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Chemistry

माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएस और टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण का उपयोग करके एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबैक्टीरियल प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान

Published: May 23, 2021 doi: 10.3791/62577
Automatic Translation
1, 1
1Produce Safety & Microbiology, Western Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture

Summary

यहां हम घर में विकसित सॉफ्टवेयर के साथ माल्दी-टीओएफ-टीओएफ टैंडेम टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण का उपयोग करके जीनोमिक अनुक्रमित रोगजनक बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित प्रोटीन की तेजी से पहचान के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। एस्पार्टिक एसिड प्रभाव के कारण मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों का टुकड़ा और प्रोटीन पहचान के लिए इस विशिष्टता का शोषण किया जाता है।

Abstract

यह प्रोटोकॉल बैक्टीरियाइडल एंजाइमों के प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान करता है: एंटीबायोटिक प्रेरण का उपयोग करके रोगजनक एस्चेरिचिया कोलाई तनाव द्वारा उत्पादित कोलिसिन E3 और बैक्टीरियोसिन, और माल्डी-टीओएफ टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री और इन-हाउस विकसित सॉफ्टवेयर के साथ टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण द्वारा पहचाना जाता है। कोलिकिन E3 (Im3) के प्रतिरक्षा प्रोटीन और जीवाणु (Im-Bac) के प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान एस्पार्टिक एसिड, ग्लूटामिक एसिड और एस्पार्टिक एसिड प्रभाव विखंडन तंत्र द्वारा सी-टर्मिनल साइड पर पॉलीपेप्टिड बैकबोन क्लीवेज (पीबीसी) द्वारा उत्पन्न प्रमुख बी-एंड/या वाई-टाइप खंड आयनों से की गई थी । सॉफ्टवेयर तेजी से सिलिको प्रोटीन दृश्यों में स्कैन बैक्टीरियल तनाव के पूरे जीनोम अनुक्रमण से प्राप्त किया । सॉफ्टवेयर भी पुनः एक प्रोटीन अनुक्रम के अमीनो एसिड अवशेषों को हटा घटना में है कि परिपक्व प्रोटीन अनुक्रम काट दिया है । एक एकल प्रोटीन अनुक्रम में प्रत्येक प्रतिरक्षा प्रोटीन के लिए पाए गए द्रव्यमान और खंड आयनों के अनुरूप होता है। इसके बाद उम्मीदवार अनुक्रम का मैन्युअल रूप से निरीक्षण किया गया ताकि यह पुष्टि की जा सके कि सभी पता लगाए गए खंड आयनों को सौंपा जा सकता है । Im3 के एन-टर्मिनल मेथियोनिन को अनुवाद के बाद हटा दिया गया था, जबकि आईएम-बीएसी का पूरा अनुक्रम था। इसके अलावा, हमने पाया कि सही प्रोटीन अनुक्रम की पहचान करने के लिए पीबीसी द्वारा गठित केवल दो या तीन गैर-पूरक खंड आयनों की आवश्यकता है। अंत में, एक प्रमोटर (एसओएस बॉक्स) जीवाणु तनाव के एक प्लाज्मिड जीनोम में जीवाणुरोधी और प्रतिरक्षा जीन के ऊपर की पहचान की गई थी ।

Introduction

बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अपाच्य प्रोटीन का विश्लेषण और पहचान को ऊपर- नीचे प्रोटेओमिक विश्लेषण 1 ,2,3, 4के रूप में जानाजाताहै। अब यह एक स्थापित तकनीक है जो इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई)5 और उच्च-रिज़ॉल्यूशन मास एनालाइजर6,और परिष्कृत वियोजन तकनीकों, जैसे, इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण वियोजन (ईटीडी), इलेक्ट्रॉन कैप्चर वियोजन (ईसीडी)7,पराबैंगनी फोटो-वियोजन (यूवी-पीडी)8,आदि का उपयोग करती है।

अन्य सॉफ्ट आयनाइजेशन तकनीक मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसोर्पशन/आयनीकरण (MALDI)9,10,11 है जिसका ऊपर-डाउन विश्लेषण के लिए कम बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है, क्योंकि यह मुख्य रूप से समय-उड़ान (टीएफए) मास एनालाइजर के साथ मिलकर होता है, जिसमें अन्य मास एनालाइजर की तुलना में सीमित संकल्प होता है। इन सीमाओं के बावजूद, शुद्ध प्रोटीन और प्रोटीन के आंशिक और बिना उल्लंघन के मिश्रण के तेजी से ऊपर-नीचे विश्लेषण के लिए मालदी-टीईएफ और मालडी-टीईएफ-टीईएफ उपकरणों का दोहन किया गया है । शुद्ध प्रोटीन की पहचान के लिए, इन-सोर्स क्षय (आईएसडी) एक विशेष रूप से उपयोगी तकनीक है क्योंकि यह आईएसडी टुकड़े आयनों के बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण की अनुमति देता है, साथ ही प्रोटीन आयन टुकड़ों के साथ मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/एमएस) अक्सर एन-और सी-टर्मिनी से लक्ष्य प्रोटीन के अनुक्रम-विशिष्ट टुकड़े प्रदान करता है, एडमैन अनुक्रमण के अनुरूप12,13 . आईएसडी दृष्टिकोण के लिए एक दोष यह है कि, एडमैन अनुक्रमण के रूप में, नमूने में केवल एक प्रोटीन होना चाहिए। एक प्रोटीन की आवश्यकता एक अग्रदूत आयन के लिए टुकड़े आयनों के स्पष्ट रोपण की आवश्यकता के कारण है। यदि एक नमूने में दो या अधिक प्रोटीन मौजूद हैं, तो यह बताना मुश्किल हो सकता है कि कौन से टुकड़े आयन किस अग्रदूत आयनों से संबंधित हैं।

खंड आयन/अग्रदूत आयन एट्रिब्यूशन को मालदी-TOF-TOF-MS/MS का उपयोग करके संबोधित किया जा सकता है । किसी भी शास्त्रीय एमएस/एमएस प्रयोग के साथ के रूप में, अग्रदूत आयनों बड़े पैमाने पर चयनित/विखंडन से पहले अलग कर रहे हैं, और पता चला खंड आयनों एक विशिष्ट अग्रदूत आयन के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । हालांकि, इस दृष्टिकोण के लिए उपलब्ध वियोजन तकनीकों को मुख्य रूप से उच्च ऊर्जा टकराव-प्रेरित वियोजन (एचई-सीआईडी)14 या पोस्ट-सोर्स क्षय (पीएसडी)15, 16तक सीमित कियागयाहै। वह-सीआईडी और पीएसडी पेप्टाइड्स और छोटे प्रोटीन को खंडित करने में सबसे प्रभावी हैं, और अनुक्रम कवरेज, कुछ मामलों में, सीमित हो सकता है । इसके अलावा, पीएसडी के परिणामस्वरूप मुख्य रूप से एस्पार्टिक और ग्लूटामिक एसिड अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड पर एस्पेटिक एसिड प्रभाव17, 18, 19, 20नामक घटना के सी-टर्मिनल पर पॉलीपेप्टाइड बैकबोन क्लीवेज (पीबीसी)होताहै।

माल्डी-टोफ-एमएस ने सूक्ष्मजीवों की वर्गीकरण पहचान में एक आला आवेदन भी पाया है: बैक्टीरिया21,कवक22,और वायरस23। उदाहरण के लिए, एमएस स्पेक्ट्रा का उपयोग तुलना के लिए पैटर्न मान्यता एल्गोरिदम का उपयोग करके ज्ञात बैक्टीरिया के एमएस स्पेक्ट्रा के संदर्भ पुस्तकालय की तुलना में अज्ञात बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए किया जाता है। यह दृष्टिकोण अपनी गति और सादगी के कारण अत्यधिक सफल साबित हुआ है, हालांकि अलग-थलग होने की रात भर खेती की आवश्यकता होती है। इस दृष्टिकोण (आमतौर पर 20 केडीए के तहत) द्वारा पता लगाए गए प्रोटीन आयनों में एक एमएस फिंगरप्रिंट शामिल है जो जीनस और प्रजातियों के स्तर पर वर्गीकरण संकल्प की अनुमति देता है और कुछ मामलों में उप-प्रजातियों24 और तनाव स्तर25,26पर है। हालांकि, न केवल संभावित रोगजनक सूक्ष्मजीवों को वर्गीकरण करने की आवश्यकता है बल्कि विशिष्ट उग्रता कारकों, विषाक्त पदार्थों और रोगाणुरोधी प्रतिरोध (एएमआर) कारकों की पहचान भी की गई है। इसे पूरा करने के लिए पेप्टाइड्स, प्रोटीन या छोटे अणुओं के द्रव्यमान को एमएस द्वारा मापा जाता है और बाद में एमएस/एमएस द्वारा अलग और खंडित किया जाता है ।

रोगजनक बैक्टीरिया अक्सर प्लाज्मिड नामक डीएनए के परिपत्र टुकड़े ले जाते हैं। प्लास्मिड्स, प्रोफैग्स के साथ, बैक्टीरिया के बीच क्षैतिज जीन हस्तांतरण का एक प्रमुख वेक्टर हैं और बैक्टीरिया में एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध और अन्य उग्रता कारकों के तेजी से फैलने के लिए जिम्मेदार हैं। प्लाज्मिड्स में एंटीबैक्टीरियल (एबी) जीन भी हो सकते हैं, जैसे, कोलिसिन और बैक्टीरियोसिन। जब इन जीनों को व्यक्त किया जाता है और प्रोटीन स्रावित होते हैं, तो वे पड़ोसी बैक्टीरिया की प्रोटीन अनुवाद मशीनरी को निष्क्रिय करने का कार्य करते हैं जो एक ही पर्यावरणीय आला27पर कब्जा करते हैं। हालांकि, ये जीवाणु एंजाइम उन्हें उत्पादित करने वाले मेजबान के लिए भी जोखिम पैदा कर सकते हैं। परिणामस्वरूप, एक जीन मेजबान द्वारा सह-व्यक्त किया जाता है जो विशेष रूप से एबी एंजाइम के कार्य को रोकता है और इसे प्रतिरक्षा प्रोटीन (आईएम) के रूप में जाना जाता है।

माइटोमाइसिन-सी और सिप्रोफ्लोक्सेसिन जैसे डीएनए-हानिकारक एंटीबायोटिक्स का उपयोग अक्सर शिगा टॉक्सिन-उत्पादक ई. कोलाई (एसटीईसी) में एसओएस प्रतिक्रिया को प्रेरित करने के लिए किया जाता है, जिसका शिगा टॉक्सिन जीन(एसटीएक्स) बैक्टीरियल जीनोम28में मौजूद एक प्रोथेज जीनोम के भीतर पाया जाता है। हमने पहले एसटीईसी उपभेदों29,30, 31, 32द्वारा उत्पादित एसटीएक्स प्रकारों और उपप्रकारों का पता लगाने और पहचानने के लिए एंटीबायोटिक इंडक्शन, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएसकाउपयोग कियाहै। पिछले काम में, एसटीईसी O113: H21 तनाव RM7788 को माइटोमाइसिन-सी के साथ पूरक आगर मीडिया पर रातोंरात सुसंस्कृत किया गया था। हालांकि, m/z ~7816 पर Stx2a के प्रत्याशित बी-सबयूनिट का पता लगाने के बजाय, एम/जेड ~ 7839 पर एक अलग प्रोटीन आयन का पता लगाया गया था और अज्ञात समारोह33के एक प्लाज्मिड-एन्कोडेड काल्पनिक प्रोटीन के रूप में पहचाना गया था। वर्तमान कार्य में, हमने एंटीबायोटिक इंडक्शन, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएस, और पूरे जीनोम अनुक्रमण (डब्ल्यूजीएस) से प्राप्त सिलिको प्रोटीन दृश्यों में प्रक्रिया और स्कैन करने के लिए विकसित स्टैंडअलोन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके इस तनाव द्वारा उत्पादित दो प्लाज्मिड-एन्कोडेड एबी-आईएम प्रोटीन की पहचान की । इसके अलावा, अनुक्रम ट्रंकेशन से जुड़े पोस्ट-ट्रांसलेशन संशोधनों (पीटीएम) की संभावना को सॉफ्टवेयर में शामिल किया गया था। एस्पेरिक एसिड प्रभाव के कारण पीबीसी से परिपक्व प्रोटीन आयन और अनुक्रम-विशिष्ट खंड आयनों के मापा द्रव्यमान से इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रतिरक्षा प्रोटीन की पहचान की गई थी और एमएस/एमएस-पीएसडी द्वारा पता लगाया गया था । अंत में, एक प्रमोटर एक प्लाज्मिड जीनोम में एबी/Im जीन के ऊपर की पहचान की गई थी जो इन जीनों की अभिव्यक्ति की व्याख्या कर सकता है जब यह तनाव डीएनए को नुकसान पहुंचाने वाली एंटीबायोटिक के संपर्क में आता है । इस कार्य के कुछ अंश नेशनल अमेरिकन केमिकल सोसायटी फॉल 2020 वर्चुअल मीटिंग एंड एक्सपो (17-20 अगस्त, 2020)34में प्रस्तुत किए गए थे।

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Protocol

1. माइक्रोबायोलॉजिकल नमूना तैयार

  1. ई. कोलाई O113 के साथ एक 50 मिलीलीटर शंकु नली में लुरिया शोरबा (एलबी) के 25 एमएल टीका: H21 तनाव RM7788 (या एक और जीवाणु तनाव) एक बाँझ 1 μL पाश का उपयोग कर एक ग्लिसरोल स्टॉक से। 4 घंटे के लिए मिलाते हुए (200 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब और पूर्व संस्कृति कैप करें।
  2. पूर्व-सुसंस्कृत शोरबा का अलीकोट 100 माइक्रोन और माइटोमाइसिन-सी के 400 या 800 एनजी/एमएल के साथ पूरक एक पौंड एगर प्लेट पर फैल गया। संस्कृति आगर प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में रात भर स्थिर रूप से।
    सावधानी: एसटीईसी उपभेद रोगजनक सूक्ष्मजीव हैं। बीएसएल-2 जैवसेफ्टी कैबिनेट में, खेती से परे सभी माइक्रोबायोलॉजिकल जोड़तोड़ करें।
  3. एक बाँझ 1 माइक्रोल लूप का उपयोग करके एकल दृश्यमान कॉलोनियों से फसल जीवाणु कोशिकाएं और एचपीएलसी-ग्रेड पानी के 300 माइक्रोल युक्त 2.0 एमएल ओ-रिंग-लाइन वाले स्क्रू-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को कैप करें, भंवर संक्षेप में, और कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 2 मिनट के लिए 11,337 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें।

2. मास स्पेक्ट्रोमेट्री

  1. स्टेनलेस स्टील माल्डी लक्ष्य पर नमूना सुपरनेटेंट का स्पॉट 0.75 μL aliquot और इसे सूखने की अनुमति दें। सूखे नमूने के स्थान को 33% एसीटोनिट्रिल, 67% पानी और 0.2% ट्राइफ्लोरेसेटिक एसिड में सिनापिनिक एसिड के संतृप्त समाधान के a0.75 μL aliquot के साथ ओवरले करें। जगह को सूखने दें।
  2. एक माल्डी-TOF-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके सूखे नमूने के स्थानों का विश्लेषण करें।
    1. माल्डी लक्ष्य को मास स्पेक्ट्रोमीटर में लोड करने के बाद, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में एमएस रैखिक मोड अधिग्रहण के लिए बटन पर क्लिक करें। अधिग्रहण विधि सॉफ्टवेयर में निचले और ऊपरी सीमा (जैसे, 2 केडीए से 20 केडीए) के एम/जेड को अपने संबंधित क्षेत्रों में दर्ज करके विश्लेषण करने के लिए एम/जेड रेंज दर्ज करें ।
    2. सॉफ्टवेयर में मालडी लक्ष्य टेम्पलेट पर विश्लेषण करने के लिए नमूना स्थान पर क्लिक करें। फिर, बाएं माउस बटन को दबाना और लेजर एब्लेशन/आयनीकरण के लिए नमूना होने के लिए आयताकार क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के लिए नमूना स्थान पर माउस कर्सर खींचें। माउस बटन जारी करें और अधिग्रहण शुरू हो जाएगा। प्रत्येक नमूना स्थान के लिए 1,000 लेजर शॉट्स ले लीजिए।
      नोट: डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर अधिग्रहण विंडो में वास्तविक समय में प्रदर्शित किया जाता है।
    3. यदि कोई आयनों का पता नहीं चल पाता है, तो सॉफ्टवेयर में लेजर तीव्रता के तहत स्लाइडिंग स्केल बार को समायोजित करके लेजर तीव्रता बढ़ाएं जब तक कि प्रोटीन आयन सिग्नल का पता न चल जाए। इसे सीमा के रूप में संदर्भित किया जाता है।
      नोट: नमूना स्पॉट विश्लेषण से पहले, प्रोटीन कैलिब्रेंट के साथ एमएस रैखिक मोड में उपकरण को बाहरी रूप से कैलिब्रेट करें, जिसका एम/जेड विस्तार सीमा का विश्लेषण किया जा रहा है, उदाहरण के लिए, प्रोटीन कैलिब्रेंट के +1 और +2 चार्ज राज्य: साइटोक्रोम-सी, लिसोजिमे, और मायोग्लोबिन 2 केडीए से 20 केडीए की एक बड़ी श्रृंखला को कवर करते हैं। निर्दिष्ट द्रव्यमान सीमा के भीतर एक मध्यवर्ती द्रव्यमान का उपयोग फोकस द्रव्यमान के रूप में किया जाता है, उदाहरण के लिए, 9 केडीए। फोकस मास आयन है जिसका एम/जेड रैखिक मोड डिटेक्टर द्वारा पता लगाने के लिए इष्टतम रूप से केंद्रित है।
    4. जब एमएस रैखिक मोड अधिग्रहण पूरा हो गया है, अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में एमएस/एमएस रिफ्लार्क मोड अधिग्रहण के लिए बटन पर क्लिक करें । अग्रदूत द्रव्यमान क्षेत्र में विश्लेषण करने के लिए अग्रदूत द्रव्यमान दर्ज करें। इसके बाद, अग्रदूत द्रव्यमान के कम और उच्च द्रव्यमान पक्ष के लिए अग्रदूत मास विंडो में एक अलगाव चौड़ाई (दा में) दर्ज करें, उदाहरण के लिए, ±100 डीए।
    5. सीआईडी ऑफ बटन पर क्लिक करें। मेटास्टेबल दबाने वाले बटन पर क्लिक करें। सॉफ्टवेयर में लेजर तीव्रता के तहत स्लाइडिंग स्केल बार को समायोजित करके लेजर तीव्रता को अपने अधिकतम मूल्य का कम से कम 90% तक समायोजित करें।
    6. सॉफ्टवेयर में मालडी लक्ष्य टेम्पलेट पर विश्लेषण करने के लिए नमूना स्थान पर क्लिक करें। फिर बाएं माउस बटन को दबाना और लेजर एब्लेशन/आयनीकरण के लिए नमूना होने के लिए आयताकार क्षेत्र को निर्दिष्ट करने के लिए नमूना स्थान पर माउस कर्सर खींचें। माउस बटन जारी करें, और अधिग्रहण शुरू हो जाएगा। प्रत्येक नमूना स्थान के लिए 10,000 लेजर शॉट्स ले लीजिए।
      नोट: नमूना स्थान विश्लेषण से पहले, उपकरण को एमएस/एमएस-रिफ्लेक्टरन मोड में बाहरी रूप से कैलिब्रेट किया जाना चाहिए, जो एल्किलेटेड थिओरडोक्सिन35के +1 चार्ज स्टेट के पोस्ट-सोर्स क्षय (पीएसडी) से टुकड़े आयनों का उपयोग करके किया जाना चाहिए।
  3. कच्चे एमएस डेटा की प्रक्रिया न करें। प्रक्रिया एमएस/एमएस-PSD कच्चे डेटा निर्दिष्ट क्रम में कदम के निम्नलिखित अनुक्रम का उपयोग कर: उन्नत बेसलाइन सुधार (३२, ०.५, ०.०) शोर हटाने (दो मानक विचलन) के बाद गॉसियन चौरसाई (31 अंक) ।
  4. पीबीसी19,20द्वारा उत्पन्न प्रमुख खंड आयनों की उपस्थिति के लिए एमएस/एमएस-पीएसडी डेटा का मैन्युअल रूप से निरीक्षण करें ।
  5. खंड आयनों के निरपेक्ष और सापेक्ष बहुतायत और उनके सिग्नल-टू-शोर (एस/एन) के संबंध में एमएस/एमएस डेटा का मूल्यांकन करें । प्रोटीन पहचान के लिए केवल सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयनों का उपयोग करें, खासकर अगर एमएस/एमएस-PSD डेटा शोर है ।

3. सिलिको प्रोटीन डेटाबेस निर्माण में

  1. बैक्टीरियल स्ट्रेन के सिलिको प्रोटीन सीक्वेंस में युक्त एक टेक्स्ट फाइल जेनरेट करें, जिसे प्रोटीन पहचान के लिए प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर द्वारा स्कैन किया जाएगा। प्रोटीन दृश्यों का विश्लेषण किया जा रहा है (या एक बारीकी से संबंधित तनाव) तनाव के पूरे जीनोम अनुक्रमण (WGS) से प्राप्त कर रहे हैं ।
  2. विशिष्ट बैक्टीरियल स्ट्रेन (जैसे, एस्चेरिचिया कोलाई O113: H21 तनाव RM7788) का विश्लेषण किया जा रहा है के लगभग ५,० प्रोटीन दृश्यों को डाउनलोड करने के लिए NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) वेबसाइट का उपयोग करें । अधिकतम डाउनलोड आकार 200 दृश्यों है।
    1. परिणामस्वरूप, 25 डाउनलोड को एक ही टेक्स्ट फ़ाइल में कॉपी और पेस्ट करें। प्रत्येक डाउनलोड के लिए FASTA (टेक्स्ट) प्रारूप का चयन करें।

4. ऑपरेटिंग प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर

  1. प्रोटीन बायोमार्कर साधक निष्पादित फ़ाइल पर डबल क्लिक करें। एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई) विंडो दिखाईदेगी (चित्रा 1,शीर्ष पैनल)।
  2. परिपक्व प्रोटीन मास क्षेत्र में प्रोटीन बायोमार्कर (जैसा कि एमएस-रैखिक मोड में मापा जाता है) के द्रव्यमान को दर्ज करें। इसके बाद, मास टॉलरेंस क्षेत्र में बड़े पैमाने पर माप त्रुटि दर्ज करें। मानक द्रव्यमान माप त्रुटि एक 10,000 डीए प्रोटीन के लिए ±10 डीए है।
  3. वैकल्पिक रूप से, पूरक बी/वाई आयन प्रोटीन मास कैलकुलेटर बटन पर क्लिक करें ताकि एक ख्यात पूरक खंड आयन जोड़ी (CFIP या b/y) से प्रोटीन द्रव्यमान की गणना की जा सके । एक पॉप-अप विंडो, प्रोटीन मास कैलकुलेटर टूल,(चित्रा 1, नीचेपैनल) दिखाई देगा।
    1. ख्यात CFIP के m/z दर्ज करें और ऐड पेयर बटन पर क्लिक करें । गणना प्रोटीन द्रव्यमान दिखाई देगा।
    2. इस नंबर को परिपक्व प्रोटीन मास फील्ड में कॉपी करें और चिपकाएं और प्रोटीन मास कैलकुलेटर टूल विंडो को बंद करें।
  4. सेट अवशेष प्रतिबंध बॉक्स पर क्लिक करके एन-टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड लंबाई चुनें। एक स्लाइडिंग स्केल और कर्सर के साथ एक पॉप-अप दिखाई देगा। कर्सर को वांछित सिग्नल पेप्टाइड लंबाई (अधिकतम 50) पर ले जाएं। यदि कोई सिग्नल पेप्टाइड लंबाई का चयन नहीं किया जाता है, तो सॉफ्टवेयर द्वारा एक अप्रतिबंधित अनुक्रम ट्रंकेशन किया जाएगा।
  5. जीयूआई में खंड आयन स्थिति के तहत, पॉलीपेप्टाइड बैकबोन (पीबीसी) के लिए अवशेषों का चयन करें। एक या एक से अधिक अवशेषों के बक्से पर क्लिक करें: डी, ई, एन, और/
    1. खोजे जाने वाले बटन को एंटर टुकड़ा आयनों (+1) पर क्लिक करें। एक पॉप-अप टुकड़ा पेज दिखाई देगा। इसके बाद, ऐड नाप टुकड़ा आयन बटन पर क्लिक करें, जो दर्ज किए जाने वाले टुकड़े आयनों की संख्या से मेल खाता है, यानी प्रत्येक खंड आयन के लिए एक क्लिक करें। प्रत्येक खंड आयन में प्रवेश करने के लिए एक ड्रॉपडाउन फ़ील्ड दिखाई देगा।
    2. खंड आयनों और उनके संबद्ध m/z सहिष्णुता के m/z दर्ज करें । पूरा होने पर सेव एंड क्लोज बटन पर क्लिक करें।
      नोट: एक उचित m/z सहिष्णुता ±१.५ है ।
    3. टुकड़े आयनों की न्यूनतम संख्या का चयन करें जिन्हें बॉक्स में वांछित संख्या में स्क्रॉल करके पहचान के लिए मिलान किया जाना चाहिए ताकि कितने खंड आयनोंका मिलान किया जा सके ।
      नोट: तीन मैच पर्याप्त होने चाहिए ।
    4. इसी सर्कल पर क्लिक करके अपने ऑक्सीडाइज्ड राज्य में होने के लिए सिस्टीन अवशेषों का चयन करें। यदि खोज के बाद कोई प्रोटीन पहचान नहीं मिलती है, तो खोज को उनकी कम अवस्था में साइस्टीन के साथ दोहराएं। यदि खोज के बाद कोई पहचान नहीं मिलती है, तो ±3 के लिए खंड आयन सहिष्णुता को चौड़ा करें और खोज दोहराएं।
  6. फाइल सेटअपके तहत, प्रोटोकाल चरण 3.1 से 3.2 में निर्मित बैक्टीरियल स्ट्रेन के सिलिको प्रोटीन दृश्यों वाले फास्टा (टेक्स्ट) फाइल को ब्राउज़ करने और चुनने के लिए चुनिंदा फास्टा फाइल बटन पर क्लिक करें। इसके बाद आउटपुट फोल्डर चुनें और आउटपुट फाइल नाम बनाएं।
  7. फाइल प्रविष्टियों बटन पर रन सर्च पर क्लिक करें। एक पॉप-अप विंडो खोज शुरू होने से पहले खोज मापदंडों को प्रदर्शित करते हुए पुष्टि खोज मापदंडों (चित्रा 1,नीचे पैनल) हकदार दिखाई देगी।
  8. यदि खोज पैरामीटर सही हैं, तो स्टार्ट सर्च बटन पर क्लिक करें। अगर सर्च पैरामीटर सही नहीं हैं तो कैंसिल बटन पर क्लिक करें और सही पैरामीटर्स को फिर से एंटर करें। एक बार खोज शुरू होने के बाद, पैरामीटर विंडो बंद हो जाती है, और प्रगति बार के साथ एक नई पॉप-अप विंडो दिखाई देती है(चित्रा 1, नीचेपैनल) खोज की प्रगति और मिली पहचान की संख्या का एक चल मिलान दिखाता है।
  9. खोज (कुछ सेकंड) के पूरा होने पर, प्रगति बार स्वचालित रूप से बंद हो जाता है, और खोज का सारांश जीयूआई(चित्रा 2,शीर्ष पैनल) के लॉग क्षेत्र में प्रदर्शित होता है। इसके अलावा, एक नई पॉप-अप विंडो भी प्रोटीन पहचान (ओं) प्रदर्शित करेगी यदि कोई(चित्रा 2, नीचेपैनल)।
    नोट: सिलिको प्रोटीन दृश्यों में अपरिचित अवशेषों, जैसे, यू या एक्स, स्वचालित रूप से विश्लेषण से छोड़ दिया जाता है और इन दृश्यों को बाद में ऑपरेटर को सचेत करने के लिए एक अलग पॉप-अप विंडो के साथ सूचित किया जाता है कि खोज के पूरा होने पर कौन सा (यदि कोई हो) दृश्यों को छोड़ दिया गया था।

5. प्रोटीन अनुक्रम की पोस्ट-सर्च पुष्टि

  1. मैनुअल विश्लेषण द्वारा उम्मीदवार अनुक्रम की शुद्धता की पुष्टि करें।
    नोट: प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर का उद्देश्य विचार से कई स्पष्ट रूप से गलत प्रोटीन दृश्यों को नष्ट करने और परिपक्व प्रोटीन में एक संभावित पीटीएम के रूप में अनुक्रम ट्रंकेशन को शामिल करके उच्च सटीकता के साथ एक प्रोटीन अनुक्रम की पहचान करना है। चूंकि वापस किए गए संभावित उम्मीदवार दृश्यों की संख्या कुछ है, इसलिए मैन्युअल पुष्टि प्रबंधनीय है।
  2. इस तरह की कार्यक्षमता वाले किसी भी बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री या प्रोटेओमिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उम्मीदवार अनुक्रम के बी-और वाई-प्रकार के खंड आयनों के औसत एम/जेड की तालिका उत्पन्न करें। डी-, ई-और एन-अवशेषों (और पी-अवशेषों के एन-टर्मिनल साइड पर) के सी-टर्मिनल साइड पर सिलिको खंड आयनों में औसत एम/जेड की तुलना एमएस/एमएस-पीएसडी डेटा से प्रमुख खंड आयनों के एम/जेड से करें ।
    नोट: सबसे प्रमुख एमएस/एमएस-PSD खंड आयनों आसानी से डी से मिलान किया जाना चाहिए-, ई, और एन-सिलिको खंड आयनों में जुड़े । हालांकि, प्रोटीन अनुक्रम36के एन या सी-टर्मिनी के पास एस्पार्टिक एसिड प्रभाव विखंडन तंत्र कम कुशल है।

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Representative Results

चित्रा 3 (शीर्ष पैनल) STEC O113 के एमएस से पता चलता है: H21 तनाव RM7788 LBA पर रातोंरात सुसंस्कृत ४०० एनजी के साथ पूरक/ एम/जेड ७२७६, ७३३७, और ७८४१ पर चोटियों पहले कोल्ड शॉक प्रोटीन सी (सीएसपीसी), कोल्ड शॉक प्रोटीन ई (सीएसपीई), और अज्ञात समारोह के एक प्लाज्मिड जनित प्रोटीन, क्रमशः३३के रूप में पहचान की गई थी । एम/जेड ९७८० [एम + एच]+ पर प्रोटीन आयन का विश्लेषण एमएस/एमएस-पीएसडी द्वारा किया गया था जैसा कि चित्र 3 (बॉटम पैनल) में दिखाया गया है । अग्रदूत आयन को एक समय पर आयन चयनकर्ता (टीआई) विंडो ±100 डीए के साथ अलग-थलग कर दिया गया था । खंड आयनों की पहचान उनके एम/जेड और टाइप/नंबर से की जाती है । एम/जेड २६७५.९ (एक स्टार के साथ प्रकाश डाला) पर टुकड़ा आयन एम/जेड ९६५५ पर मेटास्टेबल प्रोटीन आयन के वियोजन से spillover है चित्रा 3 (शीर्ष पैनल) में दिखाया गया है । प्रत्येक खंड आयन का सैद्धांतिक औसत एम/जेड ऊपर दिखाए गए कोलिकिन E3 प्रतिरक्षा प्रोटीन (Im3) के अनुक्रम के पीबीसी के आधार पर कोष्ठक में दिखाया गया है । पीबीसी की साइटों को इसी खंड आयन (एस) उत्पादित के साथ एक लाल तारांकन के साथ हाइलाइट किया जाता है। एन-टर्मिनल मेथियोनिन को इस बात को रेखांकित किया गया है कि यह परिपक्व प्रोटीन में अनुवाद के बाद हटा दिया गया है । अनुक्रम में एक सिस्टीन अवशेष (बॉक्स्ड) है और इसलिए इसकी कम स्थिति में माना जाता है।

प्रोटीन बायोमार्कर और कुछ प्रमुख गैर-पूरक खंड आयनों के द्रव्यमान का उपयोग करना: m/z 1813.8, 2128.9, और 4293.7 (±1.5 सहिष्णुता)(चित्रा 1, नीचेपैनल) और डी-और ई-अवशेषों के सी-टर्मिनल पक्ष में पीबीसी को प्रतिबंधित करना, सॉफ्टवेयर द्वारा केवल एक उम्मीदवार अनुक्रम की सूचना दी गई थी: Im3 प्रोटीन अनुक्रम (इसके एन-टर्मिनल मेथियोनिन के बिना)(चित्रा 2 , नीचे पैनल) । खोज के लिए खंड आयनों का चयन करते समय, इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि गैर-पूरक खंड आयनों का कोई भी समूह यह मानता है कि समूह में किसी भी दो खंड आयनों के एम/जेड को संक्षेप में (और दो प्रोटॉन घटाना) एक द्रव्यमान राशि में परिणाम देता है जो बायोमार्कर द्रव्यमान और संबद्ध जन सहिष्णुता (±10 डीए) के भीतर नहीं जाता है। RM7788 के ड्राफ्ट WGS ५००८ प्रोटीन दृश्यों (खुले पढ़ने के फ्रेम)३७से पता चला । इन ~ 5,000 पूर्ण प्रोटीन दृश्यों में से, 189,490 पूर्ण और आंशिक दृश्य (अप्रतिबंधित ट्रंकेशन) ने बायोमार्कर द्रव्यमान मानदंड(चित्रा 2,शीर्ष पैनल) से मुलाकात की। उन दृश्यों बड़े पैमाने पर मापदंड पारित तो डी के सी टर्मिनल पक्ष पर सिलिको पीबीसी में से गुजरना-और/या ई अवशेषों । परिणामस्वरूप उत्पन्न खंड आयनों को तब मनाया गया टुकड़ा आयनों की तुलना में किया जाता है। सॉफ्टवेयर द्वारा रिपोर्ट किया गया उम्मीदवार अनुक्रम पूरी तरह से इसके द्रव्यमान और तीन डी-और/या ई-विशिष्ट पीबीसी साइटों पर आधारित था । इतनी कम मात्रा में जानकारी द्वारा प्राप्त विशिष्टता पर अगले खंड में चर्चा की जाएगी।

जैसा कि चित्र 3 (बॉटम पैनल) में दिखाया गया है, सबसे प्रचुर मात्रा में खंड आयन एएसपार्टिक एसिड प्रभाव विखंडन तंत्र19,20के माध्यम से डी-और ई-अवशेषों के सी-टर्मिनल पक्ष पर पीबीसी का परिणाम हैं। दो CFIP मनाया जाता है: b67/y17 (m/z 7645.1/m/z 2128.9) और b70/y14 (m/z 7959.4/m/z 1813.8) । इन CFIP का उपयोग सरल सूत्र का उपयोग करके प्रोटीन अग्रदूत आयन के द्रव्यमान की अधिक सटीक गणना करने के लिए किया जा सकता है: b (m/z) + y (m/z)-2H+ = प्रोटीन द्रव्यमान (दा)३३। दो CFIP का उपयोग करना, हम प्रोटीन का एक औसत द्रव्यमान प्राप्त करते हैं: 9771.6 डीए, जो एमएस-रैखिक मोड में प्रोटीन आयन के मापा द्रव्यमान की तुलना में 9772.5 डीए के सैद्धांतिक मूल्य के करीब है: 9779 दा(चित्रा 3,शीर्ष पैनल)। केवल कुछ CFIP का पता चला क्योंकि आयनिंग प्रोटोन वाले अधिकांश अग्रदूत आयनों को केवल आर्जिनिन अवशेषों पर तनहा: R80। एक lysine अवशेष (K) (२२१.८ किलो कैलोरी/मोल३८)की तुलना में आर्जिनिन (२३७.० किलो कैलोरी/मोल३८)की उच्च गैस चरण की बुनियादीता केवल आर-अवशेषों पर आयनीकरण प्रोटॉन के तरजीही ज़ब्ती के लिए जिम्मेदार है ।

चित्रा 4 (शीर्ष पैनल) STEC O113 के एमएस से पता चलता है: H21 तनाव RM7788 LBA पर रातोंरात सुसंस्कृत ८०० एनजी के साथ पूरक/ चित्रा 4 (शीर्ष पैनल) काफी चित्रा 3 (शीर्ष पैनल) के समान है, हालांकि एंटीबायोटिक सांद्रता में अंतर के कारण कुछ प्रोटीन आयनों के सापेक्ष बहुतायत में अंतर हैं। प्रोटीन बायोमार्कर एम/जेड में मामूली बदलाव भी होते हैं जो विभिन्न दिनों में उपकरण के बाहरी अंशांकन में अंतर को दर्शाते हैं । एक बार फिर, एम/जेड ७२७२, ७३३५, और ७८३८ पर प्रोटीन आयनों क्रमशः सीएसपीसी, सीएसपीई, और एक प्लाज्मिड जनित प्रोटीन हैं । इसके अलावा, हम एम/जेड ९७७८ पर Im3 प्रोटीन आयन का पता लगाते हैं (हालांकि चित्रा 3की तुलना में कम बहुतायत के साथ) के साथ-साथ एम/जेड 9651 [एम + एच]+ परप्रोटीन आयन । चित्रा 4 (नीचे पैनल) एमएस/एमएस-PSD से पता चलता है एमएस/जेड ९६५१ पर प्रोटीन अग्रदूत आयन के । अग्रदूत आयन को एम/जेड ९५३९ और ९७७८ में आसन्न प्रोटीन आयनों के योगदान को खत्म करने के लिए-75/+ 60 डीए की एक संकरा और असममित TIS खिड़की का उपयोग करके अलग किया गया था । खंड आयनों की पहचान उनके एम/जेड और टाइप/नंबर से की जाती है । जीवाणु (आईएम-बीएसी) के प्रतिरक्षा प्रोटीन का अनुक्रम ऊपर दिखाया गया है। पीबीसी की साइटों को उनके इसी खंड आयन (एस) के साथ एक लाल तारांकन के साथ हाइलाइट किया जाता है। प्रत्येक खंड आयन का सैद्धांतिक औसत एम/जेड स्पेक्ट्रम में कोष्ठक में भी दिखाया गया है। आईएम-बीएसी अनुक्रम में एक सिस्टीन अवशेष (बॉक्स्ड) भी है और इसलिए इसे अपनी कम स्थिति में माना जाता है।

प्रोटीन बायोमार्कर द्रव्यमान का उपयोग करना, तीन प्रमुख गैर-पूरक खंड आयनों: एम/जेड २६७५.४, ३८५३.५, और ५७७२.८ (±१.५० सहिष्णुता) चित्रा 4 से और पीबीसी को केवल डी-एंड/या ई-एंड/या/या शतावरी (एन)-अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड तक सीमित करना, सॉफ्टवेयर द्वारा केवल एक उम्मीदवार अनुक्रम की सूचना दी गई थी: Im-प्रोटीन । उम्मीदवार अनुक्रम को 1 9 1,375 पूर्ण या आंशिक दृश्यों को स्कैन करने के बाद प्राप्त किया गया था जो बायोमार्कर द्रव्यमान और सहिष्णुता (±10 डीए) मानदंडों से मिले थे। उम्मीदवार अनुक्रम की पहचान सॉफ्टवेयर-आधारित द्वारा पूरी तरह से इसके द्रव्यमान और तीन डी-और/या ई-एंड/या एन-विशिष्ट पीबीसी साइटों पर की गई थी ।

चित्रा 4 (नीचे पैनल) में सबसे प्रमुख खंड आयनों, एक बार फिर, डी और/या ई अवशेषों के सी टर्मिनल पक्ष पर पीबीसी का परिणाम था और भी पी अवशेषों में से एक के एन टर्मिनल पक्ष पर20। हम एन-अवशेषों के सी-टर्मिनल पक्ष पर पीबीसी का भी निरीक्षण करते हैं जो एस्पार्टिक एसिड प्रभाव जैसे विखंडन तंत्र39,40से भी होने की संभावना है। प्रोटीन अग्रदूत आयन संकेत की कमजोरी के परिणामस्वरूप सीमित संख्या में व्याख्या योग्य खंड आयन होते हैं। टुकड़ा आयन एम/जेड की सटीकता टुकड़ा आयन बहुतायत के साथ गिरावट आती है । प्रोटीन आयन अनुक्रम के एकमात्र आर्जिनिन अवशेषों (R74) पर आयनीकरण प्रोटोन को संभवतः तनहा किए जाने के कारण कोई सीएफआईआईपी का पता नहीं चला। सभी खंड आयनों में R74 अवशेष होते हैं, जो इस परिकल्पना के अनुरूप होते हैं।

जीवाणुरोधी प्रतिरक्षा जीन के प्रमोटर
चित्रा 5 ई. कोलाई तनाव RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) के ६४८२ बीपी contig00100 के एक हिस्से से पता चलता है पूरे जीनोम शॉटगन अनुक्रमण३७से । कोलिकिन E3 के लिए कोडिंग क्षेत्र, इसकी प्रतिरक्षा प्रोटीन (Im3), बैक्टीरियोसिन (Im-Bac) की प्रतिरक्षा प्रोटीन, और एक लाइसिस प्रोटीन पीले रंग में प्रकाश डाला जाता है। कोलिकिन E3 जीन के लिए कोडिंग क्षेत्र के अपस्ट्रीम-३५ क्षेत्र, Pribnow बॉक्स (पीबी), एसओएस बॉक्स के उल्टे दोहराने, शाइन-Dalgarno/ribosomal बाध्यकारी साइट (एसडी/आरबीएस)27हैं । शूलिन E3 और Im3 के बीच नौ बेस-पेयर इंटरजेनिक क्षेत्र है। लेक्सा (एक दमनकारी प्रोटीन और एक ऑटोपेप्टिडेस) एसओएस बॉक्स से बांधता है जो जीन डाउनस्ट्रीम की अभिव्यक्ति को अवरुद्ध करता है। डीएनए क्षति (जैसे, यूवी विकिरण या डीएनए-हानिकारक एंटीबायोटिक दवाओं) पर, लेक्सा27, 28जीन डाउनस्ट्रीम की अभिव्यक्ति की अनुमति देने वाले आत्म-दरार से गुजरता है। इस प्रकार, इन दो प्रतिरक्षा प्रोटीन की अभिव्यक्ति डीएनए-हानिकारक एंटीबायोटिक के लिए इस तनाव के संपर्क में है।

Figure 1
चित्रा 1:प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर के स्क्रीन शॉट्स। शीर्ष पैनल: प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर का ग्राफिकल यूजर इंटरफेस (जीयूआई)। नीचे पैनल: प्रोटीन मास कैलकुलेटर टूल, टुकड़ा पृष्ठ, खोज मापदंडों की पुष्टि, और खोज प्रगति बार की पॉप-अप खिड़कियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन पहचान के परिणाम खोजें। शीर्ष पैनल: सॉफ्टवेयर जीयूआई के लॉग फ़ील्ड में प्रदर्शित खोज परिणामों का सारांश। नीचे पैनल: सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रोटीन पहचान प्रदर्शित करने वाली एक पॉप-अप विंडो। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:एसटीईसी O113 का मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण: एच21 तनाव RM7788। शीर्ष पैनल: STEC O113 के एमएस: H21 तनाव RM7788 LBA पर रातोंरात सुसंस्कृत ४०० एनजी के साथ पूरक/ बॉटम पैनल: एमएस/एमएस-पीएसडी प्रोटीन अग्रदूत आयन के m/z ९७८० (शीर्ष पैनल) पर । अग्रदूत आयन एक TIS खिड़की ±१०० दा के साथ अलग किया गया था । खंड आयनों उनके m/z और आयन प्रकार द्वारा पहचाने जाते हैं । कोलिकिन E3 (Im3) के लिए प्रतिरक्षा प्रोटीन का अनुक्रम दिखाया गया है। बुनियादी अवशेषों (संभावित प्रभार ज़ब्ती की साइटों) नीले रंग में प्रकाश डाला जाता है। पीबीसी को इसी खंड आयन (एस) उत्पन्न के साथ एक लाल तारांकन के साथ हाइलाइट किया जाता है। प्रत्येक खंड आयनों का सैद्धांतिक औसत एम/जेड कोष्ठक में दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:एसटीईसी O113 का मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण: एच21 स्ट्रेन RM7788। शीर्ष पैनल: STEC O113 के एमएस: H21 तनाव RM7788 LBA पर रातोंरात सुसंस्कृत ८०० एनजी के साथ पूरक/ बॉटम पैनल: एमएस/एमएस-पीएसडी प्रोटीन अग्रदूत आयन के एम/जेड ९६५१ (शीर्ष पैनल) पर । अग्रदूत आयन को अग्रदूत आयन के कम एम/जेड साइड पर-७५ की असममित टीआई विंडो और अग्रदूत आयन के उच्च एम/जेड साइड पर + ६० के साथ अलग किया गया था । खंड आयनों की पहचान उनके एम/जेड और आयन प्रकार से की जाती है। बैक्टीरियोसिन (आईएम-बीएसी) के इम्युनिटी प्रोटीन का सीक्वेंस दिखाया गया है। बुनियादी अवशेषों (संभावित प्रभार ज़ब्ती की साइटों) नीले रंग में प्रकाश डाला जाता है। पीबीसी को इसी खंड आयन (एस) उत्पन्न के साथ एक लाल तारांकन के साथ हाइलाइट किया जाता है। प्रत्येक खंड आयन का सैद्धांतिक औसत एम/जेड कोष्ठक में दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ई. कोलाई O113 द्वारा किए गए प्लाज्मिड जीनोम के एक वर्ग का विश्लेषण: H21 तनाव RM7788 । ई. कोलाई O113 के ६४८२ बीपी contig00100 का एक हिस्सा: H21 तनाव RM7788 (GenBank: NWVS01000096.1) पूरे जीनोम शॉटगन अनुक्रमण३७से । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 1 (S1 Im3): Im3 के चुनिंदा टुकड़े आयनों (चित्रा 3,नीचे पैनल से) का उपयोग कर सॉफ्टवेयर के बेंचमार्किंग विश्लेषण के परिणाम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक फाइल 2 (S2 ImBac): आईएम-बीएसी (चित्रा 4,नीचे पैनल से) के चुनिंदा खंड आयनों का उपयोग करके सॉफ्टवेयर के बेंचमार्किंग विश्लेषण के परिणाम। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रोटोकॉल विचार
वर्तमान प्रोटोकॉल की प्राथमिक ताकत इसकी गति, नमूना तैयारी की सादगी, और एक उपकरण का उपयोग है जो संचालित करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, पर प्रशिक्षित किया जाना है, और बनाए रखना है। हालांकि तरल क्रोमेटोग्राफी-ईएसआई-एचआर-एमएस द्वारा बॉटम-अप और टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण सर्वव्यापी हैं और माल्डी-TOF-TOF द्वारा ऊपर-नीचे करने के लिए कई मामलों में कहीं बेहतर हैं, उन्हें अधिक समय, श्रम और विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। साधन जटिलता अक्सर प्रभावित कर सकती है कि वैज्ञानिकों द्वारा औपचारिक रूप से बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री में प्रशिक्षित नहीं किए जाने वाले कुछ साधन प्लेटफार्मों को अपनाया जा सकता है या नहीं। माल्डी-टीओएफ-टीओएफ के साथ ऊपर-डाउन दृष्टिकोण नैदानिक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं में बैक्टीरिया की वर्गीकरण पहचान के लिए अपने वर्तमान उपयोग से परे माल्डी-TOF-एमएस के विश्लेषण का विस्तार करने के लिए है, जबकि विश्लेषण के लिए आवश्यक श्रम, जटिलता या विशेषज्ञता को नाटकीय रूप से नहीं बढ़ा रहा है।

प्रोटोकॉल किसी भी यांत्रिक (या विद्युत) सेल लाइसिस कदम को नियोजित नहीं करता है। यद्यपि प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्रावित या बाह्राश प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है, लेकिन इस विधि का एक पूर्व संस्करण सबसे पहले एसटीईसी उपभेदों से शिगा टॉक्सिन (एसटीएक्स) का पता लगाने के लिए विकसित किया गया था जिसमें एंटीबायोटिक प्रेरण बैक्टीरियल एसओएस प्रतिक्रिया को ट्रिगर करता है जिसके परिणामस्वरूप फाज जीन की अभिव्यक्ति होती है, जिसमें एसटीएक्स के साथ-साथ बैक्टीरियल सेल लाइसिस41 के लिए जिम्मेदार देर से फेज जीन शामिल हैं। . हमने पाया कि एंटीबायोटिक प्रेरित सेल लाइसिस एसटीएक्स के साथ-साथ प्लाज्मिड प्रोटीन का पता लगाने के लिए कुछ फायदे हैं जिनमें एसओएस प्रमोटर (वर्तमान कार्य) हैं। निश्चित रूप से, मैकेनिकल सेल लाइसिस (जैसे, मनका-पिटाई) का भी उपयोग किया जा सकता है (हालांकि वर्तमान काम में उपयोग नहीं किया जाता है)। हालांकि, यांत्रिक लाइसिस के परिणामस्वरूप सभी बैक्टीरियल कोशिकाओं को लाइसेड किया जा रहा है (केवल प्रेरित कोशिकाएं नहीं) जिसके परिणामस्वरूप नमूना प्रचुर मात्रा में, अत्यधिक संरक्षित मेजबान प्रोटीन के साथ समृद्ध होता है जो एक बिना उल्लंघन वाले नमूने से फाज और प्लाज्मिड प्रोटीन का पता लगा सकता है और अधिक चुनौतीपूर्ण है।

एक जीवाणु तनाव के लिए एंटीबायोटिक सांद्रता एंटीबायोटिक प्रेरित प्रोटीन का पता चला के संबंध में आम तौर पर प्रजनन योग्य पाया गया । हमने एंटीबायोटिक-प्रेरित प्रोटीन के संबंध में सापेक्ष प्रोटीन बहुतायत में भिन्नता का उल्लेख किया। चूंकि हमारा विश्लेषण गुणात्मक (मात्रात्मक नहीं) है, इसलिए प्रोटीन बायोमार्कर बहुतायत को केवल पर्याप्त एमएस/एमएस विश्लेषण के लिए पर्याप्त होना चाहिए । एक ख्यात एसटीईसी तनाव पहले एंटीबायोटिक सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ सुसंस्कृत है (जैसे, ३०० एनजी/एमएल से २,००० एनजी/माइटोमाइसिन-सी के एमएल) इष्टतम एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए इस तरह कि यह बैक्टीरियल एसओएस प्रतिक्रिया को ट्रिगर करता है, जबकि अभी भी कटाई के लिए पर्याप्त बैक्टीरियल कोशिकाओं को प्रदान करता है । एसटीईसी स्ट्रेन RM7788 के लिए, हमने पाया कि पहचाने गए बायोमार्कर का पता लगाने के लिए इष्टतम एंटीबायोटिक एकाग्रता माइटोमाइसिन-सी के ४०० से ८०० एनजी/एमएल थी ।

प्रोटीन सीक्वेंस ट्रंकेशन के अलावा, ई कोलाई प्रोटीन में पीटीएम हो सकते हैं जिसमें द्रव्यमान, उदाहरण के लिए फॉस्फोरिलेशन, ग्लाइकोसिलेशन आदि को शामिल किया जाता है। चूंकि एमएस/एमएस मालडी द्वारा उत्पन्न अकेले चार्ज मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों (द्रव्यमान में 20 केडीए के तहत) के वियोजन के लिए पीएसडी का उपयोग करता है, अवशेष पक्ष श्रृंखलाओं से जुड़े ऐसे पीटीएम को फेसियल असंबद्ध हानि से गुजरना होगा क्योंकि पीएसडी एक एर्गोडिक विघटन तकनीक है । इस तरह के पीटीएम की उपस्थिति को एमएस/एमएस डेटा में मूल अग्रदूत आयन (पीटीएम के द्रव्यमान को घटाकर) के लिए द्रव्यमान में बंद एक खंड आयन की उपस्थिति से अनुमानित किया जा सकता है । हालांकि, न तो पीएसडी और न ही सॉफ्टवेयर यह पहचान पाएंगे कि ऐसे पीटीएम कहां से जुड़े हैं । इसके अलावा, सॉफ्टवेयर केवल पीबीसी के टुकड़े आयनों से प्रोटीन की पहचान कर सकता है और अवशेषों की साइड-चेन से जुड़े छोटे अणुओं (जैसे, पानी या अमोनिया) या पीटीएम के विघटनकारी नुकसान नहीं कर सकता है। हालांकि, अगर पीबीसी से टुकड़ा आयनों का पता चला रहे हैं, प्रोटीन अभी भी या तो प्रोटीन जन सहिष्णुता खिड़की को चौड़ा करने के लिए पीटीएम के द्रव्यमान को शामिल करने या बस संदिग्ध PTM के असंबद्ध नुकसान के अनुरूप प्रोटीन खंड आयन के द्रव्यमान में प्रवेश करके सॉफ्टवेयर का उपयोग कर की पहचान की जा सकती है । सॉफ्टवेयर द्वारा कोई भी पहचान पीटीएम के बिना प्रोटीन अनुक्रम की होगी। दिलचस्प बात यह है कि हमने अपने बैक्टीरियल वर्क में अब तक फॉस्फोरिलेशन, ग्लाइकोसिलेशन आदि वाले प्रोटीन का पता नहीं लगाया है । हालांकि, यह कारण हो सकता है: माल्दी द्वारा उनकी सापेक्ष बहुतायत, बड़े पैमाने पर रेंज का उपयोग किया जा रहा है: 2-20 केडीए, कि इस तरह के पीटीएमएस असामान्य रूप से प्रयोगशाला हो सकते हैं और माल्डी मैट्रिक्स के आवेदन से बच नहीं सकते हैं, या कि इस तरह के पीटीएम स्रोत से आयनों को त्वरित करने से पहले स्रोत में बहुत तेजी से विघटनकारी नुकसान से गुजर सकते हैं।

वर्तमान में, सॉफ्टवेयर में सिस्टीन एल्किलेशन शामिल नहीं है, और हमारे नमूना प्रोटोकॉल में सिस्टीन अवशेषों के लिए एक डिसल्फाइड कमी कदम शामिल नहीं है। प्रोटोकॉल को स्पष्ट किया गया है कि खोज को उनके ऑक्सीडाइज्ड राज्य में सिस्टीन अवशेषों के साथ संचालित किया जाना है, और यदि कोई पहचान प्राप्त नहीं की जाती है, तो उनके कम राज्य में सिस्टीन अवशेषों के साथ फिर से खोज को निष्पादित करने के लिए। यदि कोई पहचान फिर से नहीं पाए जाते हैं, तो ±2 या ±3 के लिए खंड आयन सहिष्णुता को चौड़ा करना साइस्टीन के साथ दृश्यों को मिलान करने की अनुमति देने वाले खंड आयन मिलान के लिए सीमा को कम करता है कि क्या वे अपने ऑक्सीकृत और/या कम राज्यों में मौजूद हैं ।

माल्डी-टीओएफ-टीओएफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण
ईएसआई और हाई-रेजोल्यूशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्लेटफॉर्म्स का इस्तेमाल करते हुए सबसे टॉप-डाउन प्रोटेओमिक एनालिसिस हासिल किया गया है । इसके विपरीत, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ प्लेटफार्मों का उपयोग करके कम टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण किया गया है। परिणामस्वरूप, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएस-पीएसडी द्वारा उत्पन्न और विश्लेषण किए गए अकेले चार्ज मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों के विश्लेषण के लिए बहुत कम टॉप-डाउन प्रोटेओमिक सॉफ्टवेयर है जो विखंडन15,42के लिए एस्पार्टिक एसिड प्रभाव का फायदा उठाते हैं। इसके कई कारण हैं । सबसे पहले, माल्डी की आयनीकरण दक्षता कम आणविक वजन पेप्टाइड्स और प्रोटीन की ओर पक्षपातपूर्ण है, और यह पूर्वाग्रह प्रोटीन के मिश्रण के साथ विशेष रूप से स्पष्ट है जैसा कि एक अकारण जीवाणु कोशिका lysate में पाया जाएगा। दूसरा, MALDI कम चार्ज राज्यों उत्पन्न करता है, और प्रोटीन आयन वियोजन की सुविधा के लिए कम या कोई Coulomb प्रतिकर्षण है । तीसरा, पीएसडी सीक्वेंस कवरेज अन्य तकनीकों ईसीडी7,ईटीडी7,यूवी-पीडी8आदि के विपरीत काफी सीमित है। चौथा, प्रोटीन आयन के बढ़ते द्रव्यमान के साथ पीएसडी की विखंडन दक्षता में गिरावट आती है। पांचवां, एर्गोडिक वियोजन तकनीक, जैसे पीएसडी, अवशेषों से जुड़े पीटीएम के फेसियल विघटनकारी नुकसान में परिणाम देते हैं, उदाहरण के लिए, फॉस्फोरिलेशन, ग्लाइकोसिलेशन, आदि, जिससे पीटीएम अटैचमेंट की साइट का निर्धारण करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इन गंभीर सीमाओं के बावजूद, माल्डी-टीओएफ-टीओएफ-एमएस/एमएस-पीएसडी का उपयोग करके ऊपर-नीचे विश्लेषण के स्पष्ट फायदे हैं, उदाहरण के लिए, नमूना तैयारी की सादगी, एलसी जुदाई की अनुपस्थिति, एमएस/एमएस द्वारा मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों का अलगाव, प्रीकरन आयनों के लिए खंड आयनों के रोपण की अनुमति, अनुक्रम truncation और इंट्रामोल्युलर डिस्फिलाइड बांड और सबसे महत्वपूर्ण गति विश्लेषण की सबसे महत्वपूर्ण गति के लिए खंड आयनों के रोपण की अनुमति । जब WGS डेटा से प्राप्त सिलिको प्रोटीन दृश्यों में संयुक्त, इस तकनीक को अंय अधिक समय लेने वाली और श्रम गहन विश्लेषण पूरा कर रहे है पहले तेजी से जानकारी प्रदान कर सकते हैं ।

प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर को इंटेलिज का उपयोग करके विकसित किया गया था और जावा में लिखा गया था ताकि बैक्टीरियल स्ट्रेन के डब्ल्यूजीएस से प्राप्त प्रोटीन अमीनो एसिड दृश्यों को कुशलतापूर्वक संसाधित और खोजा जा सके। सॉफ्टवेयर को पहले के एल्गोरिदम से संशोधित किया गया था जो एक्सेल33के भीतर मैक्रो के रूप में संचालित था। हमने इसे और अधिक उपयोगकर्ता के अनुकूल बनाने के साथ-साथ आगे सुधार प्रदान करने के लिए जीयूआई इंटरफेस के साथ सॉफ्टवेयर का एक स्टैंडअलोन संस्करण विकसित करने का फैसला किया।

प्रोटीन अनुक्रम ट्रंकेशन से जुड़े पीटीएमएस की स्थिति में, सॉफ्टवेयर क्रमिक रूप से एन-टर्मिनस से एक अमीनो एसिड अवशेषों को हटा देता है, जबकि जब तक कि बड़े पैमाने पर राशि प्राप्त नहीं होती या पता लगाया प्रोटीन बायोमार्कर के मापा द्रव्यमान से अधिक नहीं हो जाता, तब तक अनुक्रम के अवशेषों को जोड़ते हैं। यद्यपि इस प्रक्रिया के परिणामस्वरूप प्रोटीन द्रव्यमान के टुकड़ों की एक बहुत बड़ी संख्या (~ 5000 पूर्ण प्रोटीन दृश्यों से ~ 200,000) हो सकती है, लेकिन इसमें एन-टर्मिनस या सी-टर्मिनस (या दोनों) में ट्रंकेशन से किसी भी संभावित प्रोटीन टुकड़ों को छोड़कर नहीं होने का लाभ है, हालांकि इस तरह की ट्रंकेशन जैविक परिप्रेक्ष्य से हो सकती है। इस दृष्टिकोण को अप्रतिबंधित ट्रंकेशन के रूप में संदर्भित किया जाता है । हालांकि, ट्रंकेशन से जुड़े सबसे आम बैक्टीरियल पीटीएम एन-टर्मिनल मेथियोनाइन या एन-टर्मिनल सिग्नल पेप्टाइड को हटा रहे हैं। परिणामस्वरूप, सॉफ्टवेयर ऑपरेटर को एन-टर्मिनस से अवशेष ट्रंकेशन के लिए एक ऊपरी सीमा (50 अवशेष) का चयन करने की अनुमति देता है, जिसके परिणामस्वरूप प्रोटीन बायोमार्कर द्रव्यमान मानदंडों को पूरा करने वाले बहुत कम प्रोटीन टुकड़े होते हैं।

डी-और ई-अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड पर पीबीसी और पी-अवशेषों के एन-टर्मिनल साइड पर एस्पार्टिक एसिड प्रभाव तंत्र के अनुरूप हैं, जिसका प्रयोगात्मक और सैद्धांतिक रूपसे17, 18,19,20दोनों में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। एन-अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड पर पीबीसी को शामिल करना सॉफ्टवेयर में शामिल किया गया था क्योंकि एक एस्पार्टिक एसिड प्रभाव जैसे तंत्र के कारण हमारी प्रयोगशाला39,40में कई मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों के लिए मनाया गया है। एमएस/एमएस-पीएसडी द्वारा विश्लेषण किए गए अकेले चार्ज मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों के वियोजन से सबसे प्रचुर मात्रा में खंड आयन एस्पार्टिक एसिड प्रभाव विखंडन तंत्र के कारण होते हैं । ऑपरेटर एमएस/एमएस-पीएसडी डेटा से सबसे प्रमुख खंड आयनों का चयन करता है और सॉफ्टवेयर में उनके m/z में प्रवेश करता है और साथ ही एक संबद्ध खंड आयन सहिष्णुता (±m/z) । टुकड़ा आयन सहिष्णुता प्रत्येक टुकड़ा आयन के लिए समायोजित किया जा सकता है अपने सापेक्ष बहुतायत को प्रतिबिंबित करने के लिए । एक उपयुक्त खंड आयन सहिष्णुता ±1.0 से ±2.5 मीटर/z के बीच भिन्न हो सकती है जो पृष्ठभूमि रासायनिक शोर की तुलना में खंड आयन की पूर्ण बहुतायत के साथ-साथ इसकी सापेक्ष बहुतायत पर निर्भर करती है। आमतौर पर, अधिक प्रचुर मात्रा में एक टुकड़ा आयन, बेहतर अपनी द्रव्यमान सटीकता है, जो एक संकरा टुकड़ा आयन सहिष्णुता का इस्तेमाल करने की अनुमति देता है ।

मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों के एमएस/एमएस-पीएसडी डेटा उनकी जटिलता के मामले में नाटकीय रूप से भिन्न हो सकते हैं । कुछ एमएस/एमएस-पीएसडी स्पेक्ट्रा दूसरों की तुलना में अधिक आसानी से व्याख्या योग्य हैं । इस घटना के कई कारण हैं। सबसे पहले, प्रोटीन आयन विश्लेषण (~ 10-30 μs) के टाइमस्केल पर कुशलता से टुकड़ा नहीं हो सकता है क्योंकि यह माल्डी मैट्रिक्स समाधान में घुलनशीलता के बाद भी मुड़ा हुआ या आंशिक रूप से मुड़ा हुआ रहता है। दूसरा, पीबीसी के अलावा, मेटास्टेबल प्रोटीन आयन छोटे अणुओं, यानी अमोनिया (-17 दा) या पानी (-18 दा)15के विघटनकारी नुकसान से गुजर सकते हैं । स्पेक्ट्रल जटिलता के लिए एक महत्वपूर्ण योगदानकर्ता आर-अवशेषों की साइड-चेन33से अमोनिया का विघटनकारी नुकसान प्रतीत होता है। हमने प्रोटीन अनुक्रम में आर-अवशेषों की संख्या के साथ एमएस/एमएस-पीएसडी डेटा की स्पेक्ट्रल जटिलता में वृद्धि देखी है । नो-अवशेषों वाले प्रोटीन (याहओ प्रोटीन36 और कोल्ड-शॉक प्रोटीन सीएसपीसी33, 43),एक आर-अवशेष (कोल्ड-शॉक प्रोटीन सीएसपी33 और बी-सबयूनिट ऑफ स्टेक्स241),दो आर-अवशेषों (काल्पनिक प्रोटीन33)के साथ, एमएस/एमएस-पीएसडी स्पेक्ट्रा का उत्पादन करते हैं जो अपेक्षाकृत अपूर्ण और व्याख्या करने में आसान हैं। हालांकि, जब आर-अवशेषों की संख्या बढ़कर तीन (एचयू प्रोटीन44),या चार (सर्वव्यापी35और कोल्ड-शॉक प्रोटीन CsbD33, 43),स्पेक्ट्रल जटिलता काफी बढ़ जाती है। सॉफ्टवेयर एस्पपार्टिक एसिड प्रभाव तंत्र के लिए विशिष्ट अवशेषों पर पीबीसी से टुकड़ा आयनों की तुलना केवल के रूप में यह अकेले चार्ज मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों एमएस/एमएस-PSD द्वारा विश्लेषण का सबसे सुलभ वियोजन चैनल है । सॉफ्टवेयर में छोटे तटस्थ अणु (एस) के विघटनकारी नुकसान (या नुकसान) के परिणामस्वरूप खंड आयनों को शामिल नहीं किया गया है। परिणामस्वरूप, यह महत्वपूर्ण है कि ऑपरेटर टुकड़ा आयनों का चयन नहीं करता है जिसमें छोटे तटस्थ असंबद्ध नुकसान शामिल हैं। पीबीसी से खंड आयन आम तौर पर सबसे प्रमुख खंड आयन होते हैं; हालांकि, जब प्रोटीन में आर-अवशेषों की संख्या तीन या चार तक बढ़ जाती है, तो पीबीसी साइट पर सबसे प्रचुर मात्रा में टुकड़ा आयन एक हो सकता है जिसमें एक छोटा सा विघटनकारी नुकसान (या नुकसान) शामिल है। यदि खंड आयनों के ऐसे समूह (17 या 18 मीटर/जेड के गुणकों द्वारा अलग) का पता चला है, तो एक क्लस्टर के भीतर उच्चतम एम/जेड के साथ खंड आयन का टुकड़ा आयन खोज मापदंडों में प्रवेश किया जाना चाहिए ।

इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि सॉफ्टवेयर ऑपरेटर-फ्री प्रोटेओमिक पहचान के लिए डिजाइन नहीं किया गया था । ऑपरेटर को यह चुनना होगा कि एमएस/एमएस-पीएसडी डेटा से कौन से टुकड़े आयनों को खोज में शामिल किया जाना है । हालांकि, एमएस/एमएस-पीएसडी द्वारा एस्पार्टिक एसिड प्रभाव की पुष्टि करने वाले कई प्रयोगों के आधार पर, सबसे प्रमुख खंड आयन हमेशा डी-या ई-या एन-अवशेषों के सी-टर्मिनल पक्ष पर पीबीसी का परिणाम होते हैं । सॉफ्टवेयर की उपयोगिता यह है कि यह कई स्पष्ट रूप से गलत दृश्यों को समाप्त करता है और केवल कुछ संभावित उम्मीदवारों को पुनः प्राप्त करता है। कुछ उम्मीदवार अनुक्रमों को एक खंड आयन की अनुपस्थिति के आधार पर समाप्त किया जा सकता है जहां एक अनुक्रम में डी-अवशेष एक प्रमुख टुकड़ा आयन उत्पन्न करने की उम्मीद होगी। निरपवाद रूप से, डी-अवशेषों के परिणामस्वरूप पॉलीपेप्टाइड रीढ़ की हड्डी में प्रमुख टुकड़े होते हैं, सिवाय तब जब वे एन-या सी-टर्मिनी के कुछ अवशेषों के भीतर स्थित होते हैं जहां एस्पार्टिक एसिड प्रभाव की दक्षता36में गिरावट आती है।

अस्थायी प्रोटीन पहचान के लिए आवश्यक पीबीसी साइटों की न्यूनतम संख्या
एक CFIP दो समान प्रोटीन अग्रदूत आयनों से बनता है जो एक ही पीबीसी साइट पर अलग होता है लेकिन दरार साइट के विपरीत पक्षों पर उनका आयनीकरण प्रोटोन होता है। यद्यपि एक सीएफआईआईपी का उपयोग प्रोटीन बायोमार्कर के द्रव्यमान की अधिक सटीकता से गणना करने के लिए किया जा सकता है (खोज के दौरान प्रोटीन मास सहिष्णुता को कम करने की अनुमति देना), अनुक्रम-विशिष्ट पहचान के लिए इसकी उपयोगिता दो अलग-अलग क्लीवेज साइटों से गठित दो गैर-पूरक खंड आयनों की तुलना में कम उपयोगी है, जो अधिक पहचान विशिष्टता प्रदान करती है। जिस आसानी से दो एबी-आईएम प्रोटीन की पहचान की गई थी, उससे हमें हजारों प्रोटीन या प्रोटीन टुकड़ा अनुक्रमों से सही प्रोटीन अनुक्रम की अंतरिम रूप से पहचानने के लिए आवश्यक खंड आयनों की न्यूनतम संख्या के रूप में अटकलें लगाने के लिए प्रेरित किया गया । हमने जल्दी से निर्धारित किया है कि यह प्रति टुकड़े आयनों की संख्या नहीं थी, लेकिन गैर-पूरक टुकड़े आयनों की संख्या महत्वपूर्ण है क्योंकि प्रत्येक गैर-पूरक टुकड़ा आयन एक पीबीसी साइट का प्रतिनिधित्व करता है जबकि एक सीएफआईआईपी एक ही दरार साइट का प्रतिनिधित्व करता है। इस प्रकार, पहचान विशिष्टता पीबीसी साइटों की संख्या से प्राप्त की जाती है, न कि टुकड़े आयनों की संख्या का पता चला।

यह संभव है कि केवल तीन टुकड़े आयनों के साथ पहचान में सफलता बस आकस्मिक हो सकता है । इस परिकल्पना का परीक्षण करने और खंड आयनों के चयन में पूर्वाग्रह को खत्म करने के लिए, हमने सॉफ्टवेयर के भीतर एक बेंचमार्किंग मॉड्यूल बनाया जो बेतरतीब ढंग से पूरक और/या गैर-पूरक खंड आयनों के एक बड़े पूल से खंड आयनों का चयन करता है । बड़ा टुकड़ा आयन पूल 14 प्रमुख टुकड़ा चित्रा 3 (नीचे पैनल) उनके सापेक्ष बहुतायत के आधार पर पहचान आयनों से चुना गया था ।

टेस्टिंग प्रोटोकॉल इस प्रकार था। बाइनरी खोज का उपयोग करके, चित्रा 3 (बॉटम पैनल) (एम/जेड 1813.8, 2128.9, 3881.3, में 14 प्रमुख खंड आयनों के पूल से तीन टुकड़े आयनों को बेतरतीब ढंग से चुना गया था 4293.7, 5158.0, 6505.0, 6619.9, 6939.4, 7645.1, 7959.4, 8022.7, 8136.2, 8583.3, और 8961.5). डी-या ई-या एन-अवशेषों के सी-टर्मिनल साइड पर पीबीसी से सिलिको खंड आयनों के साथ-साथ डी और ई और ई और एन के संयोजन के साथ-साथ तीन खंड आयन पलटन की तुलना की गई थी । यह तुलना एक पलटन के प्रत्येक व्यक्ति के टुकड़े आयन के लिए, एक पलटन के तीन टुकड़े आयन जोड़े के लिए और एक पलटन के तीन टुकड़े आयन संयोजन के लिए किया गया था। एक तुलना के लिए एक मैच के रूप में गिना जा करने के लिए, एक जोड़ी के दोनों टुकड़ा आयनों और एक संयोजन के सभी तीन टुकड़े आयनों सिलिको टुकड़ा आयनों में मैच चाहिए । विश्लेषण के पूरा होने के बाद, एक और तीन टुकड़ा आयन पलटन बेतरतीब ढंग से चुना जाता है, और विश्लेषण दोहराया जाता है। खंड आयन चयन में दोहराव की अनुमति दी गई थी। के रूप में वहां ३६४ संभव संयोजन कर रहे है [(n!/r!) n-r)!] 14 खंड आयनों (एन) के एक पूल से तीन-खंड आयन पलटन (आर) में से, केवल 10 विश्लेषण किए गए जैसा कि S1Im3 (अनुपूरक सूचना) में दिखाया गया था।

तीन-खंड आयन पहचान आवश्यकता एक सामान्य घटना प्रतीत होती है जैसा कि टेबल 2-7, 9-10 (एस 1Im3)के कॉलम 3_ABC में दिखाया गया है। 3_ABC कॉलम में 1 के सभी मायने रखता है Im3 अनुक्रम (एन-टर्मिनल मेथियोनिन के बिना) के अनुरूप है। पहचान में एकमात्र विफलता इसलिए हुई क्योंकि एम/जेड 8136.2 पर टुकड़ा आयन (चित्र 3, नीचेपैनल में दिखाया गया है और तालिकाओं 1 और 8में ग्रे में प्रकाश डाला गया) विश्लेषण के लिए दर्ज खंड आयन सहिष्णुता (±1.5 m/z) से अधिक है । चूंकि परीक्षण एल्गोरिथ्म की आवश्यकता है कि एक तीन टुकड़ा आयन पलटन के सभी टुकड़ा आयनों मिलान किया जाना है, किसी भी समूह है कि m/z ८१३६.२ टुकड़ा आयन शामिल करने के लिए पहचान करने में विफल होगा/

S1Im3 में तालिका 6 से पता चलता है कि जब तीन टुकड़े आयनों में से दो पूरक हैं (पीले रंग में हाइलाइट किए गए), तो अधिक गलत दृश्यों ने मानदंडों का मिलान किया जब सभी तीन टुकड़े आयन गैर-पूरक थे। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ऐसा इसलिए है क्योंकि एक सीएफआईआईपी एक पीबीसी साइट से मेल खाता है, एक सीमा जो दो गैर-पूरक खंड आयनों का उपयोग करने की तुलना में सिलिको दृश्यों में कई और गलत द्वारा प्राप्य है जो दो पीबीसी साइटों के अनुरूप है, एक अधिक कठोर मापदंड।

इसी तरह का विश्लेषण चित्रा 4 (बॉटम पैनल) में दिखाए गए आईएम-बीएसी के छह प्रमुख खंड आयनों (एम/जेड 2675.4, 2904.5, 3076.2, 3853.5, 5657.5, और 5772.8) पर किया गया था। Im3 के विपरीत, Im-Bac कोई प्रत्यक्ष CFIP है, इसलिए छह टुकड़ा आयनों संभवतः छह पीबीसी साइटों के अनुरूप है । चूंकि छह खंड आयनों के पूल से चुने गए तीन-खंड आयन पलटन के 20 संभावित संयोजन हैं, इसलिए एस 2 आईएम-बीएसी (अनुपूरक सूचना) की तालिकाओं में दिखाए गए केवल 10 विश्लेषण किए गए। आईएम-बीएसी अनुक्रम को सभी विश्लेषणों में कॉलम 3_ABC में सभी तीन-खंड आयन समूहों के लिए सही ढंग से पहचाना/गिना गया था । चार विश्लेषणों में एक-दो गलत सीक्वेंस का भी मिलान किया गया। हालांकि, गलत दृश्यों की यह छोटी संख्या मैनुअल पुष्टि के लिए एक प्रबंधनीय संख्या है।

कुल मिलाकर, पूरक और/या गैर पूरक खंड आयनों कि दो या तीन पीबीसी साइटों के अनुरूप एक या दो उंमीदवार दृश्यों को पुनः प्राप्त करने के लिए पर्याप्त विशिष्टता प्रदान करने के लिए दिखाई देते हैं । बेशक, ऑपरेटर द्वारा चयनित खंड आयनों अपेक्षाकृत प्रचुर मात्रा में होना चाहिए और अच्छा एस/ एक ही पीबीसी साइट से एक या दो टुकड़े आयनों को ऑपरेटर द्वारा पुष्टि की जानी चाहिए कि गलत दृश्यों की एक असाध्य संख्या को पुनः प्राप्त करने से बचने के लिए पर्याप्त विशिष्टता प्रदान नहीं करता है । यह स्पष्ट नहीं है कि दो या तीन पीबीसी साइटें पर्याप्त क्यों हैं, लेकिन एक भी पीबीसी साइट जाहिरा तौर पर पर्याप्त विशिष्ट नहीं है। हालांकि अप्रतिबंधित ट्रंकेशन के परिणामस्वरूप प्रोटीन द्रव्यमान मानदंडों को पूरा करने वाले ~ 200,000 प्रोटीन और प्रोटीन टुकड़ा अनुक्रमों में परिणाम होता है, लेकिन यह संभव है कि साइट/अवशेष-विशिष्ट प्रकृति दरार साइटों की, यानी डी-ई-, और एन-अवशेषों की सी-टर्मिनल साइड, टुकड़ा आयन तुलना के दौरान संभावित दृश्यों को कम करने में योगदान देती है। यह भाग में, बैक्टीरियल प्रोटीन दृश्यों में डी-, ई-और एन-अवशेषों की आवृत्ति के साथ-साथ बैक्टीरिया के प्रोटेओम में प्रोटीन दृश्यों में उनके अद्वितीय स्थानों के कारण हो सकता है। अम्लीय अवशेष प्रोटीन संरचना और विलायक बातचीत में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। परिणामस्वरूप, प्राथमिक अनुक्रम में उनकी आवृत्ति और स्थान महत्वपूर्ण हैं यदि प्रोटीन फ़ंक्शन के लिए अद्वितीय नहीं हैं और समझा सकते हैं कि सैकड़ों हजारों गलत दृश्यों के बीच केवल कुछ पीबीसी साइटें ही सही प्रोटीन अनुक्रम की अस्थायी रूप से पहचान करने के लिए आवश्यक क्यों हैं।

गैस चरण रसायन विज्ञान के नजरिए से, डी-, ई-और एन-अवशेषों का महत्व एक वियोजन चैनल में उनकी भागीदारी से उपजा है जो एमएल्डी द्वारा उत्पन्न मेटास्टेबल प्रोटीन आयनों की कम आंतरिक ऊर्जा पर सुलभ है और पीएसडी20द्वारा क्षय है। PSD द्वारा आणविक आयन विखंडन के अपेक्षाकृत लंबे टाइमस्केल (~ 10-30 माइक्रोन) का मतलब है कि प्रोटीन आयन की आंतरिक ऊर्जा आणविक आयन की सभी कंपन और घूर्णन डिग्री-स्वतंत्रता के बीच यादृच्छिक है जैसे कि वियोजन एर्गोडिक और सांख्यिकीय है। यह भी बताया जाना चाहिए कि एस्पार्टिक एसिड प्रभाव के तंत्र में आणविक आयन पुनर्व्यवस्था शामिल है जो कई परमाणुओं को शामिल करने वाले चरणों या एक ठोस कदम से होती है जब तक कि अनुकूल ज्यामिति प्राप्त नहीं हो जाती है जो पीबीसी17 , 18,19के सक्रियण बाधा को कम करता है ।

एक एसटीईसी तनाव द्वारा उत्पादित दो प्लाज्मिड-एन्कोडेड एंटीबैक्टीरियल इम्युनिटी प्रोटीन की पहचान एंटीबायोटिक इंडक्शन, माल्डी-टीओएफ-एमएस/एमएस-पीएसडी और टॉप-डाउन प्रोटेओमिक विश्लेषण से जुड़े प्रोटोकॉल का उपयोग करके की गई थी । इन प्रोटीनों की पहचान इन-हाउस विकसित सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की गई थी जिसमें प्रोटीन के मापा गया द्रव्यमान और एस्पार्टिक एसिड प्रभाव के परिणामस्वरूप गठित अनुक्रम-विशिष्ट खंड आयनों की अपेक्षाकृत कम संख्या को शामिल किया गया था। सॉफ्टवेयर एमएस और एमएस/एमएस डेटा की तुलना सिलिको प्रोटीन और प्रोटीन टुकड़ा दृश्यों में WGS डेटा से प्राप्त करने के लिए । हालांकि सॉफ्टवेयर पहचान मैट्रिक्स या स्कोरिंग प्रदान नहीं करता है, यह गलत दृश्यों का एक बहुत ही उच्च प्रतिशत समाप्त जिसके परिणामस्वरूप उम्मीदवार दृश्यों (एक या दो) की एक बहुत कम संख्या है कि आसानी से मैनुअल निरीक्षण द्वारा पुष्टि की जा सकती है । अंत में, इस बैक्टीरियल स्ट्रेन के डब्ल्यूजीएस डेटा के मैनुअल निरीक्षण से एबी और आईएम जीन के एक प्रमोटर (एसओएस बॉक्स) अपस्ट्रीम को प्लाज्मिड जीनोम में पता चला, जो डीएनए-हानिकारक एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में आने के कारण इन जीनों की अभिव्यक्ति को तर्कसंगत बनाता है ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

प्रोटीन बायोमार्कर साधक सॉफ्टवेयर clifton.fagerquist@usda.gov में क्लिफ्टन के Fagerquist से संपर्क करके स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है (कोई कीमत पर) । हम एआरएस, यूएसडीए, क्रिस ग्रांट द्वारा इस शोध के समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं: 2030-42000-051-00-डी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4000 Series Explorer software AB Sciex Version 3.5.3
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer AB Sciex
Acetonitrile Optima LC/MS grade Fisher Chemical A996-1
BSL-2 biohazard cabinet The Baker Company SG403A-HE
Cytochrome-C Sigma C2867-10MG
Data Explorer software AB Sciex Version 4.9
Focus Protein Reduction-Alkylation kit G-Biosciences 786-231
GPMAW software Lighthouse Data Version 10.0
Incubator VWR 9120973
LB Agar Invitrogen 22700-025
Luria Broth Invitrogen 12795-027
Lysozyme Sigma L4919-1G
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring Fisher Scientific 02-681-343
MiniSpin Plus Centrifuge Eppendorf 22620207
Mitomycin-C (from streptomyces) Sigma-Aldrich M0440-5MG
Myoglobin Sigma M5696-100MG
Shaker MaxQ 420HP Model 420 Thermo Scientific Model 420
Sinapinic acid Thermo Scientific 1861580
Sterile 1 uL loops Fisher Scientific 22-363-595
Thioredoxin (E. coli, recombinant) Sigma T0910-1MG
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich 299537-100G
Water Optima LC/MS grade Fisher Chemical W6-4

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रसायन विज्ञान अंक 171
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Fagerquist, C. K., Rojas, E. Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis. J. Vis. Exp. (171), e62577, doi:10.3791/62577 (2021).

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