinical stability and at exacerbation. Microbiome. 3, 12 (2015).
- Carmody, L. A., et al. Fluctuations in airway bacterial communities associated with clinical states and disease stages in cystic fibrosis. PLOS ONE. 13 (3), 0194060 (2018).
- Mahboubi, M. A., et al. Culture-based and culture-independent bacteriologic analysis of cystic fibrosis respiratory specimens. Journal of Clinical Microbiology. 54 (3), 613-619 (2016).
