Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.
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Article de méthode
Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses
Dans cet article
Avis d’erratum
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Résumé
Résumé
Les neurones subissent des changements dynamiques dans leur structure et leur fonction au cours du développement du cerveau pour former des connexions appropriées avec d’autres cellules. Le cervelet de rongeurs est un système idéal pour suivre le développement et la morphogenèse d’un seul type de cellule, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), au fil du temps. Ici, l’électroporation in vivo des progéniteurs des neurones granulaires dans le cervelet de souris en développement a été utilisée pour marquer les cellules de manière clairsemée pour des analyses morphologiques ultérieures. L’efficacité de cette technique est démontrée dans sa capacité à mettre en évidence les étapes clés du développement de la maturation CGN, avec un accent particulier sur la formation de griffes dendritiques, qui sont des structures spécialisées où ces cellules reçoivent la majorité de leurs entrées synaptiques. En plus de fournir des instantanés des structures synaptiques CGN tout au long du développement cérébelleux, cette technique peut être adaptée pour manipuler génétiquement les neurones granulaires de manière autonome par les cellules afin d’étudier le rôle de tout gène d’intérêt et son effet sur la morphologie CGN, le développement des griffes et la synaptogenèse.
Introduction
Le développement du cerveau est un processus prolongé qui s’étend de l’embryogenèse à la vie postnatale. Pendant ce temps, le cerveau intègre une combinaison de stimuli intrinsèques et extrinsèques qui sculptent le câblage des synapses entre les dendrites et les axones pour finalement guider le comportement. Le cervelet des rongeurs est un système modèle idéal pour étudier le développement des synapses, car le développement d’un seul type de neurone, le neurone granulaire cérébelleux (CGN), peut être suivi lors de sa transition d’une cellule progénitrice à un neurone mature. Cela est dû, en partie, au fait qu’une majorité du cortex cérébelleux se développe après la na....
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Protocole
REMARQUE: Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Duke (IACUC).
1. Préparation de l’ADN pour l’électroporation in vivo ou IVE (1 jour avant la chirurgie)
- Rassemblez les matériaux suivants : ADN purifié (0,5-25 μg par animal), acétate de sodium 3 M, éthanol, colorant vert rapide, eau distillée ultrapure, solution tampon phosphate (PBS) (voir le tableau des matériaux).
NOTE: Pour l’ADN, une construction exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) sous un promoteur humain de l’ubiquitine a ét....
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Résultats
Figure 4 : Analyse de la morphologie des neurones granulaires au cours du développement cérébelleux. A) Images de projection maximale des CGN électroporés de 3 DPI à 14 DPI (âge postnatal P10 à P21), noyaux (bleu) et GFP (vert); Les pointes de flèches indiquent une dendrite individuelle et la barre d’échelle est de 10 μm. (B) Nombre moyen de dendrites. (
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Discussion
Les neurones granulaires cérébelleux sont les neurones les plus abondants dans le cerveau des mammifères, représentant près de 60 à 70% de la population totale de neurones dans le cerveau des rongeurs 1,14. Le cervelet a été largement utilisé pour élucider les mécanismes de prolifération cellulaire, de migration, de formation de dendrites et de développement des synapses 6,9,10,11,15,16,17,18,19,20 <.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Le travail a été soutenu par les subventions NIH R01NS098804 (A.E.W.), F31NS113394 (U.C.) et le programme d’été en neurosciences de l’Université Duke (D.G.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bétadine | Purdue Production | 67618-150-17 | |
| Cimenté 10 & micro ; Aiguille L | Hamilton | 1701SN (80008) | Calibre 33, 1,27 cm (0,5 po), style 4 points |
| Poulet anti-GFP | Millipore Sigma | AB16901 | Notre laboratoire utilise cet anticorps à une concentration de 1:1000 |
| Applicateur | |||
| Donkey anti-poulet Cy2 | Jackson ImmunoResearch | 703-225-155 | Notre laboratoire utilise cet anticorps à une concentration de 1:500 |
| Éthanol (200 Électroporateur | Koptec | V1016 | |
| ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Fast Green FCF | Sigma | F7252-5G | |
| FUGW plasmide | Addgene | 14883 | |
| Lames de verre | VWR | 48311-703 | Superfrost plus |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Coussin chauffant | Softheat | ||
| Hoescht 33342 colorant fluorescent | Invitrogen | 62249 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | 07-893-1389 | |
| Micro cover glass | VWR | 48382-138 | |
| Vernis à ongles | Sally Hansen | Color 109 | |
| Normal goat sérum | Gibco | 16210064 | |
| O.C.T. composé d’enrobage | Tissue-Tek | 4583 | |
| Olympus MVX10 Lunette de dissection Olympus | MVX10 | ||
| P200 pointe de pipette | Fisherbrand | 02-707-138 | Utilisé pour l’espacement d’aiguille |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS pH 7,4 (10x) | Gibco | 70011-044 | |
| Neurite Tracer Simple | FIJI | https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic__ Instructions | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Outils chirurgicaux | RWD Life Science | Petits ciseaux et pinces à épiler | |
| Triton X-100 | Roche | 11332481001 | détergent non ionique |
| Pince à épiler | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 | 5 mm, électrodes de type pince à épiler plaquées platine |
| Eau distillée ultrapure | Invitrogen | 10977-015 | |
| Support de montage Vectashield | Vectashield | H1000 | |
| Vetbond adhésif tissulaire | 3M | 1469SB | |
| Zeiss 780 Confocal droit | Zeiss | 780 |
Références
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- Rahimi-Balaei, M., Bergen, H., Kong, J., Marzban, H. Neuronal migration during development of the cerebellum. Frontiers in....
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development
Posted by JoVE Editors on 4/06/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Utilizing In Vivo Postnatal Electroporation to Study Cerebellar Granule Neuron Morphology and Synapse Development. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: In vivo cerebellar electroporation of granule neuron progenitors in P7 wildtype mouse pups. (A) Pups are anesthetized with 4% isoflurane delivered at a rate of 0.8L/min to ensure anesthesia throughout the injection of the DNA solution. Isoflurane is delivered at a rate of 0.8 L/min. (B) After sterilizing the mouse 3 times with betadine and 70% ethanol, an incision is made that spans the distance of the ears, revealing the hindbrain. (C) A magnified image of a white demarcation on the cranium, a landmark for the injection site. DNA construct should be injected within 1 mm above the mark; dotted lines outline the demarcation, and black arrow denotes the injection site. The ridges of the cerebellar vermis may be visible and can be useful for finding the injection site. (D) Tweezer-type electrode orientation for efficient electroporation. Plus (+) end must be oriented downwards to pull negatively charged DNA into the cerebellar parenchyma prior to administration of electrical pulses. (E) Test injection of 1 µL of a 0.02% Fast Green dye shows injection is localized to the middle of the cerebellar vermis between lobules 5-7. Please click here to view a larger version of this figure.
