Здесь мы представляем протокол для быстрой идентификации белков, продуцируемых геномно секвенированных патогенными бактериями, с использованием тандемной масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF и нисходящего протеомного анализа с программным обеспечением, разработанным на месте. Метастабильные ионы белка фрагментируются из-за эффекта аспарагиновой кислоты, и эта специфичность используется для идентификации белка.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Идентификация белков антибактериального иммунитета в кишечной палочке с использованием MALDI-TOF-TOF-MS/MS и нисходящего протеомного анализа
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Этот протокол идентифицирует белки иммунитета бактерицидных ферментов: колицина E3 и бактериоцина, продуцируемых патогенным штаммом Escherichia coli с использованием индукции антибиотиков и идентифицированных тандемной масс-спектрометрией MALDI-TOF-TOF и нисходящим протеомным анализом с помощью программного обеспечения, разработанного на месте. Белок иммунитета колицина E3 (Im3) и белок иммунитета бактериоцина (Im-Bac) были идентифицированы из заметных ионов фрагментов b- и/или Y-типа, генерируемых полипептидным расщеплением позвоночника (PBC) на С-концевой стороне аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и остатков аспарагина механизмом фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты. Программное обеспечение быстро сканирует последовательности белков в силико, полученные из секвенирования всего генома бактериального штамма. Программное обеспечение также итеративно удаляет аминокислотные остатки белковой последовательности в случае, если зрелая белковая последовательность усечена. Одна белковая последовательность обладала массой и фрагментами ионов, согласуемых с теми, которые были обнаружены для каждого белка иммунитета. Затем последовательность-кандидат проверялась вручную, чтобы подтвердить, что все обнаруженные фрагменты ионов могут быть назначены. N-концевой метионин Im3 был постпереводно удален, тогда как Im-Bac имел полную последовательность. Кроме того, мы обнаружили, что только два или три некомментарных фрагмента ионов, образованных ПБК, необходимы для идентификации правильной последовательности белка. Наконец, промотор (SOS box) был идентифицирован перед генами антибактериального и иммунитета в плазмидном геноме бактериального штамма.
Введение
Анализ и идентификация непереваренных белков методом масс-спектрометрии называется нисходящим протеомным анализом1,2,3,4. В настоящее время это устоявшийся метод, который использует электрораспрозревшение ионизацию (ESI)5 и анализаторы массы высокого разрешения6,а также сложные методы диссоциации, например, диссоциацию переноса электронов (ETD), диссоциацию захвата электронов (ECD)7,ультрафиолетовую фотодиссоциацию (UV-PD)8и т. Д.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Микробиологическая пробоподготовка
- Инокулировать 25 мл бульона Лурии (LB) в коническую трубку 50 мл штаммом E. coli O113:H21 RM7788 (или другим бактериальным штаммом) из глицеринового бульона с использованием стерильной петли 1 мкл. Заколоть трубку и предварительно культивную культуру при 37 °C с встряхиванием (200 об/мин) в течение 4 ч.
- Aliquot 100 мкл предварительно культивированного бульона и выкладывается на агаровую пластину LB, дополненную 400 или 800 нг/мл митомицина-C. Культивирует агартовые пластины статически на ночь в инкубаторе при 37 °C.
ВНИМАНИЕ: Штаммы STEC являются патогенными микроорганизмами. Выполняйте все микробио....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 3 (верхняя панель) показан MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA, дополненном 400 нг/мл митомицина-C. Пики при m/z 7276, 7337 и 7841 были ранее идентифицированы как белок холодового шока C (CspC), белок холодного шока E (CspE) и плазмидный белок неизвестной функции, соответственно33. Ион белка при m/z 9780 [M+H]+ был проанализирован MS/MS-PSD, как показано на рисунке 3 (нижняя панель)........
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Вопросы протокола
Основными сильными сторонами текущего протокола являются его скорость, простота подготовки образцов и использование инструмента, который относительно прост в эксплуатации, обучении и обслуживании. Хотя протеомный анализ снизу вверх и сверху вниз с помощью жидкостной хроматографии-ESI-HR-MS повсеместны и намного превосходят сверху вниз MALDI-TOF-TOF, они требуют больше времени, труда и опыта. Сложность приборов часто может влиять на то, будут ли определенные инструментальные платформы.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов.
Благодарности
Программное обеспечение Protein Biomarker Seeker находится в свободном доступе (бесплатно), связавшись с Клифтоном К. Фагерквистом по clifton.fagerquist@usda.gov. Мы хотим отметить поддержку этого исследования грантом ARS, USDA, CRIS: 2030-42000-051-00-D.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Программное обеспечение проводника серии 4000 | AB Sciex | версии 3.5.3 | |
| 4800 Plus Анализатор MALDI TOF/TOF AB | Sciex | ||
| Ацетонитрил Optima LC/MS класс | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 шкаф биологической опасности | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Цитохром-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Программное обеспечение для анализа данных | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| Программное обеспечение GPMAW | Lighthouse | Data Version 10.0 | |
| Инкубатор | VWR | 9120973 | |
| LB Агар | Invitrogen | 22700-025 | |
| Бульон Luria | Invitrogen | 12795-027 | |
| Лизоцим | Sigma | L4919-1G | |
| Микроцентрифуга Пробирки, 2 мл, завинчивающаяся крышка, уплотнительное кольцо | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| Центрифуга MiniSpin Plus | Eppendorf | 22620207 | |
| Митомицин-С (из стрептомицетов) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Миоглобин | Sigma | M5696-100MG | |
| Шейкер MaxQ 420HP Модель 420 | Thermo Scientific | Модель 420 | |
| Синапиновая кислота | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Стерильная 1 мкл | петли Fisher | Scientific 22-363-595 | |
| Тиоредоксин (E. coli, рекомбинантный) | Sigma | T0910-1MG | |
| Трифторуксусная кислота | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Вода Optima LC/MS марка | Fisher Chemical | W6-4 |
Ссылки
- Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
- Fornelli, L., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
