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Immunology and Infection

1-सायनो-4-डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट (सीडीएपी) का उपयोग करके घुलनशील पॉलीसैकराइड्स का सक्रियण और संाधीनता

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62597
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1, 1
1Fina Biosolutions LLC

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रोटीन और अमीन युक्त लिगामेंट्स को सहसंयोजक प्रोटीन (लिगामेंट)-पॉलीसैकराइड कंजूगेट्स बनाने के लिए साइनिलेशन रिएजेंट, 1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट (सीडीएपी) द्वारा सक्रिय पॉलीसैकराइड्स से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है । यह लेख 0 डिग्री सेल्सियस पर नियंत्रित सीडीएपी सक्रियण और अलग-अलग पीएच और सक्रिय पॉलीसैकराइड्स के बाद के संविलियन को अंजाम देने के लिए एक बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

वैकसिनोलॉजी में कंजूगेट टीके उल्लेखनीय प्रगति हैं। पॉलीसैकराइड संजूबा टीकों की तैयारी के लिए, पॉलीसैकराइड्स को आसानी से कार्यात्मक किया जा सकता है और 1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरोबोरेट (सीडीएपी), एक आसान-से-हैंडल साइनिलेटिंग रिएजेंट का उपयोग करके वैक्सीन वाहक प्रोटीन से जोड़ा जा सकता है। सीडीएपी पीएच 7-9 पर कार्बोहाइड्रेट हाइड्रोक्सिल समूहों के साथ प्रतिक्रिया करके पॉलीसैकराइड्स को सक्रिय करता है। सीडीएपी की स्थिरता और प्रतिक्रियाशीलता अत्यधिक पीएच-निर्भर है। सीडीएपी के हाइड्रोलिसिस के कारण सक्रियण के दौरान प्रतिक्रिया का पीएच भी कम हो जाता है, जो अच्छा पीएच प्रजनन सक्रियण की कुंजी को नियंत्रित करता है। मूल सीडीएपी सक्रियण प्रोटोकॉल कमरे के तापमान पर बिना खरीदार पीएच 9 समाधानों में किया गया था।

इस स्थिति (<3 मिनट) के तहत तेजी से प्रतिक्रिया और तेजी से सीडीएपी हाइड्रोलिसिस से तेजी से पीएच ड्रॉप के कारण, कम समय सीमा में लक्ष्य प्रतिक्रिया पीएच को जल्दी से समायोजित और बनाए रखना चुनौतीपूर्ण था। यहां वर्णित बेहतर प्रोटोकॉल 0 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है, जो सीडीएपी हाइड्रोलिसिस को धीमा कर देता है और सक्रियण समय को 3 मिनट से ~ 15 मिनट तक बढ़ाता है। CDAP रिएजेंट जोड़ने से पहले लक्ष्य सक्रियण पीएच के पॉलीसैकराइड समाधान को पूर्व-समायोजित करने के लिए डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन (डीएमएपी) का भी उपयोग बफर के रूप में किया गया था। लंबी प्रतिक्रिया समय, धीमी सीडीएपी हाइड्रोलिसिस और डीएमएपी बफर के उपयोग के साथ मिलकर, सक्रियण प्रक्रिया की पूरी अवधि के लिए सक्रियण पीएच को बनाए रखना आसान बनाता है। बेहतर प्रोटोकॉल सक्रियण प्रक्रिया को कम उन्मत्त, अधिक प्रजनन योग्य और स्केलिंग के लिए अधिक उत्तरदायी बनाता है।

Introduction

वैकसिकोलॉजी1,2 में उल्लेखनीय प्रगति के बीच हैं, जैसे कि पॉलीसैकराइड से जुड़े टीकों, जैसे कि पॉलीसैकराइड्स से जुड़ेहुएहैं। पॉलीसैकराइड्स, टी-सेल-स्वतंत्र एंटीजन के रूप में, शिशुओं में खराब इम्यूनोजेनिक होते हैं और स्मृति, वर्ग स्विचिंग, या एंटीबॉडी3की आत्मीयता परिपक्वता को प्रेरित नहीं करते हैं। पॉलीसैकराइड संयोजित टीकों में इन कमियों को दूर किया जाता है4. चूंकि अधिकांश पॉलीसैकराइड्स में संवध के लिए एक सुविधाजनक रासायनिक हैंडल नहीं होता है, इसलिए उन्हें पहले प्रतिक्रियाशील या "सक्रिय" बनाया जाना चाहिए। सक्रिय पॉलीसैकराइड को तब सीधे प्रोटीन (या संशोधित प्रोटीन) से जोड़ा जाता है या संजीदशन 4 से पहले अतिरिक्त व्युत्पन्न के लिए कार्यात्मक कियाजाताहै। अधिकांश लाइसेंस प्राप्त पॉलीसैकराइड संयोजित टीके पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को सक्रिय करने के लिए या तो अपचय अमीनेशन या साइनिलेशन का उपयोग करते हैं। सायनोजेन ब्रोमाइड (सीएनबीआर), एक अभिवात जिसका उपयोग पहले क्रोमेटोग्राफी रेजिन को सक्रिय करने के लिए किया गया था, का उपयोग शुरू में पॉलीसैकराइड व्युत्पन्नीकरण के लिए किया जाता था। हालांकि, सीएनबीआर को उच्च पीएच की आवश्यकता होती है, आमतौर पर ~ पीएच 10.5 या उससे अधिक, आंशिक रूप से पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को विकृत करने के लिए ताकि वे साइनो समूह पर हमला करने के लिए पर्याप्त रूप से न्यूक्लियोफिलिक हों। उच्च पीएच आधार-लैबाइल पॉलीसैकराइड्स के लिए हानिकारक हो सकता है, और न तो सीएनबीआर और न ही सक्रिय साइनानो-एस्टर शुरू में गठित इस तरह के उच्च पीएच पर पर्याप्त रूप से स्थिर है।

सीडीएपी (1-साइनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट; चित्रा 1) 5,6के सक्रियण के लिए एक साइनिलेटिंग एजेंट केरूप में उपयोग के लिए Lees et al. द्वारा पेश किया गया था । CDAP, जो क्रिस्टलीय और संभालना आसान है, CNBr की तुलना में कम पीएच पर पॉलीसैकराइड्स को सक्रिय करने और कम साइड प्रतिक्रियाओं के साथ पाया गया। सीएनबीआर के विपरीत, सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स को संश्लेषण प्रक्रिया को सरल बनाते हुए प्रोटीन के लिए सीधे संयोजित किया जा सकता है। सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स को अमीनो-या हाइड्राइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड बनाने के लिए डायमाइन (जैसे, हेक्सेन डायमाइन) या एक डाइहाइड्राजाइड (जैसे, एडिपिक डाइहाइड्राजाइड, एडीएच) के साथ कार्यात्मक किया जा सकता है। पॉलीसैकराइड्स के क्रॉसलिंकिंग को दबाने के लिए होमोबियल रिएजेंट की उच्च एकाग्रता का उपयोग किया जाता है। अमीनो पॉलीसैकराइड्स को प्रोटीन संयुग्मण के लिए उपयोग की जाने वाली असंख्य तकनीकों में से किसी का उपयोग करके संयुग्मित किया जा सकता है। हाइड्राइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स को अक्सर कार्बोडिमाइड रिएजेंट (जैसे, 1-एथिल-3-(3-डाइमेथाइलमिनोप्रोपिल) कार्बोडिमाइड (ईडीएसी)7का उपयोग करके प्रोटीन के साथ जोड़ा जाता है। सीडीएपी पॉलीसैकराइड एक्टिवेशन का इसके अलावा अनुकूलन Lees et al.8 द्वारा वर्णित किया गया है और यहां वर्णित प्रोटोकॉल में शामिल किया गया है।

सीडीएपी संयोजीय अवलोकन
सीडीएपी प्रोटोकॉल को दो चरणों के रूप में अवधारणा किया जा सकता है: (1) पॉलीसैकराइड की सक्रियता और (2) प्रोटीन या लिगामेंट(चित्र 2)के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड का संविलियन। पहले चरण का लक्ष्य पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक सक्रिय करना है, जबकि दूसरे का लक्ष्य सक्रिय पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक संयोजित करना है। सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों चरणों को एक साथ जोड़ता है। यह अवधारणा प्रत्येक चरण के महत्वपूर्ण तत्वों पर ध्यान केंद्रित करने में मदद करती है। चित्रा 2 इस अवधारणा पर फैलता है, जिसमें हाइड्रोलिसिस प्रतिक्रियाओं और साइड प्रतिक्रियाओं के साथ वांछित सक्रियण और युग्मन प्रतिक्रियाएं दिखाई देती हैं।

सक्रियण चरण के दौरान, तीन प्रमुख चिंताएं सीडीएपी स्थिरता, पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल के साथ सीडीएपी प्रतिक्रिया, और सक्रिय पॉलीसैकराइड(चित्रा 3)की स्थिरता हैं। पीएच के साथ सीडीएपी हाइड्रोलिसिस बढ़ जाता है, जैसा कि सक्रिय पॉलीसैकराइड और साइड प्रतिक्रियाओं का हाइड्रोलिसिस है। हालांकि, पीएच बढ़ाने से पॉलीसैकराइड के साथ सीडीएपी रिएक्शन की सुविधा है। सीडीएपी के साथ पॉलीसैकराइड को कुशलतापूर्वक सक्रिय करने के लिए पॉलीसैकराइड और सीडीएपी और 2 की प्रतिक्रियाशीलता के बीच संतुलन की आवश्यकता होती है) रिएजेंट और सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों की हाइड्रोलिसिस और साइड प्रतिक्रियाएं।

लीस एट अल द्वारा वर्णित मूल सीडीएपी सक्रियण प्रोटोकॉलमें,पॉलीसैकराइड्स की सीडीएपी सक्रियण बिना खरीदार पीएच 9 समाधान में कमरे के तापमान पर किया गया था। इस स्थिति के तहत सक्रियण की दर तेजी से पाई गई, और सक्रियण 3 मिनट के भीतर पूरा हो जाएगा। प्रतिक्रिया भी CDAP के तेजी से हाइड्रोलिसिस के साथ था, unbuffered प्रतिक्रिया समाधान की एक तेजी से पीएच ड्रॉप के कारण । इतनी कम समय सीमा में लक्ष्य मूल्य पर प्रतिक्रिया पीएच को जल्दी से उठाना और बनाए रखना चुनौतीपूर्ण था। वर्णित प्रोटोकॉल में, 100 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान से बिना बड़े पॉलीसैकराइड समाधान के लिए सीडीएपी जोड़कर सक्रियण किया गया था। पीएच को 30 एस बाद में "0.2 एम ट्राइथिलमाइन की बराबर मात्रा" के साथ उठाया गया था। प्रोटीन को संयुग्मित किया जाना था, फिर सक्रियण प्रतिक्रिया में 2.5 मिनट के बाद जोड़ा गया था। विशेष रूप से, सक्रियण कदम का पीएच अच्छी तरह से नियंत्रित नहीं था और सबसे अधिक संभावना शुरू में लक्ष्य पीएच से अधिक थी। त्वरित पीएच समायोजन की आवश्यकता वाली तेज प्रतिक्रिया ने सक्रियण प्रक्रिया को नियंत्रित करने और बड़े पैमाने पर चुनौतीपूर्ण बना दिया।

मूल प्रोटोकॉल के विपरीत, यहां वर्णित संशोधित प्रोटोकॉल में दो प्रमुख सुधार हैं। सबसे पहले, पॉलीसैकराइड समाधान का पीएच सीडएपी के अलावा, बफर के रूप में डीएमएपी का उपयोग करके सक्रियण पीएच को लक्षित करने के लिए पूर्व-समायोजित किया जाता है। DMAP 9.5 का एक पीसीए है और इस तरह पीएच 9 के आसपास अच्छी बफरिंग शक्ति है, और कई अन्य बफ़र्स के विपरीत, DMAP CDAP हाइड्रोलिसिस8को बढ़ावा देने के लिए नहीं पाया गया था। इसके अलावा, डीएमएपी पहले से ही एक प्रक्रिया मध्यवर्ती है और इसलिए प्रतिक्रिया मिश्रण में एक नया घटक नहीं जोड़ता है। सीडीएपी जोड़ने से पहले पीएच को पूर्व-समायोजित करना प्रतिक्रिया की शुरुआत में बड़े पीएच स्विंग को समाप्त करता है और प्रतिक्रिया के दौरान लक्ष्य पीएच के अधिक कुशल रखरखाव की अनुमति देता है। दूसरा सुधार 0 डिग्री सेल्सियस पर सक्रियण प्रतिक्रिया करना है, जहां सीडीएपी हाइड्रोलिसिस की दर कमरे के तापमान की तुलना में स्पष्ट रूप से धीमी है। 0 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक अभिकर्ण आधा जीवन के साथ, कम तापमान पर धीमी सक्रियण दर की भरपाई के लिए सक्रियण समय 3 मिनट से बढ़कर 15 मिनट हो जाता है। अब प्रतिक्रिया समय, बदले में, प्रतिक्रिया पीएच को बनाए रखना आसान बनाता है। 0 डिग्री सेल्सियस का उपयोग पीएच-संवेदनशील पॉलीसैकराइड्स के क्षरण को भी धीमा कर देता है, जिससे इस प्रकार के पॉलीसैकराइड के संजूगेट तैयार करना संभव हो जाता है। प्रोटोकॉल में सुधार सक्रियण प्रक्रिया को कम उन्मत्त, नियंत्रित करने में आसान, अधिक प्रजनन योग्य और स्केलिंग के लिए अधिक उत्तरदायी बनाते हैं।

यह लेख 0 डिग्री सेल्सियस पर पॉलीसैकराइड के नियंत्रित सीडीएपी सक्रियण और एक निर्दिष्ट लक्ष्य पीएच पर और एडीएच के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड के बाद के व्युत्पन्न प्रदर्शन के लिए बेहतर प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। इसके अलावा वर्णित एक त्रिनीट्रोबेनजेन सल्फोनिक एसिड (TNBS) परख, क्यूई एट अल9की विधि के आधार पर, संशोधित पॉलीसैकराइड पर हाइड्राजाइड स्तर के निर्धारण के लिए है। रेसोरसिनॉल और सल्फ्यूरिक एसिड10 पर आधारित हेक्सोस के लिए एक संशोधित परख भी वर्णित है, जिसका उपयोग पॉलीसैकराइड्स की व्यापक श्रृंखला निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। सीडीएपी सक्रियण और संयोजण के बारे में अधिक जानकारी के लिए, पाठक को पहले के प्रकाशनों5,6, 8को लीस एट अल द्वारा संदर्भित कियाजाता है।

Protocol

नोट: पॉलीसैकराइड एक्टिवेशन और कार्यात्मकता प्रक्रियाओं को निष्पादित करने से पहले पॉलीसैकराइड समाधान, एडीएच समाधान, डीएमएपी समाधान और सीडीएपी स्टॉक समाधान तैयार करें। समाधान और उपकरणों को एक संगठित, सुविधाजनक और तार्किक स्थान पर रखें। वर्णित प्रतिक्रिया 10 मिलीग्राम पॉलीसैकराइड के लिए है और इसे ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है। स्केलिंग से पहले छोटे पैमाने पर प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने की सिफारिश की जाती है।

1. 5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीसैकराइड सॉल्यूशन, 2 एमएल तैयार करें।

  1. ल्योफिलाइज्ड पॉलीसैकराइड के लिए
    1. पॉलीसैकराइड कंटेनर को खोलने से पहले कमरे के तापमान पर आने की अनुमति दें। विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके स्क्रू-कैप ट्यूब के अंदर 10 मिलीग्राम पॉलीसैकराइड का वजन करें। आसान नमूना और पाउडर के अधिक सटीक वजन के लिए एक स्थिर एलीमिनेटर का उपयोग करें।
    2. पॉलीसैकराइड को भंग करने के लिए ट्यूब में 0.15 मीटर सोडियम क्लोराइड (एनएसीएल) के 2 एमएल जोड़ें। टोपी और भंवर ट्यूब।
      नोट: सोडियम क्लोराइड सीडीएपी प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन यह पॉलीसैकराइड माध्यमिक संरचना को प्रभावित कर सकता है। कुछ पॉलीसैकराइड विभिन्न नमक सांद्रता पर अधिक घुलनशील होते हैं।
    3. पॉलीसैकराइड आणविक वजन के आधार पर 12-24 घंटे के लिए अंत-ओवर-एंड रोटेशन द्वारा ट्यूब को मिलाएं, ताकि पॉलीसैकराइड को पूरी तरह से हाइड्रेट करने की अनुमति मिल सके। यदि आवश्यक हो, तो घुलनशीलता को बढ़ावा देने के लिए ट्यूब को धीरे-धीरे गर्म करें।
  2. बफर समाधान में घुलनीय पॉलीसैकराइड के लिए
    नोट: कुशल सीडीएपी सक्रियण के लिए, पॉलीसैकराइड समाधान में कोई बफर नहीं होना चाहिए, विशेष रूप से फॉस्फेट आयन। बफर को पानी या खारे समाधान से बदलने और पॉलीसैकराइड एकाग्रता को 5 मिलीग्राम/एमएल में समायोजित करने के लिए नीचे दी गई प्रक्रिया का पालन करें।
    1. उपयुक्त आणविक वजन कटऑफ (MWCO) का 4 एमएल या 15 एमएल सेंट्रलीफ्यूगल-स्पिन फिल्टर डिवाइस प्राप्त करें।
      नोट: MWCO आदर्श रूप से पॉलीसैकराइड के आणविक वजन से 5-10 गुना छोटा है।
    2. फ़िल्टर डालने के लिए ~ 20 मिलीग्राम पॉलीसैकराइड युक्त बफर पॉलीसैकराइड समाधान की मात्रा जोड़ें। पानी या एक खारा समाधान के साथ पूर्ण निशान को भरें। फिल्टर को कसकर कैप करें। कई बार एंड-ओवर-एंड से मिलाएं।
    3. निर्माता द्वारा सुझाए गए अपकेंद्रित्र बल पर फिल्टर डिवाइस को सेंट्रलाइज करें। सुनिश्चित करें कि अपकेंद्रित्र समय प्रत्येक स्पिन के बाद कम से कम 5 गुना मात्रा में कमी हासिल करने के लिए पर्याप्त है। प्रवाह के माध्यम से त्यागें। फ़िल्टर डिवाइस को फिर से इकट्ठा करें।
    4. फ़िल्टर को ताजे पानी या खारे समाधान के साथ पूर्ण निशान पर फिर से भरें। फिल्टर को कसकर कैप करें। फ़िल्टर में सामग्री को एंड-ओवर-एंड रोटेशन ~ 10 बार या कोमल भंवर द्वारा मिलाएं; स्पिन दोहराएं।
      नोट: पॉलीसैकराइड सेंट्रलाइज डिवाइस के फिल्टर डालने के नीचे जमा हो सकता है, जिससे जेल बन सकता है। अगले स्पिन से पहले ताजा रिफिल के साथ फिल्टर डालने के अंदर रिटेनेंट को फिर से मिलाने की सिफारिश की जाती है।
    5. रिफिल और स्पिन चक्र को कम से कम 3 बार दोहराएं।
    6. फिल्टर डालने से पॉलीसैकराइड रिटेनेंट को ठीक करने के लिए नीचे दिए गए व्यायाम का पालन करें।
      1. फिल्टर डालने के लिए ताजा पानी या खारा जोड़ें ताकि मात्रा ~ 1 एमएल हो। ऊपर और नीचे या कोमल भंवर से पाइपिंग करके मिलाएं।
      2. मिश्रित रिटेनेंट के सभी को 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिल्टर डालने के लिए ताजा पानी या खारा के 1 एमएल जोड़ें। फिल्टर को ऊपर और नीचे या कोमल भंवर से जोड़कर कुल्ला करें। बरामद पॉलीसैकराइड के साथ सभी कुल्ला को स्थानांतरित करें और संयोजित करें।
    7. पॉलीसैकराइड एकाग्रता निर्धारित करें (धारा 7.3 में पॉलीसैकराइड परख देखें)। पॉलीसैकराइड को अतिरिक्त पानी या खारे से 5 मिलीग्राम/एमएल तक पतला करें।
  3. जब पॉलीसैकराइड समाधान तैयार हो जाता है, तो बर्फ की बाल्टी में पॉलीसैकराइड समाधान युक्त ट्यूब को ठंडा करें।

2. 0.5 एम एडिपिक एसिड डिहाइड्रेजाइड (एडीएच) समाधान, 10 एमएल तैयार करें।

  1. विश्लेषणात्मक संतुलन में 0.87 ग्राम एडीएच का वजन करें, और 0.1 एम एचईपी (4-(2-हाइड्रोक्सीथिल) के 8 एमएल में घुलनशील हो जाएं) - 1-पिपराज़ीनीथानसुल्फोनिक एसिड), पीएच 8।
  2. पीएच मीटर द्वारा निगरानी किए गए 1 एम सोडियम हाइड्रोक्साइड (नाओएच) के साथ लक्ष्य पीएच में समायोजित करें। अतिरिक्त बफर के साथ 10 एमएल पर लाएं और पीएच की पुन पुष्टि करें।

3. 2.5 एम DMAP समाधान, 10 एमएल तैयार करें।

नोट: DMAP विषाक्त है और त्वचा में प्रवेश करेगा। प्रक्रिया का प्रदर्शन करते समय नाइट्रिल दस्ताने पहनें।

  1. ध्यान से 50 एमएल शंकु नली में डीएमएपी के 3 ग्राम का वजन करें। डीएमएपी में 5 मिलीलीटर पानी जोड़ें और बादल समाधान (~ 7 एमएल) प्राप्त करने के लिए 5 मिनट के लिए भंवर से मिलाएं।
  2. मिश्रण करते समय, डीएमएपी समाधान में 10 एन हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) की 50 माइक्रोन वेतन वृद्धि जोड़ें। प्रत्येक अतिरिक्त के बीच मिलाएं। जब समाधान स्पष्ट हो जाए तो जोड़ना बंद करें।
  3. ~ पीएच 8 के लिए DMAP समाधान लाने के लिए 25 μL वेतन वृद्धि में 10 एन NaOH जोड़ें।
  4. 2.5 एम समाधान देने के लिए पानी के साथ 10 एमएल के लिए DMAP समाधान लाओ।
  5. 2.5 एम डीएमएपी समाधान के पीएच को ठीक करें।
    नोट: DMAP समाधान पीएच एकाग्रता और आयनिक शक्ति के साथ बदलता है। यह अभ्यास 2.5 एम डीएमएपी स्टॉक को एक विशिष्ट पीएच पर ठीक करना है ताकि जब इसे पॉलीसैकराइड की 10 मात्रा के साथ मिलाया जा सके, तो परिणामस्वरूप समाधान सक्रियण के लिए लक्ष्य पीएच के करीब है।
    1. 1.5 एमएल ट्यूब की एक श्रृंखला तैयार करें जिसमें 1 एमएल पानी या एनएसीएल समाधान होता है, जो भी पॉलीसैकराइड समाधान तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता था। बर्फ पर ट्यूबों ठंडा।
    2. एक ठंडा ट्यूब के लिए DMAP के 100 μL जोड़ें। भंवर और पीएच मीटर के साथ पीएच को मापें। इसके बाद मापी गई ट्यूब को त्याग दें।
    3. यदि मापा गया पीएच लक्ष्य मूल्य के करीब नहीं है, तो डीएमएपी स्टॉक के पीएच को 1 एम नाओएच या एचसीएल के साथ उचित के रूप में समायोजित करें। मापा पीएच लक्ष्य पीएच के करीब है जब तक कदम 3.5.2 और 3.5.3 दोहराएं।

4. 100 मिलीग्राम/एमएल सीडीएपी स्टॉक समाधान तैयार करें

नोट: सीडीएपी पाउडर को कसकर बंद रखा जाना चाहिए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए और खोलने से पहले कमरे के तापमान पर आने की अनुमति दी जानी चाहिए। प्रक्रिया का प्रदर्शन करते समय नाइट्रिल दस्ताने पहनें।

  1. एक विश्लेषणात्मक संतुलन पर एक 1.5 एमएल स्नैप-कैप माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब धड़ाल। एक छोटे से स्पैटुला का उपयोग करके, ट्यूब में 10-140 मिलीग्राम सीडीएपी का वजन करें। सीडीएपी के वास्तविक वजन पर ध्यान दें।
  2. 100 मिलीग्राम/एमएल सीडीएपी तैयार करने के लिए आवश्यक एसीटोनिट्रिल की मात्रा निर्धारित करें। एक धुएं हुड में एसीटोनिट्रिल खोलें।
  3. एक उपयुक्त मात्रा पिपेट का उपयोग करके, पिपेट टिप में अपने वाष्प को बराबर करने के लिए एसीटोनीट्रिक को आकर्षित करें और जारी करें। कुछ सेकंड के बाद पिपेट टिप से बाहर निकलने के लिए सॉल्वेंट का इंतजार करें, और इसे सीधे सीडीएपी ट्यूब में स्थानांतरित करने के लिए तैयार रहें। एसीटोनिट्रिल की गणना की गई मात्रा को ड्रा करें और सीधे इसे सीडीएपी ट्यूब में स्थानांतरित करें। टोपी बंद स्नैप ।
    नोट: Acetonitrile भी एक हैमिल्टन सिरिंज या उपयुक्त आकार के अपने समकक्ष का उपयोग कर CDAP ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सकता है ।
  4. भंवर पूरी तरह से CDAP solubilize करने के लिए। एक बर्फ बाल्टी में CDAP ट्यूब रखें।
    नोट: सीडीएपी ठंड में एसीटोनीट्रील में स्थिर है। घुलनशील स्टॉक्स को >1 हफ्ते तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है। हालांकि, नए सिरे से सीडीएपी समाधान तैयार करना बेहतर है।

5. पॉलीसैकराइड एक्टिवेशन और हाइड्राजाइड कार्यात्मकता

  1. सुनिश्चित करें कि निम्नलिखित सभी वस्तुएं तैयार हैं और सक्रियण शुरू करने से पहले बर्फ पर ठंडा समाधान: एक फ्लैट-बॉटम में 5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीसैकराइड समाधान का 2 एमएल, एक हलचल बार युक्त चौड़े मुंह कंटेनर, एक चुंबकीय उभारक के शीर्ष पर रखा गया है; 100 मिलीग्राम/एमएल सीडीएपी स्टॉक समाधान; 2.5 एम डीएमएपी स्टॉक समाधान; एक अर्ध-माइक्रो पीएच जांच के साथ एक पीएच मीटर, जैसे कि 6 मिमी व्यास की जांच, निर्माता के निर्देशों के अनुसार 0 डिग्री सेल्सियस के लिए कैलिब्रेट; उपयोग करने के लिए तैयार 100 माइक्रोल पिपेट; एक टाइमर को मंजूरी दे दी और उपयोग करने के लिए तैयार; एक ऑटोटाटोटर डिस्पेंसर हेड तैनात या 10 माइक्रोल पिपेट उपयोग करने के लिए तैयार; 0.5 एम एडीएच समाधान।
  2. डीएमएपी का उपयोग करके पॉलीसैकराइड के पीएच को लक्ष्य पीएच में प्री-एडजस्ट करें।
    1. पॉलीसैकराइड समाधान में पीएच जांच रखें और पूरी सक्रियण प्रक्रिया के दौरान इसे समाधान में छोड़ दें।
    2. सरगर्मी के तहत ड्रॉपवाइज अतिरिक्त द्वारा पॉलीसैकराइड समाधान के लिए डीएमएपी स्टॉक समाधान के 200 μL स्थानांतरित करें। लक्ष्य सक्रियण पीएच के समाधान के पीएच को समायोजित करें। पीएच को बढ़ाने के लिए पीएच और 0.1 एम नाओएच को कम करने के लिए 0.1 एम एचसीएल जोड़ें। 0.1 पीएच इकाई से अधिक लक्ष्य पीएच से अधिक से बचें, और सक्रियण की अवधि के लिए एक बर्फ के पानी के स्नान में प्रतिक्रिया ठंडा रखें।
  3. सीडीएपी एक्टिवेशन
    1. पिपेट टिप में वाष्प को बराबर करने के लिए पिपेट 100 माइक्रोल सीडीएपी ऊपर और नीचे। सरगर्मी के साथ पॉलीसैकराइड समाधान के लिए सीडीएपी के 100 माइक्रोन स्थानांतरित करें।
      नोट: यह सक्रियण शुरुआती अनुपात के रूप में 1 मिलीग्राम पॉलीसैकराइड के लिए 1 मिलीग्राम सीडीएपी का उपयोग करता है। सक्रियण को अनुकूलित करते समय अनुपात को बढ़ाया या घटाया जा सकता है।
    2. टाइमर शुरू करें और पूरी सक्रियता के दौरान पीएच परिवर्तन की निगरानी करें। एक ऑटोटाटोटर डिस्पेंसर (या पिपेट) की सहायता से प्रतिक्रिया में 0.1 एम नाओएच की 10 माइक्रोन वेतन वृद्धि को तुरंत जोड़कर लक्ष्य पीएच पर प्रतिक्रिया बनाए रखें।
      नोट: यह पीएच प्रतिक्रिया समय को कम करने के लिए एक पीएच जांच धीरे के साथ हलचल में मदद कर सकते हैं । पीएच शुरुआत में अधिक तेजी से गिरता है, और 0.1 एम नाओएच को अधिक बार जोड़ना आवश्यक हो सकता है। जैसे-जैसे प्रतिक्रिया बढ़ती है, पीएच कमी धीमी हो जाती है, और इसके अलावा कम बार हो जाता है। इष्टतम सक्रियण समय आते समय पीएच अनिवार्य रूप से अपरिवर्तित रहना चाहिए, जो पीएच 9 सक्रियण के लिए 10-15 मिनट है।
  4. एडीएच कार्यात्मकता
    1. जब इष्टतम सक्रियण समय पहुंच जाता है, तो सरगर्मी के तहत सक्रिय पॉलीसैकराइड में एक बार में 0.5 एम एडीएच के 2 एमएल जोड़ें। जांच करें कि पीएच लक्ष्य सीमा (एडीएच के लिए पीएच 8-9) में है।
      नोट: त्वरित मिश्रण के साथ एक अतिरिक्त डिहाइड्राज़ाइड के दोनों सिरों के लिए सक्रिय पॉलीसैकराइड के साथ प्रतिक्रिया करने की संभावना को कम करता है, पॉलीसैकराइड क्रॉसलिंकिंग को रोकता है।
    2. कम से कम 1 घंटे के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण हलचल जारी रखें। प्रतिक्रिया मिश्रण को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें, लेकिन 0-20 डिग्री सेल्सियस स्वीकार्य है।
      नोट: एडीएच कार्यात्मकता प्रतिक्रिया दृढ़ता से तापमान पर निर्भर नहीं है। चूंकि डिहाइड्राज़ाइड की बड़ी अधिकता शमन रिएजेंट के रूप में कार्य करती है, इसलिए सक्रिय पॉलीसैकराइड को और बुझाना आवश्यक नहीं है। हालांकि, सीधे प्रोटीन को संयुग्मित करते समय, प्रतिक्रिया को बुझाया जाना चाहिए, आमतौर पर 1 एम ग्लाइसिन, पीएच 8-9 के साथ।

6. डायलिसिस द्वारा एडीएच-कार्यात्मक पॉलीसैकराइड का शुद्धिकरण

नोट: एडीएच कार्यात्मकता प्रतिक्रिया से कच्चे उत्पाद में एडीएच (0.5 एम) की उच्च एकाग्रता होती है, जिसे व्यापक डायलिसिस द्वारा सबसे कुशलता से हटाया जा सकता है। जेल निस्पंदन, या तो एक कॉलम या स्पिन डीसॉल्टिंग डिवाइस के साथ, उतना कुशल नहीं है, खासकर जब अवशिष्ट एडीएच संदूषक को हटाने की आवश्यकता होती है।

  1. डायलिसिस झिल्ली के MWCO निर्धारित करें। छोटे पॉलीसैकराइड्स के लिए 3 केडीए कटऑफ का उपयोग करें।
    नोट: डायलिसिस झिल्ली का एमडब्ल्यूसीओ आदर्श रूप से पॉलीसैकराइड के मेगावाट से 5-10 गुना छोटा है।
  2. वांछित डायलिसिस प्रारूप (कैसेट या ट्यूबिंग) और सही डिवाइस क्षमता चुनें। सुनिश्चित करें कि डिवाइस की क्षमता नमूना मात्रा से 2 गुना बड़ी है। डिवाइस का उपयोग करने के लिए निर्माताओं के निर्देशों से परामर्श करें।
  3. उपयोग से पहले डायलिसिस झिल्ली को पानी में हाइड्रेट करें। निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार क्रूड प्राप्त पॉलीसैकराइड समाधान को डायलिसिस डिवाइस में स्थानांतरित करें।
    नोट: DMAP के साथ संपर्क से बचने के लिए नाइट्रिल दस्ताने पहनें ।
  4. 1 एम NaCl के 2-4 एल और एक हलचल बार से भरे कंटेनर में डायलाइज़। कंटेनर को ठंडे कमरे में या फ्रिज के अंदर हलचल की थाली में रखें। डायलिसिस के दौरान धीरे-धीरे और लगातार डायलिसेट हिलाएं।
  5. कम से कम 4 घंटे के लिए डायलाइज़िंग के बाद, ताजा 1 एम एनएसीएल में बदलें, और कम से कम 12 घंटे के लिए डायलाइज़ करें। 0.15 एम नमकीन के 2 परिवर्तनों के खिलाफ डायलाइज़, प्रत्येक कम से कम 12 घंटे के लिए। यदि वांछित है, तो पानी के 2 परिवर्तनों के खिलाफ डायलाइज़ करें।
  6. सत्यापित करें कि क्या सभी एडीएच को त्वरित TNBS परीक्षण का उपयोग करके रात भर के डायलिसेट का परीक्षण करके हटा दिया जाता है।
    1. 3 बोरोसिलिकेट ट्यूब प्राप्त करें, उन्हें क्रमशः नकारात्मक नियंत्रण (सीटीआरएल), सकारात्मक सीटीआरएल और नमूना के रूप में लेबल करें।
    2. नकारात्मक सीटीआरएल ट्यूब में, 0.1 एम बोरेट, पीएच 9 के 975 माइक्रोल जोड़ें।
    3. सकारात्मक सीटीआरएल ट्यूब में, 0.05 mADH (0.1 m hydrazide) के 100 माइक्रोन और 0.1 मीटर बोरेट, पीएच 9 के 875 माइक्रोन जोड़ें।
    4. नमूना ट्यूब के लिए, रात भर के डायलासेट के 500 माइक्रोन और 0.1 एम बोरेट, पीएच 9 के 475 माइक्रोन जोड़ें।
    5. तीनों ट्यूबों में 1% TNBS के 25 माइक्रोन जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। 1 घंटे के लिए अंधेरे में रखें।
    6. 1 घंटे में 3 ट्यूबों की रंग तीव्रता की तुलना करें। सुनिश्चित करें कि नमूना ट्यूब रंग तीव्रता सकारात्मक सीटीआरएल और नकारात्मक सीटीआरएल के बीच है, जो इंगित करता है कि एडीएच संदूषक 0.01 mm या नीचे से नीचे है। एक बार और डायलाइज करें।
      नोट: एडीएच संदूषक के स्तर को जितना संभव हो उतना कम करना समझदारी है ताकि एडीएच हाइड्राजाइड शुद्ध हाइड्राज़ाइड-पॉलीसैकराइड में कुल हाइड्राज़ाइड के 1% से कम के लिए खातों।
    7. डायलिसिस से प्राप्त पॉलीसैकराइड को ठीक करें। पॉलीसैकराइड और हाइड्राजाइड की एकाग्रता निर्धारित करें। हाइड्राज़ाइड/पॉलीसैकराइड अनुपात की गणना करें (धारा 7 देखें)। यदि डायलिज्ड पॉलीसैकराइड को 5-10 मिलीग्राम/एमएल पर केंद्रित होना चाहिए, तो धारा 1.2 से परामर्श करें।

7. हाइड्राज़ाइड-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स का विश्लेषण

नोट: यहां वर्णित विश्लेषण का उद्देश्य पॉलीसैकराइड एकाग्रता, हाइड्राजाइड एकाग्रता, और हाइड्राज़ाइड/पॉलीसैकराइड अनुपात के संदर्भ में हाइड्राजाइड व्युत्पन्न के स्तर का निर्धारण करना है।

  1. नमूना तैयार करना
    नोट: पॉलीसैकराइड्स को परखने के लिए कम आणविक वजन कार्बोहाइड्रेट, अमीन, या हाइड्राजिड अशुद्धियों से मुक्त होने की आवश्यकता होती है। सही वजन माप सुनिश्चित करने के लिए लियोफिलिज्ड नमूने सूखे और नमक मुक्त होने चाहिए। आमतौर पर, 1-2 मिलीग्राम/एमएल समाधान का ~ 1 एमएल परख के लिए पर्याप्त है।
    1. गैर-स्थिर स्पैटुला या एक स्थिर एलिमिनेटर का उपयोग करके, विश्लेषणात्मक संतुलन पर कम से कम 10 मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड पॉलीसैकराइड नमूने का वजन करें। पॉलीसैकराइड को पानी या खारे में एकाग्रता (जैसे, 2 मिलीग्राम/एमएल) में भंग कर दें ताकि परख संकेत मानक वक्र की रैखिक सीमा के भीतर आ जाएं।
    2. एंड-ओवर-एंड मिलाएं और नमूने को पूरी तरह से भंग करने के लिए पर्याप्त समय दें। पॉलीसैकराइड आणविक वजन के आधार पर रात भर हाइड्रेशन करें।
  2. पॉलीसैकराइड परख: रेसोरसिनॉल/सल्फ्यूरिक एसिड विधि
    नोट: पॉलीसैकराइड्स के लिए उपयुक्त परख पॉलीमर की कार्बोहाइड्रेट संरचना पर निर्भर करेगी। मूल resorcinol/सल्फ्यूरिक एसिड परख हेक्सोज शर्करा के लिए करना था10. यहां हीटिंग स्टेप का तापमान 90 डिग्री सेल्सियस से बढ़ाकर 140 डिग्री सेल्सियस कर दिया गया। इस उच्च तापमान पर, परख कुछ विशिष्टता खो देता है, लेकिन कई शर्करा परख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, किसी विशेष पॉलीसैकराइड के लिए परख की उपयुक्तता निर्धारित करना अभी भी आवश्यक है। प्रत्येक बिंदु के लिए ट्रिप्लिकेट की सिफारिश की जाती है, लेकिन हीटिंग ब्लॉक की क्षमता के कारण कुछ आवास आवश्यक हो सकते हैं।
    1. 75% सल्फ्यूरिक एसिड तैयार करें
      नोट: केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड बेहद संक्षारक है और गंभीर जलने का कारण बन सकता है। एक रासायनिक धुएं हुड में इस प्रक्रिया को करें। हमेशा पानी में केंद्रित एसिड डालना, इसके विपरीतनहीं!
      1. 200 एमएल ग्लास की बोतल में 50 एमएल पानी डालें। बोतल को ठंडे पानी में स्नान करें। धीरे-धीरे इसमें 150 एमएल सल्फ्यूरिक एसिड डालें। बोतल को कैप करें ताकि उसे निकाल दिया जाए।
      2. समाधान कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें। 3 महीने के भीतर समाधान का उपयोग करें।
    2. कार्बोहाइड्रेट मानक तैयार करें
      1. मानक के रूप में उपयोग किए जाने वाले 1 मिलीग्राम/एमएल पर असंशोधित पॉलीसैकराइड समाधान तैयार करें। वैकल्पिक रूप से, मानक के रूप में कुल चीनी एकाग्रता के 1 मिलीग्राम/एमएल पर पॉलीसैकराइड की दोहराने इकाई में पाए जाने वाले अनुपात में व्यक्तिगत शर्करा के मिश्रण का उपयोग करें।
        नोट: हालांकि चीनी मिश्रण आमतौर पर समान चीनी संरचना के कार्बोहाइड्रेट बहुलक के रूप में एक ही परिणाम देगा, यह प्रयोगात्मक पुष्टि की जानी चाहिए ।
    3. सुनिश्चित करें कि 13 x 100 बोरोसिलिकेट टेस्ट ट्यूब के लिए ट्यूब धारकों के साथ हीटिंग ब्लॉक काम कर रहा है। एसिड फैल के मामले में हीटिंग ब्लॉक के नीचे और आसपास एक सुरक्षात्मक पैड का उपयोग करें। उपयोग किए गए सभी ब्लॉकों के माध्यम से स्थिर, समान तापमान प्राप्त करने के लिए न्यूनतम 1 घंटे के लिए हीटिंग ब्लॉक को 140 डिग्री सेल्सियस तक प्री-हीट करें।
    4. लेबल 13 x 100 बोरोसिलिकेट टेस्ट ट्यूब, प्रत्येक मानक और प्रत्येक नमूने के लिए ट्रिपलीकेट। तदनुसार लेबल मानक ट्यूबों के लिए 1 मिलीग्राम/एमएल कार्बोहाइड्रेट मानक के 0, 2.5, 5, 7.5, 10 माइक्रोन (या μL) जोड़ें। 100 माइक्रोल करने के लिए मात्रा लाने के लिए प्रत्येक ट्यूब में पानी जोड़ें।
      नोट: उत्पन्न रंग विशिष्ट शर्करा पर निर्भर है। चूंकि कुछ शर्करा को पूर्ण अवशोषण सीमा उत्पन्न करने के लिए अधिक द्रव्यमान की आवश्यकता होती है, इसलिए मानक वक्र के लिए उपयोग की जाने वाली वास्तविक मात्रा भिन्न हो सकती है।
    5. तीन नमूना ट्यूबों के लिए व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड के ~ 5 माइक्रोन युक्त मात्रा जोड़कर नमूना परख स्थापित करें और पानी के साथ कुल मात्रा को 100 माइक्रोन में लाएं। वैकल्पिक रूप से, यदि नमूने में पॉलीसैकराइड एकाग्रता अज्ञात है, तो 4 गुना कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला करें। ट्रिप्लिकेट में प्रत्येक कमजोर पड़ने का 100 माइक्रोल परीक्षण करें।
    6. उपयोग से तुरंत पहले डिओनाइज्ड (डीआई) पानी में 6 मिलीग्राम/एमएल पर ताजा रिसरसिनॉल तैयार करें। भंवर जब तक resorcinol समाधान में है। प्रत्येक ट्यूब में 6 मिलीग्राम/एमएल रिसोरसिनॉल का 100 माइक्रोल जोड़ें।
    7. ध्यान से 75% सल्फ्यूरिक एसिड की अनुमानित मात्रा को एक छोटे बीकर में डालें।
      नोट: एक प्रयोगशाला कोट, नाइट्रिल दस्ताने, और सुरक्षा चश्मा पहनें । ड्रिप, फैल और बौछार से सावधान रहें। किसी भी ड्रिप को पोंछने के लिए गीले पेपर तौलिए को काम में रखें। चूंकि सल्फ्यूरिक एसिड की गतिविधि हवा के विस्तारित जोखिम पर बदलती है, इसलिए पूरे परख के लिए सल्फ्यूरिक एसिड के एक समान मिश्रण का उपयोग करें।
    8. एक दोहराने पिपेटर का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब में समान रूप से 75% सल्फ्यूरिक एसिड के 300 माइक्रोन जोड़ें। भंवर ट्यूबों को अच्छी तरह से मिलाने के लिए सख्ती से, भंवर करते समय ट्यूब को दूर की ओर इशारा करते हुए। ट्यूबों को अनुक्रमिक क्रम में स्थिर गति से हीटर ब्लॉक में रखें। एक बार सभी ट्यूब ों में हैं, तुरंत 3 मिनट के लिए टाइमर सेट।
    9. 3 मिनट पर, एक ही क्रम में एक स्थिर गति से ट्यूबों को हटा दें, और उन्हें सीधे बर्फ के पानी के स्नान में एक रैक में रखें। ट्यूबों को तब तक छोड़ दें जब तक कि वे बर्फ ठंड न जाएं। ट्यूबों को हटा दें और उन्हें पढ़ने के दौरान क्यूवेट पर संघनन को रोकने के लिए ~ 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान को बराबर करने की अनुमति दें।
    10. 10 मिमी पथलेंगथ क्यूवेट का उपयोग करके 430 एनएम पर अवशोषण को पढ़ने के लिए एक यूवी/विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेट करें। एक शून्य मानक ट्यूब के साथ खाली। 430 एनएम पर सभी ट्यूबों के अवशोषण पढ़ें।
      नोट: डिस्पोजेबल प्लास्टिक क्यूवेट का उपयोग करने में सुविधाजनक हैं।
    11. एक430बनाम कार्बोहाइड्रेट मानक के μg की साजिश रचने के द्वारा एक मानक वक्र का निर्माण। संदर्भ मानक के रूप में ग्लूकोज का उपयोग कर एक ठेठ मानक वक्र के लिए चित्रा 4 देखें।
    12. मानक वक्र की रैखिक सीमा के भीतर आने वाले430 मूल्यों के साथ नमूना परख ट्यूबों का उपयोग करें, मानक वक्र समीकरण से नमूना परख ट्यूबों में अज्ञात पॉलीसैकराइड की μg राशि की गणना करें। अज्ञात जोड़े की मात्रा से अज्ञात पॉलीसैकराइड की एकाग्रता निर्धारित करें, कमजोर पड़ने के लिए लेखांकन। एकाग्रता को आवश्यकतानुसार एमजी/एमएल या माइक्रोन रिपीट इकाइयों में परिवर्तित करें।
  3. ट्राइनिट्रोबेन्ज़ेन सल्फोनिक एसिड (टीएनबीएस) का उपयोग करके हाइड्राज़ाइड परख
    1. 1 एल की अंतिम मात्रा में एनएसीएल के 9 ग्राम और डीआई एच 2 ओ में 200 मिलीग्राम सोडियमएजाइड को भंग करके 0.02% सोडियम एजाइड (नमूना बफर) युक्त 0.9% एनएसीएल तैयार करें।
    2. 0.1 एम सोडियम बोरेट, पीएच 9 (परख बफर) तैयार करें, 0.5 एम सोडियम बोरेट, पीएच 9 के 100 मिलियन एमएल को मिलाकर, डीआई एच2ओ के 400 मिलियन एमएल के साथ। पुष्टि करें कि समाधान पीएच 9 ± 0.1 है; यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें।
    3. 5% 2,4,6-ट्रिनिट्रोबेनजेन सल्फोनिक एसिड समाधान को 1 एमएल के लिए डीआई एच 2 ओ के साथ200माइक्रोन को कमजोर करके 1% TNBS तैयार करें। ट्यूब को 1% TNBS के रूप में चिह्नित करें और एक सप्ताह के लिए अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. 50 एमएमएम एडीएच स्टॉक (100 एमएम हाइड्रेड के बराबर) तैयार करें।
      1. विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग करके 871 मिलीग्राम एडिपिक डियराज़ाइड (एडीएच) पाउडर का वजन करें। एक शीर्ष लोडर संतुलन की सहायता से 100 एमएल के लिए नमूना बफर जोड़कर एक अभिकर् तार बोतल में पाउडर भंग करें।
      2. बोतल को 100 mM हाइड्राजाइड/50 mM एडीएच के रूप में लेबल करें। बोतल को कसकर कैप करें और 1 साल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. हाइड्राजाइड मानक (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, और 0.6 m M हाइड्राज़ाइड) तैयार करें।
      1. एक शीर्ष लोडर बैलेंस की सहायता से नमूना बफर के साथ 100 m hydrazide स्टॉक को कमजोर करके 6 हाइड्राज़ाइड मानकों को तैयार करें। एकाग्रता त्रुटि को कम करने के लिए प्रत्येक मानक का 100 एमएल तैयार करें। बोतलों को कसकर बंद करें और 1 साल के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. परख प्रतिक्रियाओं की स्थापना
      नोट: TNBS परख 1 मिलीएल की प्रतिक्रिया मात्रा में चलाया जाता है। प्रत्येक परख ट्यूब में एक नमूना (या एक मानक), परख बफर के 875 माइक्रोन, और 1% TNBS समाधान के 25 माइक्रोन के 100 माइक्रोन होते हैं। सभी परख प्रतिक्रियाओं (दोनों नमूनों और मानकों के लिए) ट्रिपलिकेट में स्थापित कर रहे हैं ।
      1. शून्य मानक सहित प्रत्येक मानक के लिए 3 बोरोसिलिकेट ग्लास ट्यूब (12 x 75 मिमी) लेबल करें। एकाग्रता बढ़ाने के क्रम में ट्यूब रैक में मानक ट्यूबों को छांटें और व्यवस्थित करें। प्रत्येक संबंधित ट्यूब में मानकों के 100 माइक्रोल को सही ढंग से जोड़ने के लिए कैलिब्रेटेड 100 माइक्रोल या 200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। शून्य मानक के लिए, नमूना बफर के 100 माइक्रोन का उपयोग करें।
      2. प्रत्येक पतला नमूना को परखने के लिए लेबल 3 बोरोसिलिकेट ग्लास ट्यूब (12 x 75 मिमी)। सॉर्ट करें और तदनुसार ट्यूब रैक में नमूना ट्यूबों की व्यवस्था करें। प्रत्येक संबंधित नमूना ट्यूब में नमूने के 100 माइक्रोल को सही ढंग से जोड़ने के लिए कैलिब्रेटेड 100 माइक्रोल या 200 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें।
      3. मानकों और नमूनों: सभी परख ट्यूबों के लिए परख बफर के 875 माइक्रोन जोड़ने के लिए एक अंशांकित 1000 μL माइक्रोपिपेट का प्रयोग करें।
    7. परख प्रतिक्रिया शुरू करने के लिए, प्रत्येक परख ट्यूब में 1% TNBS के 25 माइक्रोन को सही ढंग से जोड़ने के लिए कैलिब्रेटेड 100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करें। शून्य मानक ट्यूबों से शुरू करें, एकाग्रता बढ़ाने के क्रम में मानक ट्यूबों पर जाएं, फिर पूर्व निर्धारित आदेश के अनुसार नमूना ट्यूबों पर जाएं। एक नया मानक या एक नया नमूना शुरू करते समय सुझाव बदलें और सभी ट्यूबों में TNBS को जोड़ने में बिताए गए समय को 5 मिनट के भीतर रखें।
      1. भंवर उच्च गति पर 2 एस के लिए सभी परख ट्यूब या एक गति सेटिंग पर परख ट्यूब के अंदर तरल ऊपर की ओर भंवर करने के लिए ट्यूब खोलने से 1/2 इंच की ऊंचाई तक पहुंचने की अनुमति ।
      2. परख शुरू समय रिकॉर्ड करें और टाइमर को 2 घंटे तक सेट करें। 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में परख ट्यूब रैक रखें। जब समय समाप्त हो जाता है, भंवर सभी ट्यूबों एक और समय और डेटा संग्रह के लिए आगे बढ़ना ।
    8. डेटा संग्रह
      1. यूवी/विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को गर्म होने दें और बेसलाइन स्थिर हो जाए । हाइड्राजाइड परख के लिए 500 एनएम पर डिटेक्शन वेवलेंथ सेट करें। पूरे परख के लिए सभी अवशोषण माप के लिए 1 सेमी पथलेंगथ के 1 एमएल क्वार्ट्ज क्यूवेट का उपयोग करें।
      2. क्यूवेट को शून्य मानक परख स्थानांतरित करके डेटा संग्रह शुरू करें; खाली साधन (शून्य करने के लिए अवशोषण सेट) ।
      3. प्रत्येक ट्यूब पर एक ही पढ़ा प्रदर्शन करें और डेटा तालिका में अवशोषित मूल्यों को रिकॉर्ड करें। एक नया नमूना पढ़ने से पहले क्यूवेट से किसी भी अवशिष्ट तरल को हटा दें। शून्य मानकों से शुरू करें, एकाग्रता बढ़ाने के मानकों पर जाएं, और फिर नमूनों के लिए। एक बार शुरू होने के बाद, सभी चरणों को बिना रुके कुशलता से करें और 10 मिनट के भीतर सभी ट्यूबों को पढ़ें।
    9. नमूना डेटा का विश्लेषण
      1. एमएमएम हाइड्राजाइड मानक बनाम ए500की साजिश रचकर एक मानक वक्र बनाएं। वाई = एएक्स + बी के रूप में मानक वक्र समीकरण का पता लगाएं, जहां वाई एमएमए हाइड्राज़ाइड का प्रतिनिधित्व करता है और एक्स 500का प्रतिनिधित्व करता है। एक विशिष्ट मानक वक्र के लिए चित्रा 4 देखें।
      2. कमजोर पड़ने वाले कारकों के लिए समायोजन, मानक वक्र समीकरण का उपयोग कर नमूनों में एमएमए हाइड्राज़ाइड की गणना करें। गणना के लिए मानक वक्र की रैखिक सीमा के भीतर आने वाले500 मूल्यों के साथ केवल नमूना परख ट्यूब चुनें।
      3. समीकरण(1)का उपयोग करके हाइड्राज़ाइड/पॉलीसैकराइड के मोलर अनुपात की गणना करें।
        हाइड्राज़ाइड/पॉलीसैकराइड = एच /सी × मेगावाट (1)
        जहां एच एमएम हाइड्रेड है, सी पॉलीसैकराइड की एमजी/एमएल एकाग्रता है, और मेगावाट केडीए में पॉलीसैकराइड आणविक वजन है।
      4. समीकरण(2)का उपयोग कर पॉलीसैकराइड के 100 केडीए प्रति हाइड्राज़ाइड लेबलिंग घनत्व की गणना करें।
        लेबलिंग घनत्व प्रति 100 केडीए पॉलीसैकराइड = एच / सी × 100 (2)
        जहां एच एमएमएम हाइड्राइड है, और सी पॉलीसैकराइड की एमजी/एमएल एकाग्रता है।
        नोटः सुविधा के लिए पॉलीसैकराइड्स का आणविक वजन 100,000 डाल्टन माना जा सकता है। यह एक विभिन्न पॉलीसैकराइड के व्युत्पन्न के स्तर की तुलना में एक "लेबलिंग घनत्व" पर विचार करने की अनुमति देता है।
      5. वजन प्रतिशत एडीएच के रूप में हाइड्राज़ाइड लेबलिंग घनत्व की गणना करें।
        1. समीकरण(3)का उपयोग करके एडीएच की प्रभावी मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता निर्धारित करें।
          मिलीग्राम/एमएल एडीएच = (एमएम हाइड्राजाइड /1000) × 174(3)
          जहां 174 एडीएच का मेगावाट है।
        2. समीकरण(4)का उपयोग करके वजन % एडीएच की गणना करें।
          वजन % एडीएच = (मिलीग्राम/एमएल एडीएच) /(मिलीग्राम/एमएल पॉलीसैकराइड) × १००(4)

Representative Results

सीडीएपी रसायन शास्त्र का उपयोग करके पॉलीसैकराइड के सक्रियण और व्युत्पन्न को समझाने के लिए, डेक्सट्रान को 0.25 और 0.5 मिलीग्राम सीडीएपी/एमजी डेक्सट्रान पर सक्रिय किया गया था। प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए, पानी में एक 10 मिलीग्राम/एमएल डेक्सट्रन समाधान बर्फ पर ठंडा किया गया था, और 2.5 एम DMAP स्टॉक की 1/10 मात्रा (धारा 3 में वर्णित के रूप में तैयार) जोड़ा गया था। अंतिम समाधान 10 μL aliquots में 0.1 एम NaOH के अलावा पीएच 9 के लिए लाया गया था। समाधान ठंडा और उभारा गया था, CDAP जोड़ा, और पीएच 9 में 15 मिनट के लिए 0.1 एम NaOH के 10 μL aliquots जोड़कर बनाए रखा । पीएच 9 पर ०.५ एम एडीएच के केवल ०.२५ एमएल (सामान्य राशि से कम) और प्रतिक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगे बढ़ने की अनुमति दी गई ।

तब लेबल किए गए डेक्सट्रान को धारा 6 में वर्णित 1 एम एनएसीएल, 0.15 एम एनएसीएल और पानी के खिलाफ क्रमिक रूप से अलग किया गया था। इसके बाद एडीएच-डेक्सट्रान को रेसोरसिनॉल/सल्फ्यूरिक एसिड परख (धारा ७.२) का उपयोग करके डेक्सट्रान के लिए परख लिया गया । चीनी मानक के रूप में ग्लूकोज का उपयोग करके एक विशिष्ट मानक वक्र चित्रा 4 एमें दिखाया गया है। हाइड्राजाइड सामग्री धारा 7.3 में वर्णित TNBS परख का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। मानक के रूप में एडीएच का उपयोग करते हुए एक विशिष्ट हाइड्राजाइड मानक वक्र चित्रा 4Bमें दिया गया है।

सक्रियण के दो स्तरों पर डेक्सट्रान की सक्रियता से प्रतिनिधि गणना चित्रा 4 ए,बीमें दिखाई जाती है। डेटा को डेक्सट्रान बहुलक के 100 केडीए में दोनों हाइड्राज़ाइड के रूप में प्रस्तुत किया गया है और एडह के वजन प्रतिशत के रूप में डेक्सट्रान के लिए, जैसा कि चित्र 4 सीमें क्रमशः 7.9.3.4 और 7.9.3.5 वर्गों में वर्णित है। CDAP अनुपात दोगुनी हो गई थी के रूप में व्युत्पन्न की डिग्री लगभग दोगुनी हो गई थी।

Figure 1
चित्रा 1:सीडीएपी की रासायनिक संरचना। CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2:सीडीएपी सक्रियण और संयोजण की प्रक्रिया। प्रक्रिया को अवधारणानता से दो चरणों में विभाजित किया गया है, जिसमें सक्रिय पॉलीसैकराइड दोनों के लिए आम है। बुनियादी परिस्थितियों में, सीडीएपी पॉलीसैकराइड हाइड्रोक्सिल को सक्रिय करता है, डीएमएपी (प्रतिक्रिया 1) जारी करता है। सीडीएपी हाइड्रोलिसिस भी DMAP (प्रतिक्रिया 3) जारी करता है। हालांकि एक साइनो-एस्टर दिखाया गया है, यह वास्तविक मध्यवर्ती नहीं हो सकता है। इसलिए, मध्यवर्ती को (सीडीएपी) "सक्रिय" पॉलीसैकराइड कहा जाता है। पहले सक्रियण चरण के दौरान, सक्रिय पॉलीसैकराइड हाइड्रोलाइज (प्रतिक्रिया 4) या साइड प्रतिक्रियाओं (प्रतिक्रिया 5) से गुजरना कर सकता है। दूसरे संवध चरण (प्रतिक्रिया 2) में, सक्रिय पॉलीसैकराइड प्रतिक्रियाओं 4 और 5 के अलावा एक स्थिर आइसोरिया बांड बनाने के लिए एक अमीन के साथ प्रतिक्रिया करता है। संक्षिप्त: CDAP = 1-सायनो-4-डाइमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट; DMAP = 4-dimethylaminopyridine; आर-एनएच2 = अमीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3:सीडीएपी सक्रियण और संजीदशन। इस प्रक्रिया में पॉलीसैकराइड के साथ सीडीएपी प्रतिक्रियाशीलता, सीडीएपी की स्थिरता और सक्रिय पॉलीसैकराइड के साथ-साथ अमीन के साथ सक्रिय पॉलीसैकराइड की प्रतिक्रियाशीलता की आवश्यकता होती है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:डेक्सट्रान के सीडीएपी सक्रियण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (ए)resorcinol/सल्फ्यूरिक एसिड और(बी)TNBS परख के लिए विशिष्ट मानक घटता है । 0.25 और 0.5 एमजी सीडीएपी/एमजी डेक्सट्रान के साथ सक्रिय डेक्सट्रान के परख परिणाम दिखाए गए हैं। ग्लूकोज का उपयोग रेसोरसिनॉल परख के मानक के रूप में किया जाता था। एमजी/एमएल में डेक्सट्रान को मोलर कंसंट्रेशन देने के लिए 100 केडीए द्वारा विभाजित किया गया है। हाइड्राज़ाइड एकाग्रता मानक के रूप में एडीएच का उपयोग करके निर्धारित की जाती है और परिणाम μM Hz के रूप में व्यक्त किए जाते हैं।(C)हाइड्राज़ाइड की गणना: डेक्सट्रान अनुपात। विभिन्न औसत आणविक भार के बहुलकों के बीच तुलना को सुविधाजनक बनाने के लिए डेक्सट्रान के 100 केडीए में हाइड्राज़ाइड के रूप में व्युत्पन्न के स्तर की गणना की गई थी। जी एडीएच/जी डेक्सट्रान के% वजन अनुपात की गणना एडीएच के लिए 174 ग्राम/तिल के मेगावाट का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

सीडीएपी पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने और संयोजित करने के लिए एक सुविधाजनक अभिकर्षक है। यह लेख हाइड्राज़ाइड (पीएस-एडीएच) के साथ पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने के लिए सीडीएपी का उपयोग करने की सामान्य विधि का वर्णन करता है और हाल ही में प्रकाशित सुधार8को शामिल करता है। सबसे पहले, तकनीक सक्रियण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए लक्ष्य पीएच को बनाए रखने के महत्व पर जोर देती है। हमने पाया कि जबकि कई आम बफ़र्स सीडीएपी सक्रियण प्रतिक्रिया में हस्तक्षेप करते हैं, डीएमएपी को पीएच8का प्रबंधन करने के लिए बफर के रूप में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, डीएमएपी पहले से ही सीडीएपी सक्रियण का एक प्रतिक्रिया प्रतिफल है। अंत में, सीडीएपी को जोड़ने से पहले डीएमएपी के साथ पॉलीसैकराइड समाधान बफरिंग प्रतिक्रिया पीएच के सटीक लक्ष्यीकरण और रखरखाव की सुविधा प्रदान करता है। जैसा कि हम वर्णन करते हैं, केंद्रित डीएमएपी स्टॉक समाधान के पीएच को समायोजित करना उपयोगी है जैसे कि पतला होने पर, यह लक्षित पीएच तक पहुंचता है। दूसरे, ठंड में प्रक्रिया का प्रदर्शन प्रतिक्रिया समय धीमा, सक्रियण प्रक्रिया कम उंमत्त और अधिक क्षमा कर रही है । कम तापमान सीडीएपी हाइड्रोलिसिस की दर में कमी आई, और पीएच 9 पर इष्टतम सक्रियण समय ~ 3 मिनट से ~ 15 मिनट तक बढ़ जाता है। इसके अलावा, कमरे के तापमान पर प्रदर्शन की तुलना में सक्रियण के समान स्तर को प्राप्त करने के लिए कम सीडीएपी की आवश्यकता होती है।

एडीएच-व्युत्पन्न पॉलीसैकराइड्स को कार्बोडिमाइड्स (जैसे, EDAC)7का उपयोग करके प्रोटीन के लिए संयोजित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कई लाइसेंस प्राप्त हीमोफिलस इन्फ्लूएंजा बी (हिब) टीके एडीएच के साथ प्राप्त पॉलीरिबाइल्रिबिटोल्फॉस्फेट (पीआरपी) का उपयोग करते हैं ताकि EDAC का उपयोग करके टेटनस टॉक्सोइड को संयोजित किया जा सके। CNBr शुरू में कार्यरत था, लेकिन CDAP इस उद्देश्य के लिए उपयोग करने के लिए एक बहुत आसान अभिकर् ता है। हमारे अनुभव में, एडीएच व्युत्पन्नीकरण के लिए एक अच्छा लक्ष्य सीमा प्रति 100 केडीए पॉलीसैकराइड या वजन के अनुसार ~ 1-3% एडीएच 10-30 हाइड्राज़ाइड है।

इसी प्रक्रिया का उपयोग डायमिन के लिए एडीएच को प्रतिस्थापन करके प्राथमिक अमीनों के साथ पॉलीसैकराइड्स को प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। 8 अमीनों के साथ पॉलीसैकराइड्स प्राप्त करने केलिए हेक्साने डाइमाइन का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। अमीनेटेड पॉलीसैकराइड (पीएस-एनएच2)को प्रोटीन संयुग्मण11के लिए विकसित अभिजेंट्स का उपयोग करके संयुग्मित किया जा सकता है। आमतौर पर, पीएस-एनएच2 एक मालेमाइड (उदाहरण के लिए, succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] साइक्लोहेक्साने-1-कार्बोक्सिलेट (एसएमसीसी) या एन-γ-मालेमिडोबुटिलिल-ऑक्सीस्यूसिनिमाइड एस्टर (जीएमबीएस)), और प्रोटीन थिओलेटेड (जैसे, succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) प्रोपेलेट (एसपीडीपी) के साथ) है । थिओल-मलीमाइड केमिस्ट्री बहुत कुशल है।

प्रोटीन को सीधे ɛ-अमीन ऑन lysines के माध्यम से सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड्स में भी जोड़ा जा सकता है। जबकि सक्रियण प्रोटोकॉल का उपयोग आम तौर पर यहां वर्णित एक के समान होता है, सक्रियण, पॉलीसैकराइड और प्रोटीन एकाग्रता के स्तर के साथ-साथ प्रोटीन: पॉलीसैकराइड अनुपात5,6,8को अनुकूलित करना आवश्यक है।

डेक्सट्रान हाइड्रोक्सिल समूहों के अपेक्षाकृत उच्च घनत्व के कारण सीडीएपी के साथ सक्रिय करने के लिए सबसे आसान पॉलीसैकराइड्स में से एक है, लेकिन Vi एंटीजन जैसे कुछ पॉलीसैकराइड चुनौतीपूर्ण हो सकते हैं। नतीजतन, प्रोटीन के लिए सीधे सीडीएपी संयोजित करने के लिए कोई "सर्वश्रेष्ठ" प्रोटोकॉल नहीं है। हम पहले सक्रियण के उपयुक्त स्तरों को प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित करने का सुझाव देते हैं, जैसा कि हाइड्राज़ाइड व्युत्पन्न की सीमा तक निर्धारित होता है, और फिर सीडीएपी-सक्रिय पॉलीसैकराइड को सीधे प्रोटीन संग्राम करने के लिए आगे बढ़ना।

Disclosures

एंड्रयू लीस फिना बायोसॉल्यूशंस के संस्थापक और मालिक हैं। वह सीडीएपी रसायन विज्ञान और रसायन विज्ञान और CDAP conjugation पता है कि कैसे के लाइसेंस से लाभ से संबंधित कई पेटेंट रखती है ।

Acknowledgments

यहां वर्णित कार्य को फिना बायोसॉल्यूशंस एलएलसी द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Sigma 34851
Adipic acid dihydrazide Sigma A0638 MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa Millipore UFC901008 MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS
Analytical balance
Autotitrator or electronic pipet
Beaker  2-4 L
CDAP SAFC RES1458C Sigma
DMAP Sigma 107700 MW 122.2
Flake ice
HCl 1 M VWR BDH7202-1
Micro stir bar VWR 76001-878
Microfuge tube (for CDAP) VWR 87003-294
NaCl VWR BDH9286
NaOH 1 M Sigma 1099130001
NaOH 10 M Sigma SX0607N-6
pH meter
pH probe Cole Parmer 55510-22 6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH temperature probe
Pipets & tips
Saline or PBS
Small beaker 5-20 mL VWR 10754-696 A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet
Small ice bucket
Small spatula
Stir plate
Resorcinol assay
Combitip Eppendorf 10 ml
DI water
Dialysis tubing Repligen 132650T Spectra/Por 6-8kDa
Dialysis tubing clips Repligen 142150
Heating block
Nitrile gloves VWR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Resorcinol Sigma 398047
Sugar standard As appropriate
 Sulfuric acid 75% VWR BT126355-1L
Timer
TNBS assay
Adipic dihydrazide Sigma A0638 MW 174
Borosilcate test tubes 12 x 75 VWR 47729-570
Sodium borate, 0.5 M pH 9 Boston Biologicals BB-160
TNBS 5% w/v Sigma P2297 MW 293.17

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 172

Erratum

Formal Correction: Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)
Posted by JoVE Editors on 07/09/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP). A figure was updated.

Figure 4 was updated from:

Figure 4
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 4
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. Please click here to view a larger version of this figure.

1-सायनो-4-डिमेथाइलामिनोपाइरिडीन टेट्राफ्लोरोबोरेट (सीडीएपी) का उपयोग करके घुलनशील पॉलीसैकराइड्स का सक्रियण और संाधीनता
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Lees, A., Zhou, J. Activation and… More

Lees, A., Zhou, J. Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP). J. Vis. Exp. (172), e62597, doi:10.3791/62597 (2021).

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