ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
タンパク質およびアミン含有リガンドは、シアニル化試薬によって活性化される多糖類に共有結合することができ、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロゴウ酸塩(CDAP)、共有タンパク質(リガンド)多糖結合体を形成する。本稿では、制御されたCDAP活性化を0°Cで行い、pHを変化させ、活性化多糖の後で結合を行うための改良されたプロトコルについて説明します。
Abstract
共役ワクチンは、ワクチン接種の顕著な進歩である。多糖類共役ワクチンの調製のために、多糖類は便利に機能し、1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジン四フルオロプロ酸(CDAP)を使用してワクチンキャリアタンパク質に結合することができ、容易に扱いやすいシアニル化試薬である。CDAPは、pH 7-9で炭水化物ヒドロキシル基と反応することにより、多糖類を活性化します。CDAPの安定性と反応性は、pHに依存します。反応のpHはまたCDAPの加水分解による活性化の間に減少し、再現性活性化への鍵を制御する良好なpHを作る。元のCDAP活性化プロトコルは、非バッファpH 9ソリューションで室温で実行されました。
この条件下での迅速な反応(<3分)とそれに伴う高速PH低下により、迅速にCDAP加水分解から、短時間で目標反応pHを迅速に調整し、維持することは困難でした。ここで説明する改良されたプロトコルは、CDAP加水分解を遅くし、活性化時間を3分から〜15分に延長する0°Cで行われます。ジメチルアミノピリジン(DMAP)は、CDAP試薬を添加する前に、標的活性化pHに多糖溶液を事前調整するバッファーとしても使用された。より長い反応時間は、遅いCDAP加水分解とDMAPバッファの使用と相まって、活性化プロセスの全期間の活性化pHを維持することが容易になります。強化されたプロトコルにより、アクティベーションプロセスは、より熱狂的で、再現性が高く、スケールアップに適しています。
Introduction
コンジュゲートワクチンは、担体タンパク質に共有結合する多糖類からなるような、空態学1,2における顕著な進歩の一つである。多糖類は、T細胞非依存性抗原として、乳児の免疫原性が低く、抗体3の記憶、クラス切り替え、または親和性成熟を誘発しない。これらの欠点は、多糖共役ワクチン4で克服される。ほとんどの多糖類は、結合のための便利な化学ハンドルを持っていないため、まず反応性または「活性化」する必要があります。活性化された多糖は、次にタンパク質(または修飾タンパク質)と直接結合されるか、または共役前に追加の誘導体化のために機能化される4。ほとんどのライセンスを受けた多糖コンジュゲートワクチンは、還元的アミノ化またはシアニル化のいずれかを使用して多糖ヒドロキシルを活性化します。シアン臭化物(CNBr)は、クロマトグラフィー樹脂を活性化するために使用されていた試薬で、当初は多糖誘導体化に使用されていました。しかし、CNBrは高いpHを必要とし、典型的には~pH10.5以上、シアノ基を攻撃するのに十分な有核性となるように多糖ヒドロキシルを部分的に脱プロトネイトする。高pHは、塩基性不安定多糖に有害であり、また、CNBrも最初に形成された活性シアノエステルも、このような高pHで十分に安定していない。
CDAP (1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロボレート;図1)は、多糖類5,6の活性化のためのシアニル化剤として使用するためにLeesらによって導入された。結晶性で取り扱いが容易なCDAPは、CNBrよりも低いpHで多糖類を活性化し、副反応が少ないことが判明した。CNBrとは異なり、CDAP活性化多糖類はタンパク質に直接結合することができ、合成プロセスを簡素化します。CDAP活性化多糖類は、ジアミン(例えば、ヘキサンジアミン)またはジヒドラジド(例えば、アジピックジヒドラジド、ADH)で機能し、アミノ酸またはヒドラジド誘導体多糖を作製することができる。高濃度のホモ機能性試薬は、多糖類の架橋を抑制するために使用される。アミノ多糖は、タンパク質の結合に使用される無数の技術のいずれかを使用して共役することができます。ヒドラジド誘導体化多糖は、カルボジイミド試薬を用いてタンパク質に結合することが多い(例えば、1-エチル-3-(3-ジメチルプロピル)カルジギミド(EDAC))7.CDAP多糖活性化のさらなる最適化は、Leesらら 8によって説明されており、ここで説明するプロトコルに組み込まれている。
CDAP の活用の概要
CDAPプロトコルは、(1)多糖の活性化と(2)タンパク質またはリガンドによる活性化多糖の結合の2つの相として概念化することができる(図2)。第1のステップの目的は、多糖を効率的に活性化し、第2の目標は活性化多糖に効率的に共役することです。活性化された多糖は、2つのステップを結び合わせます。この概念化は、各ステップの重要な要素に焦点を当てるのに役立ちます。 図2 は、この概念化を展開し、所望の活性化反応およびカップリング反応を、加水分解反応および副反応と共に示す。
活性化段階の間、3つの主要な懸念事項は、CDAP安定性、CDAP反応と多糖ヒドロキシル、および活性化多糖類の安定性である(図3)。CDAP加水分解は、活性化多糖類および副反応の加水分解と同様に、pHとともに増加する。しかし、CDAPと多糖との反応は、pHを増加させることによって促進される。CDAPで多糖類を効率的に活性化するには、1)多糖とCDAPの反応性と2)試薬と活性化多糖の両方の加水分解および副反応とのバランスが必要です。
Leesらら 5で記述された元のCDAP活性化プロトコルでは、非バッファpH9溶液中で多糖のCDAP活性化が室温で行われた。この条件下では、活性化の速度が速く、活性化は3分以内に完了するであろう。この反応はまた、CDAPの急速な加水分解を伴い、非バッファ化反応溶液の急速なpH低下を引き起こした。このような短い時間枠で、迅速に反応pHを目標値に維持することは困難であった。記載されたプロトコルにおいて、活性化は、100mg/mLストック溶液から非バッファ化多糖溶液にCDAPを添加することによって行われた。pHを30s後に「0.2Mトリエチルアミンの等量」で引き上げた。次に、共役するタンパク質を、活性化反応に2.5分後に添加した。特に、活性化段階のpHは十分に制御されておらず、当初は標的pHを上回った可能性が最も高い。迅速なpH調整を必要とする速い反応により、活性化プロセスの制御が困難になり、スケールアップが困難になりました。
元のプロトコルとは対照的に、ここで説明する変更されたプロトコルには、2 つの大きな改良があります。まず、多糖溶液のpHは、CDAPを添加する前に、DMAPをバッファとして用いて、標的活性化pHに事前調整される。DMAPはpKaが9.5であり、従ってpH 9の周りに良好なバッファリング力を有し、そして他の多くのバッファとは異なり、DMAPはCDAP加水分解8を促進するために見つからなかった。さらに、DMAPは既にプロセス中間プロセスであるため、反応混合物に新しい成分を追加しません。CDAPを追加する前にpHを事前調整することで、反応開始時の大きなpHスイングが排除され、反応中のターゲットpHのメンテナンスがより効率的になります。第2の改善は、CDAP加水分解の速度が室温でのそれよりも著しく遅い0°Cで活性化反応を行うことである。0°Cで試薬の半減期が長くなると、活性化時間が3分から15分に増加し、より低い温度での遅い活性化速度を補います。反応時間が長いほど、反応pHを維持しやすくなります。また、0°Cの使用により、pH感受性多糖類の分解が遅くなり、このタイプの多糖類のコンジュゲートを調製することが可能になります。プロトコルの改良により、アクティベーションプロセスの熱狂性が低下し、制御しやすく、再現性が高まり、スケールアップが容易になりました。
本稿では、0°Cで、指定された標的pHで制御されたCDAP活性化を実施し、ADHで活性化された多糖のその後の誘導体化を行うための改良されたプロトコルについて説明する。また、トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)アッセイは、Qi et9の方法に基づいて、改変多糖に対するヒドラジドレベルの測定に関するものである。レゾルシノールおよび硫酸10に基づくヘキソスに対する修飾アッセイも記載されており、これはより広い範囲の多糖類を決定するために使用することができる。CDAPの活性化と活用の詳細については、読者は、Leesらによる以前の出版物5、6、8を参照する。
Protocol
注:多糖の活性化と機能化手順を実行する前に、多糖溶液、ADH溶液、DMAP溶液、およびCDAPストック溶液を事前に準備してください。ソリューションと機器を、整理された、便利で論理的な場所に配置します。記載された反応は、10mgの多糖類について、スケールアップまたはスケールダウンすることができる。スケールアップする前に、プロトコルを小規模で評価することをお勧めします。
1. 5 mg/mL 多糖液を調製し、2 mL.
- 凍結乾燥した多糖類
- 多糖類容器を開封前に室温に戻します。分析バランスを使用してスクリューキャップチューブ内の多糖10mgを計量します。粉末のサンプリングと正確な計量を容易にする静的エリミネーターを使用してください。
- チューブに0.15M塩化ナトリウム(NaCl)の2mLを加えた後、多糖を溶解します。キャップと渦管。
メモ:塩化ナトリウムはCDAP反応に影響を与えませんが、多糖類の二次構造に影響を与える可能性があります。いくつかの多糖類は、異なる塩濃度でより可溶性です。 - 多糖の分子量に応じて、エンドオーバーエンド回転でチューブを12〜24時間混合し、多糖類を完全に水和できるようにします。必要に応じて、チューブを静かに温めて可溶化を促進します。
- 緩衝溶液中の可溶化多糖
注: 効率的な CDAP 活性化のために、多糖溶液は、任意のバッファー、特にリン酸イオンを含んではなりません。バッファーを水または生理液に置き換え、多糖濃度を 5 mg/mL に調整するには、以下の手順に従ってください。- 適切な分子量カットオフ(MWCO)の4mLまたは15mL遠心スピンフィルター装置を得る。
注:MWCOは、多糖類の分子量の5〜10倍の小さいのが理想的です。 - フィルター挿入物に、〜20mgの多糖を含む緩衝多糖液の体積を加える。水または生理液で完全なマークに記入します。フィルターをしっかりとキャップします。エンドオーバーエンドで数回混ぜます。
- メーカーが提案した遠心力でフィルター装置を遠心分離する。遠心時間が各スピン後に少なくとも5倍の体積減少を達成するのに十分な長さであることを確認してください。フロースルーを破棄します。フィルタデバイスを再構成します。
- フィルター挿入物を全面に淡水または生理液で補充します。フィルターをしっかりとキャップします。エンドオーバーエンドの回転でフィルタ内の内容を混ぜ合わせる〜10回、または穏やかな渦によって。スピンを繰り返します。
注:多糖は、遠心装置のフィルター挿入物の底部に蓄積し、ゲルを形成することができます。次のスピンの前に、フィルター挿入物の内側に保持を新しい補充で再混合することをお勧めします。 - リフィルとスピンサイクルを最低3回繰り返します。
- フィルター挿入物から多糖の保持を回復するには、以下の手順に従います。
- 水または生理液をフィルター挿入物に加え、体積が約1 mLになるようにします。上下にピペットを入れるか、穏やかな渦巻きで混ぜます。
- 混合リテンタントのすべてを5 mLチューブに移します。フィルター挿入物に1mLの淡水または生理焼香を加えます。上下にピペットを入れるか、穏やかな渦によってフィルターをすすいでください。すべてのリンスを回収した多糖と移動し、組み合わせます。
- 多糖濃度を決定する(セクション7.3の多糖アッセイを参照)。追加の水または生理食塩水で多糖を5mg/mLに希釈します。
- 適切な分子量カットオフ(MWCO)の4mLまたは15mL遠心スピンフィルター装置を得る。
- 多糖液を調製したら、多糖液を含むチューブを氷バケツに冷やします。
2. 0.5 Mアジピン酸ジヒドラジド(ADH)溶液10 mLを調製する。
- 分析バランスで0.87 g ADHの重量を量り、0.1 M HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸)の8 mLで可溶化し、pH 8.
- 1 M水酸化ナトリウム(NaOH)で目標pHに調整し、pHメーターで監視します。バッファーを追加して 10 mL に持ち込み、pH を再確認します。
3. 2.5 M DMAP溶液、10 mLを準備します。
注:DMAPは有毒であり、皮膚に浸透します。手順を実行する際にはニトリル手袋を着用してください。
- 慎重に50 mL円錐管にDMAPの3gを重量を量る。DMAPに5mlの水を加え、5分間ボルテックスで混ぜて、濁った溶液(〜7mL)を得る。
- 混合中に、DMAP溶液に50μLの10N塩酸(HCl)を加えます。各追加の間に混ぜます。ソリューションが明確になったら追加を停止します。
- DMAPソリューションを~pH 8に持ち込むには、25 μL単位で10 N NaOHを追加します。
- DMAP溶液を水で10 mLにし、2.5M溶液を提供します。
- 2.5 M DMAP ソリューションの pH を微調整します。
注:DMAP溶液pHは濃度とイオン強度によって変化します。この練習では、2.5 M DMAP ストックを特定の pH に微調整し、10 個の多糖と混合すると、結果として得られる溶液が活性化のためにターゲット pH に近いようにします。- 1 mLの水またはNaCl溶液を含む一連の1.5 mLチューブを調製し、多糖溶液の調製に使用したいずれかのものを調製します。氷の上でチューブを冷やします。
- 冷却チューブにDMAPを100μL加えます。渦を、pHメーターでpHを測定します。その後、測定したチューブを廃棄します。
- 測定されたpHが目標値に近くない場合は、DMAPストックのpHを1 M NaOHまたはHClで適宜調整します。測定されたpHが目標pHに近づくまで、ステップ3.5.2と3.5.3を繰り返します。
4. 100 mg/mL CDAP ストック溶液を準備する
注:CDAP粉末は、密閉し、-20°Cで保存し、開く前に室温に来るようにしてください。手順を実行する際にはニトリル手袋を着用してください。
- 分析バランスに1.5 mLスナップキャップマイクロ遠心チューブを引き締まります。小さなへらを使用して、チューブにCDAPの10〜140mgを計量します。CDAP の実際の重量に注意してください。
- 100 mg/mL CDAP を調製するのに必要なアセトニトリルの容量を決定します。ヒュームフードでアセトニトリルを開きます。
- 適切なボリュームパイプを使用して、アセトニトリルを描画して放出し、ピペットチップの蒸気を平衡化します。数秒後にピペットチップから溶媒が滴り落ちるのを待ち、CDAPチューブに直接移す準備をしてください。計算されたアセトニトリルの体積を引き出し、CDAPチューブに直接移します。キャップを閉じます。
注:アセトニトリルは、ハミルトンシリンジまたは適切なサイズの同等のものを使用してCDAPチューブに転送することもできます。 - 完全にCDAPを可溶化する渦。CDAP チューブをアイスバケツに入れる。
注:CDAPは寒さの中でアセトニトリルで安定しています。可溶性在庫は、1週間>-20°Cに保つ場合があります。しかし、新鮮なCDAP溶液を調製することが好ましい。
5. 多糖の活性化とヒドラジドの機能化
- 次のすべての項目が準備ができていて、活性化を開始する前に氷上で冷やされた溶液を確認してください:5 mg/mL多糖溶液の2 mLを、攪拌棒を含む平底の広口容器に入れ、磁気スターラーの上に置きます。100 mg/mL CDAP ストック溶液;2.5 M DMAPストックソリューション。6 mm直径プローブなどの半マイクロpHプローブを備えたpHメーターで、メーカーの指示に従って0°Cのキャリブレーションを行います。100 μL のパイプを使用する準備ができています。タイマーがクリアされ、使用する準備ができています。オートチレーターディスペンサーヘッド位置または10 μLピペットを使用する準備ができています。0.5 M ADHソリューション。
- DMAPを使用して、多糖類のpHをターゲットpHに事前調整します。
- pHプローブを多糖液中に入れ、活性化手順全体を通して溶液中に残します。
- DMAPストック溶液の200 μLを攪拌下で滴下添加して多糖液に移します。溶液のpHを標的活性化pHに調整する。0.1 M HCl を加え、pH を下げ、0.1 M NaOH を加え、pH を増加させます。0.1 pH単位以上で目標pHを超えないようにし、活性化の間、氷水浴中で反応を冷やしてください。
- CDAP のアクティブ化
- ピペットチップの蒸気を平衡化するために、100 μL CDAPを上下にピペットします。100 μL の CDAP を攪拌しながら多糖液に移します。
注:この活性化は、開始比として1mgの多糖に対して1mgのCDAPを使用します。この比率は、アクティブ化を最適化する際に増減できます。 - タイマーを開始し、アクティブ化全体の間に pH の変更を監視します。オートチレーターディスペンサー(またはピペット)の助けを借りて、0.1 M NaOHの10 μL増分を速やかに加えることによって、ターゲットpHでの反応を維持します。
注:pHプローブで軽くかき混ぜるpH応答時間を短縮するのに役立ちます。pHは最初はより急速に低下し、より頻繁に0.1 M NaOHを加える必要があるかもしれません。反応が進むにつれて、pHが低下し、添加頻度が低くなる。pHは、pH 9の活性化のために10〜15分の最適な活性化時間に近づくと、本質的に変化しないはずです。
- ピペットチップの蒸気を平衡化するために、100 μL CDAPを上下にピペットします。100 μL の CDAP を攪拌しながら多糖液に移します。
- ADH 機能化
- 最適な活性化時間に達したら、撹拌下で活性化多糖に0.5M ADHの2mLを一度に加えます。pH が目標範囲 (ADH の場合は pH 8-9) であることを確認します。
注:迅速な混合で1つの追加は、活性化多糖と反応するジヒドラジドの両端の確率を最小限に抑え、多糖の架橋を防止します。 - 反応混合物を少なくとも1時間撹拌し続ける。反応混合物を4°Cに移すが、0〜20°Cは許容される。
注:ADH機能化反応は温度に強く依存しません。ジヒドラジドの過剰量が焼入試薬として作用するので、活性化多糖をさらに焼起させる必要はない。しかし、タンパク質を直接結合する場合、反応は、典型的には1 Mグリシン、pH 8-9で、クエンチする必要があります。
- 最適な活性化時間に達したら、撹拌下で活性化多糖に0.5M ADHの2mLを一度に加えます。pH が目標範囲 (ADH の場合は pH 8-9) であることを確認します。
透析によるADH機能化多糖の精製
注:ADH機能化反応の粗生成物は、ADH(0.5 M)の高濃度を含み、広範囲の透析により最も効率的に除去することができます。ゲル濾過は、カラムまたはスピン脱塩装置を用いて、特に残留ADH汚染物質を除去する必要がある場合ほど効率的ではない。
- 透析膜のMWCOを決定します。小さい多糖類の3kDaカットオフを使用してください。
注:透析膜のMWCOは理想的には多糖のMWよりも5〜10倍小さいです。 - 目的の透析形式(カセットまたはチューブ)と適切なデバイス容量を選択します。デバイスの容量がサンプル・ボリュームの 2 倍であることを確認します。デバイスの使用に関する製造元の説明書を参照してください。
- 透析膜を水に入れ、使用前に水にします。メーカーの指示に従って、粗い誘導体化多糖液を透析装置に移します。
注意:DMAPとの接触を避けるためにニトリル手袋を着用してください。 - 1 M NaClの2-4 Lと攪拌棒で満たされた容器内の透析。冷たい部屋のかき混ぜ皿の上に容器を置くか、または冷蔵庫の中に置きます。透析中に透析を軽く、連続してかき混ぜます。
- 少なくとも4時間透析した後、新鮮な1M NaClに変更し、少なくとも12時間透析する。0.15 M生理食音の2つの変更に対する透析、それぞれ少なくとも12時間。必要に応じて、透析は2つの水の変化に対して。
- クイックTNBSテストを使用して夜間透析をテストして、すべてのADHが削除されているかどうかを確認します。
- 3つのホウケイ酸チューブを取得し、それぞれ負のコントロール(ctrl)、正のctrl、およびサンプルとしてラベルを付けます。
- マイナスのCtrlチューブに、0.1 Mホウレート、pH 9の975 μLを追加します。
- 正のCtrlチューブに、0.05 mM ADH(0.1 mMヒドラジド)の100 μLと0.1 Mホウ酸塩の875 μL、pH 9を加えます。
- サンプルチューブに、一晩の透析液500μLと0.1 Mホウ酸塩の475 μL、pH 9を加えます。
- 3本のチューブすべてに25 μLの1%TNBSを加えます。よく混ぜます。暗闇の中に1時間置きます。
- 3つのチューブの色強度を1時間で比較します。サンプルチューブの色強度が、ADH汚染物質が0.01 mM以下に下がっていることを示す、正のctrlと負のctrlの間にあることを確認します。もう一度透析。
注:ADHヒドラジドが精製ヒドラジド-多糖類中の全ヒドラジドの1%未満を占めているように、ADH汚染物質のレベルを可能な限り低下させることは賢明です。 - 透析から誘導体多糖を回収します。多糖類とヒドラジドの濃度を決定します。ヒドラジド/多糖比を計算します(セクション7を参照)。透析用多糖類を5〜10mg/mLに濃縮する必要がある場合は、セクション1.2を参照してください。
7. ヒドラジド誘導体多糖類の解析
注:ここで説明する分析の目的は、ヒドラジド/多糖比の観点から、多糖濃度、ヒドラジド濃度、およびヒドラジド誘導体のレベルを決定することです。
- サンプル準備
注:アッセイされる多糖類は、低分子量の炭水化物、アミン、またはヒドラジド不純物を含まない必要があります。凍結乾燥したサンプルは、正確な重量測定を確実にするために乾燥し、無塩でなければなりません。通常、1〜2 mg/mL溶液の〜1mLはアッセイに適しています。- 分析バランス上の凍結乾燥した多糖類サンプルの少なくとも10mgの重量を量る、非静的なへらまたは静的エリミネーターを使用する。多糖を水または生理食い物に溶解し、アッセイ信号が標準曲線の線形範囲内に収まるように濃度(例えば、2 mg/mL)にします。
- エンドオーバーエンドを混合し、サンプルが完全に溶解するのに十分な時間を与えます。多糖類の分子量に応じて一晩の水分補給を行います。
- 多糖類アッセイ:レゾルシノール/硫酸法
注:多糖類の適切なアッセイは、ポリマーの炭水化物組成に依存します。元のレソルシノール/硫酸アッセイは、ヘキソーゼ糖を対象としていた10.ここで、加熱工程の温度を90°Cから140°Cに上げてアッセイを改変した。 この高い温度では、アッセイはいくつかの特異性を失うが、多くの糖をアッセイするために使用することができる。しかし、特定の多糖に対するアッセイの適合性を決定する必要がある。トリプリケートは各ポイントに推奨されますが、暖房ブロックの容量のためにいくつかの宿泊施設が必要な場合があります。- 75%硫酸を準備
注:濃縮硫酸は非常に腐食性であり、重度の火傷を引き起こす可能性があります。化学発煙フードで、この手順を実行します。常に濃縮酸を水に注ぎますが、 その逆ではありません!- 200mLのガラス瓶に50mLの水を加えます。ボトルを冷水浴に入れます。150mLの硫酸をゆっくり加えます。ボトルをキャップして通気します。
- 溶液を室温に平衡化させます。3ヶ月以内にソリューションを使用してください。
- 炭水化物の標準を準備します。
- 標準として使用する1mg /mLで未修飾多糖液を調製します。あるいは、多糖の反復単位に見られる比率で個々の糖の混合を、全糖濃度の1mg/mLで、標準として使用する。
注:砂糖ミックスは通常、同一の糖組成の炭水化物ポリマーと同じ結果を与えますが、これは実験的に確認されるべきです。
- 標準として使用する1mg /mLで未修飾多糖液を調製します。あるいは、多糖の反復単位に見られる比率で個々の糖の混合を、全糖濃度の1mg/mLで、標準として使用する。
- 13 x 100ホウケイ酸試験管用のチューブホルダー付きの加熱ブロックが機能していることを確認します。酸がこぼれた場合には、下と暖房ブロックの周囲に保護パッドを使用してください。利用されるすべてのブロックを通して安定した、均一な温度を達成するために最低140°Cに加熱ブロックを予熱する。
- ラベル13 x 100ホウケイ酸試験管、各標準および各サンプルの三重化。1 mg/mL の炭水化物標準の 0、2.5、5、7.5、10 μg (または μL) を、対応する標識された標準チューブに加えます。各チューブに水を加えると、体積は100μLになります。
注:生成される色は、特定の糖に依存します。一部の糖は完全な吸光度範囲を生成するためにより多くの質量を必要とするので、標準曲線に使用される実際の量は異なる場合があります。 - 導出多糖の約5μgを含む容積を3本のサンプルチューブに加えてサンプルアッセイを設定し、合計体積を水で100μLにします。あるいは、試料中の多糖濃度が不明である場合には、一連の4倍希釈を行う。各希釈液を三重で100μL試験します。
- 使用直前に6mg/mLの脱イオン(dI)水で新鮮なレゾルシノールを調製します。レソルシノールが溶液になるまで渦。各チューブに6mg/mLレゾルシノール100μLを加えます。
- 75%の硫酸の推定量を小さなビーカーに慎重に注ぎます。
メモ:ラボコート、ニトリル手袋、安全メガネを着用してください。点滴、こぼれ、水しぶきに注意してください。濡れたペーパータオルを手元に置いて、点滴を拭き取ってください。空気への長期暴露に対する硫酸の活性が変化するに応じて、アッセイ全体に対して硫酸の均一混合物を使用する。 - 繰り返しピペットを使用して、各チューブに75%の硫酸の300 μLを均一に加えます。渦を出しながらチューブを向けながら、よく混ざり合うためにチューブを激しく渦を出します。チューブをヒーターブロックに、順番に安定したペースで配置します。すべてのチューブが入ったら、タイマーを3分間すぐに設定します。
- 3分で、同じ順序で安定したペースでチューブを取り外し、氷水浴中のラックに直接置きます。氷が冷えるまでチューブを残します。チューブを取り外し、読み取り中にキュベットの結露を防ぐために、室温まで5分間平衡させます。
- UV/VIS分光光度計を設定し、10mmのパス長キュベットを使用して430 nmで吸光度を読み取ります。ゼロ標準の管が付いているブランク。430 nmですべてのチューブの吸光度を読み取ります。
注:使い捨てプラスチックキュベットは、使用するのに便利です。 - 炭水化物標準対A430のμgをプロットして標準曲線を構築する。グルコースを基準標準として使用する標準的な曲線については 、図4 を参照してください。
- A430値が標準曲線の直線範囲内に収まるサンプルアッセイチューブを使用して、標準曲線式からサンプルアッセイチューブ中の未知の多糖のμg量を算出する。希釈を考慮して、添加した未知の体積から未知の多糖の濃度を決定する。必要に応じて濃度をmg/mLまたはμMリピート単位に変換します。
- 75%硫酸を準備
- トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)を用いたヒドラジドアッセイ
- 0.02%のアジドナトリウム(サンプルバッファー)を含む0.9%のNaClを調製し、DIH2O中のアジドナトリウム200mgを1Lの最終体積に溶解します。
- 0.1 Mホウ酸ナトリウム、pH 9(アッセイ緩衝液)を調製し、0.5Mのホウ酸ナトリウム100mLを混合することにより、pH9、400 mLのdIH2O.の400 mLを用いて、溶液pHが9±0.1であることを確認する。必要に応じて調整します。
- 200 μLの 200 μLの 200 μLの 2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸溶液をdI H2O. 1 mL に 1 mL に希釈し、チューブを 1% TNBS とマークし、4 °C で暗闇の中で 1 週間保存します。
- 50 mM ADHストック(100 mMヒドラジドに相当)を準備します。
- 分析バランスを用いて871mgのアジヒラジド(ADH)粉末を計量する。トップローダーバランスの助けを借りて、100 mLにサンプルバッファーを追加することにより、試薬ボトルに粉末を溶解します。
- ボトルに100 mMヒドラジド/50 mM ADHのラベルを付けます。ボトルをしっかりとキャップし、4°Cで1年間保管してください。
- ヒドラジド標準(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mMヒドラジド)を準備してください。
- トップローダーバランスの助けを借りてサンプルバッファーで100 mMヒドラジドストックを希釈することにより、6ヒドラジド標準を準備します。濃度誤差を最小限に抑えるために、各規格の100 mLを準備してください。ボトルをしっかりと閉めて、4°Cで1年間保管してください。
- アッセイ反応の設定
メモ:TNBSアッセイは1mLの反応体積で実行されます。各アッセイチューブは、サンプル(または標準)の100 μL、875 μLのアッセイバッファー、25 μLの1%TNBS溶液で構成されています。すべてのアッセイ反応(サンプルと標準の両方)は三重に設定されます。- ラベル 3 ホウケイ酸ガラス管(12 x 75 mm)を標準にゼロを含む各規格に対して。濃度を上げる順にチューブラックに標準チューブを並べ替え、配置します。キャリブレーション済みの100 μLまたは200 μLマイクロピペットを使用して、各対応するチューブに100 μLの標準を正確に追加します。ゼロ標準の場合は、100 μL のサンプルバッファーを使用します。
- 標識3ホウケイ酸ガラス管(12 x 75mm)を、希釈したサンプルごとにアッセイする。それに応じてチューブラックにサンプルチューブを並べ替えて配置します。キャリブレーション済みの100 μLまたは200 μLマイクロピペットを使用して、対応するサンプルチューブに100 μLのサンプルを正確に追加します。
- 校正済みの1000 μLマイクロピペットを使用して、875 μLのアッセイバッファーをすべてのアッセイチューブ(標準およびサンプル)に正確に追加します。
- アッセイ反応を開始するには、校正済みの100 μLマイクロピペットを使用して、各アッセイチューブに25 μLの1%TNBSを正確に加えます。ゼロ標準チューブから開始し、濃度を上げる順に標準チューブに移動し、事前に決定された順序に従ってサンプルチューブに移動します。新しい標準または新しいサンプルを開始するときにヒントを変更し、TNBS をすべてのチューブに追加する時間を 5 分以内に保ちます。
- 高速または速度設定で2 sのすべてのアッセイチューブをボルテックスすると、アッセイチューブ内の液体がチューブ開口部から1/2インチの高さに達するまで上向きに旋回します。
- アッセイの開始時刻を記録し、タイマーを2時間に設定します。アッセイチューブラックを室温で2時間暗くします。時間が過ぎると、すべてのチューブをもう一度渦を出してデータ収集に進みます。
- データ収集
- UV/VIS分光光度計を温め、ベースラインを安定させてください。ヒドラジドアッセイ用に検出波長を500nmに設定します。アッセイ全体のすべての吸光度測定には、1 cm パスの1 mL クォーツキュベットを使用してください。
- ゼロ標準アッセイをキュヴェットに転送してデータ収集を開始します。インストゥルメントを空白にします(吸光度をゼロに設定します)。
- 各チューブで 1 回の読み取りを実行し、吸光度値をデータ テーブルに記録します。新しいサンプルを読み取る前に、キュベットから残った液体を取り除いてください。ゼロの標準から始め、濃度を上げる基準に移り、それからサンプルに移す。始めたら、すべてのステップを停止することなく効率的に実行し、10分以内にすべてのチューブを読み取ります。
- サンプル データの分析
- mM ヒドラジド標準対 A500をプロットして、標準曲線を作成します。標準曲線方程式は y =a x + b の形式で見つけ 、y は mM ヒドラジドを表し 、x は A500を表します。標準的な標準曲線については、 図 4 を参照してください。
- サンプル中のmMヒドラジドを標準的な曲線方程式を使用して計算し、希釈係数を調整します。計算のために、A 500 の値が標準曲線の線形範囲内にあるサンプルアッセイチューブのみを選択します。
- 式(1)を用いてヒドラジド/多糖のモル比を計算する。
ヒドラジド/多糖類= h / c × MW (1)
ここでhはmMヒドラジド、cは多糖のmg/mL濃度、MWはkDaの多糖分子量である。 - 式(2)を用いて多糖類の100kDa当たりのヒドラジド標識密度を計算する。
100kDa多糖あたりのラベリング密度 = h / c × 100 (2)
ここでhはmMヒドラジド、cは多糖のmg/mL濃度である。
注:便宜上、多糖類は10万ダルトンの分子量を有すると考えることができます。これにより、さまざまな多糖類の誘導体化のレベルを比較する際に「標識密度」を考慮することができます。 - ヒドラジド標識密度を重量パーセント ADH として計算します。
- 式を使用してADHの有効mg/mL濃度を決定する (3).
mg/mL ADH = (mMヒドラジド / 1000) × 174 (3)
ここで 174 は ADH の MW です。 - 数式 (4) を使用して、重み % ADH を計算します。
重量 % ADH = (mg/mL ADH) / (mg/mL 多糖類) × 100 (4)
- 式を使用してADHの有効mg/mL濃度を決定する (3).
Representative Results
CDAP化学を用いた多糖の活性化と誘導体化を例示するために、デキストランは0.25および0.5mgのCDAP/mgデキストランで活性化された。反応ごとに、水中の10mg/mLデキストラン溶液を氷上で冷却し、2.5M DMAPストック(セクション3で説明したとおりに調製)の1/10体積 を添加した。最終的な溶液は、10 μLアリコートに0.1 M NaOHを添加してpH 9に持ち込んだ。溶液を冷やして撹拌し、CDAPを加え、pH9でpH9に維持し、0.1M NaOHの10μLアリコートを15分間加え、pH9で0.25mLの0.5M ADHのみを加え(通常の量より少ない量)、反応を4°Cで一晩進行させた。
標識デキストランは、セクション6に記載されているように、1 M NaCl、0.15 M NaCl、および水に対して順次透析した。次に、ADHデキストランを、レゾルシノール/硫酸アッセイ(セクション7.2)を用いてデキストランについてアッセイした。糖標準としてグルコースを用いた典型的な標準曲線を 図4Aに示す。ヒドラジド含有量は、セクション7.3に記載のTNBSアッセイを用いて決定した。ADHを標準として用いた典型的なヒドラジド標準曲線を 図4Bに示す。
2 段階の活性化レベルでのデキストランの活性化による代表的な計算を、図 4A,Bに示します。データは、図4Cの7.9.3.4および7.9.3.5のセクションでそれぞれ説明されているように、デキストランポリマーの100kDa当たりヒドラジドとADHの重量パーセントとして提示される。CDAP比が2倍になったため、誘導体化の度合いはほぼ2倍になった。
図1: CDAPの化学構造CDAP= 1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロ化物. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2: CDAPの活性化と活用のプロセス このプロセスは概念的に2つの相に分けられ、活性化された多糖は両方に共通する。基本的な条件下では、CDAPは多糖類ヒドロキシルを活性化し、DMAP(反応1)を放出する。CDAP加水分解はDMAP(反応3)も放出する。シアノエステルが示されているが、これは実際の中間体ではないかもしれない。この中間体は、したがって、(CDAP)「活性化された」多糖類と呼ばれる。第1活性化段階の間、活性化された多糖類は加水分解(反応4)、または副反応(反応5)を受けることができる。第2の共役相(反応2)において、活性化多糖はアミンと反応して、反応4及び5に加えて安定なイズリア結合を形成する。略語: CDAP = 1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジンテトラフルオロ化;DMAP = 4-ジメチルアミノピリジン;R-NH2 = アミン. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:CDAPの活性化と活用 このプロセスでは、CDAP反応性と多糖類のバランス、CDAPおよび活性化多糖の安定性、ならびに活性化多糖類とアミンの反応性のバランスを取る必要があります。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4: デキストランのCDAP活性化の代表的な結果 典型的な標準曲線(A)レゾルシノール/硫酸および(B)TNBSアッセイ。0.25および0.5mgのCDAP/mgデキストランで活性化されたデキストランのアッセイ結果を示す。グルコースは、レゾルシノールアッセイの標準として使用した。デキストランは、mg/mLで、100kDaで割って、モル濃度を与える。ヒドラジド濃度は、ADHを標準として決定し、結果をμMHz(C)ヒドラジドの計算:デキストラン比で表します。誘導体化のレベルは、異なる平均分子量のポリマー間の比較を容易にするためにデキストランの100kDa当たりヒドラジドとして計算した。G ADH/gデキストランの重量比%は、ADHに対して174g/モルのMWを用いて計算した。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
CDAPは、多糖類を誘導し、共役するための便利な試薬です。この記事では、CDAP を使用してヒドラジド (PS-ADH) を使用して多糖類を誘導する一般的な方法について説明し、最近発表された改善点8を取り入れた。まず、この技術は、活性化プロセスを制御するために目標pHを維持することの重要性を強調する。多くの一般的なバッファがCDAP活性化反応を妨げる一方で、DMAPを正常にpH8を管理するバッファとして使用できることがわかりました。さらに、DMAPはすでにCDAP活性化の反応副産物である。最後に、CDAPを添加する前にDMAPで多糖溶液を緩衝し、反応pHの正確なターゲティングおよび維持を容易にする。説明するように、濃縮DMAPストック溶液のpHを希釈すると、目標pHに達するように調整すると便利です。第二に、低温でプロセスを行うことは反応時間を遅くし、活性化プロセスをより熱狂的で寛容にした。低い温度はCDAP加水分解の速度を低下させ、pH9の最適な活性化時間は~3分から〜15分に増加する。さらに、室温で行った場合と同じレベルの活性化を達成するために必要なCDAPが少ない。
ADH誘導体化多糖類は、カルボジイミド(例えば、EDAC)7を用いてタンパク質に結合することができる。例えば、いくつかの認可されたヘモフィルスインフルエンザb(Hib)ワクチンは、EDACを使用して破傷風トキソイドに共役するためにADHで誘導体化されたポリリボシリビトールリン酸(PRP)を使用する。CNBrは当初採用されていましたが、CDAPは、この目的のために使用するはるかに簡単な試薬です。我々の経験では、ADH誘導体化のための良い目標範囲は100 kDa多糖類または〜1-3%ADH重量あたり10-30ヒドラジドである。
同じプロセスを使用して、ADHをジアミンに置き換えることで、多糖類を一次アミンと誘導することができます。ヘキサン・ダイアミンを使用してアミン8で多糖類を誘導することをお勧めします。このアミネート多糖類(PS−NH2)は、タンパク質共役11のために開発された試薬を用いて共役することができる。典型的には、PS-NH2はマレイミド(例えば、 スクシニミジル4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1カルボキシレート(SMCC)またはN-γ-マレイミドブチル-オキシスクイクシニミドエステル(GMBS))、タンパク質はチオラ化され(例えば、スクシニニミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)。チオールマライムド化学は非常に効率的です。
タンパク質は、リジンのɛアミンを介してCDAP活性化多糖に直接結合することもできる。使用される活性化プロトコルは一般にここで説明したものと類似しているが、活性化のレベル、多糖およびタンパク質濃度、ならびにタンパク質:多糖比5、6、8を最適化する必要がある。
Dextranは、比較的高密度のヒドロキシル基のためにCDAPで活性化する最も簡単な多糖の1つですが、Vi抗原などの多糖類は挑戦的な場合があります。その結果、タンパク質に直接CDAPを結合するための単一の「最良」プロトコルはありません。まず、ヒドラジド誘導体の程度によって決定される適切なレベルの活性化を達成するためのプロトコルを開発し、次にCDAP活性化多糖へのタンパク質結合を直接進めることを提案する。
Disclosures
アンドリュー・リースは、Fina Biosolutionsの創設者兼オーナーです。CDAP化学に関する特許を複数保有し、化学とCDAP活用ノウハウのライセンス取得のメリットを得ています。
Acknowledgments
ここで説明する作業は、Fina Biosolutions LLCによって資金提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile | Sigma | 34851 | |
| Adipic acid dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
| Amicon Ultra 15 10 kDa | Millipore | UFC901008 | MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS |
| Analytical balance | |||
| Autotitrator or electronic pipet | |||
| Beaker 2-4 L | |||
| CDAP | SAFC | RES1458C | Sigma |
| DMAP | Sigma | 107700 | MW 122.2 |
| Flake ice | |||
| HCl 1 M | VWR | BDH7202-1 | |
| Micro stir bar | VWR | 76001-878 | |
| Microfuge tube (for CDAP) | VWR | 87003-294 | |
| NaCl | VWR | BDH9286 | |
| NaOH 1 M | Sigma | 1099130001 | |
| NaOH 10 M | Sigma | SX0607N-6 | |
| pH meter | |||
| pH probe | Cole Parmer | 55510-22 | 6 mm x 110 mm Epoxy single junction |
| pH temperature probe | |||
| Pipets & tips | |||
| Saline or PBS | |||
| Small beaker 5-20 mL | VWR | 10754-696 | A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet |
| Small ice bucket | |||
| Small spatula | |||
| Stir plate | |||
| Resorcinol assay | |||
| Combitip | Eppendorf | 10 ml | |
| DI water | |||
| Dialysis tubing | Repligen | 132650T | Spectra/Por 6-8kDa |
| Dialysis tubing clips | Repligen | 142150 | |
| Heating block | |||
| Nitrile gloves | VWR | ||
| Repeat pipettor | Eppendorf | M4 | |
| Resorcinol | Sigma | 398047 | |
| Sugar standard | As appropriate | ||
| Sulfuric acid 75% | VWR | BT126355-1L | |
| Timer | |||
| TNBS assay | |||
| Adipic dihydrazide | Sigma | A0638 | MW 174 |
| Borosilcate test tubes 12 x 75 | VWR | 47729-570 | |
| Sodium borate, 0.5 M pH 9 | Boston Biologicals | BB-160 | |
| TNBS 5% w/v | Sigma | P2297 | MW 293.17 |
References
- Ellis, R. W., Granoff, D. M. Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , CRC Press. (1994).
- Goebel, W. F., Avery, O. T. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).
- Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M.
- Conjugate Vaccines. Cruse, J. M., Lewis, R. E. 10, Karger. Basel. (1989).
- Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).
- Shafer, D. E., et al. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides. Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).
- Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).
- Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation. Vaccines. 8 (4), 777 (2020).
- Qi, X. -Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).
- Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod. Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).
- Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , Academic Press. (2013).
Tags
免疫学と感染症、問題172、Erratum
Formal Correction: Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)
Posted by JoVE Editors on 07/09/2021.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP). A figure was updated.
Figure 4 was updated from:
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. Please click here to view a larger version of this figure.
