Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

Published: May 23, 2021 doi: 10.3791/62577
Automatic Translation
1, 1
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

Abstract

פרוטוקול זה מזהה את חלבוני החסינות של אנזימי החיידקים: קוליצין E3 ובקטריוצין, המיוצר על ידי זן Escherichia coli פתוגניים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה דו-מושבית MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. חלבון החסינות של קוליצין E3 (Im3) וחלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) זוהו מיונים בולטים מסוג b ו/או y שנוצרו על ידי מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC) בצד ה- C-מסוף של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית ושאריות אספרגין על ידי מנגנון הפיצול של אפקט חומצה אספרטית. התוכנה סורקת במהירות רצפי חלבון סיליקו שמקורם ברצף הגנום כולו של זן החיידקים. התוכנה גם מסירה באופן איטרטיבי שאריות חומצת אמינו של רצף חלבון במקרה שרצף החלבון הבוגר נחתך. רצף חלבונים יחיד היה בעל מסה ורסיסים בקנה אחד עם אלה שזוהו עבור כל חלבון חסינות. לאחר מכן נבדק רצף המועמדים באופן ידני כדי לאשר שניתן להקצות את כל יונים הרסיסים שזוהו. המתיונין N-terminal של Im3 הוסר לאחר התרגום, ואילו לאים-באק היה את הרצף המלא. בנוסף, מצאנו כי רק שניים או שלושה יונים שבר לא משלימים שנוצרו על ידי PBC נחוצים כדי לזהות את רצף החלבון הנכון. לבסוף, מקדם (תיבת SOS) זוהה במעלה הזרם של הגנים האנטיבקטריאליים והחסינות בגנום פלסמיד של זן החיידקים.

Introduction

ניתוח וזיהוי של חלבונים לא מעוכאים על ידי ספקטרומטריית מסה מכונה ניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה1,2,3,4. זוהי כעת טכניקה מבוססת המשתמשת יינון אלקטרו-ספריי (ESI)5 ומנתחי מסה ברזולוציה גבוהה6, וטכניקות דיסוציאציה מתוחכמות, למשל, דיסוציאציה להעברת אלקטרונים (ETD), דיסוציאציה לכידת אלקטרונים (ECD)7, דיסוציאציה פוטו-דיסוציאציה אולטרה סגולה (UV-PD)8,וכו '.

טכניקת היוניזציה הרכה האחרת היא desorption/ יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)9,10,11 כי כבר פחות נרחב בשימוש לניתוח מלמעלה למטה, בין היתר משום שהוא מצמיד בעיקר מנתחי מסה זמן טיסה (TOF), אשר יש רזולוציה מוגבלת לעומת מנתחי מסה אחרים. למרות מגבלות אלה, מכשירי MALDI-TOF ו- MALDI-TOF-TOF נוצלו לניתוח מהיר מלמעלה למטה של חלבונים טהורים ותערובות מופרדות ולא מופות של חלבונים. לזיהוי חלבונים טהורים, ריקבון במקור (ISD) היא טכניקה שימושית במיוחד מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) של יונים של שברי ISD, כמו גם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (MS/MS) של שברי יון חלבון המספקים שבר ספציפי לרצף לעתים קרובות מה- N- ו- C-termini של חלבון היעד, בדומה לרצף אדמן12,13 . החיסרון בגישת ISD הוא, כמו ברצף אדמן, המדגם חייב להכיל רק חלבון אחד. דרישת החלבון האחת נובעת מהצורך בייחוס חד משמעי של יונים מקובעים ליון מקדים. אם שני חלבונים או יותר נמצאים במדגם, ייתכן שיהיה קשה להקצות אילו יונים מקדים שייכים לאיזה יונים קודמים.

ניתן לטפל בייחוס יון יון/מבשר באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS. כמו בכל ניסוי קלאסי של MS/MS, יונים קודמים נבחרים/מבודדים במסה לפני הפיצול, וניתן לייחס את יונים השברים שזוהו ליון מקדים ספציפי. עם זאת, טכניקות הניתוק הזמינות לגישה זו מוגבלות בעיקר לניתוק המושרה בהתנגשות אנרגיה גבוהה (HE-CID)14 או ריקבון לאחר המקור (PSD)15,16. HE-CID ו PSD הם היעילים ביותר בפיצול פפטידים וחלבונים קטנים, ואת כיסוי הרצף יכול, במקרים מסוימים, להיות מוגבל. בנוסף, PSD תוצאות מחשוף עמוד השדרה פוליפפטיד (PBC) בעיקר בצד C-מסוף של שאריות חומצה אספרטית וגלוטמית על ידי תופעה הנקראת אפקט חומצה אספרטית17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS מצא גם יישום נישה בזיהוי טקסונומי של מיקרואורגניזמים: חיידקים21, פטריות22, ווירוסים23. לדוגמה, ספקטרום MS משמש לזיהוי חיידקים לא ידועים בהשוואה לספריית ייחוס של ספקטרום MS של חיידקים ידועים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי דפוסים לשם השוואה. גישה זו הוכיחה את עצמה כמוצלחת מאוד בגלל המהירות והפשטות שלה, אם כי דורשת פולחן בן לילה של הבידוד. יונים חלבון שזוהו על ידי גישה זו (בדרך כלל תחת 20 kDa) מורכב טביעת אצבע MS המאפשר רזולוציה טקסונומית ברמת הסוג והמינים ובמקרים מסוימים בתת מינים24 ורמתזן 25,26. עם זאת, עדיין יש צורך לא רק לסווג טקסונומית מיקרואורגניזמים פתוגניים, אלא גם לזהות גורמי וירוליציה ספציפיים, רעלים, וגורמי התנגדות מיקרוביאלית (AMR). כדי להשיג זאת, המסה של פפטידים, חלבונים, או מולקולות קטנות נמדדים על ידי MS ולאחר מכן מבודדים ומפוצלים על ידי MS / MS.

חיידקים פתוגניים נושאים לעתים קרובות חתיכות עגולות של DNA הנקראות פלסמידים. פלסמידים, יחד עם פרופג'ים, הם וקטור מרכזי של העברת גנים אופקית בין חיידקים ואחראים להתפשטות המהירה של עמידות מיקרוביאלית וגורמי אלימות אחרים על פני חיידקים. פלסמידים עשויים גם לשאת גנים אנטיבקטריאליים (AB), למשל, קוליצין ובקטריוצין. כאשר גנים אלה באים לידי ביטוי והחלבונים מופרשים, הם פועלים כדי להשבית את מכונות תרגום החלבון של חיידקים שכנים הכובשים את אותה נישה סביבתית27. עם זאת, אנזימים חיידקיים אלה יכולים גם להוות סיכון לפונדקאי שייצר אותם. כתוצאה מכך, גן מתבטא במשותף על ידי המארח המעכב באופן ספציפי את תפקודו של אנזים AB ומכונה חלבון החסינות שלו (Im).

אנטיביוטיקה מזיקה לדנ"א כגון mitomycin-C וציפרופלוקסצין משמשות לעתים קרובות כדי לגרום לתגובת SOS ב- E. coli המייצר רעלן Shiga (STEC) שהגן שלו רעלן שיגה(STX) נמצא בתוך גנום פרופג 'הנמצא בגנום החיידקי28. השתמשנו באינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה בעבר כדי לזהות ולזהות סוגי Stx וסוגי משנה המיוצרים על ידי זני STEC29,30,31,32. בעבודה הקודמת, STEC O113:H21 זן RM7788 היה תרבותי בן לילה על תקשורת אגר בתוספת mitomycin-C. עם זאת, במקום לזהות את B-subunit הצפוי של Stx2a ב m / z ~7816, יון חלבון שונה זוהה ב m / z ~ 7839 וזוהה כחלבון היפותטי מקודד פלסמיד של פונקציה לא ידועה33. בעבודה הנוכחית, זיהינו שני חלבוני AB-Im מקודדים פלסמיד המיוצרים על ידי זן זה באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה באמצעות תוכנה עצמאית שפותחה לעיבוד וסריקה ברצפי חלבון סיליקו המופקים מרצף גנום שלם (WGS). בנוסף, האפשרות של שינויים לאחר התרגום (PTM) מעורבים truncation רצף שולבו בתוכנה. חלבוני החסינות זוהו באמצעות תוכנה זו מהמסה הנמדדת של יון החלבון הבוגר ויוני שבר ספציפיים לרצף מ- PBC שנגרמו על ידי אפקט החומצה אספרטית וזוהו על ידי MS/ MS-PSD. לבסוף, מקדם זוהה במעלה הזרם של הגנים AB / Im בגנום plasmid שעשוי להסביר את הביטוי של גנים אלה כאשר זן זה נחשף לאנטיביוטיקה מזיקה ל- DNA. חלקים מעבודה זו הוצגו בכנס הווירטואלי של האגודה האמריקנית הלאומית לכימיה בסתיו 2020 (17-20 באוגוסט 2020)34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דגימה מיקרוביולוגית

  1. לחסן 25 מ"ל של מרק לוריא (LB) בצינור חרוט 50 מ"ל עם E. coli O113:H21 זן RM7788 (או זן חיידקי אחר) ממלאי גליצל באמצעות לולאת μL סטרילית. מכסים את הצינור ואת טרום התרבות ב 37 °C (37 °F) עם רועד (200 סל"ד) עבור 4 שעות.
  2. Aliquot 100 μL של מרק מתורבת מראש להתפשט על צלחת אגר LB בתוספת 400 או 800 ng/mL של mitomycin-C. צלחות אגר תרבות סטטיות לילה באינקובטור ב 37 °C (50 °F).
    זהירות: זני STEC הם מיקרואורגניזמים פתוגניים. בצע את כל המניפולציות המיקרוביולוגיות, מעבר לכת, בארון בטיחות ביולוגית BSL-2.
  3. קציר תאים חיידקיים ממושבות גלויות בודדות באמצעות לולאת μL סטרילית של 1 μL ועבר לצינור מיקרוצנטריפוגה מצופה טבעת O בגודל 2.0 מ"ל המכיל 300 μL של מים באיכות HPLC. כיפה הצינור, מערבולת בקצרה, וצנטריפוגה ב 11,337 x g במשך 2 דקות כדי כדורי התאים.

2. ספקטרומטריית מסה

  1. ספוט 0.75 μL aliquot של supernatant מדגם על היעד MALDI נירוסטה ולאפשר לו להתייבש. לכסות את נקודת המדגם המיובש עם a0.75 μL aliquot של פתרון רווי של חומצה סינפינית ב 33% acetonitrile, 67% מים, 0.2% חומצה טריפלואורסטית. אפשר למקום להתייבש.
  2. לנתח את כתמי המדגם היבש באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF-TOF.
    1. לאחר טעינת יעד MALDI לספקטרומטר המסה, לחץ על הלחצן עבור רכישת מצב ליניארי של MS בתוכנת הרכישה. הזן את טווח m/z שיש לנתח על-ידי הזנת m/z של הגבול התחתון והעליון (למשל, 2 kDa עד 20 kDa) לשדות המתאימים שלהם בתוכנת שיטת הרכישה.
    2. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI בתוכנה. לאחר מכן, הלחצו על לחצן העכבר השמאלי וגררו את סמן העכבר מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה/יינון בלייזר. שחרר את לחצן העכבר והרכישה תתחיל. לאסוף 1,000 יריות לייזר עבור כל מקום מדגם.
      הערה: רכישת נתונים מוצגת בזמן אמת בחלון רכישת התוכנה.
    3. אם לא מזוהים יונים, הגדל את עוצמת הלייזר על-ידי התאמת סרגל סולם הזזה תחת עוצמת לייזר בתוכנה עד לזיהוי אות החלבון יון. זה נקרא סף.
      הערה: לפני ניתוח נקודת המדגם, כייל חיצונית את המכשיר במצב ליניארי MS עם כיול חלבון אשר m / z משתרע על פני הטווח מנותח, למשל, +1 ו + 2 מטען מצבים של כיול חלבון: cytochrome-C, ליזוזים, ומיוגלובין לכסות טווח מסה של 2 kDa עד 20 kDa. מסת ביניים בטווח המסה שצוין משמשת כמסה ממוקדת, למשל, 9 kDa. מסת המיקוד היא היון שמ"ק שלו ממוקד באופן אופטימלי לזיהוי על ידי גלאי המצב הליניארי.
    4. לאחר השלמת רכישת המצב הליניארי של MS, לחץ על הלחצן עבור רכישת מצב רפלקטורון MS/MS בתוכנת הרכישה. הזן את מסת המבשר שיש לנתח בשדה מסה מבשר. לאחר מכן, הזן רוחב בידוד (ב- Da) לתוך חלון המסה של הקדמה עבור הצד המסה הנמוכה והגבוהה של המסה המבשרת, למשל, ±100 Da.
    5. לחץ על כפתור כיבוי CID. לחץ על לחצן מדכא Metastable ON. התאם את עוצמת הלייזר ל-90% לפחות מערכה המרבי על-ידי התאמת סרגל קנה המידה של ההזזה מתחת לעוצמת הלייזר בתוכנה.
    6. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI בתוכנה. לאחר מכן הלחצו את לחצן העכבר השמאלי וגררו את סמן העכבר מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה/יינון בלייזר. שחרר את לחצן העכבר והרכישה תתחיל. לאסוף 10,000 יריות לייזר עבור כל מקום מדגם.
      הערה: לפני ניתוח נקודת המדגם, המכשיר צריך להיות מכויל חיצונית במצב MS / MS-רפלקטורון באמצעות יונים קטע מריקבון לאחר המקור (PSD) של מצב הטעינה +1 של thioredoxin אלקילסין35.
  3. אל תעבד נתוני MS גולמיים. עבד נתונים גולמיים MS/MS-PSD באמצעות רצף השלבים הבא בסדר שצוין: תיקון בסיסי מתקדם (32, 0.5, 0.0) ואחריו הסרת רעש (שתי סטיות תקן) ואחריו החלקה גאוסית (31 נקודות).
  4. בדוק באופן ידני נתוני MS/MS-PSD לנוכחות של יונים בולטים שנוצרו על-ידי PBC19,20.
  5. להעריך נתוני MS/MS ביחס לשפע המוחלט והיחסי של יונים מקוטעים והאות לרעש שלהם (S/N). השתמש רק ביונים השופעים ביותר לזיהוי חלבונים, במיוחד אם נתוני MS/MS-PSD רועשים.

3. בבניית מסד נתונים של חלבון סיליקו

  1. צור קובץ טקסט המכיל רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים, אשר יסרק על ידי תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון לזיהוי החלבון. רצפי חלבונים נגזרים ריצוף גנום שלם (WGS) של הזן המנותח (או זן קשור קשר הדוק).
  2. גש לאתר NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) כדי להוריד כ-5,000 רצפי חלבונים של זן החיידקים הספציפי (למשל, Escherichia coli O113:H21 זן RM7788) מנותח. גודל ההורדה המרבי הוא 200 רצפים.
    1. כתוצאה מכך, העתק והדבק את 25 ההורדות בקובץ טקסט יחיד. בחר בתבנית FASTA (טקסט) עבור כל הורדה.

4. הפעלת תוכנה למחפש סמנים ביולוגיים של חלבון

  1. לחץ פעמיים על קובץ ההפעלה של מחפש הסמן הביולוגי של חלבון. חלון ממשק משתמש גרפי (GUI) יופיע(איור 1, החלונית העליונה).
  2. הזן את המסה של הסמן הביולוגי של החלבון (כפי שהוא נמדד במצב MS-ליניארי) לשדה מסת חלבון בוגרת. לאחר מכן, הזן את שגיאת מדידת המסה בשדה 'רגישות למסה'. שגיאת מדידת המסה הסטנדרטית היא ±10 Da עבור חלבון 10,000 Da.
  3. לחלופין, לחץ על לחצן מחשבון מסת חלבון יון משלים b/y כדי לחשב את מסת החלבון מזוג יונים משלים של שברים (CFIP או b/y). חלון מוקפץ, כלי מחשבון מסת חלבון, יופיע(איור 1, החלונית התחתונה).
    1. הזן את m/z של CFIP putative ולחץ על לחצן הוסף זוג. מסת החלבון המחושבת תופיע.
    2. העתק והדבק מספר זה בשדה 'מסת חלבון בוגרת' וסגור את החלון 'הכלי מחשבון מסת חלבון'.
  4. בחר אורך פפטיד של אות N-מסוף על-ידי לחיצה על התיבה הגדר הגבלת שאריות. יופיע חלון מוקפץ עם קנה מידה וסמן הזזה. הזז את הסמן לאורך פפטיד האות הרצוי (מקסימום 50). אם לא נבחר אורך פפטיד של אותות, התוכנה תבצע רצף בלתי מוגבל.
  5. תחת מצב Ion שבר ב- GUI, בחר שאריות עבור מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC). לחץ על הקופסאות של שאריות אחת או יותר: D, E, N ו/או P.
    1. לחץ על לחצן הזן יונים של קטעים (+1) לחיפוש. יופיע עמוד קטעים מוקפץ. לאחר מכן, לחץ על לחצן הוסף קטע יון, התואם למספר יונים מקטעים שיש להזין, כלומר, לחיצה אחת עבור כל יון קטע. יופיע שדה נפתח עבור הזנת כל יון קטע.
    2. הזן את m/z של יונים שבר ואת הסבילות m/z הקשורים שלהם. לאחר השלמת, לחץ על לחצן שמור וסגור.
      הערה: סובלנות סבירה m / z היא ±1.5.
    3. בחר את המספר המינימלי של יונים מקוטעים שיש להתאים לזיהוי על-ידי גלילה למספר הרצוי בתיבה שמימין למספר Ions קטעים שיש להתאים.
      הערה: שלושה משחקים צריכים להיות מספיקים.
    4. בחר שאריות ציסטאין להיות במצבם החמוץ על ידי לחיצה על המעגל המתאים. אם לא נמצאו זיהויי חלבון לאחר החיפוש, חזור על החיפוש עם cysteines במצבם המופחת. אם לא נמצאו זיהויים לאחר החיפוש, הרחב את הסבילות ליונים של הקטע ל- ±3 וחזור על החיפוש.
  6. תחת הגדרת הקובץ, לחץ על לחצן בחר קובץ FASTA כדי לעיין ולבחור את הקובץ FASTA (טקסט) המכיל את רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים שנבנה בעבר בשלבי פרוטוקול 3.1 עד 3.2. לאחר מכן בחר תיקיית פלט וצור שם קובץ פלט.
  7. לחץ על לחצן הפעל חיפוש בערכי קבצים. יופיע חלון מוקפץ שכותרתו אישור פרמטרי חיפוש (איור 1, החלונית התחתונה), המציג את פרמטרי החיפוש לפני תחילת החיפוש.
  8. אם פרמטרי החיפוש נכונים, לחץ על לחצן התחל חיפוש. אם פרמטרי החיפוש אינם נכונים, לחץ על לחצן ביטול והזן מחדש את הפרמטרים הנכונים. לאחר תחילת החיפוש, חלון הפרמטר נסגר ומופיע חלון מוקפץ חדש עם מד התקדמות(איור 1, החלונית התחתונה) המציג את התקדמות החיפוש וספירה רצה של מספר הזיהויים שנמצאו.
  9. עם השלמת החיפוש (מספר שניות), מד ההתקדמות נסגר באופן אוטומטי וסיכום החיפוש מוצג בשדה יומן הרישום של ה- GUI (איור 2, החלונית העליונה). בנוסף, יופיע גם חלון מוקפץ חדש המציג את זיהוי החלבון אם בכלל (איור 2, החלונית התחתונה).
    הערה: ברצפי חלבון סיליקו בעלי שאריות לא מזוהות, למשל, U או X, מדלגים באופן אוטומטי מהניתוח ורצפים אלה מדווחים לאחר מכן עם חלון מוקפץ נפרד כדי להתריע בפני המפעיל על אילו רצפים (אם בכלל) דילגו עם השלמת החיפוש.

5. אישור לאחר החיפוש של רצף החלבון

  1. אשר את הנכונות של רצף מועמדים על ידי ניתוח ידני.
    הערה: מטרת התוכנה מחפש סמן ביולוגי חלבון היא לזהות רצף חלבון עם דיוק גבוה על ידי ביטול רצפי חלבון שגויים רבים מן השיקול ושילוב רצף גיזום כ- PTM אפשרי בחלבון הבוגר. מכיוון שמספר רצפי המועמדים האפשריים המוחזרים הוא מעט, ניתן לניהול באישור ידני.
  2. צור טבלה של m/z הממוצע של ions קטע מסוג b ו- y של רצף המועמדים באמצעות כל ספקטרומטריית מסה או תוכנה פרוטאומית בעלת פונקציונליות כזו. השווה את m/z הממוצע של יונים שבר סיליקו בצד C-מסוף של D-, E-, ו- N-שאריות (ועל צד N-מסוף של שאריות P) כדי m /z של יונים שבר בולטים מנתוני MS / MS-PSD.
    הערה: יש להתאים בקלות את יוני הרסיסים הבולטים ביותר של MS/MS-PSD ל- D-, E-ו- N המשויכים ליונים של שבר סיליקו. עם זאת, מנגנון פיצול אפקט חומצה אספרטית הוא פחות יעיל ליד N- או C-termini של רצף חלבון36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 3 (פאנל עליון) מציג את MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 400 ng / mL mitomycin-C. פסגות ב m/ z 7276, 7337, ו 7841 זוהו בעבר כמו חלבון הלם קר C (CspC), חלבון הלם קר E (CspE), וחלבון נישא פלסמיד של פונקציה לא ידועה, בהתאמה33. יון החלבון ב-m/z 9780 [M+H]+ נותח על-ידי MS/MS-PSD כפי שמוצג באיור 3 (החלונית התחתונה). יון המבשר היה מבודד עם חלון בורר יונים מתוזמן (TIS) ±100 Da. ions קטעים מזוהים על-ידי m/z שלהם וסוג/מספר. יון הקטע ב- m/z 2675.9 (מודגש בכוכב) נשפך מהניתוק של יון החלבון גרורתי ב-m/z 9655 המוצג באיור 3 (החלונית העליונה). הממוצע התיאורטי m/z של כל יון שבר מוצג בסוגריים המבוססים על PBC של רצף חלבון החסינות של הקוליצין E3 (Im3) המוצג לעיל. אתרים של PBC מסומנים עם כוכבית אדומה עם יון הקטע המתאים המיוצר. מת'ionine N-terminal מסומן בקו תחתון המסמל כי הוא מוסר לאחר התרגום בחלבון הבוגר. לרצף שאריות ציסטאין בודדות (בקופסה) ולכן הוא נחשב במצבו המופחת.

שימוש במסה של סמן ביולוגי חלבון וכמה יסמנים בולטים לא משלימים: m/z 1813.8, 2128.9 ו- 4293.7 (±1.5 סובלנות)(איור 1,פאנל תחתון) והגבלת PBC לצד C-מסוף של D- ו- E-שאריות, רק רצף מועמדים אחד דווח על ידי התוכנה: רצף חלבון Im3 (ללא מת'יונין N-terminal שלה) (איור 2 החלונית התחתונה)., בעת בחירת יונים מקוטעים לחיפוש, יש להדגיש כי כל קבוצה של יונים שבר לא משלימים מניחה כי סיכום m /z של כל שני ions שבר בקבוצה (והפחתה שני פרוטונים) גורם סכום המוני שאינו נופל בתוך מסת הסמן הביולוגי וסובלנות מסה הקשורה (±10 Da). טיוטת WGS של RM7788 חשפה 5008 רצפי חלבון (מסגרות קריאה פתוחות)37. מתוך כ-5,000 רצפי חלבונים מלאים אלה, 189,490 רצפים מלאים וחלקיים (טריון בלתי מוגבל) עמדו בקריטריוני המסה של הסמן הביולוגי(איור 2,פאנל עליון). רצפים אלה עוברים את קריטריוני המסה ואז עוברים בסיליקו PBC בצד C-מסוף של D- ו / או E-שאריות. יונים השברים שנוצרים לאחר מכן מושוים ליוני הקטע שנצפו שהוזנו. רצף המועמדים שדווח על ידי התוכנה התבסס אך ורק על המסה שלה ושלושה אתרי PBC ספציפיים D ו/ או E. הספציפיות שהושגה על ידי כמות כה קטנה של מידע תידון בסעיף הבא.

כפי שמוצג באיור 3 (החלונית התחתונה), יונים השברים הנפוצים ביותר הם תוצאה של PBC בצד C-מסוף של D- ו- E-שאריות באמצעות מנגנון פיצול אפקט חומצה אספרטית19,20. שני CFIP נצפו: b67/y17 (m/z 7645.1 / m /z 2128.9) ו b70/y14 (m/z 7959.4 / m /z 1813.8). ניתן להשתמש ב- CFIP אלה כדי לחשב בצורה מדויקת יותר את המסה של יון מבשרי החלבון באמצעות הנוסחה הפשוטה: b (m/z) + y (m/z) - 2H+ = מסת חלבון (Da)33. באמצעות שני CFIP, אנו מקבלים מסה ממוצעת של החלבון: 9771.6 Da, אשר קרוב יותר לערך התיאורטי שלה של 9772.5 Da מאשר המסה הנמדדת של יון החלבון במצב MS-ליניארי: 9779 Da (איור 3,פאנל עליון). רק כמה CFIP זוהו כי רוב יונים מבשר שיש פרוטון מיינטון מיינם בודד בשאריות ארגינין רק: R80. היסודות הגבוהה יותר של שלב הגז של ארגינין (237.0 קק"ל/מול38)בהשוואה לשאריות ליצין (K) (221.8 קק"ל/מול38)אחראית ככל הנראה להפרדה מועדפת של הפרוטון היונן בשאריות ה-R היחידות.

איור 4 (פאנל עליון) מציג את MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 800 ng / mL mitomycin-C. איור 4 (הפאנל העליון) דומה למדי לאיור 3 (פאנל עליון), אם כי יש הבדלים בשפע היחסי של כמה יונים של חלבונים בשל ההבדלים בריכוזים אנטיביוטיים מנוצלים. ישנם גם שינויים קלים בסמן ביולוגי חלבון m/ z המשקפים הבדלים בכיול חיצוני של המכשיר בימים שונים. שוב, יונים חלבון ב m / z 7272, 7335, ו 7838 הם CSPC, CspE, וחלבון נישא פלסמיד, בהתאמה. בנוסף, אנו מזהים את יון החלבון Im3 ב- m/z 9778 (אם כי עם פחות שפע מאשר באיור 3) וכן יון חלבון ב- m/z 9651 [M+H]+. איור 4 (החלונית התחתונה) מציג MS/MS-PSD של יון מבשרי החלבון ב-m/z 9651. יון הקדמה היה מבודד באמצעות חלון TIS צר יותר אסימטרי של -75/+60 Da כדי לחסל תרומות של יונים חלבון סמוכים ב m / z 9539 ו 9778. יונים מפוצלים מזוהים על-ידי ה-m/z והסוג/המספר שלהם. רצף חלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) מוצג לעיל. אתרים של PBC מסומנים עם כוכבית אדומה עם יון הקטע המתאים שלהם. m/z הממוצע התיאורטי של כל יון שבר מוצג גם בסוגריים בספקטרום. רצף Im-Bac יש גם שאריות ציסטאין יחיד (בקופסה) ולכן נחשב במצב מופחת שלה.

באמצעות מסת הסמן הביולוגי של החלבון, שלושה יונים בולטים שאינם משלימים: m/z 2675.4, 3853.5 ו-5772.8 (±1.50 עמידות) מאיור 4 והגבלת PBC רק לצד מסוף C של שאריות D ו/או E ו/או אספרגין (N), רק רצף מועמדים אחד דווח על ידי התוכנה: חלבון Im-Bac. רצף המועמדים אוחזר לאחר סריקת 191,375 רצפים מלאים או חלקיים שעמדו בקריטריונים של מסת סמנים ביולוגיים וסובלנות (±10 Da). רצף המועמדים זוהה על ידי התוכנה המבוססת אך ורק על המסה שלה ושלושה אתרי PBC ספציפיים D ו/ או E ו/ או N.

יונים שבר הבולטים ביותר באיור 4 (פאנל תחתון) היו, שוב, התוצאה של PBC בצד C-מסוף של D ו / או E-שאריות וגם בצד N-מסוף של אחד P-שאריות20. אנו גם רואים PBC בצד C-מסוף של N-שאריות כי הוא גם צפוי להתרחש על ידי מנגנון פיצול דמוי אפקט חומצה אספרטית39,40. החולשה של אות היון המבשר של החלבון גורמת למספר מוגבל של יונים הניתנים לפרשנות. הדיוק של שבר יון m /z יורד עם שפע יונים שבר. לא זוהו CFIP ככל הנראה בשל פרוטון מיינם להיות המבודד בשאריות ארגינין רק (R74) של רצף יון חלבון. כל חלוקי הרסיסים מכילים את שאריות ה-R74, בהתאם להשערה זו.

מקדם הגנים האנטיבקטריאליים
איור 5 מציג חלק של 6482 bp contig00100 של זן E. coli RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) מרצף רובה ציד גנום שלם37. אזורי הקידוד לקוליצין E3, חלבון החסינות שלו (Im3), חלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) וחלבון תמוגה מודגשים בצהוב. במעלה הזרם של אזור הקידוד עבור הגן הקוליצין E3 הם אזור -35, תיבת Pribnow (PB), חזרה הפוכה של תיבת SOS, אתר כריכה שיין-דלגרנו / ריבוזומלי (SD / RBS)27. יש אזור בין-גני בן תשעה זוגות בסיסים בין קוליצין E3 ל- Im3. LexA (חלבון מדכא ואוטופידידאז) נקשרת לתיבת SOS וחוסמת את הביטוי של גנים במורד הזרם. על נזק לדנ"א (למשל, קרינת UV או אנטיביוטיקה מזיקה לדנ"א), LexA עוברת מחשוף עצמי המאפשר ביטוי של גנים במורד הזרם27,28. לפיכך, הביטוי של שני חלבוני חסינות אלה עולה בקנה אחד עם חשיפה של זן זה לאנטיביוטיקה מזיקה ל- DNA.

Figure 1
איור 1: צילומי מסך של תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבונים. פאנל עליון: ממשק משתמש גרפי (GUI) של תוכנת מחפש הסמן הביולוגי חלבונים. החלוניות התחתונות: חלונות מוקפצים של הכלי מחשבון מסת חלבון, עמוד מקטע, אישור פרמטרי חיפוש וסרגל התקדמות חיפוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות חיפוש של זיהוי חלבון באמצעות תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון. החלונית העליונה: סיכום תוצאות החיפוש המוצגות בשדה יומן הרישום של GUI התוכנה. החלונית התחתונה: חלון מוקפץ המציג זיהוי חלבון באמצעות התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח ספקטרומטריית מסה של STEC O113:H21 זן RM7788. פאנל עליון: MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 400 ng / mL mitomycin-C. לוח תחתון: MS/MS-PSD של יון מבשר החלבון ב m/z 9780 (פאנל עליון). יון הקדמה היה מבודד עם חלון TIS ±100 Da. שברים יונים מזוהים על ידי סוג m / z ויון שלהם. רצף חלבון החסינות עבור קולצין E3 (Im3) מוצג. שאריות בסיסיות (אתרים של הפרדת מטען אפשרית) מסומנים בכחול. PBC מסומנים עם כוכבית אדומה עם יון הקטע המתאים שנוצר. הממוצע התיאורטי m/z של כל יונים מקטעים מוצג בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח ספקטרומטריית מסה של STEC O113:H21 זן RM7788. פאנל עליון: MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 800 ng / mL mitomycin-C. לוח תחתון: MS/MS-PSD של יון מבשר החלבון ב m/z 9651 (פאנל עליון). יון הקדמה היה מבודד עם חלון TIS אסימטרי של -75 בצד m / z נמוך של יון הקדמה ו + 60 בצד m / z הגבוה של יון הקדמה. יונים שבר מזוהים על ידי סוג m /z ויון שלהם. רצף החלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) מוצג. שאריות בסיסיות (אתרים של הפרדת מטען אפשרית) מסומנים בכחול. PBC מסומנים עם כוכבית אדומה עם יון הקטע המתאים שנוצר. הממוצע התיאורטי m/z של כל יון קטע מוצג בסוגריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: ניתוח קטע של הגנום plasmid נישא על ידי E. coli O113:H21 זן RM7788. חלק של 6482 bp contig00100 של E. coli O113:H21 זן RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) מכל רצף רובה ציד גנום37. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים 1 (S1 Im3): תוצאות ניתוח בחינת ביצועים של תוכנה באמצעות ions קטעים נבחרים של Im3 (מאיור 3, החלונית התחתונה). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ משלים 2 (S2 ImBac): תוצאות ניתוח בחינת ביצועים של תוכנה באמצעות סיכורים נבחרים של Im-Bac (מאיור 4, החלונית התחתונה). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיקולי פרוטוקול
החוזקות העיקריות של הפרוטוקול הנוכחי הן המהירות, הפשטות של הכנת המדגם, ושימוש במכשיר קל יחסית לתפעול, להיות מאומן ולתחזק. למרות שניתוח פרוטאומי מלמטה למעלה ולמעלה למטה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ESI-HR-MS נמצאים בכל מקום ועליונות בהרבה במובנים רבים מלמעלה למטה על ידי MALDI-TOF-TOF, הם דורשים יותר זמן, עבודה ומומחיות. מורכבות מכשירים יכולה לעתים קרובות להשפיע אם פלטפורמות מכשירים מסוימות צפויות להיות מאומצות על ידי מדענים שאינם מאומנים באופן רשמי בספקטרומטריית מסה. הגישה מלמעלה למטה עם MALDI-TOF-TOF נועדה להרחיב את הניתוח של MALDI-TOF-MS מעבר לשימוש הנוכחי שלה לזיהוי טקסונומי של חיידקים במעבדות מיקרוביולוגיה קלינית תוך לא להגדיל באופן דרמטי את העבודה, המורכבות, או המומחיות הנדרשים לניתוח.

הפרוטוקול אינו מפעיל כל שלב תמה תא מכני (או חשמלי). למרות שחלבונים מופרשים או חוץ-תאיים עשויים להיות מזוהים באמצעות הפרוטוקול, פותחה לראשונה גרסה מוקדמת יותר של שיטה זו לאיתור רעלן שיגה (Stx) מזני STEC שבהם אינדוקציה אנטיביוטית מפעילה את תגובת SOS החיידקית וכתוצאה מכך ביטוי של גנים פאג ', כולל STX כמו גם גנים פאג ' מאוחר האחראים על תמוגה תאי חיידקי41 . מצאנו כי תמה תאים הנגרמת על ידי אנטיביוטיקה יש יתרונות מסוימים לגילוי של Stx, כמו גם חלבונים plasmid שיש להם מקדמי SOS (העבודה הנוכחית). אין ספק, תמוגה תא מכני (למשל, חרוז מכות) ניתן להשתמש גם (אם כי לא נעשה שימוש בעבודה הנוכחית). עם זאת, תמוגה מכנית גורמת לכך שכל תאי החיידקים ניזונים (לא רק תאים מושרים) וכתוצאה מכך המדגם מועשר בחלבונים מארחים שופעים ושמורים מאוד שיכולים להפוך את הזיהוי של חלבוני פאג ' ופלסטיד מדגם לא מחולל למאתגר יותר.

ריכוזי האנטיביוטיקה לזן חיידקי נמצאו בדרך כלל ניתנים לשחזור ביחס לחלבונים הנגרמים על ידי אנטיביוטיקה שזוהו. ציינו וריאציות בשפע החלבון היחסי ביחס לחלבונים הנגרמים מאנטיביוטיקה שזוהו. מאז הניתוח שלנו הוא איכותי (לא כמותי), שפע סמן ביולוגי חלבון צריך רק להספיק לניתוח נאות MS / MS. זן STEC putative הוא הראשון תרבית עם מגוון של ריכוזים אנטיביוטיים (למשל, 300 ng/mL כדי 2,000 ng/mL של mitomycin-C) כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי כך שהוא מפעיל את תגובת SOS חיידקי תוך עדיין מתן מספיק תאים חיידקיים לקציר. עבור זן STEC RM7788, מצאנו כי ריכוז אנטיביוטיקה אופטימלי לגילוי של סמנים ביולוגיים שזוהו היה 400 עד 800 ng/mL של mitomycin-C.

בנוסף לתקיעת רצף חלבונים, חלבוני E. coli יכולים להיות PTMs הכוללים תוספת של מסה, למשל, זרחן, גליקוסילציה, וכו '. כמו MS/MS משתמש PSD לניתוק של יונים חלבון metastable טעון בנפרד (מתחת 20 kDa במסה) שנוצר על ידי MALDI, PTMs כאלה מחוברים שרשראות צד שאריות צפוי לעבור אובדן דיסוציאטיבי facile כי PSD היא טכניקת דיסוציאציה ergodic. נוכחותם של PTMs כאלה יכולה להסיק מהופעתו של יון שבר קרוב במסה ליון הקדמה המקורי (מינוס המסה של PTM) בנתוני MS / MS. עם זאת, לא PSD ולא התוכנה יוכלו לזהות היכן PTMs כאלה מצורפים. בנוסף, התוכנה יכולה לזהות רק חלבונים מיונים שברים של PBC ולא אובדן דיסוציאטיבי של מולקולות קטנות (למשל, מים או אמוניה) או PTMs המחוברים לשרשראות הצד של שאריות. עם זאת, אם יונים שבר מ PBC מזוהים, החלבון עדיין יכול להיות מזוהה באמצעות התוכנה על ידי הרחבת חלון סובלנות מסת חלבון לכלול את המסה של PTM או פשוט להיכנס המסה של יון שבר חלבון המתאים לאובדן דיסוציאטיבי של PTM חשוד. כל זיהוי על ידי התוכנה יהיה של רצף החלבון ללא PTM. מעניין, לא זיהינו חלבונים שיש זרחן, גליקוסילציה, וכו 'בעבודה החיידקית שלנו עד כה. עם זאת, זה יכול להיות בשל: השפע היחסי שלהם על ידי MALDI, טווח המסה בשימוש: 2-20 kDa, כי PTMs כאלה עשויים להיות שפתיים יוצאות דופן ולא יכול לשרוד יישום של מטריצת MALDI, או כי PTMs כאלה עשויים לעבור אובדן דיסוציאטיבי מהיר מאוד במקור לפני יונים מואצים מהמקור.

נכון לעכשיו, התוכנה אינה כוללת ציסטאין אלקילציה, ופרוטוקול המדגם שלנו אינו כולל שלב הפחתת דיסולפיד עבור שאריות ציסטאין. הפרוטוקול הובהר כדי לציין כי החיפוש הוא להיות מופעל עם שאריות ציסטאין במצבם החמוץ, ואם לא מתקבל זיהוי, אז לבצע את החיפוש שוב עם שאריות ציסטאין במצבם מופחת. אם לא נמצאו שוב זיהויים, הרחבת הסבילות ל-±2 או ±3 מורידה את הסף להתאמת יונים מקוטעים ומאפשרת להתאים רצפים עם סיסטינים בין אם הם נמצאים במצבם המחומצן ו/או המופחת.

ניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה על ידי ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF-TOF
רוב הניתוחים הפרוטאומיים מלמעלה למטה הושג באמצעות פלטפורמות ספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה. לעומת זאת, פחות ניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה נערך באמצעות פלטפורמות MALDI-TOF-TOF. כתוצאה מכך, יש מעט מאוד תוכנה פרוטאומית מלמעלה למטה לניתוח של יונים חלבון metastable טעון בנפרד שנוצר ונותח על ידי MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD המנצלים את אפקט החומצה אספרטית עבור פיצול15,42. ישנן מספר סיבות לכך. ראשית, יעילות היוניזציה של MALDI מוטה לכיוון פפטידים וחלבונים במשקל מולקולרי נמוך יותר, והטיה זו ניכרת במיוחד עם תערובת של חלבונים כפי שניתן למצוא בליסאט תאי חיידקי לא מופרך. שנית, MALDI מייצר מצבי טעינה נמוכה, ויש מעט או אין דחייה קולון כדי להקל על ניתוק יון חלבון. שלישית, כיסוי רצף PSD מוגבל למדי בניגוד לטכניקות אחרות ECD7, ETD7, UV-PD8,וכו '. רביעית, יעילות הפיצול של PSD יורדת עם המסה הגוברת של יון החלבון. חמישית, טכניקות דיסוציאציה ergodic, כגון PSD, נוטים לגרום לאובדן דיסוציאטיבי קל של PTMs המצורפים לשאריות, למשל, זרחן, גליקוסילציה, וכו ', מה שהופך את זה מאתגר לקבוע את האתר של קובץ מצורף PTM. למרות מגבלות חמורות אלה, ניתוח מלמעלה למטה באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD יש יתרונות ברורים, למשל, פשטות של הכנת מדגם, היעדר הפרדת LC, בידוד של יונים חלבון metastable על ידי MS/MS המאפשר ייחוס של יונים שברים יונים מבשרים, זיהוי של PTMs מעורבים truncation רצף ו קשרים תוך-עיניים דיסולפיד והכי חשוב את מהירות הניתוח. בשילוב עם רצפי חלבון סיליקו הנגזרים מנתוני WGS, טכניקה זו יכולה לספק מידע מהיר לפני ניתוחים אחרים הגוזלים זמן רב יותר ועבודה אינטנסיבית הושלמו.

תוכנת מחפש הסמן הביולוגי של חלבון פותחה באמצעות IntelliJ ונכתבה בג'אווה כדי לעבד ולחפש ביעילות רצפי חומצות אמינו של חלבון שמקורם ב- WGS של זן חיידקי. התוכנה שונתה מאלגוריתם קודם שפעל כמאקרו בתוך Excel33. החלטנו לפתח גרסה עצמאית של התוכנה עם ממשק GUI כדי להפוך אותה לידידותית יותר למשתמש וכן לספק שיפורים נוספים.

במקרה של PTMs מעורבים truncation רצף חלבון, התוכנה מסירה ברצף שאריות חומצת אמינו מן N-terminus תוך הוספת שאריות איטרטיביות של הרצף עד סכום המסה פוגש או עולה על המסה הנמדדת של סמן ביו חלבון שזוהה. למרות שתהליך זה יכול לגרום למספר גדול מאוד של שברי מסת חלבון (~ 200,000 מתוך ~ 5000 רצפי חלבון מלאים), יש לו את היתרון של לא לכלול שברי חלבון פוטנציאליים מן ההקצנה ב N-terminus או C-terminus (או שניהם) לא משנה כמה סביר שזיזוף כזה עשוי להיות מנקודת מבט ביולוגית. גישה זו מכונה שיזוף בלתי מוגבל. עם זאת, PTMs חיידקיים הנפוצים ביותר מעורבים truncation הם הסרת מת'ionine N-מסוף או N-מסוף אות פפטיד. כתוצאה מכך, התוכנה גם מאפשרת למפעיל לבחור גבול עליון (50 שאריות) עבור גיזום שאריות מן N-terminus, אשר גורם הרבה פחות שברי חלבון העונים על הקריטריונים מסה סמן ביולוגי חלבון.

PBC בצד C-מסוף של D- ו- E-שאריות, כמו גם בצד N-מסוף של P-שאריות עולה בקנה אחד עם מנגנון אפקט חומצה אספרטית, אשר נחקר בהרחבה הן באופן ניסיוני והן תיאורטית17,18,19,20. הכללה של PBC בצד C-מסוף של N-שאריות נכללה בתוכנה בגלל מנגנון דמוי אפקט חומצה אספרטית שנצפה עבור מספר יונים חלבון metastable במעבדה שלנו39,40. יונים שבר הנפוצים ביותר מן הניתוק של יונים חלבון metastable טעון בנפרד מנותח על ידי MS / MS-PSD נובעים מנגנון פיצול אפקט חומצה אספרטית. האופרטור בוחר את יוני הקטעים הבולטים ביותר מנתוני MS/MS-PSD ומכניס את ה- m/z שלהם לתוכנה וכן עמידות לתנודות יון קטעים משויכת (±m/z). ניתן להתאים את הסבילות של יון השבר לכל שבר כדי לשקף את השפע היחסי שלו. סבילות יון שבר מתאים עשויה להשתנות בין ±1.0 ל -±2.5 מ '/z בהתאם לשפע המוחלט של יון השברים, כמו גם השפע היחסי שלה לעומת רעש כימי ברקע. בדרך כלל, ככל שיש יותר יון שבר, כך הדיוק במסה שלו טוב יותר, מה שמאפשר שימוש בסובלנות יון שבר צרה יותר.

נתוני MS/MS-PSD של יונים חלבון גרורתיים יכולים להשתנות באופן דרמטי מבחינת המורכבות שלהם. ספקטרום MS/MS-PSD מסוימים ניתנים לפרשנות בקלות רבה יותר מאחרים. ישנן מספר סיבות לתופעה זו. ראשית, יון החלבון לא יכול להתפרק ביעילות על ציר הזמן של הניתוח (~ 10-30 μs) אולי בגלל זה נשאר מקופל או מקופל חלקית גם לאחר solubilization בתמיסת מטריצת MALDI. שנית, בנוסף ל- PBC, יונים חלבון metastable יכול לעבור אובדן דיסוציאטיבי של מולקולות קטנות, כלומר, אמוניה (-17 Da) או מים (-18 Da)15. תורם משמעותי למורכבות הספקטרלית נראה אובדן דיסוציאטיבי של אמוניה מהשרשרת הצדדית של שאריות R33. ראינו עלייה במורכבות הספקטרלית של נתוני MS/MS-PSD עם מספר שאריות R ברצף החלבון. חלבונים ללא שאריות R (חלבון YahO36 וחלבון הלם קר CspC33,43), עם שאריות R אחד (חלבון הלם קר CspE33 ו- B-subunit של Stx241), עם שני שאריות R (חלבון היפותטי33), לייצר ספקטרום MS / MS-PSD כי הם יחסית לא מסובך וקל לפרש. עם זאת, כאשר מספר שאריות R להגדיל לשלושה (חלבון HU44), או ארבעה (ubiquitin35וחלבון זעזוע CsbD33,43), המורכבות הספקטרלית עולה באופן משמעותי. התוכנה משווה פיצולים מ- PBC בשאריות ספציפיות למנגנון אפקט החומצה אספרטית רק מכיוון שזהו ערוץ הדיסוציאציה הנגיש ביותר של יונים חלבון metastable טעונים בנפרד שנותחו על ידי MS / MS-PSD. התוכנה אינה כוללת יונים שבר הנובעים אובדן דיסוציאטיבי (או הפסדים) של מולקולות נייטרליות קטנות. כתוצאה מכך, חשוב כי המפעיל אינו בוחר יונים שבר הכוללים הפסדים דיסוציאטיביים ניטרליים קטנים. שברים של יונים מ-PBC הם בדרך כלל יונים השברים הבולטים ביותר; עם זאת, כאשר מספר שאריות R בחלבון עולה לשלושה או ארבעה, יון השברים הנפוץ ביותר באתר PBC עשוי להיות אחד הכולל אובדן דיסוציאטיבי קטן (או הפסדים). אם מקבץ כזה של יונים מקוטעים (מופרדים בכפולות של 17 או 18 מ'/z) מזוהה, יון הקטע עם m/z הגבוה ביותר בתוך אשכול צריך להיות זה שהוזן לתוך הפרמטרים של חיפוש יון קטע.

יודגש כי התוכנה לא תוכננה לזיהוי פרוטאומי ללא מפעיל. על האופרטור לבחור אילו ions מקטע מנתוני MS/MS-PSD ייכללו בחיפוש. עם זאת, בהתבסס על ניסויים רבים שאישרו את אפקט החומצה אספרטית על ידי MS / MS-PSD, יונים שבר הבולטים ביותר הם תמיד תוצאה של PBC בצד C-מסוף של D- או E- או N-שאריות. התועלת של התוכנה היא שהיא מבטלת רצפים שגויים רבים בבירור ומאחזרת רק כמה מועמדים סבירים. רצפי מועמדים מסוימים עשויים להתבטל בהתבסס על היעדר יון שבר שבו D-שאריות ברצף צפוי ליצור יון שבר בולט. תמיד, שאריות D לגרום יונים שבר בולטים ברחבי עמוד השדרה הפוליפפטיד למעט כאשר הם ממוקמים בתוך כמה שאריות של N- או C-termini שבו היעילות של אפקט חומצה אספרטית יורד36.

מספר מינימלי של אתרי PBC הדרושים לזיהוי חלבון לא סופי
CFIP נוצר משני יונים מבשרי חלבון זהים המתנתקים באותו אתר PBC אך יש להם פרוטון מיינם בצדדים מנוגדים של אתר המחשוף. למרות CFIP יכול לשמש כדי לחשב את המסה של סמן ביולוגי חלבון בצורה מדויקת יותר (המאפשר צמצום של סובלנות מסת החלבון במהלך חיפוש), השירות שלה לזיהוי ספציפי לרצף הוא פחות שימושי מזה של שני יונים שבר לא משלימים שנוצרו משני אתרי מחשוף שונים, המספקים ספציפיות זיהוי גדולה יותר. הקלות שבה זוהו שני חלבוני AB-Im הובילה אותנו לשער לגבי המספר המינימלי של יונים שברים הדרושים כדי לזהות באופן זמני את רצף החלבון הנכון מאלפי חלבונים או רצפי שבר חלבון. מהר מאוד קבענו כי לא מספר יונים של שבר כשלעצמו אלא מספר יונים לא משלימים של שברים שחשוב מכיוון שכל שבר לא משלים מייצג אתר PBC אחד ואילו CFIP מייצג את אותו אתר מחשוף. לפיכך, הספציפיות לזיהוי נגזרת ממספר אתרי PBC שזוהו ולא ממספר ions השבר.

ייתכן שההצלחה בהזדהות עם שלושה שברים בלבד הייתה פשוט מקרית. כדי לבדוק השערה זו ולבטל הטיה בבחירת יונים מקוטעים, יצרנו מודול בחינת ביצועים בתוך התוכנה שבוחר באופן אקראי יונים מקוטעים מתוך מאגר גדול יותר של יונים משלימים ו / או לא משלימים. בריכת היונים הגדולה יותר נבחרה מתוך 14 יונים בולטים שזוהו באיור 3 (החלונית התחתונה) בהתבסס על השפע היחסי שלהם.

פרוטוקול הבדיקה היה כדלקמן. באמצעות חיפוש בינארי, שלושה יונים של שברים נבחרו באקראי מתוך המאגר של 14 יונים בולטים באיור 3 (החלונית התחתונה) (m/z 1813.8, 2128.9, 3881.3, 4293.7, 5158.0, 6505.0, 6619.9, 6939.4, 7645.1, 7959.4, 8022.7, 8136.2, 8583.3 ו-8961.5). קוהורטת יון בת שלושה שברים הושוותה נגד יונים של שברי סיליקו מ- PBC בצד C-מסוף של שאריות D- או E או N, כמו גם שילוב של D & E ו- D & E & N. השוואה זו בוצעה עבור כל שבר בודד של קבוצה, עבור שלושת זוגות היונים השברים של קבוצה ולשילוב היונים בן שלושת החלקים של קוהורטה. כדי שהשוואה תיספר כהתאמה, הן יונים מקוטעים של זוג והן שלושת האריונים השברים של שילוב חייבים להתאים ליונים של שברי סיליקו. לאחר השלמת הניתוח, קבוצה נוספת של שלושה שברים יון נבחרה באופן אקראי, והניתוח חוזר על עצמו. חזרה בבחירת יון קטע הותרה. כפי שיש 364 שילובים אפשריים [(n!/r!( n-r)!] של קבוצת יון בת שלושה שברים (r) ממאגר של 14 יונים שברים (n), רק 10 ניתוחים בוצעו כפי שמוצג ב- S1Im3 (מידע משלים).

נראה שדרישת זיהוי היונים בת שלושת הקטעים היא תופעה כללית כפי שמוצגת בעמודה 3_ABC של טבלאות 2-7, 9-10 (S1Im3). כל הספירה של 1 בעמודה 3_ABC תואמת לרצף Im3 (ללא מת'ionine N-terminal). הכשל היחיד בזיהוי אירע מכיוון שיון הקטע ב- m/z 8136.2 (מוצג באיור 3, החלונית התחתונה ומודגש באפור בטבלאות 1 ו- 8) חרג מסובלנות היונים של הקטע (±1.5 מ'/z) שהוזן עבור הניתוח. מכיוון שאלגוריתם הבדיקה דורש שכל חלוקי השבר של קבוצת יון בעלת שלושה שברים יותאמו, כל קבוצה שכללה את יון השבר m/z 8136.2 לא תצליח לזהות/לספור את רצף החלבון הנכון.

טבלה 6 ב- S1Im3 מראה כי כאשר שניים מתוך שלושה יונים קטעים משלימים (מודגש בצהוב), רצפים שגויים יותר תאמו את הקריטריונים מאשר זה שנצפו כאשר כל שלושת ions שברים לא היו משלימים. כפי שצוין קודם לכן, הסיבה לכך היא CFIP מתאים לאתר PBC יחיד, סף שניתן להשיג על ידי רבים יותר שגוי ברצפי סיליקו לעומת שימוש בשני ions קטע לא משלימים התואמים לשני אתרי PBC, קריטריון מחמיר יותר.

ניתוח דומה בוצע על שישה יונים בולטים (m/z 2675.4, 2904.5, 3076.2, 3853.5, 5657.5 ו-5772.8) של Im-Bac המוצגים באיור 4 (לוח תחתון). שלא כמו Im3, Im-Bac אין CFIP ניכר, ולכן ששת ions שברים תואמים ככל הנראה שישה אתרי PBC. מכיוון שיש 20 שילובים אפשריים של קבוצת יון בת שלושה שברים שנבחרה מתוך מאגר של שישה יונים שברים, רק 10 ניתוחים בוצעו כפי שמוצג בטבלאות של S2 Im-Bac (מידע משלים). רצף Im-Bac זוהה/נספר כראוי עבור כל קבוצות היונים בעלות שלושת הקטעים 3_ABC העמודות בכל הניתוחים. בארבעה ניתוחים, רצף שגוי אחד או שניים הותאמו גם הם. עם זאת, מספר קטן זה של רצפים שגויים הוא מספר לניהול עבור אישור ידני.

בסך הכל, ציוני קטעים משלימים ו/או לא משלימים התואמים לשניים או שלושה אתרי PBC מספקים די ספציפיות כדי לאחזר רצף מועמד אחד או שניים. כמובן, יונים שבר שנבחרו על ידי המפעיל צריך להיות שופע יחסית יש S / N טוב. יון קטע אחד או שניים מאתר PBC יחיד אינו מספק די ספציפיות כדי להימנע מאחזור מספר בלתי ניתן לעבודה של רצפים שגויים שיש לאשר על-ידי המפעיל. לא ברור מדוע שניים או שלושה אתרי PBC מספיקים, אבל אתר PBC אחד הוא כנראה לא ספציפי מספיק. למרות שתוצאות השזגה בלתי מוגבלות ב- ~ 200,000 חלבונים ורצפי שבר חלבון העומדים בקריטריוני מסת החלבון, סביר להניח שהאופי הספציפי לאתר / שאריות של אתרי המחשוף, כלומר, צד מסוף C של D-, E-, ו- N-שאריות, תורם לצמצום החד של רצפים אפשריים במהלך השוואת יון שבר. זה עשוי לנבוע, בין השאר, מהתדירות של D-, E-, ו- N-שאריות ברצפי חלבון חיידקיים, כמו גם מיקומם הייחודי ברצפי חלבון על פני פרוטאום של חיידקים. שאריות חומציות ממלאות תפקידים קריטיים במבנה החלבון ובאינטראקציות ממסים. כתוצאה מכך, התדירות והמיקומים שלהם ברצף הראשי הם קריטיים אם לא ייחודיים לתפקוד החלבון ועשויים להסביר מדוע רק אתרי PBC מעטים נחוצים כדי לזהות באופן זמני את רצף החלבון הנכון בין מאות אלפי רצפים שגויים.

מנקודת מבט של שלב הגז, החשיבות של D-, E-, ו- N-שאריות נובעת מהשתתפותם באפיק דיסוציאציה הנגיש באנרגיות פנימיות נמוכות של יונים חלבון metastable טעון בנפרד שנוצר על ידי MALDI וריקבון על ידי PSD20. ציר הזמן הארוך יחסית (~ 10-30 מיקרו) של פיצול יונים מולקולריים על ידי PSD פירושו שהאנרגיה הפנימית של יון החלבון אקראית בין כל דרגות הרטט והסיבוב של חופש ה- יון המולקולרי כך שהניתוק הוא ארגודי וסטטיסטי. כמו כן יש לציין כי המנגנון של אפקט חומצה אספרטית כרוך בסידור מחדש של יונים מולקולריים המתרחש על ידי רצף של צעדים או צעד מרוכז יחיד הכולל אטומים מרובים עד לגיאומטריה חיובית המורידה את מחסום ההפעלה של PBC17,18,19.

שני חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים המקודדים פלסמיד המיוצרים על ידי זן STEC זוהו באמצעות פרוטוקול הכולל אינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה. חלבונים אלה זוהו באמצעות תוכנה שפותחה בתוך הבית המשלבת את המסה הנמדדת של החלבון ומספר קטן יחסית של יונים מקטע ספציפי לרצף שנוצרו כתוצאה מאפקט החומצה אספרטית. התוכנה משווה את נתוני MS ו- MS/MS לרצפי חלבון ושבר חלבון סיליקו הנגזרים מנתוני WGS. למרות שהתוכנה אינה מספקת מדדי זיהוי או ניקוד, היא מבטלת אחוז גבוה מאוד של רצפים שגויים וכתוצאה מכך מספר קטן מאוד של רצפי מועמדים (אחד או שניים) שניתן לאשר בקלות על ידי בדיקה ידנית. לבסוף, בדיקה ידנית של נתוני WGS של זן חיידקי זה חשפה מקדם (תיבת SOS) במעלה הזרם של הגנים AB ו- Im בגנום פלסמיד, אשר מצדיק ביטוי של גנים אלה עקב חשיפה של אנטיביוטיקה מזיקה ל- DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון זמינה באופן חופשי (ללא עלות) על ידי יצירת קשר עם קליפטון ק. פג'רקוויסט בשעה clifton.fagerquist@usda.gov. אנו רוצים להכיר בתמיכה במחקר זה על ידי ARS, USDA, מענק CRIS: 2030-42000-051-00-D.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Tags

כימיה גיליון 171
זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים <em>ב- Escherichia coli</em> באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fagerquist, C. K., Rojas, E.… More

Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter