Summary
Здесь мы представляем протокол для быстрой идентификации белков, продуцируемых геномно секвенированных патогенными бактериями, с использованием тандемной масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF и нисходящего протеомного анализа с программным обеспечением, разработанным на месте. Метастабильные ионы белка фрагментируются из-за эффекта аспарагиновой кислоты, и эта специфичность используется для идентификации белка.
Abstract
Этот протокол идентифицирует белки иммунитета бактерицидных ферментов: колицина E3 и бактериоцина, продуцируемых патогенным штаммом Escherichia coli с использованием индукции антибиотиков и идентифицированных тандемной масс-спектрометрией MALDI-TOF-TOF и нисходящим протеомным анализом с помощью программного обеспечения, разработанного на месте. Белок иммунитета колицина E3 (Im3) и белок иммунитета бактериоцина (Im-Bac) были идентифицированы из заметных ионов фрагментов b- и/или Y-типа, генерируемых полипептидным расщеплением позвоночника (PBC) на С-концевой стороне аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и остатков аспарагина механизмом фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты. Программное обеспечение быстро сканирует последовательности белков в силико, полученные из секвенирования всего генома бактериального штамма. Программное обеспечение также итеративно удаляет аминокислотные остатки белковой последовательности в случае, если зрелая белковая последовательность усечена. Одна белковая последовательность обладала массой и фрагментами ионов, согласуемых с теми, которые были обнаружены для каждого белка иммунитета. Затем последовательность-кандидат проверялась вручную, чтобы подтвердить, что все обнаруженные фрагменты ионов могут быть назначены. N-концевой метионин Im3 был постпереводно удален, тогда как Im-Bac имел полную последовательность. Кроме того, мы обнаружили, что только два или три некомментарных фрагмента ионов, образованных ПБК, необходимы для идентификации правильной последовательности белка. Наконец, промотор (SOS box) был идентифицирован перед генами антибактериального и иммунитета в плазмидном геноме бактериального штамма.
Introduction
Анализ и идентификация непереваренных белков методом масс-спектрометрии называется нисходящим протеомным анализом1,2,3,4. В настоящее время это устоявшийся метод, который использует электрораспрозревшение ионизацию (ESI)5 и анализаторы массы высокого разрешения6,а также сложные методы диссоциации, например, диссоциацию переноса электронов (ETD), диссоциацию захвата электронов (ECD)7,ультрафиолетовую фотодиссоциацию (UV-PD)8и т. Д.
Другим методом мягкой ионизации является матричная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)9,10,11, которая менее широко используется для анализа сверху вниз, отчасти потому, что она в основном связана с анализаторами массы времени пролета (TOF), которые имеют ограниченное разрешение по сравнению с другими анализаторами массы. Несмотря на эти ограничения, инструменты MALDI-TOF и MALDI-TOF-TOF были использованы для быстрого нисходящего анализа чистых белков и фракционированных и нефракционированных смесей белков. Для идентификации чистых белков распад в источнике (ISD) является особенно полезным методом, поскольку он позволяет проводить масс-спектрометрический (MS) анализ ионов фрагментов ФРАГМЕНТОВ ISD, а также тандемную масс-спектрометрию (MS / MS) фрагментов ионов белков, обеспечивающих последовательно-специфический фрагмент часто из N- и C-терминов целевого белка, аналогично секвенированию Эдмана12,13 . Недостатком подхода ISD является то, что, как и в секвенировании Эдмана, образец должен содержать только один белок. Одна потребность в белке обусловлена необходимостью однозначного отнесения фрагментов ионов к иону-предшественнику. Если в образце присутствуют два или более белков, может быть трудно назначить, какие фрагменты ионов принадлежат к каким ионам-предшественникам.
Атрибуция фрагментов ионов/ионов-предшественников может быть решена с помощью MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Как и в любом классическом эксперименте с МС/МС, ионы-предшественники массово выбираются/выделяются до фрагментации, и обнаруженные фрагментированные ионы могут быть отнесены к конкретному иону-предшественнику. Однако методы диссоциации, доступные для этого подхода, ограничены в первую очередь диссоциацией, вызванной столкновением высоких энергий (HE-CID)14 или распадом после источника (PSD)15,16. HE-CID и PSD наиболее эффективны при фрагментации пептидов и небольших белков, и охват последовательности в некоторых случаях может быть ограничен. Кроме того, PSD приводит к расщеплению полипептидной магистрали (PBC) в первую очередь на стороне C-концевой стороны остатков аспарагиновой и глутаминовой кислоты явлением, называемым эффектом аспарагиновой кислоты17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS также нашла нишу в таксономической идентификации микроорганизмов: бактерий21,грибов22и вирусов23. Например, спектры MS используются для идентификации неизвестных бактерий путем сравнения с эталонной библиотекой MS-спектров известных бактерий с использованием алгоритмов распознавания образов для сравнения. Этот подход оказался весьма успешным из-за его скорости и простоты, хотя и требовал ночной культивирования изолята. Ионы белка, обнаруженные при этом подходе (обычно менее 20 кДа), содержат отпечаток РС, позволяющий таксономическое разрешение на уровне рода и вида, а в некоторых случаях и на подвиде24 и штаммеуровня 25,26. Однако остается необходимость не только таксономически классифицировать потенциально патогенные микроорганизмы, но и идентифицировать специфические факторы вирулентности, токсины и факторы устойчивости к противомикробным препаратам (УВМ). Для этого масса пептидов, белков или малых молекул измеряется РС и впоследствии выделяется и фрагментируется МС/МС.
Патогенные бактерии часто несут круговые куски ДНК, называемые плазмидами. Плазмиды, наряду с профагами, являются основным вектором горизонтального переноса генов между бактериями и отвечают за быстрое распространение устойчивости к противомикробным препаратам и других факторов вирулентности среди бактерий. Плазмиды могут также нести антибактериальные (AB) гены, например, колицин и бактериоцин. Когда эти гены экспрессируются и белки секретируются, они действуют, чтобы отключить механизм трансляции белка соседних бактерий, занимающих ту же экологическую нишу27. Однако эти бактерицидные ферменты также могут представлять риск для хозяина, который их произвел. В результате ген совместно экспрессируется хозяином, который специфически ингибирует функцию фермента AB и называется его белком иммунитета (Im).
Повреждающие ДНК антибиотики, такие как митомицин-С и ципрофлоксацин, часто используются для индуцирования ответа SOS у токсин-продуцирующей шига E. coli (STEC), чей ген токсина Шига(stx) обнаружен в геноме профага, присутствующем в бактериальном геноме28. Ранее мы использовали индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ для обнаружения и идентификации типов и подтипов Stx, продуцируемых штаммами STEC29,30,31,32. В предыдущей работе штамм STEC O113:H21 RM7788 культивировали в течение ночи на агаровых средах, дополненных митомицином-С. Однако вместо того, чтобы обнаружить ожидаемую B-субъединицу Stx2a при m/z ~7816, другой ион белка был обнаружен при m/z ~7839 и идентифицирован как плазмидно-кодируемый гипотетический белок неизвестной функции33. В текущей работе мы идентифицировали два плазмидно-кодированных белка AB-Im, продуцируемых этим штаммом, используя индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS и нисходящий протеомный анализ с использованием автономного программного обеспечения, разработанного для обработки и сканирования последовательностей белков в силико, полученных из секвенирования всего генома (WGS). Кроме того, в программное обеспечение была включена возможность модификаций постперевода (PTM), включающих усечение последовательностей. Белки иммунитета были идентифицированы с помощью этого программного обеспечения из измеренной массы зрелого иона белка и последовательно-специфических фрагментов ионов из ПБК, вызванных эффектом аспарагиновой кислоты и обнаруженных MS / MS-PSD. Наконец, промотор был идентифицирован выше генов AB / Im в геноме плазмиды, что может объяснить экспрессию этих генов, когда этот штамм подвергается воздействию повреждающего ДНК антибиотика. Части этой работы были представлены на виртуальной встрече и выставке Национального американского химического общества осень 2020 года (17-20 августа 2020 года)34.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Микробиологическая пробоподготовка
- Инокулировать 25 мл бульона Лурии (LB) в коническую трубку 50 мл штаммом E. coli O113:H21 RM7788 (или другим бактериальным штаммом) из глицеринового бульона с использованием стерильной петли 1 мкл. Заколоть трубку и предварительно культивную культуру при 37 °C с встряхиванием (200 об/мин) в течение 4 ч.
- Aliquot 100 мкл предварительно культивированного бульона и выкладывается на агаровую пластину LB, дополненную 400 или 800 нг/мл митомицина-C. Культивирует агартовые пластины статически на ночь в инкубаторе при 37 °C.
ВНИМАНИЕ: Штаммы STEC являются патогенными микроорганизмами. Выполняйте все микробиологические манипуляции, помимо культивирования, в шкафу биобезопасности BSL-2. - Собирайте бактериальные клетки из отдельных видимых колоний с помощью стерильной петли 1 мкл и перекладывайте в 2,0 мл уплотнительную кольцевую микроцентрифужную трубку, содержащую 300 мкл воды класса ВЭЖХ. Закутайте трубку, вихрь ненадолго и центрифугу при 11,337 x g в течение 2 мин, чтобы гранулировать клетки.
2. Масс-спектрометрия
- Нанесите 0,75 мкл аликвоты супернатанта образца на мишень MALDI из нержавеющей стали и дайте ему высохнуть. Налейте высушенное место образца аликвотой a0,75 мкл насыщенного раствора синапиновой кислоты в 33% ацетонитриле, 67% воде и 0,2% трифторуксусной кислоты. Дайте пятну высохнуть.
- Анализ высушенных мест отбора проб с помощью масс-спектрометра MALDI-TOF-TOF.
- После загрузки цели MALDI в масс-спектрометр нажмите кнопку получения линейного режима MS в программном обеспечении для сбора. Введите диапазон m/z для анализа, введя m/z нижней и верхней границ (например, от 2 кДа до 20 кДа) в соответствующие поля в программном обеспечении метода сбора.
- Нажмите на место образца для анализа целевого шаблона MALDI в программном обеспечении. Затем нажмите левую кнопку мыши и перетащите курсор мыши на место образца, чтобы указать прямоугольную область, которая будет отобрана для лазерной абляции / ионизации. Отпустите кнопку мыши, и начнется сбор. Соберите 1000 лазерных снимков для каждого образца пятна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сбор данных отображается в режиме реального времени в окне сбора программного обеспечения. - Если ионы не обнаружены, увеличьте интенсивность лазера, отрегулировав скользящую шкалу в разделе «Интенсивность лазера» в программном обеспечении до тех пор, пока не будет обнаружен сигнал ионов белка. Это называется порогом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед точечным анализом образца провести внешнюю калибровку прибора в линейном режиме MS с белковыми калибрантами, m/z которых охватывают диапазон анализируемого, например, состояния заряда +1 и +2 белковых калибрантов: цитохром-С, лизоцим и миоглобин охватывают диапазон масс от 2 кДа до 20 кДа. Промежуточная масса в указанном диапазоне масс используется в качестве фокусной массы, например, 9 кДа. Фокусная масса - это ион, м/з которого оптимально сфокусирован для обнаружения детектором линейного режима. - Когда сбор данных в линейном режиме MS завершен, нажмите кнопку получения в программном обеспечении для получения в режиме рефлектрона MS/MS. Введите массу прекурсора для анализа в поле Масса прекурсора. Затем введите ширину изоляции (в Da) в окно массы предшественника для стороны низкой и высокой массы массы предшественника, например, ±100 Da.
- Нажмите на кнопку CID Off. Нажмите кнопку Metastable Suppressor ON. Отрегулируйте интенсивность лазера не менее 90% от его максимального значения, отрегулировав скользящую шкалу под лазерной интенсивностью в программном обеспечении.
- Нажмите на место образца для анализа целевого шаблона MALDI в программном обеспечении. Затем нажмите левую кнопку мыши и перетащите курсор мыши на место образца, чтобы указать прямоугольную область, которая будет отобрана для лазерной абляции / ионизации. Отпустите кнопку мыши, и начнется сбор. Соберите 10 000 лазерных снимков для каждого образца пятна.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед точечным анализом образца прибор должен быть откалиброван снаружи в режиме MS/MS-рефлектрона с использованием фрагментов ионов из пост-исходного распада (PSD) состояния заряда +1 алкилированного тиоредоксина35.
- Не обрабатывайте необработанные данные MS. Обрабатывайте необработанные данные MS/MS-PSD, используя следующую последовательность шагов в указанном порядке: расширенная коррекция базовой линии (32, 0,5, 0,0) с последующим удалением шума (два стандартных отклонения) с последующим гауссовским сглаживанием (31 балл).
- Вручную проверяют данные MS/MS-PSD на наличие заметных фрагментов ионов, генерируемых PBC19,20.
- Оценка данных MS/MS в отношении абсолютного и относительного количества фрагмент-ионов и их сигнал-шум (S/N). Используйте только наиболее распространенные фрагменты ионов для идентификации белка, особенно если данные MS / MS-PSD шумные.
3. Построение базы данных белков in silico
- Сгенерируйте текстовый файл, содержащий в силико белковые последовательности бактериального штамма, который будет сканироваться программным обеспечением Protein Biomarker Seeker для идентификации белка. Белковые последовательности получены из секвенирования всего генома (WGS) анализируемого штамма (или близкородственного штамма).
- Зайдите на веб-сайт NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/), чтобы загрузить около 5000 белковых последовательностей конкретного бактериального штамма (например, Escherichia coli O113:H21 штамм RM7788), который анализируется. Максимальный размер загружаемого файла составляет 200 последовательностей.
- В результате скопируйте и вставьте 25 загрузок в один текстовый файл. Выберите формат FASTA (текстовый) для каждой загрузки.
4. Управление программным обеспечением для искателей биомаркеров белка
- Дважды щелкните исполняемый файл Protein Biomarker Seeker. Появится окно графического интерфейса пользователя (GUI)(рисунок 1,верхняя панель).
- Введите массу белкового биомаркера (измеренную в MS-линейном режиме) в поле «Масса зрелого белка». Затем введите погрешность измерения массы в поле «Допуск по массе». Стандартная погрешность измерения массы составляет ±10 Да для белка 10 000 Да.
- При желании нажмите кнопку Калькулятор комплементарной ионной белковой массы b/y, чтобы рассчитать массу белка из предполагаемой комплементарной пары ионов фрагментов (CFIP или b/y). Появится всплывающее окно, Protein Mass Calculator Tool(Рисунок 1,нижняя панель).
- Введите m/z предполагаемого CFIP и нажмите кнопку Add Pair (Добавить пару). Появится рассчитанная белковая масса.
- Скопируйте и вставьте это число в поле «Масса зрелого белка» и закройте окно инструмента «Калькулятор массы белка».
- Выберите длину сигнального пептида N-терминала, щелкнув поле Установить ограничение остатков. Появится всплывающее окно со скользящей шкалой и курсором. Наведите курсор на нужную длину сигнального пептида (максимум 50). Если длина сигнального пептида не выбрана, программное обеспечение будет выполнять неограниченное усечение последовательности.
- В разделе Условие фрагмента ионов в графическом интерфейсе выберите остатки для расщепления полипептидной основы (PBC). Нажмите на поля с одним или несколькими остатками: D, E, N и/или P.
- Нажмите на кнопку Ввести фрагменты ионов (+1) для поиска. Появится всплываемая страница фрагмента. Затем нажмите на кнопку «Добавить ион фрагмента», которая соответствует количеству вводимых ионов фрагмента, т. е. одним щелчком мыши для каждого иона фрагмента. Появится раскрывающееся поле для каждого вводимого фрагмента.
- Введите m/z ионов фрагментов и связанный с ними допуск m/z. По завершении нажмите кнопку Сохранить и закрыть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разумный допуск по м/з составляет ±1,5. - Выберите минимальное количество ионов фрагментов, которое должно быть сопоставлено для идентификации, прокрутив до нужного числа в поле справа от поля Сколько ионов фрагментов должно быть сопоставлено.
ПРИМЕЧАНИЕ: Три матча должны быть адекватными. - Выберите остатки цистеина, чтобы они были в окисленном состоянии, щелкнув по соответствующему кругу. Если после поиска идентификация белка не найдена, повторите поиск с цистеинами в их пониженном состоянии. Если после поиска идентификация не найдена, увеличьте допуск ионов фрагментов до ±3 и повторите поиск.
- В разделе Настройка файланажмите кнопку Выбрать файл FASTA, чтобы просмотреть и выбрать файл FASTA (текстовый), содержащий последовательности белков in silico бактериального штамма, ранее построенные на этапах протокола 3.1-3.2. Затем выберите выходную папку и создайте имя выходного файла.
- Нажмите кнопку Запустить поиск по записям файлов. Появится всплывающее окно под названием Confirm Search Parameters (рисунок 1,нижняя панель), отображающее параметры поиска до начала поиска.
- Если параметры поиска верны, нажмите на кнопку Начать поиск. Если параметры поиска неверны, нажмите на кнопку Отмена и повторно введите правильные параметры. Как только поиск инициируется, окно параметров закрывается, и появляется новое всплывающее окно с индикатором выполнения(рисунок 1,нижняя панель), показывающее ход поиска и бегущий подсчет количества найденных идентификаций.
- По завершении поиска (несколько секунд) индикатор выполнения автоматически закрывается, и в поле Log графического интерфейса отображается сводка поиска(рисунок 2,верхняя панель). Кроме того, появится новое всплывающее окно, отображающее идентификацию белка, если таковая имеется(рисунок 2,нижняя панель).
ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности белка in silico, имеющие нераспознанные остатки, например, U или X, автоматически пропускаются из анализа, и эти последовательности впоследствии сообщаются с помощью отдельного всплывающего окна, чтобы предупредить оператора о том, какие (если таковые имеются) последовательности были пропущены по завершении поиска.
5. Пост-поисковое подтверждение последовательности белка
- Подтвердите правильность последовательности кандидатов методом ручного анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью программного обеспечения Protein Biomarker Seeker является идентификация последовательности белка с высокой точностью путем исключения многих явно неправильных белковых последовательностей из рассмотрения и включения усечения последовательностей в качестве возможного PTM в зрелом белке. Поскольку количество возвращаемых возможных последовательностей-кандидатов несоко, ручное подтверждение является управляемым. - Сгенерировать таблицу средних m/z фрагментов b- и y-типа последовательности-кандидата с помощью любой масс-спектрометрии или протеомного программного обеспечения, обладающего такой функциональностью. Сравните среднее значение m/z ионов фрагментов in silico на С-концевой стороне D-, E- и N-остатков (и на N-концевой стороне P-остатков) с m/z заметных фрагментов ионов из данных MS/MS-PSD.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наиболее заметные ионы фрагментов MS/MS-PSD должны быть легко сопоставлены с D-, E- и N-ассоциированными ионами фрагментов кремния. Однако механизм фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты менее эффективен вблизи N- или С-терминов белковой последовательности36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3 (верхняя панель) показан MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA, дополненном 400 нг/мл митомицина-C. Пики при m/z 7276, 7337 и 7841 были ранее идентифицированы как белок холодового шока C (CspC), белок холодного шока E (CspE) и плазмидный белок неизвестной функции, соответственно33. Ион белка при m/z 9780 [M+H]+ был проанализирован MS/MS-PSD, как показано на рисунке 3 (нижняя панель). Ион-предшественник был выделен с помощью окна селектора временных ионов (TIS) ±100 Да. Фрагменты ионов идентифицируются по их m/z и типу/числу. Фрагмент иона при m/z 2675.9 (выделен звездой) является побочным эффектом диссоциации метастабильной белковой иона при m/z 9655, показанной на рисунке 3 (верхняя панель). Теоретическое среднее m/z каждого фрагмента иона показано в скобках на основе ПБК показанной выше последовательности белка иммунитета к колицину Е3 (Im3). Участки ПБК выделены красной звездочкой с соответствующим фрагментом иона (ионов). N-концевой метионин подчеркивается, что означает, что он постпереводно удаляется в зрелом белке. Последовательность имеет один остаток цистеина (в коробке) и поэтому рассматривается в восстановленном состоянии.
Используя массу биомаркера белка и несколько заметных некомплементарных фрагментов ионов: m/z 1813.8, 2128.9 и 4293.7 (допуск ±1,5)(рисунок 1,нижняя панель) и ограничивая PBC С-концевой стороной D- и E-остатков, программное обеспечение сообщило только об одной последовательности-кандидате: последовательности белка Im3 (без его N-концевого метионина)(Рисунок 2 , нижняя панель). При выборе фрагментов ионов для поиска следует подчеркнуть, что любая группа некомментарных фрагментарных ионов предполагает, что суммирование m/z любых двух фрагментов ионов в группе (и вычитание двух протонов) приводит к сумме масс, не попадающей в массу биомаркера и связанную с ней толерантность к массе (±10 Да). Проект WGS RM7788 выявил 5008 белковых последовательностей (открытые кадры считывания)37. Из этих ~ 5000 полных белковых последовательностей 189 490 полных и частичных последовательностей (неограниченное усечение) соответствовали критериям массы биомаркеров(рисунок 2,верхняя панель). Эти последовательности, проходящие критерии массы, затем подвергаются in silico PBC на стороне C-концевой стороны D- и/или E-остатков. Полученные ионы фрагмента затем сравниваются с наблюдаемыми ионами фрагментов, введенными. Последовательность кандидатов, о которых сообщает программное обеспечение, основана исключительно на его массе и трех D- и/или E-специфических участках КПБ. Специфика, достигаемая таким небольшим объемом информации, будет рассмотрена в следующем разделе.
Как показано на фиг.3 (нижняя панель), наиболее распространенные фрагменты ионов являются результатом ПБК на С-концевой стороне D- и E-остатков через механизм фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты19,20. Наблюдаются два CFIP: b67/y17 (m/z 7645.1/m/z 2128.9) и b70/y14 (m/z 7959.4/m/z 1813.8). Эти CFIP могут быть использованы для более точного расчета массы иона-предшественника белка по простой формуле: b (m/z) + y (m/z) - 2H+ = масса белка (Da)33. Используя два CFIP, получаем среднюю массу белка: 9771,6 Da, что ближе к его теоретическому значению 9772,5 Da, чем измеренная масса иона белка в MS-линейном режиме: 9779 Da(рисунок 3,верхняя панель). Было обнаружено только несколько CFIP, потому что большинство ионов-предшественников, имеющих ионизирующий протон, секвестрировались в единственном остатке аргинина: R80. Более высокая газофазная основа аргинина (237,0 ккал/моль38)по сравнению с остатком лизина (K) (221,8 ккал/моль38),вероятно, ответственна за преимущественное секвестрирование ионизирующего протона при единственном R-остатке.
На рисунке 4 (верхняя панель) показан MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA, дополненном 800 нг/мл митомицина-C. Рисунок 4 (верхняя панель) очень похож на рисунок 3 (верхняя панель), хотя существуют различия в относительном изобилии некоторых белковых ионов из-за различий в концентрациях используемых антибиотиков. Существуют также небольшие сдвиги в белковом биомаркере m/z, которые отражают различия во внешней калибровке прибора в разные дни. Опять же, ионы белка в m/z 7272, 7335 и 7838 являются CspC, CspE и плазмидным белком соответственно. Кроме того, мы обнаруживаем ион белка Im3 в m/z 9778 (хотя и с меньшим количеством, чем на рисунке 3),а также ион белка при m/z 9651 [M+H]+. На рисунке 4 (нижняя панель) показан MS/MS-PSD иона-предшественника белка при m/z 9651. Ион-предшественник изолировали с использованием более узкого и асимметричного окна TIS -75/+60 Da для устранения вклада соседних белковых ионов при m/z 9539 и 9778. Фрагменты ионов идентифицируются по их m/z и типу/числу. Последовательность белка иммунитета бактериоцина (Im-Bac) показана выше. Участки ПБК выделены красной звездочкой с соответствующими им фрагментами ионов. Теоретическое среднее m/z каждого фрагмента иона также показано в скобках в спектре. Последовательность Im-Bac также имеет один остаток цистеина (в коробке) и поэтому рассматривается в восстановленном состоянии.
Используя массу биомаркера белка, три заметных некомперментарных фрагмента ионов: m/z 2675.4, 3853.5 и 5772.8 (допуск ±1,50) с фиг.4 и ограничивающие PBC только С-концевой стороной D- и/или E- и/или аспарагин(N)-остатков, программное обеспечение сообщило только об одной последовательности-кандидате: белке Im-Bac. Последовательность-кандидат была извлечена после сканирования 191 375 полных или частичных последовательностей, которые соответствовали критериям массы и толерантности биомаркеров (±10 Да). Последовательность-кандидат была идентифицирована программным обеспечением, основанным исключительно на его массе и трех D- и/или E- и/или N-специфических участках ПКТ.
Наиболее заметные фрагменты ионов на фиг.4 (нижняя панель) были, опять же, результатом PBC на стороне C-концевого D и/или E-остатков, а также на N-концевой стороне одного из P-остатков20. Мы также наблюдаем PBC на С-концевой стороне N-остатков, что также может произойти с помощью механизма фрагментации, подобного эффекту аспарагиновой кислоты39,40. Слабость сигнала ионов-предшественников белка приводит к ограниченному числу интерпретируемых фрагментов ионов. Точность иона фрагмента m/z снижается с обилием ионов фрагмента. CfIP не был обнаружен из-за того, что ионизирующий протон был секвестрирован в единственном остатке аргинина (R74) последовательности ионов белка. Все фрагменты ионов содержат остаток R74, что согласуется с этой гипотезой.
Промотор генов антибактериального иммунитета
На рисунке 5 показана часть 6482 bp contig00100 штамма E. coli RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) из секвенирования дробовика всего генома37. Кодирующие области для колицина E3, его белка иммунитета (Im3), белка иммунитета бактериоцина (Im-Bac) и белка лизиса выделены желтым цветом. Выше по течению от кодирующей области для гена колицина E3 находятся область -35, коробка Прибнова (PB), перевернутый повтор коробки SOS, сайт связывания Shine-Dalgarno/ribosomal (SD/RBS)27. Существует межгенная область из девяти пар оснований между колицином E3 и Im3. LexA (белок-репрессор и аутопептидаза) связывается с коробкой SOS, блокируя экспрессию генов вниз по течению. При повреждении ДНК (например, ультрафиолетовое излучение или повреждающие ДНК антибиотики) LexA подвергается саморасщеплению, позволяя экспрессировать гены ниже по течению27,28. Таким образом, экспрессия этих двух белков иммунитета согласуется с воздействием этого штамма на повреждающий ДНК антибиотик.
Рисунок 1:Скриншоты программного обеспечения Protein Biomarker Seeker. Верхняя панель: Графический интерфейс пользователя (GUI) программного обеспечения Protein Biomarker Seeker. Нижние панели: всплывающие окна инструмента «Калькулятор массы белка», «Страница фрагмента», «Подтверждение параметров поиска» и «Индикатор выполнения поиска». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Результаты поиска идентификации белка с помощью программного обеспечения Protein Biomarker Seeker. Верхняя панель: сводка результатов поиска, отображаемая в поле Log графического интерфейса программного обеспечения. Нижняя панель: всплывающее окно, отображающее идентификацию белка с помощью программного обеспечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Масс-спектрометрический анализ штамма STEC O113:H21 RM7788. Верхняя панель: MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA с добавлением 400 нг/мл митомицина-C. Нижняя панель: MS/MS-PSD иона-предшественника белка при м/з 9780 (верхняя панель). Ион-предшественник был выделен с помощью окна TIS ±100 Да. Фрагменты ионов идентифицируются по их m/z и типу ионов. Показана последовательность белка иммунитета для колицина Е3 (Im3). Основные остатки (участки возможного связывания заряда) выделены синим цветом. PBC подсвечиваются красной звездочкой с соответствующими фрагментами ионов. Теоретическое среднее m/z каждого фрагмента ионов показано в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Масс-спектрометрический анализ штамма STEC O113:H21 RM7788. Верхняя панель: MS штамма STEC O113:H21 RM7788, культивируемого в течение ночи на LBA с добавлением 800 нг/мл митомицина-C. Нижняя панель: MS/MS-PSD иона-предшественника белка при м/з 9651 (верхняя панель). Ион-предшественник был выделен с асимметричным окном TIS -75 на низкой стороне m/z иона-предшественника и +60 на высокой m/z стороне иона-предшественника. Фрагменты ионов идентифицируются по их m/z и типу ионов. Показана последовательность белка иммунитета бактериоцина (Im-Bac). Основные остатки (участки возможного связывания заряда) выделены синим цветом. PBC подсвечиваются красной звездочкой с соответствующими фрагментами ионов. Теоретическое среднее m/z каждого фрагмента иона показано в скобках. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5:Анализ участка генома плазмиды, переносимого штаммом E. coli O113:H21 RM7788. Часть 6482 bp contig00100 штамма E. coli O113:H21 RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) из всего генома секвенированиядробовика 37. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1 (S1 Im3): Результаты бенчмаркингового анализа программного обеспечения с использованием выбранных фрагментов ионов Im3 (из рисунка 3,нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный файл 2 (S2 ImBac): Результаты бенчмаркингового анализа программного обеспечения с использованием выбранных фрагментов ионов Im-Bac (из рисунка 4,нижняя панель). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Вопросы протокола
Основными сильными сторонами текущего протокола являются его скорость, простота подготовки образцов и использование инструмента, который относительно прост в эксплуатации, обучении и обслуживании. Хотя протеомный анализ снизу вверх и сверху вниз с помощью жидкостной хроматографии-ESI-HR-MS повсеместны и намного превосходят сверху вниз MALDI-TOF-TOF, они требуют больше времени, труда и опыта. Сложность приборов часто может влиять на то, будут ли определенные инструментальные платформы приняты учеными, формально не обученными масс-спектрометрии. Нисходящий подход с MALDI-TOF-TOF предназначен для расширения анализа MALDI-TOF-MS за пределы его текущего использования для таксономической идентификации бактерий в клинических микробиологических лабораториях, при этом не увеличивая при этом значительно трудозатраты, сложность или опыт, необходимые для анализа.
Протокол не использует какую-либо механическую (или электрическую) ступень лизиса клеток. Хотя секретируемые или внеклеточные белки могут быть обнаружены с использованием протокола, более ранняя версия этого метода была впервые разработана для обнаружения токсина Шига (Stx) из штаммов STEC, в которых индукция антибиотика вызывает бактериальный ответ SOS, приводящий к экспрессии фагов, включая stx, а также поздние фаговы гены, ответственные за бактериальный лизис клеток41. . Мы обнаружили, что индуцированный антибиотиками клеточный лизис имеет определенные преимущества для обнаружения Stx, а также плазмидных белков, которые имеют промоторы SOS (текущая работа). Конечно, механический лизис клеток (например, биение бусин) также может быть использован (хотя и не используется в текущей работе). Однако механический лизис приводит к тому, что все бактериальные клетки подвергаются лизированию (а не просто индуцированным клеткам), в результате чего образец обогащается обильными, высоко консервативными белками-хозяевами, что может сделать обнаружение фагов и плазмидных белков из нефракционированного образца более сложным.
Было обнаружено, что концентрации антибиотиков для бактериального штамма в целом воспроизводимы по отношению к обнаруженным белкам, индуцированным антибиотиками. Мы отметили изменения в относительном изобилии белка по отношению к обнаруженным белкам, индуцированным антибиотиками. Поскольку наш анализ является качественным (а не количественным), обилие биомаркеров белка должно быть достаточным только для адекватного анализа MS / MS. Предполагаемое штамм STEC сначала культивируется с диапазоном концентраций антибиотиков (например, от 300 нг / мл до 2000 нг / мл митомицина-С), чтобы определить оптимальную концентрацию, такую, чтобы он вызывал бактериальный ответ SOS, обеспечивая при этом достаточное количество бактериальных клеток для сбора. Для штамма STEC RM7788 мы обнаружили, что оптимальная концентрация антибиотиков для обнаружения идентифицированных биомаркеров составляла от 400 до 800 нг/мл митомицина-С.
В дополнение к усечению последовательности белков, белки E. coli могут иметь PTM, которые включают добавление массы, например, фосфорилирование, гликозилирование и т. Д. Поскольку MS/MS использует PSD для диссоциации отдельно заряженных метастабильных белковых ионов (менее 20 кДа по массе), генерируемых MALDI, такие PTM, прикрепленные к остаточным боковым цепям, вероятно, подвергнутся легкой диссоциативной потере, поскольку PSD является методом эргодической диссоциации. Наличие таких ПТМ может быть выведено из появления фрагмента иона, близкого по массе к исходному иону-предшественнику (за вычетом массы ПТМ) в данных MS/MS. Однако ни PSD, ни программное обеспечение не смогут определить, где такие PTM подключены. Кроме того, программное обеспечение может идентифицировать белки только из фрагментов ионов ПБК, а не диссоциативную потерю малых молекул (например, воды или аммиака) или ПТМ, прикрепленных к боковым цепочкам остатков. Однако, если фрагмент-ионы из ПБК обнаружены, белок все еще может быть идентифицирован с помощью программного обеспечения, либо расширяя окно толерантности к массе белка, чтобы включить массу ПТМ, либо просто входя в массу иона фрагмента белка, соответствующую диссоциативной потере предполагаемого ПТМ. Любая идентификация программным обеспечением будет представлять последовательность белка без PTM. Интересно, что мы до сих пор не обнаружили белки, имеющие фосфорилирование, гликозилирование и т. Д. В нашей бактериальной работе. Однако это может быть обусловлено: их относительным изобилием MALDI, используемым диапазоном масс: 2-20 кДа, тем, что такие ПТМ могут быть необычно лабильными и могут не выдерживать применения матрицы MALDI, или что такие ПТМ могут подвергаться очень быстрым диссоциативным потерям в источнике до того, как ионы ускоряются из источника.
В настоящее время программное обеспечение не включает алкилирование цистеина, а наш протокол образца не включает стадию восстановления дисульфидов для остатков цистеина. Протокол был уточнен, чтобы указать, что поиск должен проводиться с остатками цистеина в их окисленном состоянии, а если идентификация не получена, то выполнить поиск снова с остатками цистеина в их уменьшенном состоянии. Если идентификации не обнаружены повторно, расширение толерантности к ионам фрагмента до ±2 или ±3 снижает порог соответствия ионов фрагментов, позволяя сопоставлять последовательности с цистеинами независимо от того, присутствуют ли они в их окисленом и/или восстановленном состоянии.
Нисходящий протеомный анализ методом масс-спектрометрии MALDI-TOF-TOF
Большая часть нисходящего протеомного анализа была достигнута с использованием ESI и масс-спектрометрических платформ высокого разрешения. Напротив, с использованием платформ MALDI-TOF-TOF было проведено меньше нисходящего протеомного анализа. В результате существует очень мало нисходящего протеомного программного обеспечения для анализа отдельно заряженных метастабильных белковых ионов, генерируемых и проанализированных MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD, которые используют эффект аспарагиновой кислоты для фрагментации15,42. Для этого есть ряд причин. Во-первых, эффективность ионизации MALDI смещена в сторону низкомолекулярных пептидов и белков, и это смещение особенно очевидно со смесью белков, которые были бы обнаружены в нефракционированном бактериальном клеточном лизате. Во-вторых, MALDI генерирует состояния низкого заряда, и кулоново-отталкивает мало или вообще отсутствует для облегчения диссоциации белковых ионов. В-третьих, охват последовательности PSD довольно ограничен в отличие от других методов ECD7,ETD7,UV-PD8и т. Д. В-четвертых, эффективность фрагментации PSD снижается с увеличением массы иона белка. В-пятых, методы эргодической диссоциации, такие как PSD, как правило, приводят к легкой диссоциативной потере ПТМ, прикрепленных к остаткам, например, фосфорилирование, гликозилирование и т. Д., Что затрудняет определение места присоединения ПТМ. Несмотря на эти серьезные ограничения, нисходящий анализ с использованием MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD имеет явные преимущества, например, простоту подготовки образцов, отсутствие разделения LC, выделение метастабильных белковых ионов MS/MS, позволяющее приписывать фрагменты ионов-предшественникам, идентификацию ПТМ, включающих усечение последовательностей и внутримолекулярные дисульфидные связи и, самое главное, скорость анализа. В сочетании с последовательностями белка in silico, полученными из данных WGS, этот метод может предоставить быструю информацию до завершения других, более трудоемких и трудоемких анализов.
Программное обеспечение Protein Biomarker Seeker было разработано с использованием IntelliJ и написано на Java для эффективной обработки и поиска последовательностей белковых аминокислот, полученных из WGS бактериального штамма. Программное обеспечение было модифицировано из более раннего алгоритма, который работал как макрос в Excel33. Мы решили разработать автономную версию программного обеспечения с графическим интерфейсом, чтобы сделать его более удобным для пользователя, а также обеспечить дальнейшие улучшения.
В случае PTM, включающих усечение последовательности белка, программное обеспечение последовательно удаляет аминокислотный остаток из N-конца, итеративно добавляя остатки последовательности до тех пор, пока сумма масс не встретится или не превысит измеренную массу обнаруженного белкового биомаркера. Хотя этот процесс может привести к очень большому количеству фрагментов белковой массы (~ 200 000 из ~ 5000 полных белковых последовательностей), он имеет то преимущество, что он не исключает любые потенциальные фрагменты белка из усечения на N-конце или С-конце (или обоих), однако маловероятно такое усечение может быть с биологической точки зрения. Этот подход называется неограниченным усечением. Однако наиболее распространенными бактериальными ПТМ, включающими усечение, являются удаление N-концевого метионина или N-концевого сигнального пептида. Следовательно, программное обеспечение также позволяет оператору выбрать верхний предел (50 остатков) для усечения остатков от N-конечного, что приводит к гораздо меньшему количеству фрагментов белка, которые соответствуют критериям массы биомаркера белка.
ПБК на С-концевой стороне D- и E-остатков, а также на N-концевой стороне Р-остатков согласуются с механизмом эффекта аспарагиновой кислоты, который был широко изучен как экспериментально, так и теоретически17,18,19,20. Включение ПБК на С-концевой стороне N-остатков было включено в программное обеспечение из-за эффекта аспарагиновой кислоты, подобного механизму, который наблюдался для ряда метастабильных белковых ионов в нашей лаборатории39,40. Наиболее распространенные фрагментарные ионы от диссоциации отдельно заряженных метастабильных белковых ионов, проанализированных MS/MS-PSD, обусловлены механизмом фрагментации эффекта аспарагиновой кислоты. Оператор выбирает наиболее заметные фрагменты ионов из данных MS/MS-PSD и вводит их m/z в программное обеспечение, а также связанный с ним допуск ионов фрагмента (±m/z). Допуск ионов фрагмента может быть скорректирован для каждого иона фрагмента, чтобы отразить его относительное содержание. Соответствующий допуск ионов фрагментов может варьироваться от ±1,0 до ±2,5 м/з в зависимости от абсолютного количества иона фрагмента, а также его относительного количества по сравнению с фоновым химическим шумом. Как правило, чем обильнее фрагмент-ион, тем выше его массовая точность, что позволяет использовать более узкую толерантность к ионам фрагмента.
Данные MS/MS-PSD о метастабильных ионах белка могут сильно различаться с точки зрения их сложности. Некоторые спектры MS/MS-PSD легче интерпретируются, чем другие. Причин этому явлению несколько. Во-первых, ион белка может не фрагментироваться эффективно на временной шкале анализа (~ 10-30 мкс), возможно, потому, что он остается свернутым или частично свернутым даже после солюбилизации в матричном растворе MALDI. Во-вторых, помимо ПБК, метастабильные ионы белка могут подвергаться диссоциативной потере малых молекул, т.е. аммиака (-17 Да) или воды (-18 Да)15. Существенным фактором спектральной сложности, по-видимому, является диссоциативная потеря аммиака из боковой цепи R-остатков33. Мы наблюдали увеличение спектральной сложности данных MS/MS-PSD с количеством R-остатков в белковой последовательности. Белки без R-остатков (белок YahO36 и холодный шоковый белок CspC33,43),с одним R-остатком (холодный шоковый белок CspE33 и B-субъединица Stx241),с двумя R-остатками (гипотетический белок33),продуцируют спектры MS/MS-PSD, которые относительно несложны и легко интерпретируются. Однако, когда количество R-остатков увеличивается до трех (HU белок44)или четырех (убиквитин35и хлад-шоковый белок CsbD33,43),спектральная сложность значительно возрастает. Программное обеспечение сравнивает фрагменты ионов из ПБК с остатками, специфичными для механизма эффекта аспарагиновой кислоты, только потому, что это наиболее доступный канал диссоциации единственно заряженных метастабильных белковых ионов, проанализированных MS/ MS-PSD. Программное обеспечение не включает фрагменты ионов, возникающие в результате диссоциативной потери (или потерь) малых нейтральных молекул (молекул). Следовательно, важно, чтобы оператор не выбирал фрагменты ионов, которые включают небольшие нейтральные диссоциативные потери. Фрагменты ионов из ПБК, как правило, являются наиболее заметными фрагментарными ионами; однако, когда количество R-остатков в белке увеличивается до трех или четырех, наиболее распространенным фрагментом иона на участке ПБК может быть тот, который включает небольшую диссоциативную потерю (или потери). При обнаружении такого скопления фрагмент-ионов (разделенных кратными 17 или 18 м/z) ион фрагмента с наибольшим m/z в кластере должен быть тем, который введен в параметры поиска ионов фрагмента.
Следует подчеркнуть, что программное обеспечение не было разработано для протеомной идентификации без оператора. Оператор должен выбрать, какие фрагменты ионов из данных MS/MS-PSD должны быть включены в поиск. Однако, основываясь на многочисленных экспериментах, которые подтвердили эффект аспарагиновой кислоты MS/MS-PSD, наиболее заметные фрагменты ионов всегда являются результатом ПБК на С-концевой стороне D- или E- или N-остатков. Полезность программного обеспечения заключается в том, что оно устраняет многие явно неправильные последовательности и извлекает только несколько вероятных кандидатов. Некоторые последовательности-кандидаты могут быть устранены на основе отсутствия фрагмента-иона, где D-остаток в последовательности, как ожидается, создаст заметный фрагмент-ион. Неизменно D-остатки приводят к выделению фрагментов ионов по всей полипептидной основе, за исключением случаев, когда они расположены в нескольких остатках N- или C-терминов, где эффективность эффекта аспарагиновой кислоты снижается36.
Минимальное количество участков ПБК, необходимых для предварительной идентификации белка
CFIP образуется из двух идентичных ионов-предшественников белка, которые диссоциируют в одном и том же месте PBC, но имеют свой ионизирующий протон на противоположных сторонах сайта расщепления. Хотя CFIP может быть использован для более точного расчета массы биомаркера белка (что позволяет сузить толерантность к массе белка во время поиска), его полезность для идентификации специфической последовательности менее полезна, чем у двух некомплементарных фрагментов ионов, образованных из двух разных участков расщепления, которые обеспечивают большую специфичность идентификации. Легкость, с которой были идентифицированы два белка AB-Im, заставила нас предположить, что минимальное количество фрагментов ионов необходимо для предварительной идентификации правильной последовательности белка из тысяч белков или последовательностей фрагментов белка. Мы быстро определили, что важно не количество ионов фрагментов как таковых, а количество некомплементарных фрагментных ионов, поскольку каждый некомплементарный фрагмент-ион представляет один участок ПКБ, тогда как CFIP представляет собой тот же участок расщепления. Таким образом, идентификационная специфичность выводится из числа обнаруженных участков ПКТ, а не из числа фрагментов ионов.
Вполне возможно, что успех в идентификации только с тремя фрагментными ионами, возможно, был просто случайным. Чтобы проверить эту гипотезу и устранить предвзятость при выборе фрагментных ионов, мы создали модуль бенчмаркинга в программном обеспечении, который случайным образом выбирает фрагменты ионов из большего пула комплементарных и/ или не комплементарных фрагментарных ионов. Более крупный пул фрагментов ионов был выбран из 14 выдающихся фрагментов ионов, идентифицированных на рисунке 3 (нижняя панель), на основе их относительного изобилия.
Протокол тестирования был следующим. Используя двоичный поиск, три фрагмента ионов были случайным образом выбраны из пула из 14 заметных фрагментов ионов на рисунке 3 (нижняя панель) (m/z 1813.8, 2128.9, 3881.3, 4293.7, 5158.0, 6505.0, 6619.9, 6939.4, 7645.1, 7959.4, 8022.7, 8136.2, 8583.3 и 8961.5). Когорту из трех фрагментов ионов сравнивали с ионами фрагментов in silico из PBC на C-концевой стороне D- или E- или N-остатков, а также комбинацией D & E и D & E & N. Это сравнение проводилось для каждого отдельного фрагмента иона когорты, для трех пар фрагментов ионов когорты и для комбинации трехфрагментных ионов когорты. Для сравнения, чтобы считаться совпадением, оба фрагмента ионов пары и все три фрагмента ионов комбинации должны совпадать с ионами фрагмента in silico. После завершения анализа случайным образом выбирается еще одна трехфрагментная ионо-ионотная когорта, и анализ повторяется. Допускается повторение при фрагментарном выделении ионов. Так как существует 364 возможных комбинации [(n!/r!( н-р)!] из трехфрагментной ионной когорты (r) из пула из 14 фрагментов ионов (n) было проведено только 10 анализов, как показано в S1Im3 (Дополнительная информация).
Требование об идентификации трехфрагментов ионов, по-видимому, является общим явлением, как показано в колонке 3_ABC таблиц 2-7, 9-10 (S1Im3). Все значения 1 в столбце 3_ABC соответствуют последовательности Im3 (без N-концевого метионина). Единственный сбой в идентификации произошел из-за того, что ион фрагмента при м/з 8136.2 (показан на рисунке 3,нижняя панель и выделен серым цветом в таблицах 1 и 8)превысил допуск на ион фрагмента (±1,5 м/з), введенный для анализа. Поскольку алгоритм тестирования требует, чтобы все фрагменты ионов трехфрагментной ионной когорты были сопоставлены, любая группа, включавшую ион фрагмента m/z 8136.2, не сможет идентифицировать/подсчитать правильную последовательность белка.
Таблица 6 в S1Im3 показывает, что когда два из трех фрагментов ионов являются комплементарными (выделенными желтым цветом), более неправильные последовательности соответствуют критериям, чем наблюдаемые, когда все три фрагмента ионов были некомментарными. Как отмечалось ранее, это связано с тем, что CFIP соответствует одному участку ПКТ, порог, который достижим многими более неправильными последовательностями in silico по сравнению с использованием двух некомплементарных фрагментов ионов, которые соответствуют двум участкам PBC, что является более строгим критерием.
Аналогичный анализ был выполнен на шести заметных фрагментах ионов (m/z 2675.4, 2904.5, 3076.2, 3853.5, 5657.5 и 5772.8) Im-Bac, показанных на рисунке 4 (нижняя панель). В отличие от Im3, Im-Bac не имеет различимого CFIP, поэтому шесть фрагментов ионов соответствуют, по-видимому, шести участкам PBC. Поскольку существует 20 возможных комбинаций трехфрагментной ионной когорты, выбранной из пула из шести фрагментов ионов, было проведено только 10 анализов, как показано в таблицах S2 Im-Bac (Дополнительная информация). Последовательность Im-Bac была правильно идентифицирована/подсчитана для всех трехфрагментных ионных групп в колонке 3_ABC во всех анализах. В четырех анализах также были сопоставлены одна или две неправильные последовательности. Однако это небольшое количество неправильных последовательностей является управляемым числом для ручного подтверждения.
В целом, комплементарные и/или некомментарные фрагменты ионов, которые соответствуют двум или трем участкам ПКТ, по-видимому, обеспечивают достаточную специфичность для извлечения одной или двух последовательностей-кандидатов. Конечно, выбранные оператором ионы фрагментов должны быть относительно обильными и иметь хороший S/N. Один или два фрагмента ионов из одного сайта ПКТ не обеспечивают достаточной специфичности, чтобы избежать извлечения неработоспособного количества неправильных последовательностей, которые должны быть подтверждены оператором. Неясно, почему два или три участка КПБ являются адекватными, но один сайт НБК, по-видимому, недостаточно конкретен. Хотя неограниченное усечение приводит к ~200 000 белков и последовательностей фрагментов белка, которые соответствуют критериям белковой массы, вполне вероятно, что специфический характер участков расщепления, т.е. C-концевой стороны D-, E- и N-остатков, способствует резкому сужению возможных последовательностей при сравнении фрагментов ионов. Это может быть связано, в частности, с частотой D-, E- и N-остатков в бактериальных белковых последовательностях, а также с их уникальным расположением в белковых последовательностях в протеоме бактерий. Кислотные остатки играют решающую роль в структуре белка и взаимодействиях растворителей. Следовательно, их частота и расположение в первичной последовательности имеют решающее значение, если не уникальны для функции белка, и могут объяснить, почему для предварительной идентификации правильной последовательности белка среди сотен тысяч неправильных последовательностей необходимо только несколько участков ПБК.
С точки зрения химии газовой фазы важность D-, E- и N-остатков проистекает из их участия в канале диссоциации, который доступен при низких внутренних энергиях единственно заряженных метастабильных белковых ионов, генерируемых MALDI и распадающихся PSD20. Относительно длительная временная шкала (~10-30 мкс) фрагментации молекулярных ионов PSD означает, что внутренняя энергия иона белка рандомизирована среди всех колебательных и вращательных степеней свободы молекулярного иона, так что диссоциация является эргодической и статистической. Следует также отметить, что механизм эффекта аспарагиновой кислоты включает в себя перестройку молекулярных ионов, которая происходит путем последовательности шагов или одного согласованного шага с участием нескольких атомов до тех пор, пока не будет достигнута благоприятная геометрия, которая снижает барьер активации PBC17,18,19.
Два плазмидно-кодируемых белка антибактериального иммунитета, продуцируемых штаммом STEC, были идентифицированы с использованием протокола, включающего индукцию антибиотиков, MALDI-TOF-TOF-MS / MS-PSD и нисходящий протеомный анализ. Эти белки были идентифицированы с использованием программного обеспечения, разработанного компанией, которое включает измеренную массу белка и относительно небольшое количество последовательно-специфических фрагментов ионов, образующихся в результате эффекта аспарагиновой кислоты. Программное обеспечение сравнивает данные MS и MS / MS с последовательностями белка in silico и фрагментов белка, полученными из данных WGS. Хотя программное обеспечение не предоставляет идентификационные метрики или оценку, оно устраняет очень высокий процент неправильных последовательностей, что приводит к очень небольшому количеству последовательностей-кандидатов (одна или две), которые могут быть легко подтверждены ручной проверкой. Наконец, ручная проверка данных WGS этого бактериального штамма выявила промотор (КОРОБКА SOS) выше генов AB и Im в геноме плазмиды, что рационализирует экспрессию этих генов из-за воздействия повреждающих ДНК антибиотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов.
Acknowledgments
Программное обеспечение Protein Biomarker Seeker находится в свободном доступе (бесплатно), связавшись с Клифтоном К. Фагерквистом по clifton.fagerquist@usda.gov. Мы хотим отметить поддержку этого исследования грантом ARS, USDA, CRIS: 2030-42000-051-00-D.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
| Incubator | VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
| Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
References
- Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
- Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
- He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
- Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
- Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
- Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
- Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
- Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
- Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
- Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
- Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
- Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
- Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
- Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
- Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
- Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
- Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
- Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
- Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
- Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
- Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
- Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
- Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
- Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
- Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
- Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
- Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
- Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
- Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
- Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).
