Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması

Published: May 23, 2021 doi: 10.3791/62577
Automatic Translation
1, 1
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.

Abstract

Bu protokol bakterisidal enzimlerin bağışıklık proteinlerini tanımlar: antibiyotik indüksiyonu kullanılarak patojenik bir Escherichia koli suşu tarafından üretilen ve MALDI-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz ile şirket içinde geliştirilen yazılımla tanımlanan kolisin E3 ve bakteriyosin. Kolisin E3 (Im3) bağışıklık proteini ve bakteriyosin (Im-Bac) bağışıklık proteini, kuşkonmaz asit, glutamik asit ve kuşkonmaz kalıntılarının C-terminal tarafındaki polipeptid omurga bölünmesi (PBC) tarafından üretilen belirgin b ve/veya y tipi parça iyonlarından kuşkonmaz asit etkisi parçalanma mekanizması ile tanımlanmıştır. Yazılım, bakteri suşunun tüm genom diziliminden elde edilen siliko protein dizilerini hızla tarar. Yazılım ayrıca olgun protein dizisinin kesilmesi durumunda bir protein dizisinin amino asit kalıntılarını yinelemeli olarak giderir. Tek bir protein dizisi, her bağışıklık proteini için tespit edilenlerle tutarlı kütle ve parça iyonlarına sahipti. Aday sırası daha sonra algılanan tüm parça iyonlarının atanabileceğini onaylamak için el ile denetlendi. Im3'ün N-terminal metiyoni çeviri sonrası kaldırılırken, Im-Bac tam sıraya sahipti. Ek olarak, doğru protein dizisini tanımlamak için PBC tarafından oluşturulan sadece iki veya üç tamamlayıcı olmayan parça iyonlarının gerekli olduğunu gördük. Son olarak, bakteriyel suşun plazmid genomunda antibakteriyel ve bağışıklık genlerinin yukarı akışta bir promotör (SOS kutusu) tespit edildi.

Introduction

Sindirilmemiş proteinlerin kütle spektrometresi ile analizi ve tanımlanması yukarıdan aşağıya proteomik analiz1, 2,3,4olarak adlandırılır. Artık elektrospray iyonizasyon (ESI)5 ve yüksek çözünürlüklü kütle analizörleri6ve elektron transferi ayrışması (ETD), elektron yakalama ayrışması (ECD)7,ultraviyole foto-ayrışma (UV-PD)8,vb.

Diğer yumuşak iyonizasyon tekniği matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI)9,10,11 yukarıdan aşağıya analiz için daha az yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kısmen diğer kütle analizörlerine kıyasla sınırlı çözünürlüğe sahip uçuş zamanı (TOF) kütle analizörleri ile birleştirilmiştir. Bu sınırlamalara rağmen, MALDI-TOF ve MALDI-TOF-TOF cihazları saf proteinlerin ve fraksiyone edilmiş ve kırılmamış protein karışımlarının hızlı yukarıdan aşağıya analizi için yararlanmıştır. Saf proteinlerin tanımlanması için, kaynak içi çürüme (ISD) özellikle yararlı bir tekniktir, çünkü ISD parça iyonlarının kütle spektrometresi (MS) analizine ve ayrıca genellikle hedef proteinin N ve C-terminisinden diziye özgü parça sağlayan protein iyon parçalarının tandem kütle spektrometresine (MS/ MS) izin verir, Edman dizileme12,13'e benzer . ISD yaklaşımının bir dezavantajı, Edman diziliminde olduğu gibi, numunenin yalnızca bir protein içermesi gerektiğidir. Tek protein gereksinimi, parça iyonlarının öncül bir iyona kesin bir şekilde atfedilmesi ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Bir örnekte iki veya daha fazla protein varsa, hangi parça iyonlarının hangi öncül iyonlara ait olduğunu atamak zor olabilir.

Parça iyon/öncül iyon ilişkilendirmesi MALDI-TOF-TOF-MS/MS kullanılarak ele alınabilir. Her klasik MS/MS deneyinde olduğu gibi, öncül iyonlar parçalanmadan önce kitlesel olarak seçilir/izole edilir ve tespit edilen parça iyonları belirli bir öncül iyona bağlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım için mevcut olan ayrışma teknikleri öncelikle yüksek enerjili çarpışma kaynaklı ayrışma (HE-CID)14 veya kaynak sonrası çürüme (PSD)15,16ilesınırlıdır. HE-CID ve PSD en çok peptitlerin ve küçük proteinlerin parçalanmasında etkilidir ve dizi kapsamı bazı durumlarda sınırlı olabilir. Ek olarak, PSD öncelikle aspartik ve glutamik asit kalıntılarının C-terminal tarafında polipeptid omurga bölünmesi (PBC) ile sonuçlanır aspartik asit etkisi17 , 18,19,20.

MALDI-TOF-MS ayrıca mikroorganizmaların taksonomik tanımlamasında niş bir uygulama buldu: bakteri21,mantarlar 22ve virüsler23. Örneğin, MS spektrası, karşılaştırma için desen tanıma algoritmaları kullanarak bilinen bakterilerin MS spektrumlarının bir referans kütüphanesi ile karşılaştırıldığında bilinmeyen bakterileri tanımlamak için kullanılır. Bu yaklaşım, hızı ve basitliği nedeniyle son derece başarılı olmuştur, ancak bir gecede izolenin kültleştirilmesini gerektirmektedir. Bu yaklaşımla tespit edilen protein iyonları (genellikle 20 kDa'nın altında), cins ve tür düzeyinde ve bazı durumlarda alt türler24 ve suş seviyesi 25,26'dataksonomik çözünürlüğe izin sağlayan bir MS parmak izi içerir. Bununla birlikte, sadece taksonomik olarak potansiyel patojenik mikroorganizmaları sınıflandırmakla kalmayıp, aynı zamanda spesifik virülans faktörlerini, toksinleri ve antimikrobiyal direnç (AMR) faktörlerini de tanımlamaya ihtiyaç vardır. Bunu başarmak için peptitlerin, proteinlerin veya küçük moleküllerin kütlesi MS ile ölçülür ve daha sonra MS/MS tarafından izole edilir ve parçalanır.

Patojenik bakteriler genellikle plazmid adı verilen dairesel DNA parçaları taşırlar. Plazmidler, profilaktasyonlarla birlikte, bakteriler arasında yatay gen transferinin önemli bir vektörüdür ve antimikrobiyal direncin ve diğer virülans faktörlerinin bakteriler arasında hızla yayılmasından sorumludur. Plazmidler ayrıca kolitin ve bakteriyotin gibi antibakteriyel (AB) genler de taşıyabilir. Bu genler ifade edildiğinde ve proteinler salgılandığında, aynı çevresel niş işgal komşu bakterilerin protein çeviri makinelerini devre dışı bırakmak için hareket ederler27. Bununla birlikte, bu bakterisidal enzimler, onları üreten konak için de risk oluşturabilir. Sonuç olarak, bir gen, özellikle bir AB enziminin işlevini engelleyen ve bağışıklık proteini (Im) olarak adlandırılan konak tarafından birlikte ifade edilir.

Mitomycin-C ve sirofloksasin gibi DNA'ya zarar veren antibiyotikler genellikle Shiga toksin üreten E. coli'de (STEC) SOS yanıtını teşvik etmek için kullanılır, shiga toksin geni(stx) bakteri genomunda bulunan bir prophage genomunda bulunur28. Daha önce STEC suşları29,30, 31,32 tarafından üretilen Stx tiplerini ve alt tiplerini tespit etmek ve tanımlamak için antibiyotik indüksiyonu, MALDI-TOF-TOF-MS / MS ve yukarıdan aşağıyaproteomikanalizkullandık. Önceki çalışmada, STEC O113:H21 suşu RM7788, mitomycin-C ile desteklenmiş agar media üzerinde bir gecede kültürlendi. Bununla birlikte, m/z ~7816'da Stx2a'nın beklenen B-alt birliğini tespit etmek yerine, m/z ~ 7839'da farklı bir protein iyonu tespit edildi ve bilinmeyen işlev33plazmid kodlu varsayımsal protein olarak tanımlandı. Mevcut çalışmada, antibiyotik indüksiyonu kullanılarak bu suş tarafından üretilen iki plazmid kodlu AB-Im proteini, MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz, tam genom diziliminden (WGS) elde edilen siliko protein dizilerini işlemek ve taramak için geliştirilen bağımsız yazılım kullanılarak tespit ettik. Buna ek olarak, sıralı kesilmeyi içeren çeviri sonrası değişiklikler (PTM) olasılığı yazılıma dahil edildi. Bağışıklık proteinleri, aspartik asit etkisinin neden olduğu ve MS/MS-PSD tarafından tespit edilen PBC'den olgun protein iyonunun ve diziye özgü parça iyonlarının ölçülen kütlesinden bu yazılım kullanılarak tanımlanmıştır. Son olarak, bu suş DNA'ya zarar veren bir antibiyotiğe maruz kaldığında bu genlerin ekspresyonunu açıklayabilecek bir plazmid genomda AB / Im genlerinin yukarı akışında bir promotör tespit edildi. Bu çalışmanın bazı bölümleri National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo'da (17-20 Ağustos 2020)34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mikrobiyolojik numune hazırlama

  1. Steril 1 μL döngü kullanarak gliserol stoğundan E. coli O113:H21 suşu RM7788 (veya başka bir bakteriyel suş) ile 50 mL konik tüpte 25 mL Luria suyu (LB) aşılanın. Tüpü ve ön kültürü 37 °C'de 4 saat boyunca sallama (200 rpm) ile kapla.
  2. Aliquot 100 μL önceden kültürlenmiş et suyu ve 400 veya 800 ng/mL mitomycin-C ile desteklenmiş bir LB agar plakasına yayılır. Kültür agar plakaları statik olarak 37 °C'de bir inkübatörde gece boyunca.
    DİkKAT: STEC suşları patojenik mikroorganizmalardır. Bir BSL-2 biyogüvenlik kabininde kültlemenin ötesinde tüm mikrobiyolojik manipülasyonları gerçekleştirin.
  3. Steril 1 μL döngü kullanarak tek görünür kolonilerden bakteri hücrelerini toplayın ve 300 μL HPLC sınıfı su içeren 2,0 mL O-ring kaplı vidalı kapak mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri peletmek için tüpü, girdabı kısaca ve santrifüjü 2 dakika boyunca 11.337 x g'da kapla.

2. Kütle spektrometresi

  1. Numunenin 0,75 μL aliquot'u paslanmaz çelik MALDI hedefine koyun ve kurumasını bekleyin. Kurutulmuş numune noktasını% 33 asetonitril,% 67 su ve% 0.2 trifluoracetic asit doymuş bir sinapinik asit çözeltisinin a0.75 μL aliquot ile kaplayın. Noktanın kurumasına izin verin.
  2. Maldi-TOF-TOF kütle spektrometresi kullanarak kurutulmuş numune noktalarını analiz edin.
    1. MALDI hedefini kütle spektrometresine yükledikten sonra, edinme yazılımında MS doğrusal mod alımı için düğmeyi tıklatın. Alt ve üst sınırların m/z'lerini (örneğin, 2 kDa ila 20 kDa) satın alma yöntemi yazılımındaki ilgili alanlarına girerek analiz edilecek m/z aralığını girin.
    2. Yazılımdaki MALDI hedef şablonunda analiz edilecek örnek noktaya tıklayın. Ardından, sol fare düğmesini basılın ve lazer ablasyon/iyonizasyon için örneklenecek dikdörtgen bölgeyi belirtmek için fare imlecini örnek noktanın üzerine sürükleyin. Fare düğmesini bırakın ve alım başlayacaktır. Her örnek nokta için 1.000 lazer çekimi toplayın.
      NOT: Veri toplama, yazılım edinme penceresinde gerçek zamanlı olarak görüntülenir.
    3. İyon tespit edilirse, protein iyon sinyali tespit edilene kadar yazılımdaki Lazer Yoğunluğu altında Kayan Ölçek Çubuğunu ayarlayarak lazer yoğunluğunu artırın. Buna eşik denir.
      NOT: Numune nokta analizinden önce, cihazı MS doğrusal modunda, m/z'si analiz edilen aralığı kapsayan protein kalibrantlarıyla harici olarak kalibre edin, örneğin protein kalibrantlarının +1 ve +2 yük durumları: sitokrom-C, lysozyme ve miyoglobin 2 kDa ila 20 kDa kütle aralığını kapsar. Belirtilen kütle aralığındaki bir ara kütle odak kütlesi olarak kullanılır, örneğin, 9 kDa. Odak kütlesi, doğrusal mod dedektörü tarafından algılama için m/z en iyi şekilde odaklanan iyondur.
    4. MS doğrusal mod alımı tamamlandığında, edinme yazılımında MS/MS reflectron modu alma düğmesini tıklatın. Öncü Kitle alanına analiz edilecek öncül kütleyi girin. Ardından, öncü kütlenin düşük ve yüksek kütleli tarafı için Öncü Kütle Penceresine (Da cinsinden) bir izolasyon genişliği girin, örneğin, ±100 Da.
    5. CID Kapalı düğmesine tıklayın. Metastable Suppressor ON düğmesine tıklayın. Yazılımdaki Lazer Yoğunluğu altındaki kayan ölçek çubuğunu ayarlayarak lazer yoğunluğunu maksimum değerinin en az %90'ına ayarlayın.
    6. Yazılımdaki MALDI hedef şablonunda analiz edilecek örnek noktaya tıklayın. Ardından sol fare düğmesini basılın ve lazer ablasyon/iyonizasyon için örneklenecek dikdörtgen bölgeyi belirtmek için fare imlecini örnek noktanın üzerine sürükleyin. Fare düğmesini bırakın ve alım başlatılır. Her örnek nokta için 10.000 lazer çekimi toplayın.
      NOT: Numune nokta analizinden önce, alkillenmiş tiyoksin35'in+1 şarj durumunun kaynak sonrası çürümesinden (PSD) kaynaklanan parça iyonları kullanılarak cihaz MS/MS-reflectron modunda harici olarak kalibre edilmelidir.
  3. Ham MS verilerini işlemeyin. MS/MS-PSD ham verilerini belirtilen sırada aşağıdaki adım sırasını kullanarak işleyin: gelişmiş taban çizgisi düzeltmesi (32, 0,5, 0,0) ve ardından gürültü giderme (iki standart sapma) ve ardından Gauss yumuşatma (31 puan).
  4. MS/MS-PSD verilerini PBC19,20tarafından oluşturulan belirgin parça iyonlarının varlığı için el ile inceleyin.
  5. MS/MS verilerini, parça iyonlarının mutlak ve göreceli bolluğu ve gürültüye sinyal (S/N) açısından değerlendirin. Özellikle MS/MS-PSD verileri gürültülüyse, protein tanımlama için yalnızca en bol parça iyonlarını kullanın.

3. Siliko protein veritabanı yapımında

  1. Protein tanımlama için Protein Biomarker Arayıcı yazılımı tarafından taranacak bakteri suşunun siliko protein dizilerini içeren bir metin dosyası oluşturun. Protein dizileri, analiz edilen suşun (veya yakından ilişkili bir suşun) tam genom diziliminden (WGS) türetilir.
  2. Analiz edilen spesifik bakteri suşunun (örneğin, Escherichia coli O113:H21 strain RM7788) yaklaşık 5.000 protein dizisini indirmek için NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) web sitesine erişin. En büyük indirme boyutu 200 sıradır.
    1. Sonuç olarak, 25 indirmeyi kopyalayıp tek bir metin dosyasına yapıştırın. Her indirme için FASTA (metin) biçimini seçin.

4. Protein Biyobelirteç Arayıcı yazılımının işletilimi

  1. Protein Biomarker Arayıcı yürütülebilir dosyasına çift tıklayın. Grafik kullanıcı arabirimi (GUI) penceresi görüntülenir (Şekil 1, üst panel).
  2. Protein biyobelirtecinin kütlesini (MS-lineer modda ölçüldüğü gibi) Olgun Protein Kütlesi alanına girin. Ardından, Kütle Toleransı alanına kütle ölçüm hatasını girin. Standart kütle ölçüm hatası 10.000 Da proteini için ±10 Da'dır.
  3. İsteğe bağlı olarak, protein kütlesini putatif tamamlayıcı parça iyon çiftinden (CFIP veya b/y) hesaplamak için Tamamlayıcı b/y iyon Protein Kütle Hesaplayıcısı düğmesine tıklayın. Bir açılır pencere, Protein Kütle Hesaplayıcı Aracı, görünecektir(Şekil 1, alt panel).
    1. Putatif CFIP'nin m/z'sini girin ve Çift Ekle düğmesine tıklayın. Hesaplanan protein kütlesi görünecektir.
    2. Bu numarayı kopyalayıp Olgun Protein Kütlesi alanına yapıştırın ve Protein KütleSi Hesaplayıcı Aracı penceresini kapatın.
  4. Kalıntı Kısıtlamasını Ayarla kutusuna tıklayarak bir N-terminal Sinyal Peptit Uzunluğu seçin. Kayan ölçek ve imleç içeren bir açılır pencere görünecektir. İmleci istediğiniz sinyal peptit uzunluğuna (maksimum 50) taşıyın. Sinyal peptit uzunluğu seçilmezse, yazılım tarafından sınırsız bir sıra kesilmesi gerçekleştirilir.
  5. GUI'deki Parça İyon Durumu altında, polipeptid omurga bölünmesi (PBC) için kalıntılar seçin. Bir veya daha fazla kalıntının kutularına tıklayın: D, E, N ve/veya P.
    1. Aranacak Parça Iyonlarını Gir (+1) düğmesini tıklatın. Bir açılır Parça Sayfası görünecektir. Ardından, girilecek parça iyonlarının sayısına karşılık gelen Parça İyon Ekle düğmesine tıklayın, yani her parça iyon için bir tıklama. Girilecek her parça iyon için bir açılan alan görüntülenir.
    2. Parça iyonlarının m/z'lerini ve ilişkili m/z toleranslarını girin. Tamamlandığında, Kaydet ve Kapat düğmesine tıklayın.
      NOT: Makul bir m/z toleransı ±1,5'tir.
    3. Kaç Parça İyonunun Eşleşmesi Gerektiği 'nin sağındaki kutuda istenen sayıya kaydırarak kimlik için eşleşmesi gereken en az parça iyon sayısınıseçin.
      NOT: Üç eşleşme yeterli olmalıdır.
    4. İlgili daireye tıklayarak oksitlenmiş durumda olmak için sistein kalıntılarını seçin. Aramadan sonra protein tanımlaması bulunamazsa, sisteinlerle aramayı azaltılmış hallerinde tekrarlayın. Aramadan sonra kimlik bulunamazsa, parça iyon toleransını ±3'e genişletin ve aramayı yineleyin.
  6. Dosya Kurulumualtında, daha önce protokol 3.1 ile 3.2 arasında oluşturulan bakteri türünün siliko protein dizilerini içeren FASTA (metin) dosyasına göz atmak ve seçmek için FASTA Dosyasını Seç düğmesini tıklatın. Ardından bir çıktı klasörü seçin ve bir çıktı dosyası adı oluşturun.
  7. Dosya Girişlerinde Aramayı Çalıştır düğmesini tıklatın. Arama başlatılmadan önce arama parametrelerini görüntüleyen Arama Parametrelerini Onayla (Şekil 1, alt panel) başlıklı bir açılır pencere görüntülenir.
  8. Arama parametreleri doğruysa, Aramaya Başla düğmesine tıklayın. Arama parametreleri doğru değilse, İptal düğmesini tıklatın ve doğru parametreleri yeniden girin. Arama başlatıldıktan sonra parametre penceresi kapanır ve aramanın ilerlemesini ve bulunan kimlik sayısının çalışan çetelesini gösteren ilerleme çubuğuna sahip yeni bir açılır pencere(Şekil 1, alt panel) görüntülenir.
  9. Arama tamamlandıktan sonra (birkaç saniye), ilerleme çubuğu otomatik olarak kapanır ve aramanın bir özeti GUI'nin Günlük alanında görüntülenir (Şekil 2, üst panel). Ayrıca, varsa protein tanımlamalarını görüntüleyen yeni bir açılır pencere de görünecektir (Şekil 2, alt panel).
    NOT: Tanınmayan kalıntılara sahip siliko protein dizilerinde, örneğin U veya X, analizden otomatik olarak atlanır ve bu diziler daha sonra, aramanın tamamlanmasından sonra hangi (varsa) sıraların atlandığını operatöre uyarmak için ayrı bir açılır pencere ile raporlanır.

5. Protein dizisinin arama sonrası onayı

  1. El ile analiz ile aday sırasının doğruluğunu onaylayın.
    NOT: Protein Biyobelirteç Arayıcı yazılımının amacı, birçok açıkça yanlış protein dizisini değerlendirmeden ortadan kaldırarak ve dizi kesilmeyi olgun proteine olası bir PTM olarak dahil ederek yüksek doğrulukta bir protein dizisini tanımlamaktır. Döndürülen olası aday sıralarının sayısı az olduğundan, manuel onay yönetilebilir.
  2. Bu işlevselliğe sahip herhangi bir kütle spektrometresi veya proteomik yazılımı kullanarak aday sırasının ortalama m/z'si ve y tipi parça iyonlarının bir tablosunu oluşturun. D-, E-ve N-kalıntılarının C-terminal tarafındaki (ve P-kalıntılarının N-terminal tarafındaki) siliko parça iyonlarının ortalama m/z'sini MS/MS-PSD verilerinden elde edilen belirgin parça iyonlarının m/z'sine karşılaştırın.
    NOT: En belirgin MS/MS-PSD parça iyonları siliko parça iyonlarında D-, E-ve N ile kolayca eşleştirilmelidir. Bununla birlikte, aspartik asit etkisi parçalanma mekanizması, bir protein dizisinin N veya C-termini yakınında daha az verimlidir36.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 3 (üst panel), 400 ng/mL mitomycin-C ile desteklenmiş LBA'da bir gecede kültürlenen STEC O113:H21 suşu RM7788'in MS'ini göstermektedir. M/z 7276, 7337 ve 7841'deki zirveler daha önce sırasıyla soğuk şok proteini C (CspC), soğuk şok proteini E (CspE) ve plazmid kaynaklı bilinmeyen bir proteinolaraktanımlanmıştı. m/z 9780 [M+H]+ protein iyonu Şekil 3'te (alt panel) gösterildiği gibi MS/MS-PSD tarafından analiz edildi. Öncü iyon, zamanlanmış iyon seçici (Tİs) penceresi ile izole edilmiştir ±100 Da. Parça iyonları m/z ve tip/sayılarına göre tanımlanır. m/z 2675.9'daki parça iyonu (bir yıldızla vurgulanır), Şekil 3'te (üst panel) gösterilen m/z 9655'teki metastable protein iyonunun ayrışmasıyla dökülür. Her parça iyonunun teorik ortalama m/z'si, yukarıda gösterilen kolin E3 bağışıklık proteini (Im3) dizisinin PBC'lerine göre parantez içinde gösterilmiştir. PBC siteleri, üretilen ilgili parça iyonları ile kırmızı bir yıldız işareti ile vurgulanır. N-terminal methionine olgun proteinde çeviri sonrası çıkarıldığını gösteren altı çizili. Dizi tek bir sistein kalıntısına (kutulu) sahiptir ve bu nedenle azaltılmış durumunda kabul edilir.

Protein biyobelirteç kütlesini ve birkaç belirgin tamamlayıcı olmayan parça iyonunu kullanarak: m/z 1813.8, 2128.9 ve 4293.7 (±1.5 tolerans) (Şekil 1, alt panel) ve PBC'yi D ve E-kalıntılarının C-terminal tarafıyla kısıtlayan yazılım tarafından yalnızca bir aday sırası bildirildi: Im3 protein dizisi (N-terminal metiyonin olmadan) (Şekil 2 , alt panel). Bir arama için parça iyonları seçilirken, tamamlayıcı olmayan parça iyonları grubunun, gruptaki herhangi iki parça iyonunun m/z'sini toplamanın (ve iki protonun çıkarılması) biyobelirteç kütlesi ve ilişkili kütle toleransı (±10 Da) içine girmeyen bir kütle toplamıyla sonuçlanacağını varsaydığı vurgulanmalıdır. RM7788 taslak WGS ortaya 5008 protein dizileri (açık okuma çerçeveleri)37. Bu ~5.000 tam protein dizisinden 189.490 tam ve kısmi dizi (sınırsız kesilme) biyobelirteç kütle kriterlerini(Şekil 2, üst panel) karşıladı. Kütle kriterlerini geçen bu diziler daha sonra D ve/veya E-kalıntılarının C-terminal tarafındaki siliko PBC'de geçer. Elde edilen parça iyonları daha sonra girilen gözlemlenen parça iyonları ile karşılaştırılır. Yazılım tarafından bildirilen aday sırası yalnızca kütlesine ve üç D ve/veya E'ye özgü PBC sitesine dayanıyordu. Bu kadar az miktarda bilginin elde ettiği özgüllük bir sonraki bölümde tartışılacaktır.

Şekil 3'te (alt panel) gösterildiği gibi, en bol parça iyonları, D-ve E-kalıntılarının C-terminal tarafındaki PBC'nin aspartik asit etkisi parçalanma mekanizması19,20aracılığıyla sonucudur. İki CFIP gözlenir: b67/y17 (m/z 7645.1 / m/z 2128.9) ve b70/y14 (m/z 7959.4 / m/z 1813.8). Bu CFIP, basit formülü kullanarak protein öncüsü iyonunun kütlesini daha doğru hesaplamak için kullanılabilir: b (m/z) + y (m/z) - 2H+ = protein kütlesi (Da)33. İki CFIP kullanarak, proteinin ortalama bir kütlesini elde ediyoruz: 9771.6 Da, teorik değerine ms-lineer modda protein iyonunun ölçülen kütlesinden daha yakın olan 9771.6 Da: 9779 Da(Şekil 3, üst panel). Sadece birkaç CFIP tespit edildi, çünkü iyonlaştırıcı protona sahip öncül iyonların çoğu tek arginin kalıntısına inzal etti: R80. Arginin (237.0 kcal/mol38)ve lizin kalıntısı (K) (221.8 kcal/mol38)ile karşılaştırıldığında daha yüksek gaz fazı temelliği, iyonlaştırıcı protonun tek R kalıntısında tercihli olarak inzitrasyondan sorumludur.

Şekil 4 (üst panel), LBA'da bir gecede kültürlenen STEC O113:H21 suşu RM7788'in MS'ini 800 ng/mL mitomycin-C ile birlikte göstermektedir. Şekil 4 (üst panel), Kullanılan antibiyotik konsantrasyonlarındaki farklılıklar nedeniyle bazı protein iyonlarının göreceli bolluğunda farklılıklar olmasına rağmen, Şekil 3'e (üst panel) oldukça benzerdir. Protein biyobelirteç m/z'de, cihazın farklı günlerde dış kalibrasyonunda farklılıkları yansıtan küçük kaymalar da vardır. Bir kez daha, m/z 7272, 7335 ve 7838'deki protein iyonları sırasıyla CspC, CspE ve plazmid kaynaklı bir proteindir. Ek olarak, Im3 protein iyonunu m/z 9778'de (Şekil 3'tendaha az bollukla da olsa) ve m/z 9651 [M +H]+'da bir protein iyonunu tespit ediyoruz. Şekil 4 (alt panel) m/z 9651'de protein öncüsü iyonunun MS/MS-PSD'sini göstermektedir. Öncü iyon, m/z 9539 ve 9778'deki bitişik protein iyonlarının katkılarını ortadan kaldırmak için -75/+60 Da'lık daha dar ve asimetrik bir Tİs penceresi kullanılarak izole edildi. Parça iyonları m/z ve tip/sayıları ile tanımlanır. Bakteriyosinin (Im-Bac) bağışıklık proteininin sırası yukarıda gösterilmiştir. PBC siteleri, karşılık gelen parça iyonlarıyla kırmızı bir yıldız işaretiyle vurgulanır. Her parça iyonunun teorik ortalama m/z'si de spektrumdaki parantez içinde gösterilir. Im-Bac dizisi ayrıca tek bir sistein kalıntısına (kutulu) sahiptir ve bu nedenle azaltılmış durumunda kabul edilir.

Protein biyobelirteç kütlesini kullanarak, üç belirgin tamamlayıcı olmayan parça iyonu: m/z 2675.4, 3853.5 ve 5772.8 (±1.50 tolerans) Şekil 4'ten ve PBC'yi D ve/veya E- ve/veya kuşkonmaz (N) kalıntılarının sadece C-terminal tarafıyla sınırlamak, yazılım tarafından sadece bir aday dizisi bildirilmiştir: Im-Bac protein. Aday sırası, biyobelirteç kütlesi ve tolerans (±10 Da) kriterlerini karşılayan 191.375 tam veya kısmi dizi tarandıktan sonra alındı. Aday sırası yazılım tabanlı olarak yalnızca kütlesine ve üç D ve/veya E ve/veya N'ye özgü PBC sitesine göre tanımlanmıştır.

Şekil 4'teki (alt panel) en belirgin parça iyonları, bir kez daha, D ve / veya E-kalıntılarının C terminali tarafında ve ayrıca P-kalıntılarından birinin N-terminal tarafında PBC'nin sonucu20' dir. Ayrıca, aspartik asit etkisi benzeri bir parçalanma mekanizması39,40ile ortaya çıkması muhtemel bir N-kalıntılarının C-terminal tarafında PBC gözlemliyoruz. Protein öncül iyon sinyalinin zayıflığı, sınırlı sayıda yorumlanabilir parça iyonlarına neden olur. Parça iyon m/z'nin doğruluğu parça iyon bolluğu ile azalır. Muhtemelen protein iyon dizisinin tek arginin kalıntısında (R74) inzal ettirilen iyonlaştırıcı proton nedeniyle CFIP saptanmamıştır. Tüm parça iyonları bu hipotezle uyumlu olarak R74 kalıntısı içerir.

Antibakteriyel bağışıklık genlerinin promotörü
Şekil 5, 6482 bp contig00100 E. coli strain RM7788'in (GenBank: NWVS01000096.1) tam genomlu av tüfeği diziliminden bir kısmını göstermektedir37. Kolisin E3 için kodlama bölgeleri, bağışıklık proteini (Im3), bakteriyosin bağışıklık proteini (Im-Bac) ve bir lizis proteini sarı ile vurgulanır. Colicin E3 geni için kodlama bölgesinin yukarı akışı -35 bölgesi, Pribnow kutusu (PB), SOS kutusunun ters tekrarı, Shine-Dalgarno/ribozomal bağlama bölgesi (SD/ RBS)27'dir. Kolin E3 ve Im3 arasında dokuz baz çifti interjenik bölge vardır. LexA (bir represör proteini ve bir otopeptidaz) sos kutusuna bağlanarak genlerin aşağı akış ifadesini engeller. DNA hasarı üzerine (örneğin, UV radyasyon veya DNA'ya zarar veren antibiyotikler), LexA, genlerin aşağı akış27 , 28ifadesini sağlayan kendi kendine bölünmeye tabidir. Bu nedenle, bu iki bağışıklık proteininin ekspresy ifadesi, bu türün DNA'ya zarar veren bir antibiyotiğe maruz kalmasıyla tutarlıdır.

Figure 1
Şekil 1: Protein Biomarker Arayıcı yazılımının ekran görüntüleri. Üst panel: Protein Biomarker Arayıcı yazılımının grafik kullanıcı arayüzü (GUI). Alt paneller: Protein Kütle Hesaplayıcı Aracı, Parça Sayfası, Arama Parametrelerini Onayla ve Arama ilerleme çubuğunun açılır pencereleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Protein Biyobelirteç Arayıcı yazılımını kullanarak protein tanımlamasının arama sonuçları. Üst panel: Yazılım GUI'nin Günlük Alanında görüntülenen arama sonuçlarının özeti. Alt panel: Yazılımı kullanarak protein tanımlamasını görüntüleyen bir açılır pencere. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: STEC O113:H21 suşu RM7788'in kütle spektrometresi analizi. Üst panel: STEC O113:H21 suş RM7788 MS 400 ng/mL mitomycin-C ile desteklenmiş LBA'da bir gecede kültürlendi. Alt panel: m/z 9780'deki (üst panel) protein öncüsü iyonunun MS/MS-PSD'si. Öncü iyon Tİs penceresi ile izole edildi ±100 Da. Parça iyonları m/z ve iyon tiplerine göre tanımlanır. Kolin E3 (Im3) için bağışıklık proteininin sırası gösterilmiştir. Temel kalıntılar (olası ücret sequestration siteleri) mavi ile vurgulanır. PBC, oluşturulan karşılık gelen parça iyonları ile kırmızı bir yıldız işareti ile vurgulanır. Her parça iyonunun teorik ortalama m/z parantez içinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: STEC O113:H21 suşu RM7788'in kütle spektrometresi analizi. Üst panel: STEC O113:H21 suş RM7788 MS 800 ng/mL mitomycin-C ile desteklenmiş LBA üzerinde bir gecede kültürlü. Alt panel: M/z 9651'deki (üst panel) protein öncüsü iyonunun MS/MS-PSD'si. Öncü iyon, öncü iyonun düşük m/z tarafında -75 ve öncü iyonun yüksek m/z tarafında +60 asimetrik Tİs penceresi ile izole edildi. Parça iyonları m/z ve iyon tiplerine göre tanımlanır. Bakteriyosinin (Im-Bac) bağışıklık proteininin sırası gösterilmiştir. Temel kalıntılar (olası ücret sequestration siteleri) mavi ile vurgulanır. PBC, oluşturulan karşılık gelen parça iyonları ile kırmızı bir yıldız işareti ile vurgulanır. Her parça iyonunun teorik ortalama m/z parantez içinde gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: E. coli O113:H21 strain RM7788 tarafından taşınan plazmid genomunun bir bölümünün analizi. E. coli O113:H21 strain RM7788(GenBank: NWVS01000096.1) 6482 bp contig00100'ün bir kısmı tüm genom av tüfeği diziliminden37. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tamamlayıcı Dosya 1 (S1 Im3): Im3'ün belirli parça iyonlarını kullanarak yazılımın kıyaslama analizinin sonuçları (Şekil 3, alt panelden). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tamamlayıcı Dosya 2 (S2 ImBac): Im-Bac'ın belirli parça iyonlarını kullanarak yazılımın kıyaslama analizinin sonuçları (Şekil 4, alt panelden). Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokolle ilgili önemli noktalar
Mevcut protokolün birincil güçlü yönleri hızı, numune hazırlama basitliği ve kullanımı nispeten kolay olan, eğitilen ve bakımı olan bir cihazın kullanımıdır. Sıvı kromatografisi-ESI-HR-MS tarafından yapılan aşağıdan yukarıya ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz her yerde bulunmasına ve MALDI-TOF-TOF tarafından yukarıdan aşağıya doğru birçok açıdan çok daha üstün olmasına rağmen, daha fazla zaman, emek ve uzmanlık gerektirir. Cihaz karmaşıklığı genellikle belirli enstrüman platformlarının kütle spektrometresi konusunda resmi olarak eğitilmeyen bilim adamları tarafından benimsenip benimsenmeyeceğini etkileyebilir. MALDI-TOF-TOF ile yukarıdan aşağıya yaklaşım, MALDI-TOF-MS'in analizini klinik mikrobiyoloji laboratuvarlarındaki bakterilerin taksonomik tanımlanması için mevcut kullanımının ötesine uzatmayı ve analiz için gereken emeği, karmaşıklığı veya uzmanlığı önemli ölçüde artırmayı amaçlamaktadır.

Protokolde herhangi bir mekanik (veya elektriksel) hücre liziz adımı kullanılmaz. Protokol kullanılarak salgılanan veya hücre dışı proteinler tespit edilebilse de, bu yöntemin daha önceki bir sürümü ilk olarak STEC suşlarından Shiga toksininin (Stx) tespiti için geliştirilmiştir, burada antibiyotik indüksiyonu, stx ve bakteri hücresi lizizinden sorumlu geç faj genleri de dahil olmak üzere faj genlerinin ekspresyonu ile sonuçlanan bakteriyel SOS yanıtını tetikler41 . Antibiyotik kaynaklı hücre lizizinin Stx'in yanı sıra SOS promotörleri olan plazmid proteinlerin (mevcut çalışma) tespiti için belirli avantajları olduğunu bulduk. Elbette, mekanik hücre lizisi (örneğin boncuk dövme) de kullanılabilir (mevcut çalışmada kullanılmamasına rağmen). Bununla birlikte, mekanik lizis, tüm bakteri hücrelerinin (sadece indüklenmiş hücreler değil) lize edilmesine neden olur ve numunenin kırılmamış bir numuneden faj ve plazmid proteinlerinin tespitini daha zor hale getirebilecek bol, yüksek oranda korunmuş konak proteinlerle zenginleştirilmesine neden olur.

Bakteriyel bir suş için antibiyotik konsantrasyonlarının, tespit edilen antibiyotik kaynaklı proteinlere göre genellikle tekrarlanabilir olduğu bulunmuştur. Saptaılan antibiyotik kaynaklı proteinlere göre göreli protein bolluğundaki farklılıklara dikkat çektik. Analizimiz nitel (nicel değil) olduğundan, protein biyobelirteç bolluğunun yeterli MS/MS analizi için yeterli olması gerekir. Putatif bir STEC suşu, hasat için yeterli bakteri hücresi sağlarken bakteriyel SOS yanıtını tetikleyecek şekilde optimum konsantrasyonu belirlemek için ilk olarak bir dizi antibiyotik konsantrasyonu (örneğin, 300 ng / mL ila 2.000 ng / mL mitomisin-C) ile kültürlendirilir. STEC suşu RM7788 için, tanımlanan biyobelirteçlerin tespiti için optimum antibiyotik konsantrasyonunun 400 ila 800 ng/mL mitomisinin-C olduğunu bulduk.

Protein dizisi kesilmesine ek olarak, E. coli proteinleri kütle ilavesi içeren PTM'lere sahip olabilir, örneğin fosforilasyon, glikosilasyon vb. MS/MS, MALDI tarafından üretilen tek yüklü metastabl protein iyonlarının (kütle olarak 20 kDa'nın altında) ayrışması için PSD'yi kullandığından, kalıntı yan zincirlerine bağlı bu tür PTM'ler büyük olasılıkla facile dissosiyatif kayıp geçirir, çünkü PSD ergodik bir ayrışma tekniğidir. Bu tür PTM'lerin varlığı, ms/ms verilerindeki orijinal öncül iyona (PTM kütlesi hariç) yakın bir parça iyonunun görünümünden çıkarılabilir. Ancak, ne PSD ne de yazılım bu tür PTM'lerin nereye eklendiğini belirleyemez. Ek olarak, yazılım sadece PBC'nin parça iyonlarından proteinleri tanımlayabilir ve küçük moleküllerin (örneğin, su veya amonyak) veya kalıntıların yan zincirlerine bağlı PTM'lerin ayrıştırıcı kaybını tanımlayamaz. Bununla birlikte, PBC'den parça iyonları tespit edilirse, protein, protein kütle toleransı penceresini PTM'nin kütlesini içerecek şekilde genişleterek veya sadece şüpheli PTM'nin ayrışma kaybına karşılık gelen protein parçası iyonunun kütlesine girerek yazılım kullanılarak tanımlanabilir. Yazılım tarafından yapılan herhangi bir tanımlama, PTM olmadan protein dizisinden olacaktır. İlginçtir ki, şimdiye kadar bakteriyel çalışmalarımızda fosforilasyon, glikosilasyon vb. Bununla birlikte, bunun nedeni şu olabilir: MALDI tarafından göreli bollukları, kullanılan kütle aralığı: 2-20 kDa, bu tür PTM'lerin alışılmadık bir şekilde labile olabileceği ve MALDI matrisinin uygulanmasından sağ çıkamayacağı veya bu TÜR PTM'lerin iyonlar kaynaktan hızlandırılmadan önce kaynakta çok hızlı ayrışma kaybına uğrayabileceği.

Şu anda, yazılım sistein alkilasyonu içermez ve örnek protokolümüz sistein kalıntıları için bir disülfür azaltma adımı içermez. Protokol, aramanın Oksitlenmiş durumlarında sistein kalıntıları ile çalıştırılacağını ve kimlik tespiti elde edilmezse, azaltılmış durumlarında sistein kalıntıları ile tekrar aramanın yapılması için açıklığa kavuşturuldu. Yeniden kimlik bulunamazsa, parça iyon toleransını ±2 veya ±3'e genişletmek, sisteinli dizilerin oksitlenmiş ve/veya azaltılmış durumlarında bulunup bulunmadıklarıyla eşleştirilmesine izin vererek parça iyon eşleştirme eşiğini düşürür.

MALDI-TOF-TOF kütle spektrometresi ile yukarıdan aşağıya proteomik analiz
Yukarıdan aşağıya proteomik analizlerin çoğu ESI ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi platformları kullanılarak sağlanmıştır. Buna karşın, MALDI-TOF-TOF platformları kullanılarak daha az yukarıdan aşağıya proteomik analiz yapılmıştır. Sonuç olarak, MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD tarafından üretilen ve analiz edilen ve parçalanma için aspartik asit etkisinden yararlanan tek başına şarj edilen metastable protein iyonlarının analizi için çok az yukarıdan aşağıya proteomik yazılım vardır15,42. Bunun birkaç nedeni vardır. İlk olarak, MALDI'nin iyonlaşma verimliliği daha düşük moleküler ağırlıklı peptitlere ve proteinlere karşı önyargılıdır ve bu önyargı, kırılmamış bir bakteri hücresi lisatında bulunacağı gibi özellikle proteinlerin bir karışımı ile belirgindir. İkincisi, MALDI düşük yük durumları üretir ve protein iyon ayrışmasını kolaylaştırmak için çok az Coulomb itme vardır veya yoktur. Üçüncü olarak, PSD sıra kapsamı ECD 7 , ETD7,UV-PD8,vb. Dördüncüsü, PSD'nin parçalanma verimliliği protein iyonunun artan kütlesi ile azalır. Beşinci olarak, PSD gibi ergodik ayrışma teknikleri, kalıntılara bağlı PTM'lerin, örneğin fosforilasyon, glikosilasyon vb. Bu ağır sınırlamalara rağmen, MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD kullanılarak yapılan yukarıdan aşağıya analizler, örneğin numune hazırlamanın basitliği, LC ayrımının olmaması, parça iyonlarının öncü iyonlara atfedilmesine izin vererek MS/MS tarafından metastable protein iyonlarının izolasyonu, sıra kesme ve intramoleküler disülat bağları içeren PTM'lerin tanımlanması ve en önemlisi analiz hızı gibi açık avantajlara sahiptir. WGS verilerinden elde edilen siliko protein dizileri ile birleştirildiğinde, bu teknik diğer daha fazla zaman alan ve emek yoğun analizler tamamlanmadan önce hızlı bilgi sağlayabilir.

Protein Biomarker Arayıcı yazılımı IntelliJ kullanılarak geliştirilmiştir ve bir bakteri türünün WGS'sinden elde edilen protein amino asit dizilerini verimli bir şekilde işlemek ve aramak için Java ile yazılmıştır. Yazılım, Excel33içinde makro olarak çalışan önceki bir algoritmadan değiştirildi. Yazılımı daha kullanıcı dostu hale getirmek ve daha fazla iyileştirme sağlamak için GUI arayüzüne sahip bağımsız bir sürümünü geliştirmeye karar verdik.

Protein dizisi kesilmesini içeren PTM'ler durumunda, yazılım bir amino asit kalıntısını N-terminustan sırayla çıkarırken, kütle toplamı tespit edilen protein biyobelirtecinin ölçülen kütlesini karşılayana veya aşana kadar sıranın kalıntılarını yinelemeli olarak ekler. Bu işlem çok sayıda protein kütlesi parçasına (~5000 tam protein dizisinden ~ 200.000) neden olsa da, N-terminus veya C-terminus'taki (veya her ikisi de) herhangi bir potansiyel protein parçasını kesilmeden dışlamama avantajına sahiptir, ancak bu tür bir kesilme biyolojik bir perspektiften mümkün olmayabilir. Bu yaklaşım sınırsız kesilme olarak adlandırılır. Bununla birlikte, kesilmeyi içeren en yaygın bakteriyel PTM'ler N-terminal metiyonin veya N-terminal sinyal peptidinin çıkarılmasıdır. Sonuç olarak, yazılım ayrıca operatörün N-terminustan kalıntı kesilmesi için bir üst sınır (50 kalıntı) seçmesine izin verir, bu da protein biyobelirteç kütle kriterlerini karşılayan çok daha az protein parçası ile sonuçlanır.

D ve E-kalıntılarının C-terminal tarafında ve P-kalıntılarının N-terminal tarafında PBC, hem deneysel hem de teorik olarak 17,18 , 19,20olarak kapsamlı bir şekilde çalışılan aspartik asit etki mekanizması ile tutarlıdır. Laboratuvarımızda bir dizi metastable protein iyonu için gözlenen aspartik asit etkisi benzeri bir mekanizma nedeniyle PBC'nin N-kalıntılarının C-terminal tarafına dahil edilmesi yazılıma dahil edilmiştir39,40. MS/MS-PSD tarafından analiz edilen tek yüklü metastaz protein iyonlarının ayrışmasındaki en bol parça iyonları aspartik asit etkisi parçalanma mekanizmasından kaynaklanmaktadır. operatör, MS/MS-PSD verilerinden en belirgin parça iyonlarını seçer ve m/z'lerini yazılıma ve ilişkili bir parça iyon toleransına (±m/z) girer. Parça iyon toleransı, her parça iyon için göreli bolluğunu yansıtacak şekilde ayarlanabilir. Uygun bir parça iyon toleransı, parça iyonunun mutlak bolluğuna ± ve arka plan kimyasal gürültüsüne kıyasla göreceli bolluğuna bağlı olarak 1,0 ila 2,5 m/z ± arasında değişebilir. Tipik olarak, bir parça iyon ne kadar bol olursa, kütle doğruluğu o kadar iyi olur, bu da daha dar bir parça iyon toleransı kullanılmasını sağlar.

Metastable protein iyonlarının MS/MS-PSD verileri karmaşıklıkları açısından önemli ölçüde değişebilir. Bazı MS/MS-PSD spektrumları diğerlerine göre daha kolay yorumlanabilir. Bu fenomenin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, protein iyonu analizin zaman ölçeğinde (~10-30 μs) verimli bir şekilde parçalanmayabilir, çünkü maldi matris çözeltisinde çözünürizasyondan sonra bile katlanmış veya kısmen katlanmış olarak kalabilir. İkincisi, PBC'ye ek olarak, metastable protein iyonları küçük moleküllerin, yani amonyak (-17 Da) veya su (-18 Da)15'indissosiyatif kaybına uğrayabilirler. Spektral karmaşıklığa önemli bir katkıda bulunan, R kalıntılarının yan zincirinden ayrışma amonyak kaybı gibi görünmektedir33. Protein dizisindeki R-kalıntılarının sayısı ile MS/MS-PSD verilerinin spektral karmaşıklığında bir artış gözlemledik. R kalıntısı olmayan proteinler (YahOproteini 36 ve soğuk şok proteini CspC33,43), bir R kalıntısı (soğuk şok proteini CspE33 ve Stx241'inB-alt birliği), iki R kalıntısı (varsayımsal protein33),nispeten karmaşık olmayan ve yorumlaması kolay MS / MS-PSD spektrumları üretir. Bununla birlikte, R-kalıntılarının sayısı üçe (HUproteini 44) veya dörde (her yerde bulunan35andcold şok proteini CsbD33,43)arttığındaspektralkarmaşıklık önemli ölçüde artar. Yazılım, PBC'den gelen parça iyonlarını aspartik asit etki mekanizmasına özgü kalıntılarda karşılaştırır, çünkü bu MS / MS-PSD tarafından analiz edilen tek yüklü metastable protein iyonlarının en erişilebilir ayrışma kanalıdır. Yazılım, küçük nötr moleküllerin ayrışma kaybından (veya kayıplarından) kaynaklanan parça iyonlarını içermez. Sonuç olarak, operatörün küçük nötr dissosiyatif kayıplar içeren parça iyonlarını seçmemesi önemlidir. PBC'den parça iyonları tipik olarak en belirgin parça iyonlarıdır; bununla birlikte, bir proteindeki R kalıntılarının sayısı üç veya dörde çıktığında, bir PBC sitesindeki en bol parça iyonu küçük bir dissosiyatif kayıp (veya kayıplar) içeren bir iyon olabilir. Böyle bir parça iyon kümesi (17 veya 18 m/z'nin katlarıyla ayrılmış) algılanırsa, bir küme içindeki en yüksek m/z'ye sahip parça iyon, parça iyon arama parametrelerine girilen iyon olmalıdır.

Yazılımın operatörsüz proteomik tanımlama için tasarlanmadığı vurgulanmalıdır. İşleç, MS/MS-PSD verilerinden hangi parça iyonlarının aramaya dahil edileceğini seçmelidir. Bununla birlikte, MS/ MS-PSD tarafından aspartik asit etkisini doğrulayan çok sayıda deneye dayanarak, en belirgin parça iyonları her zaman D veya E-veya N kalıntılarının C-terminal tarafındaki PBC'nin sonucudur. Yazılımın faydası, birçok açıkça yanlış diziyi ortadan kaldırması ve sadece birkaç olası adayı almasıdır. Bazı aday dizileri, bir dizideki bir D kalıntısının belirgin bir parça iyonu oluşturmasının beklendiği bir parça iyonunun yokluğuna bağlı olarak ortadan kaldırılabilir. Her zaman, D kalıntıları polipeptid omurgası boyunca belirgin parça iyonlarına neden olur, ancak aspartik asit etkisinin verimliliğinin36azaldığı N veya C-termini'nin birkaç kalıntısı içinde bulundukları durumlar dışında.

Belirsiz protein tanımlaması için gereken minimum PBC bölgesi sayısı
CFIP, aynı PBC sitesinde ayrışan ancak iyonlaştırıcı protonları dekolte bölgesinin karşı taraflarında olan iki özdeş protein öncüsü iyonundan oluşur. Bir CFIP, protein biyobelirtecinin kütlesini daha doğru hesaplamak için kullanılabilse de (bir arama sırasında protein kütle toleransının daralmasına izin verir), sıraya özgü tanımlama için faydası, daha fazla tanımlama özgüllüğü sağlayan iki farklı bölünme bölgesinden oluşan iki tamamlayıcı olmayan parça iyonundan daha az yararlıdır. İki AB-Im proteininin tanımlanma kolaylığı, binlerce protein veya protein parçası dizisinden doğru protein dizisini belirsiz bir şekilde tanımlamak için gerekli minimum parça iyonları sayısı hakkında spekülasyon yapmamıza neden oldu. Hızlı bir şekilde, parça iyonlarının sayısı değil, önemli olanın tamamlayıcı olmayan parça iyonlarının sayısı olduğunu belirledik, çünkü tamamlayıcı olmayan her parça iyon bir PBC bölgesini temsil ederken, cfip aynı bölünme bölgesini temsil eder. Bu nedenle, tanımlama özgüllüğü, parça iyonlarının sayısından değil, algılanan PBC sitelerinin sayısından türetilir.

Sadece üç parça iyon ile tanımlamadaki başarının sadece tesadüfi olması mümkündür. Bu hipotezi test etmek ve parça iyonlarının seçiminde önyargıyı ortadan kaldırmak için, yazılım içinde daha büyük bir tamamlayıcı ve/veya tamamlayıcı olmayan parça iyonları havuzundan parça iyonlarını rastgele seçen bir kıyaslama modülü oluşturduk. Daha büyük parça iyon havuzu, şekil 3'te (alt panel) tanımlanan 14 belirgin parça iyonundan göreceli bolluklarına göre seçilmiştir.

Test protokolü aşağıdaki gibidir. İkili arama kullanılarak, Şekil 3'teki (alt panel) 14 belirgin parça iyonunun havuzundan rastgele üç parça iyonları seçilmiştir (m/z 1813.8, 2128.9, 3881.3, 4293,7, 5158,0, 6505,0, 6619,9, 6939,4, 7645,1, 7959,4, 8022,7, 8136,2, 8583,3 ve 8961,5). Üç parçalı bir iyon kohort, D veya E veya N kalıntılarının C terminali tarafındaki PBC'den gelen siliko parça iyonlarının yanı sıra D & E ve D & N kombinasyonu ile karşılaştırıldı. Bu karşılaştırma, bir kohortun her bir parça iyononu, bir kohortun üç parça iyon çifti ve bir kohortun üç parçalı iyon kombinasyonu için gerçekleştirildi. Bir karşılaştırmanın eşleşme olarak sayılması için, hem bir çiftin parça iyonları hem de bir kombinasyonun üç parça iyonunun siliko parça iyonlarıyla eşleşmesi gerekir. Analizin tamamlanmasından sonra, rastgele başka bir üç parçalı iyon kohort seçilir ve analiz tekrarlanır. Parça iyon seçiminde tekrara izin verildi. 364 olası kombinasyon olduğu için [(n!/r!) n-r)!] 14 parçalı iyon (n) havuzundan üç parçalı bir iyon kohortunun (r), S1Im3'te (Ek Bilgi) gösterildiği gibi sadece 10analiz gerçekleştirildi.

Üç parçalı iyon tanımlama gereksinimi, Tablo 2-7 , 9-10(S1Im3)sütun 3_ABC gösterildiği gibi genel bir fenomen gibi görünmektedir. 3_ABC sütunundaki 1'in tüm sayıları Im3 dizisine karşılık gelir (N-terminal methionine olmadan). Tanımlamadaki tek hata, m/z 8136.2'deki parça iyonunu (Şekil 3, alt panelde gösterilen ve Tablo 1 ve 8'degri renkle vurgulanan) analiz için girilen parça iyon toleransını (±1,5 m/z) aşması nedeniyle meydana geldi. Test algoritması üç parçalı bir iyon kohortunun tüm parça iyonlarının eşleşmesini gerektirdiğinden, m/z 8136.2 parça iyonunu içeren herhangi bir grup doğru protein dizisini tanımlayamaz/sayamaz.

S1Im3'teki Tablo 6, üç parça iyondan ikisi tamamlayıcı olduğunda (sarı ile vurgulandığında), üç parça iyonunun da tamamlayıcı olmadığı durumlarda gözlemlenenden daha fazla yanlış sıranın ölçütlerle eşleştiğini göstermektedir. Daha önce de belirtildiği gibi, bunun nedeni, bir CFIP'nin tek bir PBC sitesine karşılık gelmesidir, siliko dizilerinde iki PBC sitesine karşılık gelen iki tamamlayıcı olmayan parça iyonunu kullanmaya kıyasla çok daha yanlış elde edilebilen bir eşik, daha sıkı bir kriterdir.

Benzer bir analiz Şekil 4'te (alt panel) gösterilen Im-Bac'ın altı belirgin parça iyonunda (m/z 2675.4, 2904.5, 3076.2, 3853.5, 5657.5 ve 5772.8) yapıldı. Im3'ün aksine, Im-Bac'ın ayırt edilebilir bir CFIP'si yoktur, bu nedenle altı parça iyon muhtemelen altı PBC bölgesine karşılık gelir. Altı parçalı iyon havuzundan seçilen üç parçalı bir iyon kohortunun 20 olası kombinasyonu olduğundan, S2 Im-Bac tablolarında gösterildiği gibi sadece 10 analiz gerçeklenmiştir (Ek Bilgi). Im-Bac dizisi, tüm analizlerde sütun 3_ABC üç parçalı iyon gruplarının tümü için doğru şekilde tanımlanmış/sayılmıştır. Dört analizde, bir veya iki yanlış dizi de eşleştirildi. Ancak, bu az sayıda yanlış sıra, el ile onay için yönetilebilir bir sayıdır.

Genel olarak, iki veya üç PBC sitesine karşılık gelen tamamlayıcı ve/veya tamamlayıcı olmayan parça iyonları, bir veya iki aday dizisini almak için yeterli özgüllük sağladığı görülmektedir. Tabii ki, operatör tarafından seçilen parça iyonları nispeten bol olmalı ve iyi S / N'ye sahip olmalıdır. Tek bir PBC sitesinden bir veya iki parça iyonları, işleç tarafından onaylanması gereken çalışılamaz sayıda yanlış sıranın alınmasından kaçınmak için yeterli özgüllük sağlamaz. İki veya üç PBC sitesinin neden yeterli olduğu açık değildir, ancak tek bir PBC sitesi görünüşe göre yeterince spesifik değildir. Sınırsız kesilme protein kütle kriterlerini karşılayan ~200.000 protein ve protein parçası dizileri ile sonuçlansa da, bölünme alanlarının, yani D-, E-ve N kalıntılarının C-terminal tarafının, parçalanma karşılaştırması sırasında olası dizilerin keskin daralmasına katkıda bulunduğu muhtemeldir. Bunun nedeni, kısmen bakteriyel protein dizilerindeki D,E-ve N kalıntılarının sıklığının yanı sıra bakterilerin proteomlarındaki protein dizilerindeki benzersiz konumları olabilir. Asidik kalıntılar protein yapısında ve solvent etkileşimlerinde kritik roller oynar. Sonuç olarak, birincil dizideki sıklıkları ve konumları protein fonksiyonu için benzersiz değilse kritiktir ve yüz binlerce yanlış dizi arasında doğru protein dizisini belirsiz bir şekilde tanımlamak için neden sadece birkaç PBC sitesinin gerekli olduğunu açıklayabilir.

Gaz fazı kimyası açısından bakıldığında, D-, E-ve N kalıntılarının önemi, MALDI tarafından üretilen tek başına yüklü metastable protein iyonlarının düşük iç enerjilerinde erişilebilen bir ayrışma kanalına katılımlarından ve PSD20tarafından çürümeden kaynaklanmaktadır. PSD tarafından moleküler iyon parçalanmasının nispeten uzun zaman ölçeği (~10-30 μs), protein iyonunun iç enerjisinin, moleküler iyonun tüm titreşimsel ve dönme serbestlik dereceleri arasında, ayrışma ergodik ve istatistiksel olacak şekilde randomize olduğu anlamına gelir. Ayrıca, aspartik asit etki mekanizmasının, PBC17 , 18,19aktivasyon bariyerini düşüren elverişli bir geometri elde edilene kadar bir dizi adım veya birden fazla atom içeren tek bir uyumlu adımla meydana gelen moleküler bir iyon yeniden düzenlemeyi içerdiği belirtilmelidir.

Bir STEC suşu tarafından üretilen iki plazmid kodlu antibakteriyel bağışıklık proteini antibiyotik indüksiyonu, MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz içeren bir protokol kullanılarak tanımlandı. Bu proteinler, proteinin ölçülen kütlesini ve aspartik asit etkisi sonucu oluşan nispeten az sayıda diziye özgü parça iyonlarını içeren şirket içinde geliştirilen yazılım kullanılarak tanımlanmıştır. Yazılım, MS ve MS/MS verilerini WGS verilerinden elde edilen siliko protein ve protein parçası dizileriyle karşılaştırır. Yazılım tanımlama ölçümleri veya puanlama sağlamasa da, çok yüksek oranda yanlış sırayı ortadan kaldırır ve bu da manuel inceleme ile kolayca onaylanabilen çok az sayıda aday dizisi (bir veya iki) ile sonuçlanır. Son olarak, bu bakteriyel türün WGS verilerinin manuel olarak incelenmesi, DNA'ya zarar veren antibiyotiklerin maruz kalması nedeniyle bu genlerin ekspresyonunu rasyonalize eden bir plazmid genomda AB ve Im genlerinin yukarı akışında bir promotör (SOS kutusu) ortaya çıkardı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Protein Biomarker Seeker yazılımı, clifton.fagerquist@usda.gov'de Clifton K. Fagerquist ile iletişime geçerek (hiçbir ücret ödemeden) serbestçe kullanılabilir. Ars, USDA, CRIS hibesi: 2030-42000-051-00-D tarafından bu araştırmanın desteğini kabul etmek istiyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
  2. Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
  3. He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
  4. Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
  5. Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
  6. Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
  7. Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
  8. Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
  9. Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
  10. Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
  11. Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
  12. Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
  13. Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
  14. Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
  15. Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
  16. Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
  17. Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
  18. Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
  19. Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
  20. Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
  21. Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
  22. Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
  23. Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
  24. Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
  25. Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
  26. Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
  27. Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
  28. Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
  29. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
  30. Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
  31. Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
  32. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
  33. Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
  34. Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
  35. Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
  36. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
  37. Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
  38. Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
  39. Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
  40. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
  41. Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
  42. Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
  43. Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
  44. Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).

Tags

Kimya Sayı 171
MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak <em>Escherichia coli'de</em> Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fagerquist, C. K., Rojas, E.… More

Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter