Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في الإشريكية القولونية باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل

Published: May 23, 2021 doi: 10.3791/62577
Automatic Translation
1, 1
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

هنا نقدم بروتوكولا لتحديد سريع للبروتينات التي تنتجها البكتيريا المسببة للأمراض تسلسل الجينوم باستخدام MALDI-TOF-TOF قياس الطيف الكتلي جنبا إلى جنب وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل مع البرامج التي وضعت في المنزل. أيونات البروتين ميتاستابل جزء بسبب تأثير حمض الأسبارتيك ويتم استغلال هذه خصوصية لتحديد البروتين.

Abstract

يحدد هذا البروتوكول بروتينات المناعة للإنزيمات المبيدة للبكتيريا: colicin E3 والبكتيريا ، التي تنتجها سلالة الإشريكية القولونية المسببة للأمراض باستخدام تحريض المضادات الحيوية ، وتم تحديدها من قبل قياس الطيف الكتلي المترادف MALDI-TOF والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل مع البرامج المطورة داخليا. تم تحديد بروتين المناعة من الكوليسين E3 (Im3) وبروتين المناعة من البكتيريا (Im-Bac) من أيونات جزء بارزة من نوع b و / أو y التي تم إنشاؤها بواسطة الانقسام العمود الفقري للبوليبتيد (PBC) على الجانب C-terminal من حمض الأسبارتيك وحمض الجلوتاميك ومخلفات الهليون بواسطة آلية تجزئة تأثير حمض الأسبارتيك. البرنامج بمسح بسرعة في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم كله من سلالة بكتيرية. البرنامج أيضا يزيل تكراريا بقايا الأحماض الأمينية من تسلسل البروتين في حالة أن يتم اقتطاع تسلسل البروتين ناضجة. يمتلك تسلسل بروتين واحد أيونات الكتلة والشظايا بما يتفق مع تلك التي تم اكتشافها لكل بروتين مناعة. ثم تم فحص تسلسل المرشح يدويا للتأكد من إمكانية تعيين جميع أيونات الأجزاء المكتشفة. تمت إزالة ميثيونين N-terminal من Im3 بعد الترجمة ، في حين كان Im-Bac التسلسل الكامل. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا أن اثنين أو ثلاثة فقط من أيونات الشظايا غير التكميلية التي شكلتها لجنة البرنامج والميزانية ضرورية لتحديد تسلسل البروتين الصحيح. وأخيرا، تم تحديد مروج (صندوق SOS) في المنبع لجينات مضادة للبكتيريا والمناعة في جينوم بلازميد للسلالة البكتيرية.

Introduction

يشار إلى تحليل وتحديد البروتينات غير المهضومة عن طريق قياس الطيف الكتلي على أنه التحليل البروتيوميكي من أعلى إلى أسفل1،2،3،4. وهي الآن تقنية راسخة تستخدم تأين الرذاذ الكهربائي (ESI)5 وتحليلات الكتلة عالية الدقة6، وتقنيات التفكك المتطورة ، على سبيل المثال ، فصاب نقل الإلكترون (ETD) ، فصيل التقاط الإلكترون (ECD)7، الفصام فوق البنفسجي للصور (UV-PD)8، إلخ.

تقنية التأين الناعمة الأخرى هي desorption الليزر بمساعدة المصفوفة / التأين (MALDI)9،10،11 التي تم استخدامها على نطاق أقل على نطاق واسع للتحليل من أعلى إلى أسفل ، ويرجع ذلك جزئيا إلى أنها تقترن في المقام الأول إلى وقت الطيران (TOF) محللات الكتلة ، والتي لديها دقة محدودة مقارنة مع محللات الكتلة الأخرى. وعلى الرغم من هذه القيود، استغلت أدوات MALDI-TOF وMALDI-TOF-TOF للتحليل السريع من أعلى إلى أسفل للبروتينات النقية والخليط المجزئ وغير المكسر من البروتينات. لتحديد البروتينات النقية، الاضمحلال في المصدر (ISD) هو تقنية مفيدة بشكل خاص لأنه يسمح تحليل الطيف الكتلي (MS) من أيونات شظايا ISD، فضلا عن الطيف الكتلي جنبا إلى جنب (MS/ MS) من شظايا أيون البروتين توفير جزء تسلسل محدد في كثير من الأحيان من N- و C-termini من البروتين المستهدف، على غرار تسلسل إدمان12،13 . العيب في نهج ISD هو أنه ، كما هو الحال في تسلسل إدمان ، يجب أن تحتوي العينة على بروتين واحد فقط. ويعزى شرط البروتين الوحيد إلى الحاجة إلى إسناد أيونات الشظايا بشكل لا لبس فيه إلى أيونات السلائف. إذا كان هناك اثنين أو أكثر من البروتينات الموجودة في عينة، قد يكون من الصعب تعيين أي أيونات الشظايا تنتمي إلى أي أيونات السلائف.

ويمكن معالجة إسناد أيونات الشظايا/السلائف باستخدام الملدي -TOF-TOF-MS/MS. وكما هو الحال مع أي تجربة كلاسيكية لمرض التصلب العصبي المتعدد/ مرض التصلب العصبي المتعدد، فإن أيونات السلائف يتم اختيارها/عزلها على نطاق واسع قبل التفتت، ويمكن أن تعزى أيونات الشظايا المكتشفة إلى أيون سلائف محدد. ومع ذلك ، تقتصر تقنيات الانفصال المتاحة لهذا النهج على التفكك الناجم عن تصادم الطاقة العالية في المقام الأول (HE-CID)14 أو الاضمحلال بعد المصدر (PSD)15،16. HE-CID و PSD هي الأكثر فعالية في تجزئة الببتيدات والبروتينات الصغيرة، ويمكن أن تكون تغطية التسلسل، في بعض الحالات، محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، يؤدي PSD في شق العمود الفقري البولي ببتيد (PBC) في المقام الأول على الجانب C-المحطة من بقايا حمض الأسبارتيك والغلوتاميك من قبل ظاهرة تسمى تأثير حمض الأسبارتيك17،18،19،20.

وقد وجدت مالدي-TOF-MS أيضا تطبيق متخصصة في تحديد التصنيف من الكائنات الحية الدقيقة: البكتيريا21، الفطريات22، والفيروسات23. على سبيل المثال، تستخدم أطياف التصلب المتعدد لتحديد البكتيريا غير المعروفة بالمقارنة مع مكتبة مرجعية لأطياف MS للبكتيريا المعروفة باستخدام خوارزميات التعرف على الأنماط للمقارنة. وقد أثبت هذا النهج نجاحا كبيرا بسبب سرعته وبساطته، على الرغم من أنه يتطلب زراعة العزل بين عشية وضحاها. أيونات البروتين التي تم الكشف عنها من خلال هذا النهج (عادة تحت 20 كيلودا) تشمل بصمة MS السماح القرار التصنيفي على مستوى جنس والأنواع وفي بعض الحالات في الأنواع الفرعية24 وسلالة مستوى25،26. ومع ذلك، لا تزال هناك حاجة ليس فقط لتصنيف الكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض بشكل تصنيفي فحسب، بل أيضا تحديد عوامل خبيثة محددة، والسموم، وعوامل مقاومة مضادات الميكروبات (AMR). ولتحقيق ذلك، يتم قياس كتلة الببتيدات أو البروتينات أو الجزيئات الصغيرة بالتصلب المتعدد ثم عزلها وتجزئتها بواسطة MS/MS.

البكتيريا المسببة للأمراض غالبا ما تحمل قطع دائرية من الحمض النووي تسمى البلازميدات. البلازميدات، جنبا إلى جنب مع البروبهاج، هي ناقل رئيسي لنقل الجينات الأفقية بين البكتيريا وهي مسؤولة عن الانتشار السريع لمقاومة مضادات الميكروبات وغيرها من عوامل الفوعة عبر البكتيريا. قد تحمل البلازميدات أيضا جينات مضادة للبكتيريا (AB) ، على سبيل المثال ، كوليسين وبكتيريا. عندما يتم التعبير عن هذه الجينات وإفراز البروتينات ، فإنها تعمل على تعطيل آلات ترجمة البروتين من البكتيريا المجاورة التي تحتل نفس المكانة البيئية27. ومع ذلك ، يمكن أن تشكل هذه الإنزيمات المبيدة للبكتيريا خطرا على المضيف الذي أنتجها. ونتيجة لذلك ، يتم التعبير عن الجين من قبل المضيف الذي يمنع على وجه التحديد وظيفة إنزيم AB ويشار إليه باسم بروتين المناعة (Im).

وغالبا ما تستخدم المضادات الحيوية الضارة بالحمض النووي مثل mitomycin-C و ciprofloxacin للحث على استجابة SOS في الإشريكية القولونية المنتجة للسموم في شيغا (STEC) التي يوجد جين سم شيغا(stx) داخل جينوم البروجاب الموجود في الجينوم البكتيري28. لقد استخدمنا التعريفي المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل سابقا للكشف عن وتحديد أنواع Stx والأنواع الفرعية التي تنتجها سلالات STEC29،30،31،32. في العمل السابق، STEC O113:H21 سلالة RM7788 كان مثقف بين عشية وضحاها على وسائل الإعلام أجار تكملها mitomycin-C. ومع ذلك ، بدلا من الكشف عن المتوقع B - subunit من Stx2a في م / ض ~7816 ، تم الكشف عن أيون بروتين مختلف في م / ض ~ 7839 وحددت على أنها بروتين افتراضي بلازميد المشفرة من وظيفة غيرمعروفة 33. في العمل الحالي، حددنا اثنين من البروتينات AB-Im المشفرة بلازميد التي تنتجها هذه السلالة باستخدام تحريض المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل باستخدام برامج مستقلة وضعت لمعالجة ومسح في تسلسل البروتين سيليكو المستمدة من تسلسل الجينوم الكامل (WGS). وبالإضافة إلى ذلك، أدرجت إمكانية إدخال تعديلات بعد الترجمة تتضمن اقتطاع التسلسل في البرنامج الحاسوبي. تم تحديد بروتينات المناعة باستخدام هذا البرنامج من الكتلة المقاسة من أيون البروتين الناضج أيونات جزء تسلسل محدد من لجنة البرنامج والميزانية الناجمة عن تأثير حمض الأسبارتيك والكشف عنها من قبل MS / MS-PSD. وأخيرا، تم تحديد مروج المنبع من الجينات AB / ايم في الجينوم البلازميد التي قد تفسر التعبير عن هذه الجينات عندما تتعرض هذه السلالة لمضاد حيوي ضار بالحمض النووي. تم تقديم أجزاء من هذا العمل في الاجتماع الافتراضي للجمعية الكيميائية الأمريكية الوطنية خريف 2020 والمعرض (17-20 أغسطس 2020)34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد العينة الميكروبيولوجية

  1. تلقيح 25 مل من مرق لوريا (LB) في أنبوب مخروطي 50 مل مع E. coli O113:H21 سلالة RM7788 (أو سلالة بكتيرية أخرى) من مخزون الجلسرين باستخدام حلقة معقمة 1 ميكرولتر. كب الأنبوب وما قبل الثقافة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز (200 دورة في الدقيقة) لمدة 4 ساعة.
  2. Aliquot 100 ميكرولتر من مرق ما قبل المستزرعة وانتشرت على لوحة أجار LB تكملها مع 400 أو 800 نانوغرام / مل من mitomycin-C. لوحات أجار الثقافة ثابت بين عشية وضحاها في حاضنة في 37 درجة مئوية.
    تنبيه: سلالات STEC هي كائنات دقيقة مسببة للأمراض. إجراء جميع التلاعبات الميكروبيولوجية، وراء زراعة، في خزانة السلامة البيولوجية BSL-2.
  3. حصاد الخلايا البكتيرية من مستعمرات مرئية واحدة باستخدام حلقة معقمة 1 ميكرولتر ونقلها إلى 2.0 مل O-حلقة مبطنة المسمار كاب أنبوب الطرد الدقيق التي تحتوي على 300 ميكروغرام من المياه HPLC الصف. كاب الأنبوب، دوامة لفترة وجيزة، والطرد المركزي في 11،337 × ز لمدة 2 دقيقة لبيليه الخلايا.

2. قياس الطيف الكتلي

  1. بقعة 0.75 ميكرولتر aliquot من عينة supernatant على الهدف MALDI الفولاذ المقاوم للصدأ والسماح لها لتجف. تراكب بقعة عينة المجففة مع a0.75 ميكرولتر aliquot من محلول مشبع من حمض السنابيني في 33٪ أسيتونيتريل، 67٪ من الماء، و 0.2٪ حمض ثلاثي الفلوروسيتيك. السماح بقعة لتجف.
  2. تحليل بقع العينة المجففة باستخدام مطياف كتلة MALDI-TOF-TOF.
    1. بعد تحميل هدف MALDI في مطياف الكتلة، انقر فوق الزر للحصول على الوضع الخطي MS في برنامج الاستحواذ. أدخل نطاق m/z المطلوب تحليله بإدخال m/z في الحدين السفلي والعلوي (على سبيل المثال، 2 كيلو دا إلى 20 كيلودا) في حقول كل منهما في برنامج أسلوب الاستحواذ.
    2. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على القالب الهدف MALDI في البرنامج. ثم قم باكتئاب زر الماوس الأيسر واسحب مؤشر الماوس فوق بقعة العينة لتحديد المنطقة المستطيلة التي سيتم أخذ عينات منها لإجراء إزالة/تأين بالليزر. تحرير زر الماوس واقتناء ستبدأ. جمع 1000 طلقة ليزر لكل بقعة عينة.
      ملاحظة: يتم عرض الحصول على البيانات في الوقت الحقيقي في إطار اقتناء البرامج.
    3. إذا لم يتم الكشف عن أيونات، قم بزيادة كثافة الليزر عن طريق ضبط شريط مقياس الانزلاق تحت كثافة الليزر في البرنامج حتى يتم الكشف عن إشارة أيون البروتين. ويشار إلى ذلك على أنه عتبة.
      ملاحظة: قبل تحليل عينة بقعة، معايرة خارجيا الصك في الوضع الخطي MS مع calibrants البروتين الذي m / z تمتد النطاق الذي يجري تحليله، على سبيل المثال، و +1 و +2 الدولة تهمة من calibrants البروتين: السيتوكروم-C، lysozyme، والميوجلوبين تغطي مجموعة كتلة من 2 كدا إلى 20 كيلودا. وتستخدم كتلة متوسطة ضمن نطاق الكتلة المحدد ككتلة تركيز، على سبيل المثال، 9 كيلودا. كتلة التركيز هي الأيون الذي يركز m/z بشكل أمثل للكشف عن طريق كاشف الوضع الخطي.
    4. عند اكتمال اكتساب الوضع الخطي MS، انقر فوق الزر للحصول على وضع انعكاس MS/MS في برنامج الاستحواذ. أدخل كتلة السلائف ليتم تحليلها في حقل كتلة السلائف. بعد ذلك، أدخل عرض العزلة (في Da) في نافذة كتلة السلائف للجانب الكتلي المنخفض والعالي من كتلة السلائف، على سبيل المثال، ±100 Da.
    5. انقر على زر إيقاف CID. انقر فوق الزر "منع Metastable على". ضبط كثافة الليزر إلى ما لا يقل عن 90٪ من قيمته القصوى عن طريق ضبط شريط مقياس انزلاق تحت كثافة الليزر في البرنامج.
    6. انقر فوق عينة بقعة لتحليلها على القالب الهدف MALDI في البرنامج. ثم قم باكتئاب زر الماوس الأيسر واسحب مؤشر الماوس فوق عينة البقعة لتحديد المنطقة المستطيلة التي سيتم أخذ عينات منها لإجراء إزالة الليزر/التأين. تحرير زر الماوس، وسوف تبدأ اقتناء. جمع 10000 طلقات الليزر لكل بقعة عينة.
      ملاحظة: قبل تحليل بقعة العينة، ينبغي معايرة الأداة خارجيا في وضع MS/MS-reflectron باستخدام أيونات الشظايا من تسوس ما بعد المصدر (PSD) لحالة الشحن +1 من ثيوريجوشين35.
  3. لا تعالج بيانات MS الخام. معالجة MS/MS-PSD البيانات الخام باستخدام التسلسل التالي من الخطوات بالترتيب المحدد: تصحيح خط الأساس المتقدم (32، 0.5، 0.0) متبوعا إزالة الضوضاء (انحرافين قياسيين) متبوعا تنعيم الغاوسية (31 نقطة).
  4. فحص بيانات MS/MS-PSD يدويا للتأكد من وجود أيونات أجزاء بارزة تم إنشاؤها بواسطة PBC19و20.
  5. تقييم بيانات MS/MS فيما يتعلق بالوفرة المطلقة والنسبية لأيونات الشظايا وإشارة إلى ضوضاء (S/N). استخدم فقط أيونات الأجزاء الأكثر وفرة لتحديد البروتين ، خاصة إذا كانت بيانات MS / MS-PSD صاخبة.

3. في بناء قاعدة بيانات بروتين سيليكو

  1. إنشاء ملف نصي يحتوي على تسلسل بروتين سيليكو من السلالة البكتيرية ، والتي سيتم مسحها ضوئيا من قبل برنامج البروتين Biomarker الباحث عن تحديد البروتين. وتستمد تسلسل البروتين من تسلسل الجينوم الكامل (WGS) من سلالة يجري تحليلها (أو سلالة وثيقة الصلة).
  2. الوصول إلى موقع NCBI / PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) لتحميل ما يقرب من 5000 تسلسل البروتين من سلالة بكتيرية محددة (على سبيل المثال، Escherichia القولونية O113:H21 سلالة RM7788) يجري تحليلها. الحد الأقصى لحجم التنزيل هو 200 تسلسل.
    1. ونتيجة لذلك، نسخ ولصق التنزيلات 25 في ملف نصي واحد. حدد تنسيق FASTA (نص) لكل تنزيل.

4. تشغيل البروتين Biomarker الباحث البرمجيات

  1. انقر نقرا مزدوجا على الملف القابل للتنفيذ الباحث عن العلامات الحيوية البروتين. ستظهر نافذة واجهة مستخدم رسومية (GUI)(الشكل 1، اللوحة العلوية).
  2. أدخل كتلة العلامات الحيوية للبروتين (كما تقاس في الوضع الخطي MS) في حقل كتلة البروتين الناضجة. بعد ذلك، أدخل خطأ قياس الكتلة في حقل التسامح الجماعي. الخطأ القياسي لقياس الكتلة هو ±10 دا لبروتين دا 10000.
  3. اختياريا، انقر على زر حاسبة كتلة البروتين التكميلي b/y أيون من أجل حساب كتلة البروتين من زوج أيون جزء تكميلي المفترض (CFIP أو b/y). ستظهر نافذة منبثقة، أداة حاسبة كتلة البروتين (الشكل 1، اللوحة السفلية).
    1. أدخل m/z من CFIP المفترض وانقر على زر إضافة زوج. ستظهر كتلة البروتين المحسوبة.
    2. نسخ ولصق هذا الرقم في حقل الكتلة البروتين ناضجة وإغلاق نافذة أداة حاسبة كتلة البروتين.
  4. حدد طول إشارة ببتيد N-terminal بالنقر فوق مربع تقييد المخلفات المحددة. ستظهر نافذة منبثقة ذات مقياس ومؤشر منزلق. حرك المؤشر إلى طول الببتيد المطلوب للإشارة (الحد الأقصى 50). إذا لم يتم تحديد طول الببتيد إشارة، سيتم إجراء اقتطاع تسلسل غير مقيد من قبل البرنامج.
  5. تحت شرط أيون جزء في واجهة المستخدم الرسومية، حدد بقايا لانشقاق العمود الفقري البولي ببتيد (PBC). انقر على صناديق واحد أو أكثر من المخلفات: D، E، N، و / أو P.
    1. انقر على زر إدخال أيونات الأجزاء (+1) ليتم البحث فيها. ستظهر صفحة جزء منبثقة. بعد ذلك، انقر على زر إضافة جزء أيون، والذي يتوافق مع عدد أيونات الأجزاء التي سيتم إدخالها، أي بنقرة واحدة لكل أيون جزء. سيظهر حقل منسدل لكل أيون جزء يتم إدخاله.
    2. أدخل m/z من أيونات الأجزاء وتفاوت m/z المقترن بها. عند الانتهاء، انقر على الزر حفظ وإغلاق.
      ملاحظة: التسامح m/z معقول هو ±1.5.
    3. حدد الحد الأدنى لعدد أيونات الأجزاء التي يجب مطابقتها لتعريف عن طريق التمرير إلى الرقم المطلوب في المربع إلى يمين عدد أيونات الأجزاء التي تحتاج إلى مطابقة.
      ملاحظة: يجب أن تكون ثلاث مباريات كافية.
    4. حدد بقايا السيستين لتكون في حالتها المؤتأكسدة عن طريق النقر على الدائرة المقابلة. إذا لم يتم العثور على تحديدات البروتين بعد البحث، كرر البحث مع السيستين في حالتها المخفضة. إذا لم يتم العثور على أية هويات بعد البحث، قم بتوسيع تفاوت أيون جزء إلى ±3 وتكرار البحث.
  6. ضمن إعداد الملف، انقر فوق الزر تحديد FASTA File لاستعراض وتحديد الملف FASTA (النص) الذي يحتوي على تسلسل بروتين السيليكو في السلالة البكتيرية التي تم إنشاؤها سابقا في خطوات البروتوكول من 3.1 إلى 3.2. ثم حدد مجلد إخراج ثم قم بإنشاء اسم ملف إخراج.
  7. انقر على زر تشغيل البحث في إدخالات الملفات. ستظهر نافذة منبثقة بعنوان تأكيد معلمات البحث (الشكل 1، اللوحة السفلية) ، تعرض معلمات البحث قبل بدء البحث.
  8. إذا كانت معلمات البحث صحيحة، فانقر على زر بدء البحث. إذا لم تكن معلمات البحث صحيحة، فانقر على زر إلغاء الأمر ثم قم بإعادة إدخال المعلمات الصحيحة. بمجرد بدء البحث، تغلق نافذة المعلمة، وتظهر نافذة منبثقة جديدة مع شريط تقدم(الشكل 1،اللوحة السفلية) تظهر تقدم البحث وعدد الهويات التي تم العثور عليها.
  9. عند الانتهاء من البحث (بضع ثوان) ، شريط التقدم يغلق تلقائيا ، ويتم عرض ملخص للبحث في حقل سجل واجهة المستخدم الرسومية(الشكل 2، لوحة أعلى). بالإضافة إلى ذلك، ستظهر نافذة منبثقة جديدة تعرض أيضا تعريف البروتين (البروتينات) إن وجدت(الشكل 2،اللوحة السفلية).
    ملاحظة: في تسلسل بروتين سيليكو وجود بقايا غير معترف بها، على سبيل المثال، U أو X، يتم تخطي تلقائيا من التحليل ويتم الإبلاغ عن هذه التسلسلات في وقت لاحق مع نافذة منبثقة منفصلة لتنبيه المشغل إلى أي (إن وجدت) تم تخطي تسلسل عند الانتهاء من البحث.

5. تأكيد ما بعد البحث من تسلسل البروتين

  1. تأكيد صحة تسلسل المرشحين بواسطة التحليل اليدوي.
    ملاحظة: الغرض من برنامج الباحث عن العلامات الحيوية البروتين هو تحديد تسلسل البروتين بدقة عالية عن طريق القضاء على العديد من تسلسل البروتين غير صحيحة من النظر ودمج اقتطاع تسلسل ممكن PTM في البروتين ناضجة. وبما أن عدد تسلسلات المرشحين المحتملة التي يتم إرجاعها قليل، فإن التأكيد اليدوي يمكن التحكم فيه.
  2. إنشاء جدول متوسط m/z من أيونات جزء من نوع b و y من تسلسل المرشح باستخدام أي برنامج قياس الطيف الكتلي أو proteomic وجود مثل هذه الوظائف. قارن متوسط m/z في أيونات شظايا السيليكو على الجانب C-terminal من D-و E-و N-residues (وعلى الجانب N-terminal من بقايا P) ب m/z من أيونات الشظايا البارزة من بيانات MS/MS-PSD.
    ملاحظة: يجب أن تكون أيونات جزء MS/MS-PSD الأبرز مطابقة بسهولة إلى D-و E-و N المقترنة في أيونات جزء سيليكو. ومع ذلك، فإن تأثير حمض الأسبارتيك آلية التجزئة أقل كفاءة بالقرب من N- أو C-termini من تسلسل البروتين36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الشكل 3 (لوحة أعلى) يظهر MS من STEC O113:H21 سلالة RM7788 مثقف بين عشية وضحاها على LBA تكملها مع 400 نانوغرام / مل mitomycin-C. وقد تم تحديد القمم في m/z 7276 و 7337 و 7841 سابقا كبروتين الصدمة الباردة C (CspC) وبروتين الصدمة الباردة E (CspE) وبروتين محمول بلازميد غير معروف الوظيفة ، على التوالي33. تم تحليل أيون البروتين في m/z 9780 [M +H]+ من قبل MS/MS-PSD كما هو موضح في الشكل 3 (اللوحة السفلية). تم عزل أيون السلائف مع نافذة محدد الأيونات (TIS) في الوقت المناسب ±100 Da. يتم تحديد أيونات الأجزاء بواسطة m/z ونوع / رقم. أيون جزء في m/z 2675.9 (أبرز مع نجمة) هو امتداد من تفكك أيون البروتين ميتاستابل في م / ض 9655 هو مبين في الشكل 3 (لوحة أعلى). يظهر المتوسط النظري m/z لكل أيون جزء بين قوسين استنادا إلى PBC لتسلسل بروتين المناعة كولايسين E3 (Im3) الموضح أعلاه. يتم تمييز مواقع لجنة البرنامج والميزانية مع النجمة الحمراء مع الجزء المقابلة أيون (ق) المنتجة. يتم التأكيد على الميثيونين N-terminal مما يدل على أنه تتم إزالته بعد الترجمة في البروتين الناضج. التسلسل يحتوي على بقايا السيستين واحد (محاصر) ، وبالتالي يعتبر في حالته المخفضة.

باستخدام كتلة من البروتين العلامات الحيوية وعدد قليل من الأيونات جزء بارز غير مكملة: م / ض 1813.8، 2128.9، و4293.7 (±1.5 التسامح) (الشكل 1، لوحة أسفل) وتقييد لجنة البرنامج والميزانية إلى الجانب C-المحطة الطرفية من D- و E-المخلفات، تم الإبلاغ عن تسلسل مرشح واحد فقط من قبل البرنامج: Im3 تسلسل البروتين (دون ميثيونين N-المحطة الطرفية) (الشكل 2 ، اللوحة السفلية). عند اختيار أيونات الشظايا للبحث، ينبغي التأكيد على أن أي مجموعة من أيونات الشظايا غير التكميلية تفترض أن تلخيص m/z لأي أيونات جزءين في المجموعة (وطرح بروتونين) يؤدي إلى مجموع كتلة لا يندرج ضمن كتلة العلامة الحيوية والتسامح الكتلي المرتبط بها (±10 Da). كشف مشروع WGS من RM7788 5008 تسلسل البروتين (إطارات القراءة المفتوحة)37. من هذه ~ 5000 تسلسل البروتين الكامل ، 189490 تسلسل كامل وجزئي (اقتطاع غير مقيد) تلبي معايير كتلة العلامات الحيوية(الشكل 2، لوحة أعلى). ثم تخضع تلك التسلسلات التي تمر بمعايير الكتلة في سيليكو بي بي سي على الجانب C-terminal من D-و/أو E-residues. ثم تتم مقارنة أيونات الأجزاء الناتجة التي تم إنشاؤها إلى أيونات الأجزاء الملاحظة التي تم إدخالها. واستند تسلسل المرشح الذي أبلغ عنه البرنامج فقط إلى كتلته وثلاثة مواقع للجنة البرنامج والميزانية الخاصة بالحاقد و/أو E. وستناقش في الفرع التالي خصوصية هذا الكم الضئيل من المعلومات.

كما هو مبين في الشكل 3 (لوحة أسفل), الأيونات جزء الأكثر وفرة هي نتيجة لجنة البرنامج والميزانية على الجانب C-المحطة من D- و E-المخلفات عن طريق تأثير حمض الأسبارتيك آلية تجزئة19,20. ويلاحظ وجود اثنين من CFIP: b67/y17 (م/ض 7645.1 / م/ض 2128.9) وب70/y14 (م/ض 7959.4 / م/ض 1813.8). ويمكن استخدام هذه CFIP لحساب أكثر دقة كتلة أيون السلائف البروتين باستخدام صيغة بسيطة: ب (م / ض) + y (م / ض) - 2H+ = كتلة البروتين (دا)33. باستخدام اثنين من CFIP، نحصل على كتلة متوسط البروتين: 9771.6 دا، وهو أقرب إلى قيمته النظرية من 9772.5 دا من الكتلة المقاسة من أيون البروتين في الوضع MS الخطي: 9779 دا (الشكل 3، لوحة أعلى). تم الكشف عن عدد قليل فقط من CFIP لأن معظم أيونات السلائف وجود بروتون المؤينة عزل في بقايا أرجينين فقط: R80. ومن المرجح أن تكون أساسيات مرحلة الغاز الأعلى للأرجينيين (237.0 سعرة حرارية/مول38)مقارنة ببقايا اللسين (K) (221.8 سعرة حرارية/مول38)مسؤولة عن العزل التفضيلي للبروتون المؤين في بقايا R الوحيدة.

الشكل 4 (لوحة أعلى) يظهر MS من STEC O113:H21 سلالة RM7788 مثقف بين عشية وضحاها على LBA تكملها مع 800 نانوغرام / مل mitomycin-C. الشكل 4 (أعلى لوحة) يشبه إلى حد بعيد الشكل 3 (لوحة أعلى)، على الرغم من أن هناك اختلافات في وفرة النسبية لبعض الأيونات البروتين بسبب الاختلافات في تركيزات المضادات الحيوية المستخدمة. وهناك أيضا تحولات طفيفة في البروتين العلامات الحيوية م / ض التي تعكس الاختلافات في المعايرة الخارجية للأداة في أيام مختلفة. مرة أخرى، أيونات البروتين في m/z 7272، 7335، و 7838 هي CspC، CspE، والبروتين المنقولة بلازميد، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، فإننا الكشف عن أيون البروتين Im3 في m/z 9778 (وإن كان مع وفرة أقل مما كانت عليه في الشكل 3)وكذلك أيون البروتين في م / ض 9651 [M + H]+. الشكل 4 (اللوحة السفلية) يظهر MS/MS-PSD من أيون السلائف البروتين في m/z 9651. تم عزل أيون السلائف باستخدام إطار TIS أضيق وغير متماثل من -75/+60 دا للقضاء على مساهمات أيونات البروتين المجاورة في m/z 9539 و 9778. يتم تعريف أيونات الأجزاء بواسطة m/z الخاصة بها ونوعها/رقمها. يظهر تسلسل بروتين المناعة للبكتيريا (Im-Bac) أعلاه. يتم تمييز مواقع PBC بعلامة نجمية حمراء مع أيونات الأجزاء المقابلة لها. كما يظهر المتوسط النظري m/z لكل أيون جزء بين قوسين في الطيف. تسلسل ايم باك أيضا بقايا السيستين واحد (محاصر) ، وبالتالي يعتبر في حالتها المخفضة.

باستخدام كتلة العلامات الحيوية البروتين، ثلاثة الأيونات جزء بارز غير مكملة: m/z 2675.4, 3853.5, و 5772.8 (±1.50 التسامح) من الشكل 4 وتقييد لجنة البرنامج والميزانية إلى الجانب C-المحطة الطرفية فقط من D- و / أو E- و / أو asparagine (N)-المخلفات, تم الإبلاغ عن تسلسل مرشح واحد فقط من قبل البرنامج: بروتين ايم باك. تم استرجاع تسلسل المرشح بعد مسح 191,375 تسلسلا كاملا أو جزئيا يستوفي معيار كتلة العلامات الحيوية والتسامح (±10 Da). تم تحديد تسلسل المرشح من خلال البرنامج القائم فقط على كتلته وثلاثة مواقع D و /أو E و / أو N-محددة PBC.

وكانت أبرز أيونات الشظايا في الشكل 4 (اللوحة السفلية) مرة أخرى نتيجة للجنة البرنامج والميزانية على الجانب C-terminal من D و/أو المخلفات الإلكترونية وكذلك على الجانب N-terminal من أحد بقايا P20. نلاحظ أيضا لجنة البرنامج والميزانية على الجانب C-المحطة الطرفية من N-المخلفات التي من المرجح أيضا أن تحدث من قبل آلية تجزئة حمض الأسبارتيك مثل تأثير39,40. يؤدي ضعف إشارة أيون السلائف البروتينية إلى عدد محدود من أيونات الشظايا القابلة للتفسير. تنخفض دقة جزء أيون m/z مع وفرة أيونات الشظايا. لم يتم الكشف عن CFIP بسبب يفترض أن البروتون المؤين يجري عزلها في بقايا أرجينين فقط (R74) من تسلسل أيون البروتين. تحتوي جميع أيونات الشظايا على بقايا R74، بما يتفق مع هذه الفرضية.

مروج جينات المناعة المضادة للبكتيريا
الشكل 5 يظهر جزءا من 6482 نقطة أساس contig00100 من سلالة الإشريكية القولونية RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) من تسلسل بندقية الجينوم كله37. يتم تسليط الضوء على مناطق الترميز للكولايسين E3 ، وبروتين المناعة (Im3) ، وبروتين المناعة للبكتيريا (Im-Bac) ، وبروتين التحلل باللون الأصفر. المنبع من منطقة الترميز للجين كولايسين E3 هي منطقة -35، مربع Pribnow (PB)، تكرار مقلوب من مربع SOS، وتألق-Dalgarno/ribosomal موقع الربط (SD / RBS)27. هناك تسعة قاعدة الزوج منطقة بين القولونية E3 وIm3. LexA (بروتين المكبوت وautpeptidase) يربط إلى مربع SOS منع التعبير عن الجينات المصب. عند تلف الحمض النووي (على سبيل المثال، الأشعة فوق البنفسجية أو المضادات الحيوية الضارة بالحمض النووي)، تخضع LexA لانشقاق ذاتي مما يسمح بالتعبير عن الجينات في المصب27،28. وبالتالي ، فإن التعبير عن هذين البروتينين المناعيين يتسق مع تعرض هذه السلالة لمضاد حيوي ضار بالحمض النووي.

Figure 1
الشكل 1: لقطات الشاشة من البروتين Biomarker الباحث البرمجيات. أعلى لوحة: واجهة المستخدم الرسومية (GUI) من البروتين Biomarker الباحث البرمجيات. اللوحات السفلية: نوافذ منبثقة من أداة حاسبة كتلة البروتين، صفحة الأجزاء، تأكيد معلمات البحث، وشريط تقدم البحث. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2:نتائج البحث لتحديد البروتين باستخدام البروتين Biomarker الباحث البرمجيات. أعلى لوحة: ملخص نتائج البحث المعروضة في سجل حقل البرمجيات واجهة المستخدم الرسومية. اللوحة السفلية: نافذة منبثقة تعرض تعريف البروتين باستخدام البرنامج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: تحليل الطيف الكتلي لسلالة STEC O113:H21 RM7788. أعلى لوحة: MS من STEC O113:H21 سلالة RM7788 مثقف بين عشية وضحاها على LBA تكملها مع 400 نانوغرام / مل mitomycin-C. اللوحة السفلية: MS/MS-PSD من أيون السلائف البروتينية عند m/z 9780 (اللوحة العليا). تم عزل أيون السلائف مع نافذة TIS ±100 دا. يتم تحديد أيونات جزء من قبل m /z ونوع الأيونات الخاصة بهم. يظهر تسلسل بروتين المناعة للكوليسين E3 (Im3). يتم تمييز المخلفات الأساسية (مواقع عزل الشحن المحتملة) باللون الأزرق. يتم تمييز PBC مع علامة نجمية حمراء مع الجزء المقابل أيون (ق) التي تم إنشاؤها. يظهر المتوسط النظري m/z لكل أيونات الأجزاء بين قوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحليل الطيف الكتلي لسلالة STEC O113:H21 RM7788. أعلى لوحة: MS من STEC O113:H21 سلالة RM7788 مثقف بين عشية وضحاها على LBA تكملها مع 800 نانوغرام / مل mitomycin-C. اللوحة السفلية: MS/MS-PSD من أيون السلائف البروتينية عند m/z 9651 (اللوحة العليا). عزلت أيونات السلائف بنافذة غير متماثلة من TIS من -75 على الجانب المنخفض m/z من أيون السلائف و +60 على الجانب العالي m/z من أيون السلائف. يتم تحديد أيونات الشظايا حسب نوع m/z والأيون. يظهر تسلسل بروتين المناعة من البكتيريا (Im-Bac). يتم تمييز المخلفات الأساسية (مواقع عزل الشحن المحتملة) باللون الأزرق. يتم تمييز PBC مع علامة نجمية حمراء مع الجزء المقابل أيون (ق) التي تم إنشاؤها. يظهر المتوسط النظري m/z لكل أيون جزء بين قوسين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:تحليل قسم من الجينوم البلازميد الذي يحمله E. coli O113:H21 سلالة RM7788. جزء من 6482 نقطة أساس contig00100 من E. coli O113:H21 سلالة RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) من تسلسل بندقية الجينوم كله37. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الملف التكميلي 1 (S1 Im3): نتائج تحليل القياس من البرمجيات باستخدام أيونات جزء مختارة من Im3 (من الشكل 3، لوحة القاع). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2 (S2 ImBac): نتائج تحليل القياس من البرمجيات باستخدام أيونات جزء مختارة من ايم باك (من الشكل 4، لوحة القاع). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

اعتبارات البروتوكول
وتتمثل نقاط القوة الرئيسية للبروتوكول الحالي في سرعته وبساطة إعداد العينات واستخدام أداة يسهل تشغيلها نسبيا والتدريب عليها وصيانتها. على الرغم من أن التحليل البروتيوميكي من أسفل إلى أعلى ومن أعلى إلى أسفل بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة-ESI-HR-MS موجود في كل مكان ومتفوقا بكثير في العديد من النواحي على من أعلى إلى أسفل من قبل MALDI-TOF-TOF، إلا أنها تتطلب المزيد من الوقت والعمل والخبرة. ويمكن أن يؤثر تعقيد الأجهزة في كثير من الأحيان على ما إذا كان من المرجح أن يعتمد علماء غير مدربين رسميا على قياس الطيف الكتلي منصات معينة للآلات. يهدف النهج من أعلى إلى أسفل مع MALDI-TOF-TOF إلى توسيع نطاق تحليل MALDI-TOF-MS إلى ما هو أبعد من استخدامه الحالي لتحديد البكتيريا التصنيفية في مختبرات علم الأحياء المجهرية السريرية مع عدم زيادة العمل أو التعقيد أو الخبرة المطلوبة للتحليل بشكل كبير.

لا يستخدم البروتوكول أي خطوة تحلل خلية ميكانيكية (أو كهربائية). على الرغم من أنه قد يتم الكشف عن البروتينات المفرزة أو خارج الخلية باستخدام البروتوكول ، فقد تم تطوير نسخة سابقة من هذه الطريقة لأول مرة للكشف عن سم شيغا (Stx) من سلالات STEC حيث يؤدي تحريض المضادات الحيوية إلى استجابة SOS البكتيرية مما يؤدي إلى التعبير عن جينات phage ، بما في ذلك جينات الستاكس وكذلك جينات phage المتأخرة المسؤولة عن تحلل الخلايا البكتيرية41 . وجدنا أن تحلل الخلايا الناجم عن المضادات الحيوية له مزايا معينة للكشف عن ستيكس وكذلك بروتينات البلازميد التي لديها مروجين SOS (العمل الحالي). بالتأكيد ، يمكن أيضا استخدام تحلل الخلايا الميكانيكية (مثل ضرب الخرز) (على الرغم من عدم استخدامه في العمل الحالي). ومع ذلك ، يؤدي التحلل الميكانيكي إلى جميع الخلايا البكتيرية التي يتم التخلص منها (وليس الخلايا المستحثة ببساطة) مما يؤدي إلى إثراء العينة ببروتينات مضيفة وفيرة ومحافظ عليها للغاية يمكن أن تجعل الكشف عن بروتينات الفاج وبلازميد من عينة غير انكسارية أكثر تحديا.

تم العثور على تركيزات المضادات الحيوية لسلالة بكتيرية لتكون قابلة للاستنساخ بشكل عام فيما يتعلق بالبروتينات الناجمة عن المضادات الحيوية التي تم اكتشافها. لاحظنا اختلافات في وفرة البروتين النسبي فيما يتعلق بالبروتينات الناجمة عن المضادات الحيوية التي تم اكتشافها. وبما أن تحليلنا نوعي (وليس كميا)، فإن وفرة العلامات الحيوية للبروتين لا تحتاج إلا إلى أن تكون كافية لتحليل مرض التصلب العصبي المتعدد/التصلب المتعدد الكافي. يتم استزراع سلالة STEC المفترضة لأول مرة مع مجموعة من تركيزات المضادات الحيوية (على سبيل المثال ، 300 نانوغرام / مل إلى 2000 نانوغرام / مل من mitomycin-C) لتحديد التركيز الأمثل بحيث يؤدي إلى استجابة SOS البكتيرية مع الاستمرار في توفير ما يكفي من الخلايا البكتيرية للحصاد. لسلالة STEC RM7788، وجدنا أن تركيز المضادات الحيوية الأمثل للكشف عن المؤشرات الحيوية التي تم تحديدها كان 400 إلى 800 نانوغرام / مل من mitomycin-C.

بالإضافة إلى اقتطاع تسلسل البروتين، يمكن أن تحتوي بروتينات الإشريكية القولونية على PTMs تتضمن إضافة كتلة، على سبيل المثال، الفوسفور، الجليكوزيليشن، إلخ. وبما أن MS/MS يستخدم PSD للتفكك بين أيونات البروتين الميتاستابل المشحونة بشكل مغر (أقل من 20 كيلودا في الكتلة) التي تولدها MALDI ، فمن المرجح أن تخضع PTMs المرفقة بسلاسل جانبية للمخلفات لخسارة فصيلية سهلة لأن PSD تقنية فصيلة إرغودية. ويمكن الاستدلال على وجود هذه الأجهزة من ظهور أيون جزء قريب من كتلته من أيون السلائف الأصلي (ناقص كتلة PTM) في بيانات MS/MS. ومع ذلك، لن تتمكن شعبة القطاع الخاص أو البرنامج من تحديد مكان إرفاق هذه الأجهزة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للبرنامج تحديد البروتينات من أيونات جزء من لجنة البرنامج والميزانية وليس فقدان فصام للجزيئات الصغيرة (مثل الماء أو الأمونيا) أو PTMs تعلق على السلاسل الجانبية من المخلفات. ومع ذلك ، إذا تم الكشف عن أيونات جزء من لجنة البرنامج والميزانية ، لا يزال من الممكن تحديد البروتين باستخدام البرنامج إما عن طريق توسيع نافذة تحمل كتلة البروتين لتشمل كتلة PTM أو ببساطة دخول كتلة أيون جزء البروتين المقابل للخسارة الفصامية ل PTM المشتبه به. أي تحديد من قبل البرنامج سيكون من تسلسل البروتين دون PTM. ومن المثير للاهتمام، أننا لم نكتشف البروتينات وجود الفوسفور، الجليكوزيليشن، وما إلى ذلك في عملنا البكتيري حتى الآن. غير أن ذلك قد يعزى إلى: وفرة هذه الأجهزة النسبية من جانب مالدي، أو النطاق الكتلي المستخدم: 2-20 كيلودا، أو أن هذه الكائنات قد تكون مختبرية على نحو غير عادي وقد لا تنجو من تطبيق مصفوفة MALDI، أو أن هذه ال PTMs قد تتعرض لخسارة فصيلية سريعة جدا في المصدر قبل تسارع الأيونات من المصدر.

حاليا، لا يتضمن البرنامج السيستين الألكيليشن، وبروتوكول العينة لدينا لا يتضمن خطوة الحد من ثاني كبريتيد لمخلفات السيستين. وقد تم توضيح البروتوكول للإشارة إلى أن البحث سيتم تشغيله ببقايا السيستين في حالتها المؤأكسدة ، وإذا لم يتم الحصول على تحديد الهوية ، ثم لتنفيذ البحث مرة أخرى مع بقايا السيستين في حالتها المخفضة. إذا لم يتم العثور على أية هويات مرة أخرى، توسيع التسامح أيون جزء إلى ±2 أو ±3 يخفض عتبة أيون جزء مطابقة السماح تسلسل مع السيستينات لتكون مطابقة سواء كانت موجودة في حالاتها المؤأكسدة و / أو مخفضة.

تحليل بروتيومي من أعلى إلى أسفل بواسطة قياس الطيف الكتلي MALDI-TOF-TOF
وقد تم تحقيق معظم التحليل البروتيوميك من أعلى إلى أسفل باستخدام ESI ومنصات قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. وعلى النقيض من ذلك، أجري عدد أقل من التحليلات البروتيوميكية من أعلى إلى أسفل باستخدام منصات MALDI-TOF-TOF. ونتيجة لذلك، هناك القليل جدا من أعلى إلى أسفل البرمجيات بروتيوميك لتحليل أيونات البروتين ميتاستابل مشحونة بشكل خبيث ولدت وتحليلها من قبل MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD التي تستغل تأثير حمض الأسبارتيك للتجزئة15،42. وهناك عدد من الأسباب لذلك. أولا، إن كفاءة تأين MALDI منحازة نحو الببتيدات والبروتينات ذات الوزن الجزيئي المنخفض، وهذا التحيز واضح بشكل خاص مع خليط من البروتينات كما يمكن العثور عليه في lysate الخلايا البكتيرية غير المهتكسرة. ثانيا، يولد MALDI الدول تهمة منخفضة، وهناك القليل أو معدومة كولوم التنافر لتسهيل الفصام أيون البروتين. ثالثا، تغطية تسلسل PSD محدودة جدا على عكس التقنيات الأخرى ECD7، ETD7، UV-PD8، إلخ. رابعا، تنخفض كفاءة تجزئة شعبة القطاع الخاص مع زيادة كتلة أيون البروتين. خامسا، تميل تقنيات التفكك الإرغودي، مثل PSD، إلى أن تؤدي إلى فقدان فصامات سهلة من PTMs المرتبطة بالمخلفات، مثل الفوسفور، والتكسير، وما إلى ذلك، مما يجعل من الصعب تحديد موقع مرفق PTM. وعلى الرغم من هذه القيود الشديدة، فإن التحليل من أعلى إلى أسفل باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD له مزايا واضحة، مثل بساطة إعداد العينة، وعدم فصل LC، وعزل أيونات البروتين الميتاستابل بواسطة MS/MS مما يسمح بإسناد أيونات الشظايا إلى أيونات السلائف، وتحديد PTMs التي تنطوي على اقتطاع التسلسل وروابط ثنائي الكبريت داخل الجزيئية والأهم من ذلك سرعة التحليل. عند دمجها مع تسلسل بروتين السيليكو المستمدة من بيانات WGS ، يمكن لهذه التقنية توفير معلومات سريعة قبل الانتهاء من تحليلات أخرى أكثر استهلاكا للوقت وكثيفة العمالة.

تم تطوير برنامج البروتين Biomarker الباحث باستخدام IntelliJ وكتب في جاوة لمعالجة بكفاءة والبحث عن تسلسل البروتين الأحماض الأمينية المستمدة من WGS من سلالة بكتيرية. تم تعديل البرنامج من خوارزمية سابقة تعمل كك الماكرو داخل Excel33. قررنا تطوير نسخة مستقلة من البرنامج مع واجهة المستخدم الرسومية لجعلها أكثر سهولة في الاستخدام وكذلك توفير المزيد من التحسينات.

في حالة PTMs التي تنطوي على اقتطاع تسلسل البروتين، والبرنامج يزيل بالتسلسل بقايا الأحماض الأمينية من N-terminus في حين إضافة تكرار بقايا التسلسل حتى المبلغ الإجمالي يلبي أو يتجاوز الكتلة المقاسة من العلامات الحيوية البروتين المكتشفة. على الرغم من أن هذه العملية يمكن أن تؤدي إلى عدد كبير جدا من شظايا كتلة البروتين (~ 200،000 من ~ 5000 تسلسل البروتين الكامل)، لديها ميزة عدم استبعاد أي شظايا البروتين المحتملة من اقتطاع في ن-تيرمينوس أو C-terminus (أو كليهما) ولكن قد يكون من غير المحتمل مثل هذا الاقتطاع من منظور بيولوجي. ويشار إلى هذا النهج باسم اقتطاع غير مقيد. ومع ذلك ، فإن PTMs البكتيرية الأكثر شيوعا التي تنطوي على اقتطاع هي إزالة الميثيونين N-terminal أو ببتيد إشارة N-terminal. ونتيجة لذلك، يسمح البرنامج أيضا للمشغل بتحديد حد أعلى (50 بقايا) لاقتطاع المخلفات من N-terminus، مما يؤدي إلى أجزاء بروتين أقل بكثير تلبي معايير كتلة العلامة الحيوية للبروتين.

PBC على الجانب C-المحطة من D- و E-المخلفات وكذلك على الجانب N-المحطة من P-المخلفات تتفق مع آلية تأثير حمض الأسبارتيك, التي تمت دراستها على نطاق واسع على حد سواء تجريبيا ونظريا17,18,19,20. إدراج PBC على الجانب C-المحطة الطرفية من N-المخلفات أدرج في البرنامج بسبب آلية مثل تأثير حمض الأسبارتيك التي لوحظت لعدد من الأيونات البروتين ميتاستابل في مختبرنا39,40. أيونات الشظايا الأكثر وفرة من تفكك أيونات البروتين الميتاستابل المشحونة بشكل خبيث التي حللتها MS/MS-PSD ترجع إلى آلية تجزئة تأثير حمض الأسبارتيك. يختار المشغل أيونات الأجزاء الأبرز من بيانات MS/MS-PSD ويدخل m/z في البرنامج بالإضافة إلى تحمل أيون جزء مرتبط (±m/z). يمكن تعديل تحمل أيون الشظايا لكل أيون جزء ليعكس وفرة نسبية. قد تتفاوت درجة تحمل أيونات الشظايا المناسبة بين 1.0 ± و2.5 م/ض ± اعتمادا على الوفرة المطلقة لتأيون الشظايا وكذلك وفرته النسبية مقارنة بالضوضاء الكيميائية الخلفية. عادة ، كلما كانت أيونات الشظايا أكثر وفرة ، كلما كانت دقتها الجماهيرية أفضل ، مما يسمح باستخدام تفاوت أيوني أضيق للشظايا.

يمكن أن تختلف بيانات MS/MS-PSD من أيونات البروتين الميتاستابل بشكل كبير من حيث تعقيدها. بعض أطياف MS/MS-PSD يمكن تفسيرها بسهولة أكبر من غيرها. وهناك عدة أسباب لهذه الظاهرة. أولا، قد لا يتفتت أيون البروتين بكفاءة على المقياس الزمني للتحليل (~10-30 ميكروس) ربما لأنه لا يزال مطويا أو مطويا جزئيا حتى بعد التشحيم في محلول مصفوفة MALDI. ثانيا، بالإضافة إلى PBC، يمكن أن تخضع أيونات البروتين الميتاستابل لفقدان فصام للجزيئات الصغيرة، أي الأمونيا (-17 دا) أو الماء (-18 دا)15. ويبدو أن أحد المساهمين الهامين في التعقيد الطيفي هو فقدان الأمونيا الفصامي من السلسلة الجانبية لمخلفاتR-33. لقد لاحظنا زيادة في التعقيد الطيفي لبيانات MS/MS-PSD مع عدد بقايا R في تسلسل البروتين. البروتينات مع عدم وجود R-بقايا (بروتين YahO36 وبروتين الصدمة الباردة CspC33,43),مع واحد R-بقايا (بروتين الصدمة الباردة CspE33 وB-subunit من Stx241),مع اثنين من R-بقايا (البروتين الافتراضي33),إنتاج أطياف MS/MS-PSD التي هي غير معقدة نسبيا وسهلة التفسير. ومع ذلك، عندما يزيد عدد R-بقايا إلى ثلاثة (بروتين HU44)،أو أربعة (يوبيكيتين35والكولد صدمة البروتين CsbD33،43)،يزيد التعقيد الطيفي بشكل كبير. يقارن البرنامج أيونات الشظايا من لجنة البرنامج والميزانية في المخلفات الخاصة بآلية تأثير حمض الأسبارتيك فقط لأن هذه هي قناة التفكك الأكثر سهولة من أيونات البروتين القابلة للتجزئة المشحونة بشكل مغرض التي تم تحليلها بواسطة MS/MS-PSD. لا يتضمن البرنامج أيونات الشظايا الناتجة عن فقدان (أو خسائر) فصاحية صغيرة محايدة. ونتيجة لذلك، من المهم ألا يختار المشغل أيونات الشظايا التي تشمل خسائر فصاحية محايدة صغيرة. أيونات الشظايا من PBC هي عادة أهم أيونات الأجزاء؛ ومع ذلك، عندما يزيد عدد بقايا R في البروتين إلى ثلاثة أو أربعة، قد يكون أيون الجزء الأكثر وفرة في موقع لجنة البرنامج والميزانية هو الذي يتضمن خسارة فصيبية صغيرة (أو خسائر). وإذا اكتشفت هذه المجموعة من أيونات الشظايا (مفصولة بمضاعفات 17 أو 18 م/ض)، ينبغي أن يكون أيون الشظايا الذي له أعلى m/z داخل الكتلة هو الذي يدخل في معلمات البحث عن أيونات الشظايا.

وينبغي التأكيد على أن البرنامج لم يصمم لتحديد هوية البروتيوميك الخالي من المشغلين. يجب على عامل التشغيل تحديد أي أيونات الأجزاء من بيانات MS/MS-PSD التي سيتم تضمينها في البحث. ومع ذلك، واستنادا إلى العديد من التجارب التي أكدت تأثير حمض الأسبارتيك من قبل MS/MS-PSD، فإن أبرز أيونات الشظايا هي دائما نتيجة ل PBC على الجانب C-terminal من بقايا D-أو E-أو N. فائدة البرنامج هو أنه يلغي العديد من تسلسل غير صحيح من الواضح ويسترد سوى عدد قليل من المرشحين المحتملين. ويمكن إزالة بعض تسلسلات المرشحين على أساس عدم وجود أيون جزء حيث يتوقع من بقايا D في تسلسل أن تولد أيون جزء بارز. دائما، D-المخلفات يؤدي إلى الأيونات جزء بارز في جميع أنحاء العمود الفقري البولي ببتيد إلا عندما تكون موجودة ضمن بقايا قليلة من N- أو C-termini حيث تنخفض كفاءة تأثير حمض الأسبارتيك36.

الحد الأدنى لعدد مواقع PBC اللازمة لتحديد البروتين المؤقت
يتم تشكيل CFIP من اثنين من الأيونات السلائف البروتين متطابقة التي تنفصم في نفس موقع لجنة البرنامج والميزانية ولكن لها بروتون المؤينة على طرفي نقيض من موقع الانقسام. على الرغم من أنه يمكن استخدام CFIP لحساب كتلة العلامة الحيوية للبروتين بشكل أكثر دقة (مما يسمح بتضييق تحمل كتلة البروتين أثناء البحث) ، إلا أن فائدته لتحديد تسلسل محدد أقل فائدة من أيونات جزء غير مكملة تشكلت من موقعين مختلفين للانشقاق ، والتي توفر خصوصية أكبر لتحديد الهوية. السهولة التي تم بها تحديد اثنين من بروتينات AB-Im قادتنا إلى التكهن بالحد الأدنى من أيونات الشظايا اللازمة لتحديد تسلسل البروتين الصحيح مؤقتا من آلاف البروتينات أو تسلسل شظايا البروتين. وسرعان ما قررنا أنه ليس عدد أيونات الشظايا في حد ذاتها، بل عدد أيونات الأجزاء غير التكميلية هو المهم لأن كل أيون جزء غير مكمل يمثل موقعا واحدا للجنة البرنامج والميزانية في حين يمثل CFIP نفس موقع الانقسام. وهكذا، فإن خصوصية التعريف مستمدة من عدد مواقع لجنة البرنامج والميزانية التي لم تكتشف عدد أيونات الأجزاء.

فمن الممكن أن النجاح في تحديد مع ثلاثة فقط أيونات جزء قد يكون مجرد مصادفة. لاختبار هذه الفرضية والقضاء على التحيز في اختيار أيونات الشظايا ، أنشأنا وحدة قياس داخل البرنامج الذي يختار عشوائيا أيونات الشظايا من مجموعة أكبر من أيونات الأجزاء التكميلية و / أو غير التكميلية. وقد اختيرت المجموعة الأيونية الأكبر من بين 14 أيونا بارزا للشظايا تم تحديدها في الشكل 3 (اللوحة السفلية) استنادا إلى وفرتها النسبية.

وكان بروتوكول الاختبار على النحو التالي. باستخدام بحث ثنائي، تم اختيار ثلاثة أيونات مجزأة عشوائيا من مجموعة من 14 أيونات أجزاء بارزة في الشكل 3 (اللوحة السفلية) (m/z 1813.8، 2128.9، 3881.3، 4293.7، 5158.0، 6505.0، 6619.9، 6939.4، 7645.1، 7959.4، 8022.7، 8136.2، 8583.3، و 8961.5). تمت مقارنة مجموعة أيونات مكونة من ثلاثة أجزاء في أيونات شظايا السيليكو من PBC على الجانب C-terminal من بقايا D- أو E- أو N بالإضافة إلى مزيج من D و E و D و E و N. وقد أجريت هذه المقارنة لكل أيون جزء فردي من الفوج، وللأزواج الأيونية الثلاثة للفئة وللمزيج الأيوني الثلاثي الأجزاء من الفوج. للمقارنة التي سيتم حسابها على أنها مطابقة، يجب أن تتطابق أيونات الأجزاء للزوج وجميع أيونات الأجزاء الثلاثة للمزيج مع أيونات جزء السيليكو. بعد الانتهاء من التحليل، يتم اختيار مجموعة أيونات أخرى من ثلاثة أجزاء بشكل عشوائي، ويتكرر التحليل. وسمح بالتكرار في اختيار أيونات الشظايا. كما أن هناك 364 تركيبات ممكنة [(ن!/ص!) ن ص)!] من مجموعة أيونات من ثلاثة أجزاء (ص) من مجموعة من 14 أيونات مجزأة (ن)، تم إجراء 10 تحليلات فقط كما هو موضح في S1Im3 (معلومات تكميلية).

ويبدو أن شرط تحديد أيونات الأجزاء الثلاثة ظاهرة عامة كما هو مبين في العمود 3_ABC من الجداول 2-7، 9-10 (S1Im3). جميع التهم من 1 في العمود 3_ABC تتوافق مع تسلسل Im3 (دون ميثيونين N-المحطة الطرفية). حدث الفشل الوحيد في تحديد الهوية لأن أيون الجزء عند m/z 8136.2 (الموضح في الشكل 3، اللوحة السفلية وتم تمييزه باللون الرمادي في الجدولين 1 و 8) تجاوز تفاوت أيون الشظايا (±1.5 م/ض) الذي تم إدخاله للتحليل. وبما أن خوارزمية الاختبار تتطلب مطابقة جميع أيونات الأجزاء من مجموعة أيونات من ثلاثة أجزاء، فإن أي مجموعة تتضمن أيون جزء m/z 8136.2 ستفشل في تحديد/عد تسلسل البروتين الصحيح.

ويبين الجدول 6 في S1Im3 أنه عندما يكون اثنان من ثلاثة أيونات مجزأة متكاملين (تم تمييزهما باللون الأصفر)، فإن التسلسلات غير الصحيحة تتطابق مع المعايير أكثر من تلك التي لوحظت عندما كانت جميع أيونات الأجزاء الثلاثة غير مكملة. وكما لوحظ سابقا، يرجع ذلك إلى أن CFIP يتوافق مع موقع واحد للجنة البرنامج والميزانية، وهي عتبة يمكن تحقيقها من قبل العديد من أكثر غير صحيحة في تسلسلات سيليكو مقارنة باستخدام اثنين من الأيونات جزء غير مكملة التي تتوافق مع موقعين لجنة البرنامج والميزانية، وهو معيار أكثر صرامة.

وقد تم إجراء تحليل مماثل على ستة أيونات بارزة للأجزاء (m/z 2675.4 و2904.5 و3076.2 و3853.5 و5657.5 و5772.8) من Im-Bac الموضحة في الشكل 4 (اللوحة السفلية). على عكس Im3 ، لا يوجد لدى Im-Bac CFIP ملحوظ ، وبالتالي فإن أيونات الأجزاء الستة تتوافق على ما يفترض مع ستة مواقع للجنة البرنامج والميزانية. وبما أن هناك 20 تركيبة ممكنة من مجموعة أيونات مكونة من ثلاثة أجزاء تم اختيارها من بين ستة أيونات مجزأة، فقد تم إجراء 10 تحليلات فقط كما هو موضح في جداول S2 Im-Bac (معلومات تكميلية). تم تحديد/حساب تسلسل إم باك بشكل صحيح لجميع مجموعات الأيونات ذات الأجزاء الثلاثة في العمود 3_ABC في جميع التحليلات. وفي أربعة تحليلات، تمت مطابقة تسلسل أو تسلسلين غير صحيحين. ومع ذلك، هذا العدد الصغير من التسلسلات غير صحيحة رقم يمكن التحكم فيه للتأكيد اليدوي.

وعموما، يبدو أن أيونات الأجزاء التكميلية و/أو غير التكميلية التي تتوافق مع موقعين أو ثلاثة مواقع للجنة البرنامج والميزانية توفر ما يكفي من التحديد لاسترداد تسلسل واحد أو اثنين من تسلسل المرشحين. وبطبيعة الحال، ينبغي أن تكون أيونات الشظايا التي يختارها المشغل وفيرة نسبيا وأن تكون جيدة S/N. لا يوفر أيون جزء واحد أو اثنين من موقع PBC واحد خصوصية كافية لتجنب استرداد عدد غير قابل للتطبيق من تسلسلات غير صحيحة التي يجب تأكيدها من قبل عامل التشغيل. وليس من الواضح لماذا يوجد موقعان أو ثلاثة مواقع للجنة البرنامج والميزانية كافية، ولكن يبدو أن موقعا واحدا للجنة البرنامج والميزانية ليس محددا بما فيه الكفاية. على الرغم من أن الاقتطاع غير المقيد يؤدي إلى ~ 200،000 البروتينات وتسلسل شظايا البروتين التي تلبي معايير كتلة البروتين، فمن المحتمل أن الموقع / بقايا محددة طبيعة مواقع الانقسام، أي الجانب C-المحطة الطرفية من D-، E-، و N-المخلفات، يساهم في تضييق حاد من تسلسل ممكن خلال مقارنة أيون جزء. قد يكون هذا راجعا، جزئيا، إلى تواتر D-، E-، و N-المخلفات في تسلسل البروتين البكتيري، فضلا عن مواقعها الفريدة في تسلسل البروتين عبر بروتيوم البكتيريا. المخلفات الحمضية تلعب أدوارا حاسمة في بنية البروتين والتفاعلات المذيبات. ونتيجة لذلك، فإن تواترها ومواقعها في التسلسل الأولي أمر بالغ الأهمية إن لم يكن فريدا من نوعه بالنسبة لوظيفة البروتين وقد يفسر لماذا لا يلزم سوى عدد قليل من مواقع لجنة البرنامج والميزانية لتحديد تسلسل البروتين الصحيح بشكل مؤقت بين مئات الآلاف من التسلسلات غير الصحيحة.

من منظور الكيمياء مرحلة الغاز، وأهمية D-، E-، و N-المخلفات ينبع من مشاركتهم في قناة الانفصال التي يمكن الوصول إليها في الطاقات الداخلية المنخفضة من أيونات البروتين ميتاستابل مشحونة بشكل مغرد التي تولدها MALDI والاضمحلال من قبل PSD20. مقياس زمني طويل نسبيا (~ 10-30 ميكروس) من تجزئة الأيون الجزيئي من قبل PSD يعني أن الطاقة الداخلية للبروتين أيون هو العشوائية بين جميع الاهتزازات والتناوب درجة من حرية الأيون الجزيئي بحيث التفكك هو إرغوديك والإحصائية. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن آلية تأثير حمض الأسبارتيك ينطوي على إعادة ترتيب الأيون الجزيئي الذي يحدث من خلال سلسلة من الخطوات أو خطوة واحدة منسقة تنطوي على ذرات متعددة حتى يتم تحقيق هندسة مواتية أن يخفض حاجز التنشيط من PBC17،18،19.

تم تحديد اثنين من بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا المشفرة بلازميد التي تنتجها سلالة STEC باستخدام بروتوكول ينطوي على تحريض المضادات الحيوية، MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD، وتحليل بروتيوميك من أعلى إلى أسفل. تم تحديد هذه البروتينات باستخدام البرمجيات التي تم تطويرها داخليا التي تتضمن الكتلة المقاسة من البروتين وعدد صغير نسبيا من الأيونات جزء تسلسل محددة تشكلت نتيجة لتأثير حمض الأسبارتيك. يقارن البرنامج بيانات MS و MS / MS بتسلسل بروتين سيليكو وتسلسل جزء البروتين المستمدة من بيانات WGS. على الرغم من أن البرنامج لا يوفر مقاييس تحديد الهوية أو التهديف ، فإنه يلغي نسبة عالية جدا من التسلسلات غير الصحيحة مما يؤدي إلى عدد صغير جدا من تسلسل المرشحين (واحد أو اثنين) يمكن تأكيده بسهولة عن طريق الفحص اليدوي. وأخيرا، كشف الفحص اليدوي لبيانات WGS لهذه السلالة البكتيرية عن وجود مروج (صندوق SOS) في المنبع لجينات AB و Im في جينوم بلازميد، الذي يترشيد التعبير عن هذه الجينات بسبب التعرض للمضادات الحيوية الضارة بالحمض النووي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يوجد بين أصحاب البلاغ تضارب في المصالح.

Acknowledgments

البروتين Biomarker الباحث البرمجيات متاحة بحرية (دون أي تكلفة) عن طريق الاتصال كليفتون ك. Fagerquist في clifton.fagerquist@usda.gov. نود أن نعترف بدعم هذا البحث من قبل ARS، وزارة الزراعة الأميركية، منحة CRIS: 2030-42000-051-00-D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Tags

الكيمياء، العدد 171،
تحديد بروتينات المناعة المضادة للبكتيريا في <em>الإشريكية القولونية</em> باستخدام MALDI-TOF-TOF-MS/MS والتحليل البروتيومي من أعلى إلى أسفل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fagerquist, C. K., Rojas, E.… More

Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter