Summary
在这里,我们提出了一种方案,用于使用MALDI-TOF-TOF串联质谱和自上而下的蛋白质组学分析以及内部开发的软件快速鉴定基因组测序的致病细菌产生的蛋白质。亚稳态蛋白离子片段由于天冬氨酸效应和这种特异性被用于蛋白质鉴定。
Abstract
该协议鉴定了杀菌酶的免疫蛋白:大肠杆菌E3和细菌素,由使用抗生素诱导的致病性 大肠杆菌 菌株产生,并通过MALDI-TOF-TOF串联质谱和自上而下的蛋白质组学分析与内部开发的软件进行鉴定。通过天冬氨酸效应片段化机理,从天冬氨酸、谷氨酸和天冬酰胺残基C端多肽骨链裂解(PBC)产生的突出的b型和/或y型片段离子中鉴定出绞增素E3(Im3)的免疫蛋白和细菌素(Im-Bac)的免疫蛋白。该软件可快速扫描来自细菌菌株全基因组测序的 硅 质蛋白质序列。该软件还可以在成熟蛋白质序列被截断的情况下迭代删除蛋白质序列的氨基酸残基。单个蛋白质序列具有与每种免疫蛋白检测到的离子一致的质量和片段离子。然后手动检查候选序列,以确认可以分配所有检测到的片段离子。Im3的N端蛋氨酸被翻译后去除,而Im-Bac具有完整的序列。此外,我们发现只有两到三个由PBC形成的非互补片段离子是鉴定正确蛋白质序列所必需的。最后,在细菌菌株的质粒基因组中鉴定出抗菌和免疫基因的上游的启动子(SOS盒)。
Introduction
通过质谱法分析和鉴定未消化的蛋白质被称为自上而下的蛋白质组学分析1,2,3,4。它现在是一种成熟的技术,利用电喷雾电离(ESI)5和高分辨率质量分析仪6,以及复杂的解离技术,例如电子转移解离(ETD),电子捕获解离(ECD)7,紫外线光解离(UV-PD)8等。
另一种软电离技术是基质辅助激光解吸/电离(MALDI)9,10,11,该技术在自上而下分析中的应用较少,部分原因是它主要耦合到飞行时间(TOF)质量分析仪,与其他质量分析仪相比,其分辨率有限。尽管存在这些局限性,但MALDI-TOF和MALDI-TOF-TOF仪器已被用于纯蛋白质以及蛋白质的分馏和普通混合物的快速自上而下分析。对于纯蛋白质的鉴定,源内衰变(ISD)是一种特别有用的技术,因为它允许对ISD片段离子进行质谱(MS)分析,以及蛋白质离子片段的串联质谱(MS / MS),提供通常来自靶蛋白的N-和C-末端的序列特异性片段,类似于Edman测序12,13 .ISD方法的缺点是,与Edman测序一样,样品必须只包含一种蛋白质。一种蛋白质要求是由于需要明确地将片段离子归因于前体离子。如果样品中存在两种或多种蛋白质,则可能很难分配哪些片段离子属于哪些前体离子。
片段离子/前体离子归属可以使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS来解决。与任何经典的MS / MS实验一样,前体离子在碎片化之前被质量选择/分离,检测到的碎片离子可以归因于特定的前体离子。然而,可用于这种方法的解离技术主要限于高能碰撞诱导的解离(HE-CID)14或后源衰变(PSD)15,16。HE-CID和PSD在片段化肽和小蛋白质方面最有效,并且在某些情况下,序列覆盖率可能受到限制。此外,PSD导致多肽骨架裂解(PBC)主要在天冬氨酸和谷氨酸残基的C端侧通过称为天冬氨酸效应的现象17,18,19,20。
MALDI-TOF-MS在微生物分类鉴定中也发现了一个利基应用:细菌21,真菌22和病毒23。例如,MS光谱用于通过使用模式识别算法进行比较的已知细菌的MS光谱参考库来识别未知细菌。这种方法因其速度和简单性而证明非常成功,尽管需要过夜培养分离物。通过这种方法检测到的蛋白质离子(通常低于20 kDa)包括MS指纹,允许在属和物种水平上进行分类分辨率,在某些情况下在亚种24和菌株水平25,26上进行分类分辨率。然而,不仅需要从分类学上对潜在的致病微生物进行分类,还需要确定特定的毒力因子、毒素和抗菌素耐药性(AMR)因子。为了实现这一点,肽,蛋白质或小分子的质量通过MS测量,然后通过MS / MS分离和片段化。
致病细菌通常携带称为质粒的圆形DNA片段。质粒和前噬细胞是细菌之间水平基因转移的主要载体,负责抗菌素耐药性和其他毒力因子在细菌中的快速传播。质粒也可能携带抗菌(AB)基因,例如大肠杆菌素和细菌素。当这些基因被表达并且蛋白质分泌时,它们的作用是禁用占据相同环境生态位的相邻细菌的蛋白质翻译机制27。然而,这些杀菌酶也会对产生它们的宿主构成风险。因此,宿主共表达一个基因,该基因特异性地抑制AB酶的功能,被称为其免疫蛋白(Im)。
破坏DNA的抗生素如丝裂霉素-C和环丙沙星通常用于诱导产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)的SOS反应,其志贺毒素基因(stx)存在于细菌基因组中存在的原噬菌体基因组中28。我们以前使用抗生素诱导,MALDI-TOF-TOF-MS / MS和自上而下的蛋白质组学分析来检测和鉴定STEC菌株29,30,31,32产生的Stx类型和亚型。在之前的工作中,STEC O113:H21菌株RM7788在补充丝裂霉素-C的琼脂培养基上培养过夜。然而,不是在m / z〜7816处检测到Stx2a的预期B亚基,而是在m /z〜7839处检测到不同的蛋白质离子,并将其鉴定为具有未知功能的质粒编码的假设蛋白质33。在目前的工作中,我们鉴定了两种质粒编码的AB-Im蛋白,这些质粒编码的AB-Im蛋白使用抗生素诱导,MALDI-TOF-TOF-MS / MS和自上而下的蛋白质组学分析,使用开发的独立软件处理和扫描来自全基因组测序(WGS)的硅质蛋白序列。此外,该软件还包含了涉及序列截断的翻译后修改(PTM)的可能性。使用该软件从天冬氨酸效应引起的成熟蛋白离子和PBC序列特异性片段离子的测量质量中鉴定免疫蛋白,并通过MS / MS-PSD检测。最后,在质粒基因组中AB / Im基因的上游鉴定出一种启动子,当该菌株暴露于DNA损伤抗生素时,该启动子可以解释这些基因的表达。这项工作的部分内容在美国国家化学学会2020年秋季虚拟会议和博览会(2020年8月17日至20日)上发表34。
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Protocol
1. 微生物样品制备
- 使用无菌的1μL环将25 mL Luria肉汤(LB)接种在50 mL锥形管中,其中含有 大肠杆菌 O113:H21菌株RM7788(或其他细菌菌株)。盖上管子并在37°C下振荡(200rpm)预培养4小时。
- 等分100μL预培养的肉汤,并铺展到补充有400或800ng / mL丝裂霉素-C的LB琼脂平板上。将琼脂平板在37°C的培养箱中静态过夜。
注意:STEC菌株是致病微生物。在BSL-2生物安全柜中执行除培养之外的所有微生物操作。 - 使用无菌的1μL环从单个可见菌落中收获细菌细胞,并转移到含有300μLHPLC级水的2.0mL O环衬里螺旋盖微量离心管中。盖上管子,短暂涡旋,并以11,337×g离心2分钟以沉淀细胞。
2. 质谱
- 将0.75μL等分试样的样品上清液点到不锈钢MALDI靶标上,并使其干燥。用0.75μL等分试样在33%乙腈,67%水和0.2%三氟乙酸中的芥那酸饱和溶液覆盖干燥的样品斑点。让斑点干燥。
- 使用MALDI-TOF-TOF质谱仪分析干燥的样品斑点。
- 将MALDI靶标加载到质谱仪中后,单击采集软件中的MS线性模式采集按钮。通过在采集方法软件中将下限和上限(例如,2 kDa 至 20 kDa)的 m/z 输入要分析的范围。
- 单击要在软件中的MALDI目标模板上进行分析的样品点。然后,按下鼠标左键并将鼠标光标拖到样品点上,以指定要采样以进行激光烧蚀/电离的矩形区域。松开鼠标按钮,采集将启动。为每个样品点收集1,000张激光照。
注:数据采集在软件采集窗口中实时显示。 - 如果未检测到离子,请通过调整软件中"激光强度"下的滑动比例尺来增加激光强度,直到检测到蛋白质离子信号。这称为阈值。
注意:在样品点分析之前,使用m/ z跨越被分析范围的蛋白质校准剂以MS线性模式对仪器进行外部校准,例如,蛋白质校准剂的+1和+2电荷态:细胞色素-C,溶菌酶和肌红蛋白覆盖2 kDa至20 kDa的质量范围。指定质量范围内的中间质量用作焦点质量,例如9 kDa。聚焦质量是其m/ z被最佳聚焦的离子,以便由线性模式检测器进行检测。 - MS线性模式采集完成后,单击采集软件中的MS/MS反射管模式采集按钮。在"前体质量"字段中输入要分析 的前体质量 。接下来,在前 体质量窗口中输入前体质量窗口 的低质量侧和高质量侧的隔离宽度(以Da为单位),例如±100 Da。
- 单击 "CID 关闭" 按钮。单击 "亚稳压抑制器 ON" 按钮。通过调整软件中"激光强度"下的 滑动比例尺 ,将 激光强度 调整到其最大值的至少 90%。
- 单击要在软件中的MALDI目标模板上进行分析的样品点。然后按下鼠标左键并将鼠标光标拖到样品点上,以指定要采样以进行激光烧蚀/电离的矩形区域。松开鼠标按钮,采集将启动。为每个样品点收集10,000张激光照。
注意:在样品点分析之前,仪器应使用烷基化硫氧还蛋白35的+1电荷状态的后源衰变(PSD)片段离子在MS / MS反射管模式下进行外部校准。
- 不要处理原始 MS 数据。按指定顺序使用以下步骤序列处理 MS/MS-PSD 原始数据:高级基线校正(32,0.5,0.0),然后是噪声消除(两个标准差),然后是高斯平滑(31 点)。
- 手动检查MS / MS-PSD数据是否存在PBC19,20产生的突出片段离子。
- 根据片段离子的绝对和相对丰度及其信噪比(S/N)评估MS/MS数据。仅使用最丰富的片段离子进行蛋白质鉴定,特别是当MS / MS-PSD数据有噪声时。
3.在计算机 中蛋白质数据库的构建
- 生成一个文本文件,其中包含细菌菌株 的硅质 蛋白质序列,该文本文件将由蛋白质生物标志物搜索软件进行扫描以进行蛋白质鉴定。蛋白质序列来自被分析菌株(或密切相关的菌株)的全基因组测序(WGS)。
- 访问NCBI / PubMed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)网站,下载正在分析的特定细菌菌株(例如,大肠 杆菌O113:H21菌株RM7788)的约5,000个蛋白质序列。最大下载大小为 200 个序列。
- 因此,将 25 个下载内容复制并粘贴到单个文本文件中。选择每次下载的 FASTA(文本)格式。
4. 操作蛋白质生物标志物寻求者软件
- 双击 蛋白质生物标志物搜索可 执行文件。将出现一个图形用户界面(GUI)窗口(图1,顶部面板)。
- 将蛋白质生物标志物的质量(在MS线性模式下测量)输入 成熟蛋白质质量 字段。接下来,在" 质量公差" 字段中输入质量测量误差。对于10,000 Da蛋白,标准质量测量误差为±10 Da。
- 或者,单击互补 b/y 离子蛋白质质量计算器 按钮,以便从假定的互补片段离子对(CFIP 或 b/y)计算蛋白质质量。将出现一个弹出窗口,蛋白质质量计算器工具(图1,底部面板)。
- 输入假定 CFIP 的 m/z, 然后单击 添加对 按钮。将出现计算出的蛋白质质量。
- 将此数字复制并粘贴到 "成熟蛋白质质量" 字段中,然后关闭 "蛋白质质量计算器工具 "窗口。
- 通过单击"设置残基限制"框选择N 端信号肽长度。将出现一个带有滑动刻度和光标的弹出窗口。将光标移动到所需的信号肽长度(最大50)。如果未选择信号肽长度,则软件将执行无限制的序列截断。
- 在 GUI 中的 片段离子条件下 ,选择多肽主链切割 (PBC) 的残基。单击一个或多个残留物的框:D、E、N 和/或 P。
- 单击" 输入要搜索的片段离子 (+1)" 按钮。将出现一个弹出 的片段页面 。接下来,单击" 添加片段离子 "按钮,该按钮对应于要输入的片段离子数,即每个片段离子单击一次。对于要输入的每个片段,将出现一个下拉字段。
- 输入片段离子的 m/z 及其相关的 m/z 容差。完成后,单击" 保存并关闭 "按钮。
注:合理的 m/z 公差为 ±1.5。 - 选择必须匹配以进行标识的最小片段离子数,方法是滚动到" 需要匹配多少个片段离子"右侧框中的所需数量。
注意:三个匹配项应该足够了。 - 通过单击相应的圆圈选择要处于氧化状态的半胱氨酸残基。如果在搜索后未发现蛋白质鉴定,则用处于还原状态的半胱氨酸重复搜索。如果搜索后未发现任何鉴定,请将片段离子耐受性扩大到±3,然后重复搜索。
- 在 "文件设置"下,单击 "选择FASTA文件" 按钮浏览并选择FASTA(文本)文件,该文件包含先前在实验方案步骤3.1至3.2中构建的细菌菌株的 硅 蛋白序列。然后选择输出文件夹并创建输出文件名。
- 单击" 对文件条目运行搜索 "按钮。将出现一个名为 "确认搜索参数 "的弹出窗口(图1,底部面板),在启动搜索之前显示搜索参数。
- 如果搜索参数正确,请单击" 开始搜索 "按钮。如果搜索参数不正确,请单击" 取消" 按钮,然后重新输入正确的参数。启动搜索后,参数窗口将关闭,并出现一个带有进度条的新弹出窗口(图1,底部面板),显示搜索进度和找到的标识数量的运行计数。
- 完成搜索后(几秒钟),进度条将自动关闭,搜索摘要将显示在 GUI 的"日志"字段中(图 2,顶部面板)。此外,还将出现一个新的弹出窗口,显示蛋白质鉴定(如果有的话)(图2,底部面板)。
注意:在具有不可识别残基 的硅藻 蛋白质序列中,例如U或X,会自动从分析中跳过,并且随后通过单独的弹出窗口报告这些序列,以提醒操作员在完成搜索后跳过了哪些(如果有)序列。
5. 蛋白质序列的搜索后确认
- 通过手动分析确认候选序列的正确性。
注意:蛋白质生物标志物搜索软件的目的是通过从考虑中消除许多明显不正确的蛋白质序列并将序列截断作为成熟蛋白质中可能的PTM来识别高精度的蛋白质序列。由于返回的可能候选序列的数量很少,因此可以管理手动确认。 - 使用任何具有这种功能的质谱或蛋白质组学软件生成候选序列的b型和y型片段离子的平均m / z表。比较D-,E-和N-残基(以及P-残基的N端侧)的硅质片段离子的平均m / z与MS / MS-PSD数据 中 突出片段离子的m / z。
注意:最突出的 MS/MS-PSD 片段离子应容易与 硅片离子中的 D-、E 和 N-相关。然而,天冬氨酸效应片段化机制在蛋白质序列36的N-或C-末端附近效率较低。
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Representative Results
图3(顶图)显示了在补充400ng / mL丝裂霉素-C的LBA上培养过夜的STEC O113:H21菌株RM7788的MS。m / z 7276,7337和7841处的峰先前已被鉴定为冷休克蛋白C(CspC),冷休克蛋白E(CspE)和功能未知的质粒传播蛋白,分别为33。通过MS / MS-PSD分析m / z 9780 [M + H]+ 处的蛋白质离子, 如图3 所示(底部面板)。前体离子用定时离子选择器(TIS)窗口±100 Da分离,碎片离子通过其m / z和类型/编号进行鉴定。m/z 2675.9处的片段离子(用星号突出显示)是从 图3 所示的m/z 9655处的亚稳态蛋白离子解离溢出的(顶部面板)。每个片段离子的理论平均m / z显示在括号中,基于上面所示的绞痛素E3免疫蛋白(Im3)序列的PBC。PBC的位点用红色星号突出显示,并产生相应的片段离子。N端蛋氨酸带有下划线,表示它在成熟蛋白质中被翻译后去除。该序列具有单个半胱氨酸残基(盒装),因此被认为是其还原状态。
使用蛋白质生物标志物的质量和一些突出 的非互补 片段离子:m / z 1813.8,2128.9和4293.7(±1.5耐受性)(图1,底图)并将PBC限制在D和E残基的C端侧,软件仅报告了一个候选序列:Im3蛋白质序列(不含其N端蛋氨酸)(图2,底部面板)。在选择片段离子进行搜索时,应该强调的是,任何一组非互补片段离子都假设将组中任何两个片段离子的m / z相加(并减去两个质子)会导致质量总和不在生物标志物质量和相关的质量耐受性(±10 Da)之内。RM7788的WGS草案揭示了5008个蛋白质序列(开放阅读框)37。在这约5,000个完整的蛋白质序列中,189,490个完整的和部分序列(无限制截断)符合生物标志物质量标准(图2,顶部面板)。那些通过质量标准的序列然后在D和/或E残基的C端侧进行 计算机 PBC。然后将生成的片段离子与观察到的输入片段离子进行比较。该软件报告的候选序列仅基于其质量和三个D和/或E特异性PBC站点。如此少量的信息所达到的特殊性将在下一节中讨论。
如图3(下图)所示,最丰富的片段离子是PBC在C端侧的D-和E-残基通过天冬氨酸效应破碎机理19、20的结果。观测到两个CFIP:b67/y17 (m/z 7645.1 / m/z 2128.9)和b70/y 14 (m/z 7959.4 / m/z 1813.8)。这些CFIP可用于更准确地计算蛋白质前体离子的质量,使用简单的公式:b(m / z)+ y(m / z) - 2H+ = 蛋白质质量(Da)33。使用两个CFIP,我们得到蛋白质的平均质量:9771.6 Da,这比MS线性模式下蛋白质离子的测量质量更接近其理论值9772.5 Da:9779 Da(图3,顶图)。只有少数CFIP被检测到,因为大多数具有电离质子的前体离子被隔离在唯一的精氨酸残基:R80上。与赖氨酸残基(K)(221.8千卡/摩尔38)相比,精氨酸的气相碱度更高(237.0千卡/摩尔38)可能是电离质子在唯一R-残留物上优先封存的原因。
图4( 顶图)显示了在补充800ng / mL丝裂霉素-C的LBA上培养过夜的STEC O113:H21菌株RM7788的MS。 图4( 顶图)与 图3( 顶图)非常相似,尽管由于所利用的抗生素浓度的差异,某些蛋白质离子的相对丰度存在差异。蛋白质生物标志物m / z也有轻微的变化,反映了仪器在不同日期的外部校准的差异。同样,m/ z 7272,7335和7838处的蛋白质离子分别是CspC,CspE和质粒传播的蛋白质。此外,我们在m/ z 9778处检测到Im3蛋白离子(尽管丰度低于 图3),以及m / z 9651 [M + H]+处的蛋白质离子。 图4( 下图)显示了蛋白质前体离子在m/z 9651处的MS/MS-PSD。使用较窄且不对称的TIS窗口-75/+60 Da分离前体离子,以消除相邻蛋白质离子在m / z 9539和9778处的贡献。片段离子通过其m / z和类型/数量来识别。细菌素(Im-Bac)的免疫蛋白的序列如上所示。PBC的位点用红色星号突出显示,并带有相应的片段离子。每个片段离子的理论平均m / z也显示在光谱中的括号中。Im-Bac序列还具有单个半胱氨酸残基(盒装),因此被认为是其还原状态。
使用蛋白质生物标志物质量,三个突出的非互补片段离子:m / z 2675.4,3853.5和5772.8(±1.50耐受性),并将PBC限制为仅D-和/或E-和/或天冬酰胺(N)残基的C端侧,软件仅报告了一个候选序列:Im-Bac蛋白。在扫描了符合生物标志物质量和耐受性(±10 Da)标准的191,375个完整或部分序列后检索候选序列。软件仅根据其质量以及三个D和/或E和/或N特异性PBC位点来识别候选序列。
图4(底图)中最突出的片段离子再次是PBC在D和/或E残基的C端侧以及P残基20之一的N端侧的结果。我们还观察到PBC在C端侧的N-残基,这也很可能通过天冬氨酸效应样破碎机制发生39,40。蛋白质前体离子信号的弱点导致可解释的片段离子数量有限。片段离子m/z的精度随片段离子丰度而下降。没有检测到CFIP,可能是因为电离质子被隔离在蛋白质离子序列的唯一精氨酸残基(R74)上。所有片段离子都含有R74残基,符合这一假设。
抗菌免疫基因的启动子
图5显示了来自全基因组鸟枪测序的6482 bp重叠群00100的一部分大肠杆菌菌株RM7788(GenBank:NWVS01000096.1)。绞痛素E3,其免疫蛋白(Im3),细菌素的免疫蛋白(Im-Bac)和裂解蛋白的编码区域以黄色突出显示。绞痛素E3基因编码区的上游是-35区,Pribnow盒(PB),SOS盒的倒置重复,Shine-Dalgarno/核糖体结合位点(SD /RBS)27。在绞痛素E3和Im3之间有一个九个碱基对基因间区域。LexA(一种抑制蛋白和一种自身肽酶)与SOS盒结合,阻断下游基因的表达。在DNA损伤(例如,紫外线辐射或DNA损伤抗生素)时,LexA经历自裂,允许下游27,28的基因表达。因此,这两种免疫蛋白的表达与该菌株暴露于DNA损伤抗生素一致。
图1:蛋白质生物标志物搜索软件的屏幕截图。 顶部面板:蛋白质生物标志物搜索软件的图形用户界面(GUI)。底部面板:蛋白质质量计算器工具,片段页面,确认搜索参数和搜索进度条的弹出窗口。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:使用蛋白质生物标志物搜索软件进行蛋白质鉴定的搜索结果。 顶部面板:软件 GUI 的"日志"字段中显示的搜索结果摘要。底部面板:一个弹出窗口,显示使用软件进行蛋白质鉴定。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:STEC O113:H21应变RM7788的质谱分析。 上图:STEC O113:H21菌株RM7788的MS在补充400 ng / mL丝裂霉素-C的LBA上培养过夜。底板:蛋白质前体离子的MS/MS-PSD,m/z 9780(上图)。前体离子用TIS窗口±100 Da分离,碎片离子通过其m / z和离子类型进行鉴定。显示了绞痛素E3(Im3)的免疫蛋白序列。基本残留物(可能电荷封存的地点)以蓝色突出显示。PBC用红色星号突出显示,并生成相应的片段离子。每个片段离子的理论平均值m/ z显示在括号中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4:STEC O113:H21应变RM7788的质谱分析。 顶图:STEC O113:H21菌株MSRM7788在补充800 ng / mL丝裂霉素-C的LBA上培养过夜。底部面板:蛋白质前体离子的MS/MS-PSD,位于m/z 9651(顶部面板)。前体离子在前驱体离子的低m/z侧用不对称TIS窗口-75,在前驱体离子的高m/z侧用+60分离。片段离子通过其m / z和离子类型来识别。显示了细菌素(Im-Bac)的免疫蛋白的序列。基本残留物(可能电荷封存的地点)以蓝色突出显示。PBC用红色星号突出显示,并生成相应的片段离子。每个片段离子的理论平均值m/ z显示在括号中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图5:大肠杆菌O113:H21菌株RM7788携带的质粒基因组切片的分析。大肠杆菌O113:H21菌株RM7788(GenBank:NWVS01000096.1)的6482 bp重叠群00100的一部分来自全基因组鸟枪测序37。请点击此处查看此图的放大版本。
补充文件 1 (S1 Im3): 使用Im3的选定片段离子对软件进行基准测试的结果(来自 图3,底部面板)。 请点击此处下载此文件。
补充文件 2 (S2 ImBac): 使用Im-Bac的选定片段离子对软件进行基准测试的结果(来自 图4,底部面板)。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
协议注意事项
当前方案的主要优势是其速度,样品制备的简单性以及使用相对易于操作,训练和维护的仪器。尽管通过液相色谱-ESI-HR-MS进行的自下而上和自上而下的蛋白质组学分析无处不在,并且在许多方面远远优于MALDI-TOF-TOF自上而下的蛋白质组学分析,但它们需要更多的时间,劳动力和专业知识。仪器的复杂性通常会影响某些仪器平台是否有可能被未接受过质谱学正式培训的科学家采用。MALDI-TOF-TOF的自上而下方法旨在将MALDI-TOF-MS的分析扩展到临床微生物实验室中用于细菌分类鉴定的当前用途之外,同时不会显着增加分析所需的劳动力,复杂性或专业知识。
该协议不采用任何机械(或电气)细胞裂解步骤。虽然可以使用该协议检测分泌或细胞外蛋白,但该方法的早期版本首先被开发用于检测来自STEC菌株的志贺毒素(Stx),其中抗生素诱导触发细菌SOS反应,导致噬菌体基因的表达,包括 stx 以及负责细菌细胞裂解的晚期噬菌体基因41.我们发现抗生素诱导的细胞裂解对于检测Stx以及具有SOS启动子的质粒蛋白具有一定的优势(目前的工作)。当然,也可以使用机械细胞裂解(例如,磁珠跳动)(尽管在当前工作中没有使用)。然而,机械裂解导致所有细菌细胞(不仅仅是诱导细胞)被裂解,导致样品富含丰富,高度保守的宿主蛋白,这使得从普通样品中检测噬菌体和质粒蛋白更具挑战性。
发现细菌菌株的抗生素浓度相对于检测到的抗生素诱导的蛋白质通常是可重复的。我们注意到相对于检测到的抗生素诱导的蛋白质的相对蛋白质丰度的变化。由于我们的分析是定性的(非定量的),蛋白质生物标志物的丰度只需要足以进行充分的MS / MS分析。首先培养一系列抗生素浓度(例如,300 ng/mL 至 2,000 ng/mL 丝裂霉素-C)的推测 STEC 菌株,以确定最佳浓度,使其触发细菌 SOS 反应,同时仍提供足够的细菌细胞用于收获。对于STEC菌株RM7788,我们发现用于检测所鉴定的生物标志物的最佳抗生素浓度为400至800ng / mL丝裂霉素-C。
除了蛋白质序列截断外, 大肠杆菌 蛋白质还可以具有涉及添加质量的PTM,例如磷酸化,糖基化等。由于MS / MS利用PSD解离由MALDI产生的单电荷亚稳态蛋白离子(质量低于20 kDa),因此这种附着在残留侧链上的PTM可能会经历简单的解离损失,因为PSD是一种遍历解离技术。这种PTM的存在可以从MS / MS数据中质量接近原始前体离子(减去PTM的质量)的片段离子的外观推断出来。但是,PSD和软件都无法确定这些PTM的连接位置。此外,该软件只能从PBC的片段离子中鉴定蛋白质,而不能分离小分子(例如,水或氨)或PTMs附着在残基侧链上的损失。然而,如果检测到来自PBC的片段离子,仍然可以使用软件通过扩大蛋白质质量耐受性窗口以包括PTM的质量或简单地输入对应于可疑PTM解离损失的蛋白质片段离子的质量来鉴定蛋白质。软件的任何鉴定都将是没有PTM的蛋白质序列。有趣的是,到目前为止,我们还没有在我们的细菌工作中检测到具有磷酸化,糖基化等的蛋白质。然而,这可能是由于:它们被MALDI的相对丰度,使用的质量范围:2-20 kDa,这种PTM可能异常不稳定,可能无法在MALDI基质的应用中存活下来,或者这种PTM可能在离子从源加速之前在源中经历非常快速的解离损失。
目前,该软件不包括半胱氨酸烷基化,我们的样品方案不包括半胱氨酸残基的二硫化物还原步骤。该协议已被澄清,以表明搜索将使用处于氧化状态的半胱氨酸残基进行操作,如果没有获得鉴定,则使用处于还原状态的半胱氨酸残基再次执行搜索。如果没有再次发现鉴定,将片段离子耐受性扩大到±2或±3会降低片段离子匹配的阈值,从而允许与半胱氨酸的序列相匹配,无论它们是否以氧化和/或还原状态存在。
通过 MALDI-TOF-TOF 质谱进行自上而下的蛋白质组学分析
大多数自上而下的蛋白质组学分析都是使用ESI和高分辨率质谱平台实现的。相比之下,使用MALDI-TOF-TOF平台进行的自上而下的蛋白质组学分析较少。因此,很少有自上而下的蛋白质组学软件用于分析由MALDI-TOF-TOF-MS/ MS-PSD产生和分析的单电荷亚稳态蛋白质离子,这些离子利用天冬氨酸效应进行片段化15,42。造成这种情况的原因有很多。首先,MALDI的电离效率偏向于较低分子量的肽和蛋白质,这种偏倚在蛋白质混合物中尤其明显,就像在普通细菌细胞裂解物中发现的那样。其次,MALDI产生低电荷态,并且几乎没有或没有库仑斥力以促进蛋白质离子解离。第三,与其他技术ECD 7、ETD7、UV-PD8等不同,PSD序列的覆盖率非常有限。第四,PSD的碎裂效率随着蛋白离子质量的增加而下降。第五,遍历解离技术,如PSD,往往会导致附着在残基上的PTM的简单解离丧失,例如磷酸化,糖基化等,使得确定PTM附着的部位具有挑战性。尽管存在这些严重的局限性,但使用MALDI-TOF-TOF-MS/MS-PSD进行自上而下的分析具有明显的优势,例如,样品制备简单,没有LC分离,通过MS / MS分离亚稳态蛋白离子,允许将片段离子归因于前体离子,鉴定涉及序列截断和分子内二硫键的PTM,最重要的是分析速度。当与来自WGS数据的计算机蛋白序列结合使用时,该技术可以在完成其他更耗时和劳动密集型的分析之前提供快速信息。
蛋白质生物标志物寻求者软件是使用IntelliJ开发的,并用Java编写,以有效地处理和搜索来自细菌菌株WGS的蛋白质氨基酸序列。该软件是从早期的算法修改而来的,该算法在Excel33中作为宏运行。我们决定开发一个带有GUI界面的软件的独立版本,以使其更加用户友好,并提供进一步的改进。
在涉及蛋白质序列截断的PTM的情况下,软件依次从N端去除氨基酸残基,同时迭代添加序列的残基,直到质量和达到或超过检测到的蛋白质生物标志物的测量质量。虽然这个过程可以导致非常大量的蛋白质质量片段(从~5000个完整的蛋白质序列中产生约200,000个),但它的优点是不会从N端或C端(或两者)的截断中排除任何潜在的蛋白质片段,无论从生物学角度来看,这种截断可能是不可能的。这种方法称为无限制截断。然而,涉及截断的最常见细菌PTM是去除N端蛋氨酸或N端信号肽。因此,该软件还允许操作员从N端选择残基截断的上限(50个残基),从而产生更少的符合蛋白质生物标志物质量标准的蛋白质片段。
PBC在D-和E-残基的C端侧以及P-残基的N端侧与天冬氨酸效应机理一致,这在实验和理论上都得到了广泛的研究17,18,19,20。在N-残基的C端侧包含PBC被包括在软件中,因为在我们的实验室中已经观察到许多亚稳态蛋白质离子的天冬氨酸效应样机制39,40。通过MS / MS-PSD分析的单电荷亚稳蛋白离子解离中最丰富的片段离子是由于天冬氨酸效应片段化机制。操作员从 MS/MS-PSD 数据中选择最突出的片段离子,并将其 m/z 以及相关的片段离子容差 (±m/z) 输入到软件中。可以调整每个片段离子的片段离子耐受性,以反映其相对丰度。适当的片段离子耐受性可能在±1.0至±2.5 m/z之间变化,具体取决于片段离子的绝对丰度以及与背景化学噪声相比的相对丰度。通常,片段离子越丰富,其质量精度越高,从而允许使用较窄的片段离子容差。
亚稳态蛋白离子的MS / MS-PSD数据在其复杂性方面可能有很大差异。一些MS / MS-PSD光谱比其他光谱更容易解释。造成这种现象的原因有多种。首先,蛋白质离子可能无法在分析的时间尺度上有效碎裂(〜10-30μs),可能是因为它即使在MALDI基质溶液中溶解后仍保持折叠或部分折叠。其次,除PBC外,亚稳态蛋白离子还可以经历小分子的解离损失,即氨(-17 Da)或水(-18Da)15。光谱复杂性的一个重要因素似乎是氨从R-残基33的侧链中分离损失。我们观察到MS / MS-PSD数据的光谱复杂性随着蛋白质序列中R-残基的数量而增加。没有R残基的蛋白质(YahO蛋白36和冷休克蛋白CspC33,43),具有一个R残基(冷休克蛋白CspE33和Stx241的B亚基),具有两个R残基(假设蛋白33),产生相对简单且易于解释的MS / MS-PSD光谱。然而,当R-残基的数量增加到三个(HU蛋白44)或四个(泛素35和冷休克蛋白CsbD 33,43)时,光谱复杂性显着增加。该软件将来自PBC的片段离子与天冬氨酸效应机制特异性残基进行比较,因为这是MS / MS-PSD分析的单电荷亚稳态蛋白离子最容易获得的解离通道。该软件不包括由中性小分子的解离损失(或损失)引起的片段离子。因此,重要的是,操作员不要选择包含小中性解离损耗的片段离子。来自PBC的片段离子通常是最突出的片段离子;然而,当蛋白质中的R-残基数量增加到三个或四个时,PBC位点最丰富的片段离子可能是包括小的解离损失(或损失)的片段离子。如果检测到这样的片段离子簇(以17或18 m/ z的倍数分隔),则簇中具有最高m / z的片段离子应该是输入到片段离子搜索参数中的片段离子。
应该强调的是,该软件不是为无操作员的蛋白质组学识别而设计的。操作员必须选择将 MS/MS-PSD 数据中的哪些片段离子包含在搜索中。然而,基于许多实验证实了MS / MS-PSD对天冬氨酸的影响,最突出的片段离子始终是PBC在D-或E-或N-残基的C端侧的结果。该软件的效用在于它消除了许多明显不正确的序列,并且只检索了几个可能的候选序列。一些候选序列可能因没有片段离子而被消除,其中序列中的D-残基有望产生突出的片段离子。D-残基总是导致整个多肽主链中突出的片段离子, 除非 它们位于N-或C-末端的几个残基内,其中天冬氨酸效应的效率下降36。
暂定蛋白鉴定所需的PBC位点的最小数量
CFIP由两个相同的蛋白质前体离子形成,它们在同一PBC位点解离,但其电离质子位于切割位点的相对侧。尽管CFIP可用于更准确地计算蛋白质生物标志物的质量(允许在搜索过程中缩小蛋白质质量耐受性),但其对序列特异性鉴定的效用不如由两个不同裂解位点形成的两个非互补片段离子有用,后者提供更高的鉴定特异性。两种AB-Im蛋白被鉴定的容易程度使我们推测出从数千种蛋白质或蛋白质片段序列中初步鉴定正确蛋白质序列所需的最小片段离子数量。我们很快确定,重要的不是片段离子本身的数量,而是非互补片段离子的数量,因为每个非互补片段离子代表一个PBC位点,而CFIP代表相同的裂解位点。因此,鉴定特异性来自检测到的PBC位点的数量,而不是片段离子的数量。
仅鉴定三个片段离子的成功可能只是偶然的。为了验证这一假设并消除片段离子选择中的偏差,我们在软件中创建了一个基准测试模块,该模块从更大的互补和/或非互补片段离子池中随机选择片段离子。较大的碎片离子池是根据其相对丰度从 图3( 底部图)中鉴定的14个突出碎片离子中选择的。
测试协议如下。使用二进制搜索,从 图 3(底部面板)(m/ z 1813.8,2128.9,3881.3,4293.7,5158.0,6505.0,6619.9,6939.4,7645.1,7959.4,8022.7,8136.2,8583.3和8961.5)中随机选择三个片段离子。将三片段离子队列与来自PBC的C端的D-或E-或N-残基以及D&E和D&E&N的组合的 硅 片离子进行比较。对队列的每个片段离子,队列的三个片段离子对和队列的三个片段离子组合进行这种比较。为了将比较计为匹配,一对的片段离子和组合的所有三个片段离子必须匹配 到硅质 片段离子中。分析完成后,随机选择另一个三片段离子队列,并重复分析。允许片段离子选择中的重复。由于有 364 种可能的组合 [(n!/r!(n-r)!]在来自14个片段离子(n)池的三片段离子队列(r)中,仅进行了10次分析,如 S1Im3 所示(补充信息)。
三片段离子鉴定要求似乎是一种普遍现象,如表2-7,9-10(S1Im3)第3_ABC列所示。 3_ABC列中所有计数1对应于Im3序列(不含N端蛋氨酸)。唯一的鉴定失败是因为m/z 8136.2处的片段离子(如图3所示,底部面板,并在表1和表8中以灰色突出显示)超过了为分析输入的片段离子容差(±1.5 m/z)。由于测试算法要求匹配三片段离子队列中的所有片段离子,因此任何包含m / z 8136.2片段离子的组都无法识别/计数正确的蛋白质序列。
S1Im3中的表6显示,当三个片段离子中的两个互补(以黄色突出显示)时,与所有三个片段离子非互补时观察到的序列相比,与标准匹配的不正确序列更多。如前所述,这是因为CFIP对应于单个PBC位点,与使用对应于两个PBC位点的两个非互补片段离子相比,在计算机序列中有更多的不正确可以达到这个阈值,这是一个更严格的标准。
对Im-Bac的六个突出的片段离子(m / z 2675.4,2904.5,3076.2,3853.5,5657.5和5772.8)进行了类似的分析,如图4所示(底板)。与Im3不同,Im-Bac没有可识别的CFIP,因此六个片段离子可能对应于六个PBC位点。由于从六个片段离子池中选择了20种可能的三片段离子队列组合,因此仅进行了10次分析,如S2 Im-Bac(补充信息)表中所示。在所有分析中,正确鉴定/计数了柱3_ABC中所有三个片段离子组的Im-Bac序列。在四项分析中,还匹配了一个或两个不正确的序列。但是,这少量不正确的序列是手动确认的可管理数字。
总体而言,对应于两个或三个PBC位点的互补和/或非互补片段离子似乎提供了足够的特异性来检索一个或两个候选序列。当然,操作者选择的片段离子应相对丰富,并具有良好的S/N。来自单个PBC位点的一个或两个片段离子不能提供足够的特异性,以避免检索到必须由操作员确认的不可行的不正确序列数量。目前尚不清楚为什么两个或三个PBC站点就足够了,但单个PBC站点显然不够具体。虽然无限制的截断导致约200,000个符合蛋白质质量标准的蛋白质和蛋白质片段序列,但切割位点的位点/残基特异性性质,即D-,E-和N-残基的C端侧,可能有助于片段离子比较期间可能序列的急剧变窄。这可能部分是由于细菌蛋白质序列中D-,E-和N-残基的频率以及它们在细菌蛋白质组中蛋白质序列中的独特位置。酸性残基在蛋白质结构和溶剂相互作用中起着关键作用。因此,它们在原代序列中的频率和位置对于蛋白质功能至关重要,如果不是唯一的,并且可以解释为什么只需要几个PBC位点来暂时识别数十万个不正确序列中的正确蛋白质序列。
从气相化学的角度来看,D-,E-和N-残基的重要性源于它们参与解离通道,该通道可在MALDI产生的单电荷亚稳态蛋白离子的低内部能量下获得,并通过PSD20衰变。PSD分子离子片段化的相对较长的时间尺度(~10-30 μs)意味着蛋白质离子的内部能量在分子离子的所有振动和旋转自由度之间随机化,使得解离是遍历和统计的。还应该指出的是,天冬氨酸效应的机制涉及分子离子重排,该重排由一系列步骤或涉及多个原子的单个协同步骤发生,直到达到有利的几何形状,降低PBC17,18,19的活化势垒。
使用涉及抗生素诱导,MALDI-TOF-TOF-MS / MS-PSD和自上而下的蛋白质组学分析的方案鉴定了由STEC菌株产生的两种质粒编码的抗菌免疫蛋白。这些蛋白质是使用内部开发的软件鉴定的,该软件结合了蛋白质的测量质量以及由于天冬氨酸效应而形成的相对较少的序列特异性片段离子。该软件将MS和MS / MS数据与来自WGS数据的 硅 蛋白和蛋白质片段序列进行比较。虽然该软件不提供识别指标或评分,但它消除了非常高比例的错误序列,导致非常少量的候选序列(一个或两个),可以通过手动检查轻松确认。最后,对这种细菌菌株的WGS数据的手动检查揭示了质粒基因组中AB和Im基因上游的启动子(SOS盒),这使得由于暴露于DNA损伤抗生素而使这些基因的表达合理化。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
蛋白质生物标志物搜索软件可通过联系 clifton.fagerquist@usda.gov 的Clifton K. Fagerquist免费获得(免费)。我们希望感谢ARS,USDA,CRIS拨款:2030-42000-051-00-D对这项研究的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
Incubator | VWR | 9120973 | |
LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
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