JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Chemistry

Идентификация белков антибактериального иммунитета в кишечной палочке с использованием MALDI-TOF-TOF-MS/MS и нисходящего протеомного анализа

Published: May 23, 2021
doi:
10.3791/62577
,
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center,Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Здесь мы представляем протокол для быстрой идентификации белков, продуцируемых геномно секвенированных патогенными бактериями, с использованием тандемной масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF и нисходящего протеомного анализа с программным обеспечением, разработанным на месте. Метастабильные ионы белка фрагментируются из-за эффекта аспарагиновой кислоты, и эта специфичность используется для идентификации белка.

Abstract

Этот протокол идентифицирует белки иммунитета бактерицидных ферментов: колицина E3 и бактериоцина, продуцируемых патогенным штаммом Escherichia coli с использованием индукции антибиотиков и идентифицированных тандемной масс-спектрометрией MALDI-TOF-TOF и нисходящим протеомным анализом с помощью программного обеспечения, разработанного на месте. Белок иммунитета колицина E3 (Im3) и белок иммунитета бактериоцина (Im-Bac) были идентифицированы из заметных ионов фрагментов b- и/или Y-типа, генерируемых полипептидным расщеплением позвоночника (PBC) на С-концевой стороне аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и остатков аспарагина механизмом фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты. Программное обеспечение быстро сканирует последовательности белков в силико, полученные из секвенирования всего генома бактериального штамма. Программное обеспечение также итеративно удаляет аминокислотные остатки белковой последовательности в случае, если зрелая белковая последовательность усечена. Одна белковая последовательность обладала массой и фрагментами ионов, согласуемых с теми, которые были обнаружены для каждого белка иммунитета. Затем последовательность-кандидат проверялась вручную, чтобы подтвердить, что все обнаруженные фрагменты ионов могут быть назначены. N-концевой метионин Im3 был постпереводно удален, тогда как Im-Bac имел полную последовательность. Кроме того, мы обнаружили, что только два или три некомментарных фрагмента ионов, образованных ПБК, необходимы для идентификации правильной последовательности белка. Наконец, промотор (SOS box) был идентифицирован перед генами антибактериального и иммунитета в плазмидном геноме бактериального штамма.

Introduction

Анализ и идентификация непереваренных белков методом масс-спектрометрии называется нисходящим протеомным анализом1,2,3,4. В настоящее время это устоявшийся метод, который использует электрораспрозревшение ионизацию (ESI)5 и анализаторы массы высокого разрешения6,а также сложные методы диссоциации, например, диссоциацию переноса электронов (ETD), диссоциацию захвата электронов (ECD)7,ультрафиолетовую фотодиссоциацию (UV-PD)8и т. Д.

Другим методом мягкой ионизации является матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)9,10,11, которая менее широко используется для анализа сверху вниз, отчасти потому, что она в основном связана с анализаторами массы времени пролета (TOF), которые имеют ограниченное разрешение по сравнению с другими анализаторами массы. Несмотря на эти ограничения, инструменты MALDI-TOF и MALDI-TOF-TOF были использованы для быстрого нисходящего анализа чистых белков и фракционированных и нефракционированных смесей белков. Для идентификации чистых белков распад в источнике (ISD) является особенно полезным методом, поскольку он позволяет проводить масс-спектрометрический (MS) анализ ионов фрагментов ФРАГМЕНТОВ ISD, а также тандемную масс-спектрометрию (MS / MS) фрагментов ионов белков, обеспечивающих последовательно-специфический фрагмент часто из N- и C-терминов целевого белка, аналогично секвенированию Эдмана12,13 . Недостатком подхода ISD является то, что, как и в секвенировании Эдмана, образец должен содержать только один белок. Одна потребность в белке обусловлена необходимостью однозначного отнесения фрагментов ионов к иону-предшественнику. Если в образце присутствуют два или более белков, может быть трудно назначить, какие фрагменты ионов принадлежат к каким ионам-предшественникам.

Атрибуция фрагментов ионов/ионов-предшественников может быть решена с помощью MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Как и в любом классическом эксперименте с МС/МС, ионы-предшественники массово выбираются/выделяются до фрагментации, и обнаруженные фрагментированные ионы могут быть отнесены к конкретному иону-предшественнику. Однако методы диссоциации, доступные для этого подхода, ограничены в первую очередь диссоциацией, вызванной столкновением высоких энергий (HE-CID)14 или распадом после источника (PSD)15,16. HE-CID и PSD наиболее эффективны при фрагментации пептидов и небольших белков, и охват последовательности в некоторых случаях может быть ограничен. Кроме того, PSD приводит к расщеплению полипептидной магистрали (PBC) в первую очередь на стороне C-концевой стороны остатков аспарагиновой и глутаминовой кислоты явлением, называемым эффектом аспарагиновой кислоты17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS также нашла нишу в таксономической идентификации микроорганизмов: бактерий21,грибов22и вирусов23. Например, спектры MS используются для идентификации неизвестных бактерий путем сравнения с эталонной библиотекой MS-спектров известных бактерий с использованием алгоритмов распознавания образов для сравнения. Этот подход оказался весьма успешным из-за его скорости и простоты, хотя и требовал ночной культивирования изолята. Ионы белка, обнаруженные при этом подходе (обычно менее 20 кДа), содержат отпечаток РС, позволяющий таксономическое разрешение на уровне рода и вида, а в некоторых случаях и на подвиде24 и штаммеуровня 25,26. Однако остается необходимость не только таксономически классифицировать потенциально патогенные микроорганизмы, но и идентифицировать специфические факторы вирулентности, токсины и факторы устойчивости к противомикробным препаратам (УВМ). Для этого масса пептидов, белков или малых молекул измеряется РС и впоследствии выделяется и фрагментируется МС/МС.

Патогенные бактерии часто несут круговые куски ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, наряду с профагами, являются основным вектором горизонтального переноса генов между бактериями и отвечают за быстрое распространение устойчивости к противомикробным препаратам и других факторов вирулентности среди бактерий. Плазмиды могут также нести антибактериальные (AB) гены, например, колицин и бактериоцин. Когда эти гены экспрессируются и белки секретируются, они действуют, чтобы отключить механизм трансляции белка соседних бактерий, занимающих ту же экологическую нишу27. Однако эти бактерицидные ферменты также могут представлять риск для хозяина, который их произвел. В результате ген совместно экспрессируется хозяином, который специфически ингибирует функцию фермента AB и называется его белком иммунитета (Im).

Повреждающие ДНК антибиотики, такие как митомицин-С и ципрофлоксацин, часто используются для индуцирования ответа SOS у токсин-продуцирующей шига E. coli (STEC), чей ген токсина Шига(stx) обнаружен в геноме профага, присутствующем в бактериальном геноме28. Ранее мы использовали индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ для обнаружения и идентификации типов и подтипов Stx, продуцируемых штаммами STEC29,30,31,32. В предыдущей работе штамм STEC O113:H21 RM7788 культивировали в течение ночи на агаровых средах, дополненных митомицином-С. Однако вместо того, чтобы обнаружить ожидаемую B-субъединицу Stx2a при m/z ~7816, другой ион белка был обнаружен при m/z ~7839 и идентифицирован как плазмидно-кодируемый гипотетический белок неизвестной функции33. В текущей работе мы идентифицировали два плазмидно-кодированных белка AB-Im, продуцируемых этим штаммом, используя индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ с использованием автономного программного обеспечения, разработанного для обработки и сканирования последовательностей белков в силико, полученных из секвенирования всего генома (WGS). Кроме того, в программное обеспечение была включена возможность модификаций постперевода (PTM), включающих усечение последовательностей. Белки иммунитета были идентифицированы с помощью этого программного обеспечения из измеренной массы зрелого иона белка и последовательно-специфических фрагментов ионов из ПБК, вызванных эффектом аспарагиновой кислоты и обнаруженных MS / MS-PSD. Наконец, промотор был идентифицирован выше генов AB / Im в геноме плазмиды, что может объяснить экспрессию этих генов, когда этот штамм подвергается воздействию повреждающего ДНК антибиотика. Части этой работы были представлены на виртуальной встрече и выставке Национального американского химического общества осень 2020 года (17-20 августа 2020 года)34.

Protocol

1. Микробиологическая пробоподготовка Инокулировать 25 мл бульона Лурии (LB) в коническую трубку 50 мл штаммом E. coli O113:H21 RM7788 (или другим бактериальным штаммом) из глицеринового бульона с использованием стерильной петли 1 мкл. Заколоть трубку и предварительно культивную культуру ?…

Representative Results

На рисунке 3 (верхняя панель) показан MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA, дополненном 400 нг/мл митомицина-C. Пики при m/z 7276, 7337 и 7841 были ранее идентифицированы как белок холодового шока C (CspC), белок холодного шока E (CspE) и плазмидный белок неизвестной фун…

Discussion

Вопросы протокола
Основными сильными сторонами текущего протокола являются его скорость, простота подготовки образцов и использование инструмента, который относительно прост в эксплуатации, обучении и обслуживании. Хотя протеомный анализ снизу вверх и сверху вниз с помощ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Программное обеспечение Protein Biomarker Seeker находится в свободном доступе (бесплатно), связавшись с Клифтоном К. Фагерквистом по clifton.fagerquist@usda.gov. Мы хотим отметить поддержку этого исследования грантом ARS, USDA, CRIS: 2030-42000-051-00-D.

Materials

4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Tags

Escherichia ColiAntibacterial Immunity ProteinsMALDI-TOF-TOF-MS/MSTop-down ProteomicsMass SpectrometryBacterial Protein IdentificationAntibiotic InductionSample PreparationHPLC-grade WaterSinapinic AcidMS Linear Mode AcquisitionMS/MS Reflectron Mode AcquisitionPrecursor MassIsolation WidthCIDMetastable Suppressor

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image