Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur schnellen Identifizierung von Proteinen vor, die von genomisch sequenzierten pathogenen Bakterien mittels MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit eigens entwickelter Software produziert werden. Metastabile Proteinionen fragmentieren aufgrund der Asparaginsäurewirkung und diese Spezifität wird für die Proteinidentifizierung ausgenutzt.
Abstract
Dieses Protokoll identifiziert die Immunitätsproteine der bakteriziden Enzyme: Colicin E3 und Bakteriacin, die von einem pathogenen Escherichia coli-Stamm mittels Antibiotika-Induktion produziert und durch MALDI-TOF-TOF-Tandem-Massenspektrometrie und Top-Down-Proteomanalyse mit selbst entwickelter Software identifiziert wurden. Das Immunitätsprotein von Colicin E3 (Im3) und das Immunitätsprotein von Bakteriacin (Im-Bac) wurden aus prominenten b- und/oder y-Typ-Fragmentionen identifiziert, die durch die Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) auf der C-terminalen Seite von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Asparaginresten durch den Asparaginsäure-Effektfragmentierungsmechanismus erzeugt wurden. Die Software scannt schnell in silico Proteinsequenzen, die aus der gesamten Genomsequenzierung des Bakterienstamms stammen. Die Software entfernt auch iterativ Aminosäurereste einer Proteinsequenz für den Fall, dass die reife Proteinsequenz abgeschnitten wird. Eine einzelne Proteinsequenz besaß Massen- und Fragmentionen, die mit denen übereinstimmten, die für jedes Immunitätsprotein nachgewiesen wurden. Die Kandidatensequenz wurde dann manuell inspiziert, um zu bestätigen, dass alle erkannten Fragmentionen zugeordnet werden konnten. Das N-terminale Methionin von Im3 wurde posttranslational entfernt, während Im-Bac die komplette Sequenz hatte. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass nur zwei oder drei nicht-komplementäre Fragmentionen, die durch PBC gebildet werden, notwendig sind, um die richtige Proteinsequenz zu identifizieren. Schließlich wurde ein Promotor (SOS-Box) vor den antibakteriellen und Immunitätsgenen in einem Plasmidgenom des Bakterienstamms identifiziert.
Introduction
Die Analyse und Identifizierung unverdauter Proteine mittels Massenspektrometrie wird als Top-down-Proteomanalyse1,2,3,4bezeichnet. Es ist jetzt eine etablierte Technik, die Elektrospray-Ionisation (ESI)5 und hochauflösende Massenanalysatoren6und ausgeklügelte Dissoziationstechniken verwendet, z. B. Elektronentransferdissoziation (ETD), Elektroneneinfangdissoziation (ECD)7,ultraviolette Photodissoziation (UV-PD)8usw.
Die andere weiche Ionisationstechnik ist die matrixgestützte Laserdesorption / Ionisation (MALDI)9,10,11 ,die für die Top-Down-Analyse weniger umfassend verwendet wurde, zum Teil, weil sie in erster Linie an Time-of-Flight (TOF) Massenanalysatoren gekoppelt ist, die im Vergleich zu anderen Massenanalysatoren eine begrenzte Auflösung haben. Trotz dieser Einschränkungen wurden die Instrumente MALDI-TOF und MALDI-TOF-TOF für die schnelle Top-Down-Analyse von reinen Proteinen und fraktionierten und unfraktionierten Proteinmischungen eingesetzt. Für die Identifizierung reiner Proteine ist der In-Source-Zerfall (ISD) eine besonders nützliche Technik, da sie die massenspektrometrische (MS) Analyse von ISD-Fragmentionen sowie die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) von Proteinionenfragmenten ermöglicht, die sequenzspezifische Fragmente liefern, oft aus den N- und C-Termini des Zielproteins, analog zur Edman-Sequenzierung12,13 . Ein Nachteil des ISD-Ansatzes besteht darin, dass die Probe wie bei der Edman-Sequenzierung nur ein Protein enthalten darf. Die eine Proteinanforderung ist auf die Notwendigkeit einer eindeutigen Zuordnung von Fragmentionen zu einem Vorläuferion zurückzuführen. Wenn zwei oder mehr Proteine in einer Probe vorhanden sind, kann es schwierig sein, zuzuordnen, welche Fragmentionen zu welchen Vorläuferionen gehören.
Fragmention/Vorläufer-Ionen-Attribution kann mit MALDI-TOF-TOF-MS/MS adressiert werden. Wie bei jedem klassischen MS/MS-Experiment werden Vorläuferionen vor der Fragmentierung massenselektiert/isoliert, und die nachgewiesenen Fragmentionen können einem bestimmten Vorläuferion zugeschrieben werden. Die für diesen Ansatz verfügbaren Dissoziationstechniken beschränken sich jedoch auf primär hochenergetische kollisionsinduzierte Dissoziation (HE-CID)14 oder Post-Source-Zerfall (PSD)15,16. HE-CID und PSD sind am effektivsten bei der Fragmentierung von Peptiden und kleinen Proteinen, und die Sequenzabdeckung kann in einigen Fällen begrenzt sein. Darüber hinaus führt PSD zu einer Polypeptid-Rückgratspaltung (PBC) vor allem auf der C-terminalen Seite von Asparagin- und Glutaminsäureresten durch ein Phänomen, das als Asparaginsäureeffekt bezeichnet wird17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS hat auch eine Nischenanwendung bei der taxonomischen Identifizierung von Mikroorganismen gefunden: Bakterien21, Pilze22und Viren23. Zum Beispiel werden MS-Spektren verwendet, um unbekannte Bakterien durch Vergleich mit einer Referenzbibliothek von MS-Spektren bekannter Bakterien unter Verwendung von Mustererkennungsalgorithmen zum Vergleich zu identifizieren. Dieser Ansatz hat sich aufgrund seiner Geschwindigkeit und Einfachheit als sehr erfolgreich erwiesen, obwohl er eine Übernacht-Kultivierung des Isolats erfordert. Die mit diesem Ansatz nachgewiesenen Proteinionen (in der Regel unter 20 kDa) umfassen einen MS-Fingerabdruck, der eine taxonomische Auflösung auf Gattungs- und Artebene und in einigen Fällen auf der Unterart24 und Stammebene25,26ermöglicht. Es besteht jedoch nach wie vor die Notwendigkeit, nicht nur potenziell pathogene Mikroorganismen taxonomisch zu klassifizieren, sondern auch spezifische Virulenzfaktoren, Toxine und Antimikrobielle Resistenzfaktoren (AMR) zu identifizieren. Um dies zu erreichen, wird die Masse von Peptiden, Proteinen oder kleinen Molekülen mittels MS gemessen und anschließend von MS/MS isoliert und fragmentiert.
Pathogene Bakterien tragen oft kreisförmige DNA-Stücke, die Plasmide genannt werden. Plasmide sind zusammen mit Prophagen ein Hauptvektor des horizontalen Gentransfers zwischen Bakterien und sind für die schnelle Ausbreitung von antibiotikaresistenzen und anderen Virulenzfaktoren über Bakterien verantwortlich. Plasmide können auch antibakterielle (AB) Gene tragen, z. B. Colicin und Bakteriacin. Wenn diese Gene exprimiert und die Proteine sezerniert werden, deaktivieren sie die Proteintranslationsmaschinerie benachbarter Bakterien, die die gleiche Umweltnische besetzen27. Diese bakteriziden Enzyme können jedoch auch ein Risiko für den Wirt darstellen, der sie produziert hat. Folglich wird ein Gen vom Wirt mitexprimiert, das spezifisch die Funktion eines AB-Enzyms hemmt und als sein Immunitätsprotein (Im) bezeichnet wird.
DNA-schädigende Antibiotika wie Mitomycin-C und Ciprofloxacin werden häufig verwendet, um die SOS-Reaktion in Shiga-Toxin-produzierenden E. coli (STEC) zu induzieren, deren Shiga-Toxin-Gen(stx) sich in einem im bakteriellen Genom vorhandenen Prophagengenom befindet28. Wir haben zuvor Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS und Top-Down-Proteomanalyse verwendet, um Stx-Typen und Subtypen zu erkennen und zu identifizieren, die von den STEC-Stämmen29,30,31,32produziert werden. In der vorherigen Arbeit wurde der STEC O113:H21-Stamm RM7788 über Nacht auf Agarmedien kultiviert, die mit Mitomycin-C ergänzt wurden. Anstatt jedoch die erwartete B-Untereinheit von Stx2a bei m/z ~7816 nachzuweisen, wurde bei m/z ~7839 ein anderes Proteinion nachgewiesen und als plasmidkodiertes hypothetisches Protein unbekannter Funktion33identifiziert. In der aktuellen Arbeit identifizierten wir zwei plasmidkodierte AB-Im-Proteine, die von diesem Stamm mittels Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, und Top-Down-Proteomanalyse mit eigenständiger Software hergestellt wurden, die entwickelt wurde, um in silico Proteinsequenzen zu verarbeiten und zu scannen, die aus der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) abgeleitet wurden. Darüber hinaus wurde die Möglichkeit von Post-Translation-Modifikationen (PTM) mit Sequenzkürzung in die Software integriert. Die Immunitätsproteine wurden mit dieser Software aus der gemessenen Masse des reifen Proteinions und sequenzspezifischen Fragmentionen aus PBC, die durch den Asparaginsäureeffekt verursacht und durch MS/MS-PSD nachgewiesen wurden, identifiziert. Schließlich wurde ein Promotor vor den AB/Im-Genen in einem Plasmidgenom identifiziert, der die Expression dieser Gene erklären könnte, wenn dieser Stamm einem DNA-schädigenden Antibiotikum ausgesetzt ist. Teile dieser Arbeit wurden auf dem National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (August 17-20, 2020)34vorgestellt.
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Protocol
1. Mikrobiologische Probenvorbereitung
- Impfen Sie 25 ml Luria-Brühe (LB) in einem 50 mL konischen Röhrchen mit E. coli O113:H21-Stamm RM7788 (oder einem anderen Bakterienstamm) aus einem Glycerinvorrat unter Verwendung einer sterilen 1 μL-Schleife. Röhre verschließen und bei 37 °C mit Schütteln (200 U/min) für 4 h vorkultivieren.
- Aliquot 100 μL vorkultivierte Brühe und auf einer LB-Agarplatte verteilt, ergänzt mit 400 oder 800 ng / ml Mitomycin-C. Agarplatten statisch über Nacht in einem Inkubator bei 37 °C kultivieren.
VORSICHT: STEC-Stämme sind pathogene Mikroorganismen. Führen Sie alle mikrobiologischen Manipulationen, über die Kultivierung hinaus, in einer BSL-2-Biosicherheitswerkbank durch. - Ernten Sie Bakterienzellen aus einzelnen sichtbaren Kolonien mit einer sterilen 1-μL-Schleife und übertragen Sie sie in ein 2,0 mL O-Ring-ausgekleidetes Mikrozentrifugenröhrchen mit 300 μL HPLC-Wasser. Kappen Sie das Rohr, wirbeln Sie es kurz und zentrifugieren Sie es bei 11.337 x g für 2 min, um die Zellen zu pelletieren.
2. Massenspektrometrie
- Markieren Sie 0,75 μL Aliquot des Probenüberstandes auf das EDELSTAHL-MALDI-Target und lassen Sie es trocknen. Überlagern Sie den getrockneten Probenfleck mit a0,75 μL Aliquot einer gesättigten Lösung von Sinapinsäure in 33% Acetonitril, 67% Wasser und 0,2% Trifluoressigsäure. Lassen Sie die Stelle trocknen.
- Analysieren Sie die getrockneten Probenspots mit einem MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometer.
- Nachdem Sie das MALDI-Ziel in das Massenspektrometer geladen haben, klicken Sie in der Erfassungssoftware auf die Schaltfläche für die Erfassung im ms linearen Modus. Geben Sie den zu analysierenden m/z-Bereich ein, indem Sie die m/z der unteren und oberen Grenze (z. B. 2 kDa bis 20 kDa) in die entsprechenden Felder in der Erfassungsmethode-Software eingeben.
- Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot auf der MALDI-Zielvorlage in der Software. Drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Mauszeiger über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für die Laserablation/ Ionisation abgetastet werden soll. Lassen Sie die Maustaste los und die Erfassung wird eingeleitet. Sammeln Sie 1.000 Laserschüsse für jeden Probenspot.
HINWEIS: Die Datenerfassung wird in Echtzeit im Softwareerfassungsfenster angezeigt. - Wenn keine Ionen detektiert werden, erhöhen Sie die Laserintensität, indem Sie die Gleitskalaleiste unter Laserintensität in der Software anpassen, bis das Proteinionensignal erkannt wird. Dies wird als Schwellenwert bezeichnet.
HINWEIS: Kalibrieren Sie das Gerät vor der Probenspotanalyse extern im linearen MS-Modus mit Proteinkalibranten, deren m/z den zu analysierenden Bereich abdecken, z. B. die Ladezustände +1 und +2 von Proteinkalibranten: Cytochrom-C, Lysozym und Myoglobin decken einen Massenbereich von 2 kDa bis 20 kDa ab. Als Fokusmasse wird eine Zwischenmasse innerhalb des vorgegebenen Massenbereichs verwendet, z.B. 9 kDa. Die Fokusmasse ist das Ion, dessen m/z für die Detektion durch den linearen Modendetektor optimal fokussiert ist. - Wenn die Erfassung im linearen MS-Modus abgeschlossen ist, klicken Sie in der Erfassungssoftware auf die Schaltfläche für die Erfassung des MS/MS-Reflektormodus. Geben Sie die zu analysierende Vorläufermasse in das Feld Vorläufermasse ein. Als nächstes geben Sie eine Isolationsbreite (in Da) in das Precursor-Massenfenster für die Low- und High-Mass-Seite der Precursor-Masse ein, z. B. ±100 Da.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche CID Aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Metastable Suppressor ON. Stellen Sie die Laserintensität auf mindestens 90% ihres Maximalwerts ein, indem Sie die gleitende Skala unter der Laserintensität in der Software einstellen.
- Klicken Sie auf den zu analysierenden Probenspot auf der MALDI-Zielvorlage in der Software. Drücken Sie dann die linke Maustaste und ziehen Sie den Mauszeiger über den Probenspot, um den rechteckigen Bereich anzugeben, der für die Laserablation/Ionisation abgetastet werden soll. Lassen Sie die Maustaste los, und die Erfassung wird initiiert. Sammeln Sie 10.000 Laserschüsse für jeden Probenspot.
ANMERKUNG: Vor der Stichprobenpunktanalyse sollte das Gerät extern im MS/MS-Reflektormodus kalibriert werden, wobei die Fragmentionen aus dem Post-Source-Zerfall (PSD) des +1-Ladungszustands von alkyliertem Thioredoxin35 verwendetwerden sollten.
- Verarbeiten Sie keine MS-Rohdaten. Verarbeiten Sie MS/MS-PSD-Rohdaten mit der folgenden Schrittfolge in der angegebenen Reihenfolge: erweiterte Baseline-Korrektur (32, 0,5, 0,0), gefolgt von Rauschunterdrückung (zwei Standardabweichungen), gefolgt von Gaußscher Glättung (31 Punkte).
- Überprüfen Sie ms/MS-PSD-Daten manuell auf das Vorhandensein prominenter Fragmentionen, die von PBC19,20 erzeugtwurden.
- Auswertung von MS/MS-Daten in Bezug auf die absolute und relative Häufigkeit von Fragmentionen und deren Signal-Rausch-Rauschen (S/N). Verwenden Sie nur die am häufigsten vorkommenden Fragmentionen für die Proteinidentifizierung, insbesondere wenn die MS/MS-PSD-Daten verrauscht sind.
3. Aufbau der In-silico-Proteindatenbank
- Generieren Sie eine Textdatei mit In-silico-Proteinsequenzen des Bakterienstamms, die von der Protein Biomarker Seeker-Software zur Proteinidentifizierung gescannt wird. Proteinsequenzen werden aus der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) des zu analysierenden Stammes (oder eines eng verwandten Stammes) abgeleitet.
- Auf der NCBI/PubMed-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) können Sie etwa 5.000 Proteinsequenzen des spezifischen Bakterienstamms (z. B. Escherichia coli O113:H21-Stamm RM7788) herunterladen, der analysiert wird. Die maximale Downloadgröße beträgt 200 Sequenzen.
- Kopieren Sie daher die 25 Downloads und fügen Sie sie in eine einzige Textdatei ein. Wählen Sie das FASTA-Format (Text) für jeden Download aus.
4. Betrieb der Protein Biomarker Seeker Software
- Doppelklicken Sie auf die ausführbare Datei Protein Biomarker Seeker. Ein Fenster mit grafischer Benutzeroberfläche (GUI) wird angezeigt(Abbildung 1,oberes Bedienfeld).
- Geben Sie die Masse des Protein-Biomarkers (gemessen im MS-linearen Modus) in das Feld Mature Protein Mass ein. Geben Sie als Nächstes den Massenmessfehler in das Feld Massentoleranz ein. Der Standard-Massenmessfehler ist ±10 Da für ein 10.000 Da Protein.
- Klicken Sie optional auf die Schaltfläche Complementary b/y ion Protein Mass Calculator, um die Proteinmasse aus einem vermeintlich komplementären Fragmentionenpaar (CFIP oder b/y) zu berechnen. Ein Popup-Fenster, Protein Mass Calculator Tool, wird angezeigt(Abbildung 1,unterer Bereich).
- Geben Sie die m/z des vermeintlichen CFIP ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Add Pair. Die berechnete Proteinmasse wird angezeigt.
- Kopieren Sie diese Zahl, fügen Sie sie in das Feld Mature Protein Mass ein, und schließen Sie das Fenster Protein Mass Calculator Tool.
- Wählen Sie eine N-terminale Signalpeptidlänge aus, indem Sie auf das Feld Rückstandsrestriktion einstellen klicken. Ein Pop-up mit einer gleitenden Skala und einem Cursor wird angezeigt. Bewegen Sie den Cursor auf die gewünschte Signalpeptidlänge (maximal 50). Wenn keine Signalpeptidlänge ausgewählt ist, wird eine uneingeschränkte Sequenzkürzung durch die Software durchgeführt.
- Wählen Sie unter Fragmention Condition in der GUI Reste für die Polypeptid-Backbone-Spaltung (PBC) aus. Klicken Sie auf die Kästchen mit einem oder mehreren Rückständen: D, E, N und/oder P.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Zu durchsuchendes Fragmentionen (+1) eingeben. Eine Popup-Fragmentseite wird angezeigt. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Fragmention hinzufügen, die der Anzahl der einzugebenden Fragmentionen entspricht, d.h. einem Klick für jedes Fragmention. Für jedes einzugebende Fragmention erscheint ein Dropdown-Feld.
- Geben Sie die m/z der Fragmentionen und die zugehörige m/z-Toleranz ein. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern und Schließen.
HINWEIS: Eine vernünftige m/z-Toleranz beträgt ±1,5. - Wählen Sie die Mindestanzahl von Fragmentionen aus, die für eine Identifizierung abgeglichen werden müssen, indem Sie zu der gewünschten Zahl im Feld rechts neben Wie viele Fragmentionen müssen abgeglichen werden.
HINWEIS: Drei Übereinstimmungen sollten ausreichend sein. - Wählen Sie Cysteinreste so aus, dass sie sich in ihrem oxidierten Zustand befinden, indem Sie auf den entsprechenden Kreis klicken. Wenn nach der Suche keine Proteinidentifikationen gefunden werden, wiederholen Sie die Suche mit Cysteinen in ihrem reduzierten Zustand. Wenn nach der Suche keine Identifikationen gefunden werden, erweitern Sie die Fragmentionentoleranz auf ±3 und wiederholen Sie die Suche.
- Klicken Sie unter Datei-Setupauf die Schaltfläche FASTA-Datei auswählen, um die FASTA-Datei (Textdatei) mit den In-silico-Proteinsequenzen des zuvor in den Protokollschritten 3.1 bis 3.2 konstruierten Bakterienstamms zu durchsuchen und auszuwählen. Wählen Sie dann einen Ausgabeordner aus und erstellen Sie einen Ausgabedateinamen.
- Klicken Sie auf die Schaltfläche Suche nach Dateieinträgen ausführen. Ein Popup-Fenster mit dem Titel Suchparameter bestätigen (Abbildung 1, unterer Bereich) wird angezeigt, in dem die Suchparameter angezeigt werden, bevor die Suche initiiert wird.
- Wenn die Suchparameter korrekt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Suche starten. Wenn die Suchparameter nicht korrekt sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Abbrechen und geben Sie die richtigen Parameter erneut ein. Sobald die Suche initiiert wurde, wird das Parameterfenster geschlossen, und ein neues Popup-Fenster mit einem Fortschrittsbalken wird angezeigt(Abbildung 1,unterer Bereich), das den Fortschritt der Suche und eine laufende Zählung der Anzahl der gefundenen Identifikationen anzeigt.
- Nach Abschluss der Suche (einige Sekunden) wird der Fortschrittsbalken automatisch geschlossen, und eine Zusammenfassung der Suche wird im Feld Protokoll der GUI angezeigt(Abbildung 2,oberes Bedienfeld). Darüber hinaus wird ein neues Popup-Fenster angezeigt, in dem die Proteinidentifikation(en) angezeigt werden, falls vorhanden(Abbildung 2,unterer Bereich).
HINWEIS: In-silico-Proteinsequenzen mit nicht erkannten Resten, z. B. U oder X, werden automatisch aus der Analyse übersprungen und diese Sequenzen werden anschließend mit einem separaten Popup-Fenster gemeldet, um den Bediener darüber zu informieren, welche (falls vorhanden) Sequenzen nach Abschluss der Suche übersprungen wurden.
5. Bestätigung der Proteinsequenz nach der Suche
- Bestätigen Sie die Richtigkeit einer Kandidatensequenz durch manuelle Analyse.
HINWEIS: Der Zweck der Protein Biomarker Seeker-Software besteht darin, eine Proteinsequenz mit hoher Genauigkeit zu identifizieren, indem viele offensichtlich falsche Proteinsequenzen aus der Betrachtung eliminiert und die Sequenzkürzung als mögliches PTM in das reife Protein aufgenommen wird. Da die Anzahl der möglichen zurückgegebenen Kandidatensequenzen gering ist, ist die manuelle Bestätigung überschaubar. - Generieren Sie eine Tabelle der durchschnittlichen m/z von b- und y-Typ-Fragmentionen der Kandidatensequenz unter Verwendung einer Massenspektrometrie- oder Proteom-Software mit einer solchen Funktionalität. Vergleichen Sie die durchschnittliche m/z von In-silico-Fragmentionen auf der C-terminalen Seite von D-, E- und N-Resten (und auf der N-terminalen Seite von P-Resten) mit dem m/z prominenter Fragmentionen aus den MS/MS-PSD-Daten.
HINWEIS: Die prominentesten MS/MS-PSD-Fragmentionen sollten leicht mit D-, E- und N-assoziierten In-silico-Fragmentionen abgeglichen werden können. Der Fragmentierungsmechanismus des Asparaginsäureeffekts ist jedoch in der Nähe der N- oder C-Termini einer Proteinsequenz weniger effizient36.
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Representative Results
Abbildung 3 (oberes Bild) zeigt die MS des STEC O113:H21-Stammes RM7788, der über Nacht auf LBA mit 400 ng/ml Mitomycin-C kultiviert wurde. Peaks bei m/z 7276, 7337 und 7841 wurden zuvor als Kälteschockprotein C (CspC), Kälteschockprotein E (CspE) und ein plasmidgetragenes Protein unbekannter Funktion identifiziert33. Das Proteinion bei m/z 9780 [M+H]+ wurde mittels MS/MS-PSD analysiert, wie in Abbildung 3 (unteres Bild) dargestellt. Das Vorläuferion wurde mit einem zeitgesteuerten Ionenselektorfenster (TIS) ±100 Da isoliert. Das Fragmention bei m/z 2675.9 (hervorgehoben mit einem Stern) ist ein Spillover aus der Dissoziation des metastabilen Proteinions bei m/z 9655, die in Abbildung 3 (oberes Bild) dargestellt ist. Der theoretische Durchschnitt m/z jedes Fragmentions ist in Klammern basierend auf dem PBC der oben gezeigten Sequenz des Colicin E3 Immunitätsproteins (Im3) dargestellt. PBC-Stellen werden mit einem roten Sternchen hervorgehoben, wobei die entsprechenden Fragmentionen erzeugt werden. Das N-terminale Methionin wird unterstrichen, was bedeutet, dass es posttranslational im reifen Protein entfernt wird. Die Sequenz hat einen einzelnen Cysteinrest (boxed) und wird daher in ihrem reduzierten Zustand betrachtet.
Unter Verwendung der Masse des Protein-Biomarkers und einiger prominenter nicht-komplementärer Fragmentionen: m/z 1813.8, 2128.9 und 4293.7 (±1,5 Toleranz) (Abbildung 1, untere Tafel) und Beschränkung von PBC auf die C-terminale Seite von D- und E-Resten wurde von der Software nur eine Kandidatensequenz berichtet: Im3-Proteinsequenz (ohne ihr N-terminales Methionin) (Abbildung 2 , untere Tafel). Bei der Auswahl von Fragmentionen für eine Suche sollte betont werden, dass jede Gruppe von nicht-komplementären Fragmentionen davon ausgeht, dass das Summieren des m/z von zwei beliebigen Fragmentionen in der Gruppe (und das Subtrahieren von zwei Protonen) zu einer Massensumme führt, die nicht unter die Biomarkermasse und die damit verbundene Massentoleranz fällt (±10 Da). Entwurf WGS von RM7788 enthüllte 5008 Proteinsequenzen (offene Leserahmen)37. Von diesen ~5.000 vollständigen Proteinsequenzen erfüllten 189.490 Voll- und Teilsequenzen (uneingeschränkte Kürzung) die Biomarker-Massenkriterien(Abbildung 2,oberes Panel). Die Sequenzen, die die Massenkriterien erfüllen, durchlaufen dann in silico PBC auf der C-terminalen Seite von D- und/oder E-Resten. Die resultierenden Erzeugten Fragmentionen werden dann mit den beobachteten eingegebenen Fragmentionen verglichen. Die von der Software gemeldete Kandidatensequenz basierte ausschließlich auf ihrer Masse und drei D- und/oder E-spezifischen PBC-Standorten. Die Spezifität, die durch eine so geringe Menge an Informationen erreicht wird, wird im nächsten Abschnitt diskutiert.
Wie in Abbildung 3 (untere Abbildung) gezeigt, sind die am häufigsten vorkommenden Fragmentionen das Ergebnis von PBC auf der C-terminalen Seite von D- und E-Resten über den Asparaginsäureeffekt-Fragmentierungsmechanismus19,20. Es werden zwei CFIP beobachtet: b67/y 17 (m/z 7645.1 /m/z 2128.9) und b70/y14 (m/z 7959.4/m/z 1813.8). Diese CFIP können verwendet werden, um die Masse des Proteinvorläuferions genauer zu berechnen, indem die einfache Formel verwendet wird: b (m/z) + y (m/z) - 2H+ = Proteinmasse (Da)33. Mit den beiden CFIP erhalten wir eine durchschnittliche Masse des Proteins: 9771,6 Da, was näher an seinem theoretischen Wert von 9772,5 Da liegt als die gemessene Masse des Proteinions im MS-linearen Modus: 9779 Da (Abbildung 3, oberes Bild). Nur wenige CFIP wurden nachgewiesen, da die meisten Vorläuferionen mit dem ionisierenden Proton am einzigen Argininrest: R80 sequestriert waren. Die höhere Gasphasenbasizität von Arginin (237,0 kcal/mol38) im Vergleich zu einem Lysinrest (K) (221,8 kcal/mol38) ist wahrscheinlich für die bevorzugte Sequestrierung des ionisierenden Protons am einzigen R-Rückstand verantwortlich.
Abbildung 4 (oberes Bild) zeigt die MS des STEC O113:H21-Stammes RM7788, der über Nacht auf LBA mit 800 ng/ml Mitomycin-C kultiviert wurde. Abbildung 4 (oberes Bild) ist Abbildung 3 (oberes Bild) sehr ähnlich, obwohl es unterschiede in der relativen Häufigkeit einiger Proteinionen aufgrund der Unterschiede in den verwendeten Antibiotikakonzentrationen gibt. Es gibt auch leichte Verschiebungen im Protein-Biomarker m/z, die Unterschiede in der externen Kalibrierung des Instruments an verschiedenen Tagen widerspiegeln. Auch hier sind die Proteinionen bei m/z 7272, 7335 und 7838 CspC, CspE bzw. ein plasmidhaltiges Protein. Darüber hinaus detektieren wir das Im3-Proteinion bei m/z 9778 (wenn auch mit geringerer Häufigkeit als in Abbildung 3)sowie ein Proteinion bei m/z 9651 [M+H]+. Abbildung 4 (unteres Feld) zeigt MS/MS-PSD des Proteinvorläuferions bei m/z 9651. Das Vorläuferion wurde unter Verwendung eines engeren und asymmetrischen TIS-Fensters von -75/+60 Da isoliert, um Beiträge benachbarter Proteinionen bei m/z 9539 und 9778 zu eliminieren. Fragmentionen werden durch ihre m/z und ihren Typ/ihre Anzahl identifiziert. Die Sequenz des Immunitätsproteins von Bakteriacin (Im-Bac) ist oben gezeigt. PBC-Stellen sind mit einem roten Sternchen mit den entsprechenden Fragmentionen hervorgehoben. Der theoretische Mittelwert m/z jedes Fragmentions ist ebenfalls in Klammern im Spektrum dargestellt. Die Im-Bac-Sequenz hat auch einen einzelnen Cysteinrest (boxed) und wird daher in ihrem reduzierten Zustand betrachtet.
Unter Verwendung der Protein-Biomarker-Masse, drei prominenter nicht-komplementärer Fragmentionen: m/z 2675.4, 3853.5 und 5772.8 (±1,50 Toleranz) aus Abbildung 4 und beschränkt PBC nur auf die C-terminale Seite von D- und/oder E- und/oder Asparagin (N)-Resten, wurde von der Software nur eine Kandidatensequenz berichtet: Im-Bac-Protein. Die Kandidatensequenz wurde nach dem Scannen von 191.375 Voll- oder Teilsequenzen, die die Kriterien für Biomarkermasse und Toleranz (±10 Da) erfüllten, abgerufen. Die Kandidatensequenz wurde von der Software ausschließlich anhand ihrer Masse und drei D- und/oder E- und/oder N-spezifischen PBC-Stellen identifiziert.
Die prominentesten Fragmentionen in Abbildung 4 (untere Tafel) waren wiederum das Ergebnis von PBC auf der C-terminalen Seite von D- und/oder E-Resten und auch auf der N-terminalen Seite eines der P-Reste20. Wir beobachten auch PBC auf der C-terminalen Seite eines N-Restes, der wahrscheinlich auch durch einen Asparaginsäureeffekt-ähnlichen Fragmentierungsmechanismusauftritt 39,40. Die Schwäche des Proteinvorläufer-Ionensignals führt zu einer begrenzten Anzahl interpretierbarer Fragmentionen. Die Genauigkeit des Fragmentions m/z nimmt mit der Fragmentionenhäufigkeit ab. Es wurden keine CFIP nachgewiesen, vermutlich weil das ionisierende Proton am einzigen Argininrest (R74) der Proteinionensequenz sequestriert wurde. Alle Fragmentionen enthalten den R74-Rest, der mit dieser Hypothese übereinstimmt.
Der Promotor antibakterieller Immunitätsgene
Abbildung 5 zeigt einen Teil der 6482 bp contig00100 des E. coli-Stammes RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) aus der Gesamtgenom-Shotgun-Sequenzierung37. Die kodierenden Regionen für Colicin E3, sein Immunitätsprotein (Im3), das Immunitätsprotein von Bacteriocin (Im-Bac) und ein Lyseprotein sind gelb hervorgehoben. Vor der kodierenden Region für das Colicin E3-Gen befinden sich die -35-Region, die Pribnow-Box (PB), die invertierte Wiederholung der SOS-Box, die Shine-Dalgarno/ribosomale Bindungsstelle (SD/RBS)27. Es gibt eine intergene Region mit neun Basenpaaren zwischen Colicin E3 und Im3. LexA (ein Repressorprotein und eine Autopeptidase) bindet an die SOS-Box und blockiert die Expression von Genen stromabwärts. Bei DNA-Schäden (z. B. UV-Strahlung oder DNA-schädigende Antibiotika) wird LexA einer Selbstspaltung unterzogen, die die Expression von Genen stromabwärts ermöglicht27,28. Somit stimmt die Expression dieser beiden Immunitätsproteine mit der Exposition dieses Stammes gegenüber einem DNA-schädigenden Antibiotikum überein.
Abbildung 1: Screenshots der Protein Biomarker Seeker Software. Oberes Panel: Grafische Benutzeroberfläche (GUI) der Protein Biomarker Seeker Software. Untere Bereiche: Popup-Fenster des ProteinMassenrechner-Tools, der Fragmentseite, der Bestätigung der Suchparameter und des Suchfortschrittsbalkens. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Suchergebnisse einer Proteinidentifikation mit der Protein Biomarker Seeker Software. Oberes Feld: Zusammenfassung der Suchergebnisse, die im Protokollfeld der Software-GUI angezeigt werden. Unterer Bereich: Ein Popup-Fenster, das eine Proteinidentifikation mithilfe der Software anzeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Massenspektrometrische Analyse des STEC O113:H21-Stammes RM7788. Oberes Panel: MS von STEC O113:H21 Stamm RM7788 kultiviert über Nacht auf LBA ergänzt mit 400 ng/ml Mitomycin-C. Unterseite: MS/MS-PSD des Proteinvorläuferions bei m/z 9780 (oberes Bild). Das Vorläuferion wurde mit einem TIS-Fenster ±100 Da isoliert. Fragmentionen werden durch ihren m/z- und Ionentyp identifiziert. Die Sequenz des Immunitätsproteins für Colicin E3 (Im3) wird gezeigt. Basisrückstände (Stellen möglicher Ladungssequestrierung) sind blau hervorgehoben. PBC werden mit einem roten Sternchen hervorgehoben, wobei die entsprechenden Fragmentionen generiert werden. Der theoretische Mittelwert m/z jedes Fragmentionen ist in Klammern dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Massenspektrometrische Analyse des STEC O113:H21-Stammes RM7788. Oberes Panel: MS von STEC O113:H21 Stamm RM7788 kultiviert über Nacht auf LBA ergänzt mit 800 ng/ml Mitomycin-C. Unterseite: MS/MS-PSD des Proteinvorläuferions bei m/z 9651 (oberes Bild). Das Vorläuferion wurde mit einem asymmetrischen TIS-Fenster von -75 auf der niedrigen m/z-Seite des Vorläuferions und +60 auf der hohen m/z-Seite des Vorläuferions isoliert. Fragmentionen werden durch ihren m/z- und Ionentyp identifiziert. Die Sequenz des Immunitätsproteins von Bakteriacin (Im-Bac) wird gezeigt. Basisrückstände (Stellen möglicher Ladungssequestrierung) sind blau hervorgehoben. PBC werden mit einem roten Sternchen hervorgehoben, wobei die entsprechenden Fragmentionen generiert werden. Der theoretische Mittelwert m/z jedes Fragmentions ist in Klammern dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Analyse eines Abschnitts des Plasmidgenoms, der von E. coli O113:H21 Stamm RM7788 getragen wird. Ein Teil der 6482 bp contig00100 von E. coli O113:H21 Stamm RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) aus der Sequenzierung des gesamten Genoms37. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzungsakte 1 (S1 Im3): Ergebnisse der Benchmarking-Analyse von Software unter Verwendung ausgewählter Fragmentionen von Im3 (aus Abbildung 3,unteres Feld). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Akte 2 (S2 ImBac): Ergebnisse der Benchmarking-Analyse von Software unter Verwendung ausgewählter Fragmentionen von Im-Bac (aus Abbildung 4,unteres Feld). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Überlegungen zum Protokoll
Die Hauptstärken des aktuellen Protokolls sind seine Geschwindigkeit, die Einfachheit der Probenvorbereitung und die Verwendung eines Instruments, das relativ einfach zu bedienen, zu trainieren und zu warten ist. Obwohl bottom-up- und top-down-Proteomanalyse mittels Flüssigkeitschromatographie-ESI-HR-MS allgegenwärtig und in vielerlei Hinsicht der Top-down-Analyse durch MALDI-TOF-TOF weit überlegen sind, erfordern sie mehr Zeit, Arbeit und Fachwissen. Die Komplexität von Instrumenten kann oft beeinflussen, ob bestimmte Instrumentenplattformen wahrscheinlich von Wissenschaftlern übernommen werden, die nicht formell in der Massenspektrometrie ausgebildet sind. Der Top-down-Ansatz mit MALDI-TOF-TOF soll die Analyse von MALDI-TOF-MS über ihre derzeitige Verwendung für die taxonomische Identifizierung von Bakterien in klinischen Mikrobiologielabors hinaus erweitern, ohne die für die Analyse erforderliche Arbeit, Komplexität oder Expertise drastisch zu erhöhen.
Das Protokoll verwendet keine mechanischen (oder elektrischen) Zelllyseschritte. Obwohl sekretierte oder extrazelluläre Proteine unter Verwendung des Protokolls nachgewiesen werden können, wurde eine frühere Version dieser Methode zunächst für den Nachweis von Shiga-Toxin (Stx) aus STEC-Stämmen entwickelt, bei denen die Antibiotika-Induktion die bakterielle SOS-Reaktion auslöst, was zur Expression von Phagengenen führt, einschließlich stx sowie spätphagengenen Genen, die für die bakterielle Zelllyse verantwortlich sind41 . Wir fanden heraus, dass die antibiotikainduzierte Zelllyse bestimmte Vorteile für den Nachweis von Stx sowie Plasmidproteinen mit SOS-Promotoren hat (aktuelle Arbeit). Sicherlich kann auch eine mechanische Zelllyse (z. B. Perlenschlagen) verwendet werden (obwohl sie in der aktuellen Arbeit nicht verwendet wird). Die mechanische Lyse führt jedoch dazu, dass alle Bakterienzellen lysiert werden (nicht nur induzierte Zellen), was dazu führt, dass die Probe mit reichlich vorhandenen, hochkonservierten Wirtsproteinen angereichert wird, die den Nachweis von Phagen- und Plasmidproteinen aus einer unfraktionierten Probe erschweren können.
Die Antibiotikakonzentrationen für einen Bakterienstamm erwiesen sich im Allgemeinen als reproduzierbar in Bezug auf die nachgewiesenen antibiotikainduzierten Proteine. Wir stellten Variationen in der relativen Proteinhäufigkeit in Bezug auf die nachgewiesenen antibiotikainduzierten Proteine fest. Da unsere Analyse qualitativ (nicht quantitativ) ist, muss die Häufigkeit von Protein-Biomarkern nur für eine adäquate MS/MS-Analyse ausreichen. Ein mutmaßlicher STEC-Stamm wird zunächst mit einer Reihe von Antibiotikakonzentrationen (z. B. 300 ng / ml bis 2.000 ng / ml Mitomycin-C) kultiviert, um die optimale Konzentration so zu bestimmen, dass er die bakterielle SOS-Reaktion auslöst und gleichzeitig genügend Bakterienzellen für die Ernte bereitstellt. Für den STEC-Stamm RM7788 fanden wir heraus, dass die optimale Antibiotikakonzentration für den Nachweis der identifizierten Biomarker 400 bis 800 ng/ml Mitomycin-C betrug.
Zusätzlich zum Abschneiden der Proteinsequenz können E. coli-Proteine PTMs aufweisen, die eine Zugabe von Masse beinhalten, z. B. Phosphorylierung, Glykosylierung usw. Da MS/MS PSD zur Dissoziation von einzeln geladenen metastabilen Proteinionen (unter 20 kDa masse) verwendet, die durch MALDI erzeugt werden, würden solche PTMs, die an Rückstandsseitenketten gebunden sind, wahrscheinlich einen leichten dissoziativen Verlust erleiden, da PSD eine ergodische Dissoziationstechnik ist. Das Vorhandensein solcher PTMs könnte aus dem Auftreten eines Fragmentions in der Nähe der Masse des ursprünglichen Vorläuferions (abzüglich der Masse des PTM) in den MS/MS-Daten abgeleitet werden. Weder PSD noch die Software wären jedoch in der Lage zu erkennen, wo solche PTMs angebracht sind. Darüber hinaus kann die Software nur Proteine aus Fragmentionen von PBC identifizieren und keinen dissoziativen Verlust von kleinen Molekülen (z. B. Wasser oder Ammoniak) oder PTMs, die an die Seitenketten von Rückständen gebunden sind. Wenn jedoch Fragmentionen von PBC nachgewiesen werden, könnte das Protein immer noch mit der Software identifiziert werden, indem entweder das Proteinmassentoleranzfenster um die Masse des PTM erweitert wird oder einfach in die Masse des Proteinfragmentions eingedrungen wird, was einem dissoziativen Verlust des vermuteten PTM entspricht. Jede Identifizierung durch die Software wäre die der Proteinsequenz ohne ptm. Interessanterweise haben wir in unserer bakteriellen Arbeit bisher keine Proteine mit Phosphorylierung, Glykosylierung usw. nachgewiesen. Dies kann jedoch darauf zurückzuführen sein: ihre relative Häufigkeit durch MALDI, der verwendete Massenbereich: 2-20 kDa, dass solche PTMs ungewöhnlich labil sein können und die Anwendung der MALDI-Matrix möglicherweise nicht überleben, oder dass solche PTMs einen sehr schnellen dissoziativen Verlust in der Quelle erleiden können, bevor Ionen von der Quelle beschleunigt werden.
Derzeit enthält die Software keine Cysteinalkylierung, und unser Probenprotokoll enthält keinen Disulfidreduktionsschritt für Cysteinreste. Das Protokoll wurde präzisiert, um anzuzeigen, dass die Suche mit Cysteinresten in ihrem oxidierten Zustand durchgeführt werden soll, und wenn keine Identifizierung erhalten wird, dann die Suche erneut mit Cysteinresten in ihrem reduzierten Zustand durchzuführen. Wenn wieder keine Identifizierungen gefunden werden, senkt die Erweiterung der Fragmentionentoleranz auf ±2 oder ±3 die Schwelle für die Fragmentionenanpassung, so dass Sequenzen mit Cysteinen abgeglichen werden können, unabhängig davon, ob sie in ihren oxidierten und/oder reduzierten Zuständen vorhanden sind.
Top-down-Proteomanalyse mittels MALDI-TOF-TOF-Massenspektrometrie
Die meisten Top-Down-Proteomanalysen wurden mit ESI- und hochauflösenden Massenspektrometrie-Plattformen durchgeführt. Im Gegensatz dazu wurden weniger Top-Down-Proteomanalysen mit MALDI-TOF-TOF-Plattformen durchgeführt. Infolgedessen gibt es sehr wenig Top-down-Proteom-Software für die Analyse von einzeln geladenen metastabilen Proteinionen, die von MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD erzeugt und analysiert werden, die den Asparaginsäureeffekt für die Fragmentierung ausnutzen15,42. Dafür gibt es eine Reihe von Gründen. Erstens ist die Ionisationseffizienz von MALDI auf Peptide und Proteine mit niedrigerem Molekulargewicht ausgerichtet, und diese Verzerrung ist besonders offensichtlich bei einer Mischung von Proteinen, wie sie in einem unfraktionierten Bakterienzelllysat zu finden wäre. Zweitens erzeugt MALDI niedrige Ladungszustände, und es gibt wenig oder keine Coulomb-Abstoßung, um die Proteinionendissoziation zu erleichtern. Drittens ist die PSD-Sequenzabdeckung im Gegensatz zu anderen Techniken ECD7, ETD7, UV-PD8usw. ziemlich begrenzt. Viertens nimmt die Fragmentierungseffizienz von PSD mit zunehmender Masse des Proteinions ab. Fünftens führen ergodische Dissoziationstechniken wie PSD tendenziell zu einem leichten dissoziativen Verlust von PTMs, die an Rückstände gebunden sind, z. B. Phosphorylierung, Glykosylierung usw., was es schwierig macht, den Ort der PTM-Bindung zu bestimmen. Trotz dieser starken Einschränkungen hat die Top-down-Analyse mit MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD klare Vorteile, z. B. Einfachheit der Probenvorbereitung, Fehlen einer LC-Trennung, Isolierung metastabiler Proteinionen durch MS/MS, die die Zuordnung von Fragmentionen zu Vorläuferionen ermöglicht, Identifizierung von PTMs mit Sequenzkürzung und intramolekularen Disulfidbindungen und vor allem die Geschwindigkeit der Analyse. In Kombination mit In-silico-Proteinsequenzen, die aus WGS-Daten abgeleitet wurden, kann diese Technik schnelle Informationen liefern, bevor andere zeit- und arbeitsintensivere Analysen durchgeführt werden.
Die Protein Biomarker Seeker-Software wurde mit IntelliJ entwickelt und in Java geschrieben, um Protein-Aminosäuresequenzen, die aus WGS eines Bakterienstamms stammen, effizient zu verarbeiten und zu durchsuchen. Die Software wurde von einem früheren Algorithmus modifiziert, der als Makro in Excel33arbeitete. Wir haben uns entschieden, eine eigenständige Version der Software mit einer GUI-Oberfläche zu entwickeln, um sie benutzerfreundlicher zu gestalten und weitere Verbesserungen bereitzustellen.
Bei PTMs mit Proteinsequenzkürzung entfernt die Software sequentiell einen Aminosäurerest aus dem N-Terminus, während iterativ Reste der Sequenz hinzugefügt werden, bis die Massensumme die gemessene Masse des nachgewiesenen Protein-Biomarkers erreicht oder überschreitet. Obwohl dieser Prozess zu einer sehr großen Anzahl von Proteinmassenfragmenten führen kann (~ 200.000 von ~ 5000 vollständigen Proteinsequenzen), hat er den Vorteil, dass keine potenziellen Proteinfragmente aus dem Abschneiden am N-Terminus oder C-Terminus (oder beidem) ausgeschlossen werden, so unwahrscheinlich eine solche Kürzung aus biologischer Sicht auch sein mag. Dieser Ansatz wird als uneingeschränktes Abschneiden bezeichnet. Die häufigsten bakteriellen PTMs mit Kürzungen sind jedoch die Entfernung des N-terminalen Methionins oder des N-terminalen Signalpeptids. Folglich ermöglicht die Software dem Bediener auch, eine Obergrenze (50 Rückstände) für das Rückstandsabschneiden aus dem N-Terminus auszuwählen, was zu viel weniger Proteinfragmenten führt, die die Massenkriterien des Proteinbiomarkers erfüllen.
PBC auf der C-terminalen Seite von D- und E-Resten sowie auf der N-terminalen Seite von P-Resten stimmen mit dem Asparaginsäure-Effektmechanismus überein, der sowohl experimentell als auch theoretisch umfassend untersucht wurde17,18,19,20. Die Aufnahme von PBC auf der C-terminalen Seite von N-Resten wurde in die Software aufgenommen, da in unserem Labor39,40ein Asparaginsäure-Effekt-ähnlicher Mechanismus für eine Reihe von metastabilen Proteinionen beobachtet wurde. Die am häufigsten vorkommenden Fragmentionen aus der Dissoziation von einzeln geladenen metastabilen Proteinionen, die mittels MS/MS-PSD analysiert wurden, sind auf den Asparaginsäure-Effekt-Fragmentierungsmechanismus zurückzuführen. Der Bediener wählt aus den MS/MS-PSD-Daten die prominentesten Fragmentionen aus und gibt deren m/z sowie eine zugehörige Fragmentionentoleranz (±m/z) in die Software ein. Die Fragmentionentoleranz kann für jedes Fragmention angepasst werden, um seine relative Häufigkeit widerzuspiegeln. Eine angemessene Fragmentionentoleranz kann zwischen ±1,0 bis ±2,5 m/z variieren, abhängig von der absoluten Häufigkeit des Fragmentions sowie seiner relativen Häufigkeit im Vergleich zum chemischen Hintergrundrauschen. Je häufiger ein Fragmention vorkommt, desto besser ist typischerweise seine Massengenauigkeit, wodurch eine engere Fragmentionentoleranz verwendet werden kann.
MS/MS-PSD-Daten von metastabilen Proteinionen können in ihrer Komplexität dramatisch variieren. Einige MS/MS-PSD-Spektren sind leichter interpretierbar als andere. Es gibt mehrere Gründe für dieses Phänomen. Erstens fragmentiert das Proteinion möglicherweise nicht effizient auf der Zeitskala der Analyse (~ 10-30 μs), möglicherweise weil es auch nach der Solubilisierung in der MALDI-Matrixlösung gefaltet oder teilweise gefaltet bleibt. Zweitens können metastabile Proteinionen zusätzlich zu PBC einen dissoziativen Verlust von kleinen Molekülen erleiden, d.h. Ammoniak (-17 Da) oder Wasser (-18 Da)15. Ein wesentlicher Beitrag zur spektralen Komplexität scheint der dissoziative Verlust von Ammoniak aus der Seitenkette der R-Reste zu sein33. Wir haben eine Zunahme der spektralen Komplexität von MS/MS-PSD-Daten mit der Anzahl der R-Reste in der Proteinsequenz beobachtet. Proteine ohne R-Reste (YahO-Protein36 und Kälteschockprotein CspC33,43), mit einem R-Rückstand (Kälteschockprotein CspE33 und B-Untereinheit von Stx241), mit zwei R-Resten (hypothetisches Protein33), produzieren MS/MS-PSD-Spektren, die relativ unkompliziert und einfach zu interpretieren sind. Wenn jedoch die Anzahl der R-Reste auf drei (HU-Protein44)oder vier (Ubiquitin35und Co-Schock-Protein CsbD33,43)ansteigt, steigt die spektrale Komplexität signifikant an. Die Software vergleicht Fragmentionen von PBC an Resten, die für den Asparaginsäure-Effektmechanismus spezifisch sind, nur da dies der am besten zugängliche Dissoziationskanal von einzeln geladenen metastabilen Proteinionen ist, die mit MS/MS-PSD analysiert wurden. Die Software enthält keine Fragmentionen, die aus dissoziativem Verlust (oder Verlusten) kleiner neutraler Moleküle resultieren. Folglich ist es wichtig, dass der Bediener keine Fragmentionen auswählt, die kleine neutrale dissoziative Verluste enthalten. Fragmentionen von PBC sind typischerweise die prominentesten Fragmentionen; Wenn jedoch die Anzahl der R-Reste in einem Protein auf drei oder vier ansteigt, kann das am häufigsten vorkommende Fragmention an einer PBC-Stelle eines sein, das einen kleinen dissoziativen Verlust (oder Verluste) enthält. Wenn ein solcher Cluster von Fragmentionen (getrennt durch Vielfache von 17 oder 18 m/z) nachgewiesen wird, sollte das Fragmention mit dem höchsten m/z innerhalb eines Clusters dasjenige sein, das in die Fragmentionen-Suchparameter eingegeben wurde.
Es sollte betont werden, dass die Software nicht für die bedienerfreie proteomische Identifizierung konzipiert wurde. Der Bediener muss auswählen, welche Fragmentionen aus MS/MS-PSD-Daten in die Suche einbezogen werden sollen. Basierend auf zahlreichen Experimenten, die die Asparaginsäurewirkung durch MS/MS-PSD bestätigt haben, sind die prominentesten Fragmentionen jedoch immer das Ergebnis von PBC auf der C-terminalen Seite von D- oder E- oder N-Resten. Der Nutzen der Software besteht darin, dass sie viele offensichtlich falsche Sequenzen eliminiert und nur wenige wahrscheinliche Kandidaten abruft. Einige Kandidatensequenzen können aufgrund des Fehlens eines Fragmentions eliminiert werden, wobei zu erwarten wäre, dass ein D-Rest in einer Sequenz ein prominentes Fragmention erzeugt. D-Reste führen ausnahmslos zu prominenten Fragmentionen im gesamten Polypeptid-Rückgrat, es sei denn, sie befinden sich in wenigen Resten der N- oder C-Termini, wo die Effizienz des Asparaginsäureeffekts abnimmt36.
Mindestanzahl von PBC-Standorten, die für die vorläufige Proteinidentifizierung erforderlich sind
Ein CFIP wird aus zwei identischen Proteinvorläuferionen gebildet, die an derselben PBC-Stelle dissoziieren, aber ihr ionisierendes Proton auf gegenüberliegenden Seiten der Spaltungsstelle haben. Obwohl ein CFIP verwendet werden kann, um die Masse des Protein-Biomarkers genauer zu berechnen (was eine Verengung der Proteinmassentoleranz während einer Suche ermöglicht), ist sein Nutzen für die sequenzspezifische Identifizierung weniger nützlich als der von zwei nicht-komplementären Fragmentionen, die aus zwei verschiedenen Spaltungsstellen gebildet werden, die eine größere Identifizierungsspezifität bieten. Die Leichtigkeit, mit der die beiden AB-Im-Proteine identifiziert wurden, führte uns zu Spekulationen über die minimale Anzahl von Fragmentionen, die notwendig sind, um vorläufig die richtige Proteinsequenz aus Tausenden von Proteinen oder Proteinfragmentsequenzen zu identifizieren. Wir stellten schnell fest, dass es nicht die Anzahl der Fragmentionen an sich ist, sondern die Anzahl der nicht-komplementären Fragmentionen, die wichtig ist, da jedes nicht-komplementäre Fragmention eine PBC-Stelle darstellt, während ein CFIP die gleiche Spaltungsstelle darstellt. Somit wird die Identifizierungsspezifität aus der Anzahl der nachgewiesenen PBC-Stellen abgeleitet, nicht aus der Anzahl der Fragmentionen.
Es ist möglich, dass der Erfolg bei der Identifizierung mit nur drei Fragmentionen einfach zufällig war. Um diese Hypothese zu testen und Verzerrungen bei der Auswahl von Fragmentionen zu eliminieren, haben wir ein Benchmarking-Modul innerhalb der Software erstellt, das nach dem Zufallsprinzip Fragmentionen aus einem größeren Pool komplementärer und/oder nicht-komplementärer Fragmentionen auswählt. Der größere Fragmentionenpool wurde aus den 14 prominenten Fragmentionen ausgewählt, die in Abbildung 3 (untere Abbildung) basierend auf ihrer relativen Häufigkeit identifiziert wurden.
Das Testprotokoll war wie folgt. Mittels einer binären Suche wurden drei Fragmentionen zufällig aus dem Pool von 14 prominenten Fragmentionen in Abbildung 3 (unteres Feld) ausgewählt (m/z 1813.8, 2128.9, 3881.3, 4293.7, 5158.0, 6505.0, 6619.9, 6939.4, 7645.1, 7959.4, 8022.7, 8136.2, 8583.3 und 8961.5). Eine Drei-Fragment-Ionenkohorte wurde mit In-silico-Fragmentionen von PBC auf der C-terminalen Seite von D- oder E- oder N-Resten sowie einer Kombination aus D & E und D & E & N verglichen. Dieser Vergleich wurde für jedes einzelne Fragmention einer Kohorte, für die drei Fragmentionenpaare einer Kohorte und für die Drei-Fragment-Ionenkombination einer Kohorte durchgeführt. Damit ein Vergleich als Übereinstimmung gezählt werden kann, müssen sowohl Fragmentionen eines Paares als auch alle drei Fragmentionen einer Kombination mit In-silico-Fragmentionen übereinstimmen. Nach Abschluss der Analyse wird eine weitere Drei-Fragment-Ionenkohorte zufällig ausgewählt und die Analyse wiederholt. Wiederholungen bei der Fragmentionenselektion waren erlaubt. Da es 364 mögliche Kombinationen gibt [(n!/r!( n-r)!] von einer Drei-Fragment-Ionenkohorte (r) aus einem Pool von 14 Fragmentionen (n) wurden nur 10 Analysen durchgeführt, wie in der S1Im3 (Ergänzende Informationen) gezeigt.
Die Anforderung an die Identifizierung von Drei-Fragment-Ionen scheint ein allgemeines Phänomen zu sein, wie in Spalte 3_ABC der Tabellen 2-7, 9-10 (S1Im3 )dargestellt. Alle Zählungen von 1 in der Spalte 3_ABC entsprechen der Im3-Sequenz (ohne N-terminales Methionin). Der einzige Fehler bei der Identifizierung trat auf, weil das Fragmention bei m/z 8136.2 (in Abbildung 3, unteres Panel dargestellt und in den Tabellen 1 und 8grau hervorgehoben) die für die Analyse eingegebene Fragmentionentoleranz (±1,5 m/z) überschritt. Da der Testalgorithmus erfordert, dass alle Fragmentionen einer Drei-Fragment-Ionenkohorte übereinstimmen, würde jede Gruppe, die das m/z 8136.2-Fragmention enthält, die richtige Proteinsequenz nicht identifizieren/zählen.
Tabelle 6 in S1Im3 zeigt, dass, wenn zwei von drei Fragmentionen komplementär sind (gelb hervorgehoben), mehr falsche Sequenzen den Kriterien entsprachen als die, die beobachtet wurde, wenn alle drei Fragmentionen nicht komplementär waren. Wie bereits erwähnt, liegt dies daran, dass ein CFIP einem einzelnen PBC-Standort entspricht, ein Schwellenwert, der durch viel mehr falsche in silico-Sequenzen erreicht werden kann als durch die Verwendung von zwei nicht-komplementären Fragmentionen, die zwei PBC-Sites entsprechen, ein strengeres Kriterium.
Eine ähnliche Analyse wurde an sechs prominenten Fragmentionen (m/z 2675.4, 2904.5, 3076.2, 3853.5, 5657.5 und 5772.8) von Im-Bac durchgeführt, die in Abbildung 4 (unteres Bild) dargestellt sind. Im Gegensatz zu Im3 hat Im-Bac keine erkennbare CFIP, daher entsprechen die sechs Fragmentionen vermutlich sechs PBC-Stellen. Da es 20 mögliche Kombinationen einer Drei-Fragment-Ionenkohorte gibt, die aus einem Pool von sechs Fragmentionen ausgewählt wurden, wurden nur 10 Analysen durchgeführt, wie in den Tabellen von S2 Im-Bac (Ergänzende Informationen) gezeigt. Die Im-Bac-Sequenz wurde für alle drei Fragment-Ionengruppen in Spalte 3_ABC in allen Analysen korrekt identifiziert/gezählt. In vier Analysen wurden auch ein oder zwei falsche Sequenzen abgeglichen. Diese geringe Anzahl falscher Sequenzen ist jedoch eine überschaubare Anzahl für die manuelle Bestätigung.
Insgesamt scheinen komplementäre und/oder nicht-komplementäre Fragmentionen, die zwei oder drei PBC-Standorten entsprechen, genügend Spezifität zu bieten, um eine oder zwei Kandidatensequenzen abzurufen. Natürlich sollten die vom Bediener ausgewählten Fragmentionen relativ reichlich vorhanden sein und einen guten S / N aufweisen. Ein oder zwei Fragmentionen von einer einzigen PBC-Stelle bieten nicht genügend Spezifität, um zu vermeiden, dass eine undurchführbare Anzahl falscher Sequenzen abgerufen wird, die vom Bediener bestätigt werden müssen. Es ist nicht klar, warum zwei oder drei PBC-Standorte ausreichend sind, aber ein einzelner PBC-Standort ist anscheinend nicht spezifisch genug. Obwohl eine uneingeschränkte Kürzung zu ~200.000 Proteinen und Proteinfragmentsequenzen führt, die die Proteinmassenkriterien erfüllen, ist es wahrscheinlich, dass die orts-/rückstandsspezifische Natur der Spaltungsstellen, d.h. die C-terminale Seite von D-, E- und N-Resten, zur scharfen Verengung möglicher Sequenzen während des Fragmentionenvergleichs beiträgt. Dies kann zum Teil auf die Häufigkeit von D-, E- und N-Resten in bakteriellen Proteinsequenzen sowie auf ihre einzigartigen Positionen in Proteinsequenzen im Proteom von Bakterien zurückzuführen sein. Saure Rückstände spielen eine entscheidende Rolle bei der Proteinstruktur und den Lösungsmittelwechselwirkungen. Infolgedessen sind ihre Häufigkeit und Positionen in der Primärsequenz entscheidend, wenn nicht sogar einzigartig für die Proteinfunktion und könnten erklären, warum nur wenige PBC-Stellen notwendig sind, um vorläufig die richtige Proteinsequenz unter Hunderttausenden falscher Sequenzen zu identifizieren.
Aus sicht der Gasphasenchemie ergibt sich die Bedeutung von D-, E- und N-Resten aus ihrer Beteiligung an einem Dissoziationskanal, der bei niedrigen internen Energien von einzeln geladenen metastabilen Proteinionen, die durch MALDI erzeugt und durch PSD20zerfallen, zugänglich ist. Die relativ lange Zeitskala (~10-30 μs) der molekularen Ionenfragmentierung durch PSD bedeutet, dass die innere Energie des Proteinions auf alle Schwingungs- und Rotationsfreiheitsgrade des Molekülions randomisiert wird, so dass die Dissoziation ergodisch und statistisch ist. Es sollte auch darauf hingewiesen werden, dass der Mechanismus des Asparaginsäureeffekts eine molekulare Ionenumlagerung beinhaltet, die durch eine Folge von Schritten oder einen einzelnen konzertierten Schritt mit mehreren Atomen auftritt, bis eine günstige Geometrie erreicht ist, die die Aktivierungsbarriere von PBC17,18,19senkt .
Zwei Plasmid-kodierte antibakterielle Immunitätsproteine, die von einem STEC-Stamm produziert wurden, wurden unter Verwendung eines Protokolls mit Antibiotika-Induktion, MALDI-TOF-TOF-MS / MS-PSD und Top-Down-Proteomanalyse identifiziert. Diese Proteine wurden mit einer selbst entwickelten Software identifiziert, die die gemessene Masse des Proteins und eine relativ kleine Anzahl sequenzspezifischer Fragmentionen enthält, die als Folge des Asparaginsäureeffekts gebildet werden. Die Software vergleicht die MS- und MS/MS-Daten mit In-silico-Proteinen und Proteinfragmentsequenzen, die aus WGS-Daten abgeleitet wurden. Obwohl die Software keine Identifikationsmetriken oder Bewertungen bereitstellt, eliminiert sie einen sehr hohen Prozentsatz falscher Sequenzen, was zu einer sehr kleinen Anzahl von Kandidatensequenzen (ein oder zwei) führt, die durch manuelle Inspektion leicht bestätigt werden können. Schließlich ergab die manuelle Inspektion der WGS-Daten dieses Bakterienstamms einen Promotor (SOS-Box) vor den Genen AB und Im in einem Plasmidgenom, der die Expression dieser Gene aufgrund der Exposition von DNA-schädigenden Antibiotika rationalisiert.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Protein Biomarker Seeker Software ist frei verfügbar (kostenlos) durch Kontaktaufnahme mit Clifton K. Fagerquist unter clifton.fagerquist@usda.gov. Wir möchten die Unterstützung dieser Forschung durch ARS, USDA, CRIS Grant: 2030-42000-051-00-D anerkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
| Incubator | VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
| Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
References
- Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
- Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
- He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
- Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
- Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
- Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
- Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
- Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
- Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
- Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
- Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
- Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
- Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
- Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
- Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
- Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
- Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
- Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
- Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
- Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
- Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
- Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
- Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
- Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
- Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
- Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
- Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , Palm Springs, CA. (2019).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
- Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
- Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
- Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).
