Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تفعيل وارتقاط السكريات المتعددة القابلة للذوبان باستخدام 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين تترافلوروبورات (CDAP)

Published: June 14, 2021 doi: 10.3791/62597
Automatic Translation
1, 1
1Fina Biosolutions LLC

ERRATUM NOTICE

Summary

يمكن ربط البروتينات والليجانات المحتوية على الأمين بشكل مشترك بالبوليساتتشاريدات التي ينشطها كاشف السيانيل، 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبريدين رباعي فلوريبوروبورات (CDAP)، لتشكيل البروتين التساهمي (ليغاند) -polysaccharide المصاحبة. توضح هذه المقالة بروتوكول محسن لتنفيذ تنشيط CDAP الخاضعة للرقابة عند 0 درجة مئوية و درجة الحموضة متفاوتة وإجراء اقتران اللاحقة من السكريات المنشطة.

Abstract

اللقاحات المصاحبة هي تقدم ملحوظ في علم اللقاحات. لإعداد اللقاحات المترافقة مع السكريات المتعددة، يمكن تشغيل السكريات بشكل ملائم وربطها بالبروتينات الناقلة لللقاحات باستخدام 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين رباعي فلوريدين (CDAP)، وهو كاشف سيانيلاتينغ سهل المعالجة. CDAP ينشط السكريات عن طريق التفاعل مع مجموعات هيدروكسيل الكربوهيدرات في PH 7-9. الاستقرار والتفاعل من CDAP تعتمد بدرجة عالية على درجة الحموضة. انخفاض درجة الحموضة من رد الفعل أيضا أثناء التنشيط بسبب التحلل المائي للCDAP، مما يجعل درجة الحموضة جيدة السيطرة على مفتاح لتنشيط استنساخها. تم تنفيذ بروتوكول تنشيط CDAP الأصلي في درجة حرارة الغرفة في حلول درجة الحموضة 9 غير المكتومة.

بسبب رد الفعل السريع في ظل هذه الحالة (<3 دقيقة) وانخفاض الرقم الحموضة السريع المصاحب من التحلل المائي السريع CDAP ، كان من الصعب ضبط درجة الحموضة المستهدفة والحفاظ عليها بسرعة في الإطار الزمني القصير. يتم تنفيذ البروتوكول المحسن الموصوف هنا عند 0 درجة مئوية ، مما يبطئ التحلل المائي CDAP ويمدد وقت التنشيط من 3 دقائق إلى ~ 15 دقيقة. كما تم استخدام Dimethylaminopyridine (DMAP) كمخزن مؤقت لضبط حل السكريات مسبقا إلى الرقم الحموضة لتنشيط الهدف قبل إضافة كاشف CDAP. وقت رد الفعل أطول، إلى جانب تحلل هيدروليسيس CDAP أبطأ واستخدام المخزن المؤقت DMAP، يجعل من الأسهل للحفاظ على درجة الحموضة التنشيط لكامل مدة عملية التنشيط. البروتوكول المحسن يجعل عملية التنشيط أقل المحمومة، وأكثر استنساخا، وأكثر قابلية للتوسع.

Introduction

اللقاحات المصاحبة، مثل تلك التي تتكون من السكريات المتعددة المرتبطة بشكل مشترك إلى بروتين الناقل، هي من بين التقدم الملحوظ في علم اللقاحات1،2. السكريات، كما مستضدات تي الخلية المستقلة، هي المناعة سيئة في الرضع ولا تحفز الذاكرة، والتحول الطبقي، أو نضوج تقارب الأجسام المضادة3. يتم التغلب على أوجه القصور هذه في اللقاحات متعددة الشاريد المصاحبة4. وبما أن معظم السكريات ليس لديها مقبض كيميائي مناسب للإترافق ، فيجب أولا أن تكون تفاعلية أو "نشطة". ثم يتم ربط البوليساكريد المنشط إما مباشرة مع البروتين (أو البروتين المعدل) أو يتم تفعيله للحصول على اشتقاق إضافي قبل اقتران4. تستخدم معظم اللقاحات المرخصة متعددة الشاريد المصاحبة إما الأمينية الاختزالية أو السيانيل لتنشيط هيدروكسيلات البوليساكريد. بروميد السيانوجين (CNBr)، وهو كاشف كان يستخدم في السابق لتنشيط راتنجات الكروماتوغرافيا، كان يستخدم في البداية لاستخلاص الشاريد المتعدد. ومع ذلك، يتطلب CNBr درجة الحموضة عالية، عادة ~ درجة الحموضة 10.5 أو أكثر، لإلغاء بروتونات جزئيا هيدروكسيلات البولي ساكريد بحيث تكون نوكليوفليك بما فيه الكفاية لمهاجمة مجموعة سيانو. ارتفاع درجة الحموضة يمكن أن تكون ضارة ل polysaccharides قاعدة labile، ولا CNBr ولا السيانو-إستر النشطة التي تشكلت في البداية مستقرة بما فيه الكفاية في مثل هذا درجة الحموضة العالية.

CDAP (1-سيانو-4-ديميثيلامينوبريدين رباعي فلوريبوروبورات; الشكل 1) وقدم من قبل Lees وآخرون لاستخدامها كعامل cyanylating لتفعيل السكريات5،6. تم العثور على CDAP ، وهو بلوري وسهل التعامل معه ، لتنشيط السكريات عند درجة الحموضة أقل من CNBr ومع ردود فعل جانبية أقل. على عكس CNBr ، يمكن ربط السكريات المتعددة المنشطة CDAP مباشرة بالبروتينات ، مما يسهل عملية التوليف. يمكن تشغيل السكريات المتعددة المنشطة CDAP مع ديامين (على سبيل المثال، الهيكسان ديامين) أو ديهيدرازيد (على سبيل المثال، ديهيدرازيد الديديبيك، ADH) لصنع السكريات الأمينية أو المشتقة من الهيدرازيد. يتم استخدام تركيز عال من الكاشف المثلي لقمع الربط المتبادل بين السكريات. يمكن بعد ذلك اقتران السكريات الأمينية باستخدام أي من التقنيات التي لا تعد ولا تحصى المستخدمة في اقتران البروتين. وغالبا ما تقترن السكريات المشتقة من هيدرازايد إلى البروتينات باستخدام كاشف كاربوديميد (على سبيل المثال، 1-إيثيل-3-(3-dimethylaminopropyl)كاربوديميد (EDAC))7. وقد وصف المزيد من التحسين لتفعيل CDAP polysaccharide من قبل Lees et al.8 ويتم دمجها في البروتوكول الموصوف هنا.

نظرة عامة على اقتران CDAP
يمكن تصور بروتوكول CDAP على أنه مرحلتين: (1) تنشيط البوليساكريد و (2) اقتران البوليساكريد المنشط ببروتين أو ليغند(الشكل 2). الهدف من الخطوة الأولى هو تنشيط السكريات بكفاءة ، في حين أن الهدف من الثانية هو اقترانها بكفاءة مع البوليساكريد المنشط. يربط تعدد الشاريد المنشط بين الخطوتين معا. ويساعد هذا التصور على التركيز على العناصر الحاسمة لكل خطوة. الشكل 2 يتوسع في هذا التصور ، مما يدل على التنشيط المطلوب وتفاعلات اقتران ، جنبا إلى جنب مع ردود الفعل التحلل المائي وردود الفعل الجانبية.

خلال مرحلة التنشيط ، والشواغل الرئيسية الثلاثة هي استقرار CDAP ، رد فعل CDAP مع هيدروكسيلات البوليساكريد ، واستقرار البوليساكريد المنشط(الشكل 3). يزداد التحلل المائي CDAP مع درجة الحموضة ، كما يفعل التحلل المائي للبوليساكريد المنشط وردود الفعل الجانبية. ومع ذلك، يتم تسهيل رد فعل CDAP مع البوليساكريد بزيادة درجة الحموضة. يتطلب تنشيط السكريات بكفاءة مع CDAP توازنا بين 1) تفاعل البوليساكريد وCDAP و 2) التحلل المائي وردود الفعل الجانبية لكل من الكاشف وبوليساكريد المنشط.

في بروتوكول تفعيل CDAP الأصلي الذي وصفه Lees et al.5، تم تنشيط CDAP من السكريات في درجة حرارة الغرفة في محلول درجة الحموضة 9 غير المكتبر. تم العثور على معدل التنشيط ليكون سريعا في ظل هذا الشرط، وسوف يكون التنشيط كاملة في غضون 3 دقائق. ورافق رد الفعل أيضا التحلل المائي السريع للCDAP، مما تسبب في انخفاض درجة الحموضة السريع من محلول رد الفعل غير المكتبر. وكان من الصعب رفع درجة الحموضة بسرعة والحفاظ عليها عند القيمة المستهدفة في مثل هذا الإطار الزمني القصير. في البروتوكول الموصوف، تم تنفيذ التنشيط عن طريق إضافة CDAP من محلول مخزون 100 ملغم/مل إلى محلول السكرييد غير المحشو. تم رفع رقم الحموضة 30 ق في وقت لاحق مع "حجم متساو من 0.2 M تريثيلامين". ثم أضيف البروتين الذي سيتم اقترانه بعد 2.5 دقيقة إلى رد فعل التنشيط. وتجدر الإشارة إلى أن الرقم الحموضة لخطوة التنشيط لم يكن مسيطرا عليه بشكل جيد، ومن المرجح أن يكون قد تجاوز الرقم PH المستهدف في البداية. رد الفعل السريع الذي يتطلب تعديل درجة الحموضة الفوري جعل عملية التنشيط صعبة للسيطرة وصعبة لتوسيع نطاق.

وعلى النقيض من البروتوكول الأصلي، فإن البروتوكول المعدل الموصوف هنا له تحسينان رئيسيان. أولا، يتم ضبط الرقم الحموضة لحل السكريات قبل لاستهداف الرقم الحموضة التنشيط، وذلك باستخدام DMAP كمخزن مؤقت، قبل إضافة CDAP. DMAP لديه pKa من 9.5 وبالتالي لديه قوة التخزين المؤقت جيدة حول pH 9، وخلافا للعديد من المخازن المؤقتة الأخرى، لم يتم العثور على DMAP لتعزيز التحلل المائي CDAP8. وعلاوة على ذلك، DMAP هو بالفعل عملية وسيطة، وبالتالي لا يضيف عنصرا جديدا إلى خليط رد الفعل. قبل ضبط درجة الحموضة قبل إضافة CDAP يزيل أرجوحة درجة الحموضة الكبيرة في بداية رد الفعل ويسمح لصيانة أكثر كفاءة من الرقم الحموضة المستهدفة أثناء رد الفعل. التحسين الثاني هو إجراء رد فعل التنشيط عند 0 درجة مئوية ، حيث يكون معدل التحلل المائي CDAP أبطأ بشكل ملحوظ من ذلك في درجة حرارة الغرفة. مع فترة نصف عمر الكاشف الأطول عند 0 درجة مئوية ، يتم زيادة وقت التنشيط من 3 دقائق إلى 15 دقيقة للتعويض عن معدل التنشيط الأبطأ في درجة الحرارة المنخفضة. وقت رد الفعل الأطول، بدوره، يجعل من الأسهل للحفاظ على درجة الحموضة رد الفعل. كما يؤدي استخدام 0 درجة مئوية إلى إبطاء تدهور السكريات الحساسة ل درجة الحموضة، مما يجعل من الممكن إعداد اقترانات لهذا النوع من السكريات. التحسينات في البروتوكول تجعل عملية التنشيط أقل المحمومة، وأسهل للسيطرة، وأكثر استنساخها، وأكثر قابلية لتوسيع نطاق.

توضح هذه المقالة البروتوكول المحسن لتنفيذ تنشيط CDAP للبوليساكريد في 0 درجة مئوية وعلى درجة الحموضة الهدف المحدد وتنفيذ اشتقاق اللاحقة من السكريات المنشطة مع ADH. كما هو وصفها هو حمض كبرتونيك trinitrobenzene (TNBS) المقايسة، استنادا إلى طريقة تشيوآخرون. كما يوصف أيضا المقايسة المعدلة للهيكسوس على أساس ريسورسينول وحمض الكبريتيك10، والتي يمكن استخدامها لتحديد مجموعة أوسع من السكريات. لمزيد من المعلومات حول تفعيل CDAP و اقترانها، القارئ يشار إلى المنشورات السابقة5،6،8 من قبل Lees وآخرون.

Protocol

ملاحظة: تحضير الحل polysaccharide حل ADH حل DMAP و CDAP الأسهم الحل مقدما قبل تنفيذ إجراءات تنشيط ووظيفية polysaccharide. ضع الحلول والمعدات في موقع منظم ومريح ومنطقي. رد الفعل الموصوف هو ل 10 ملغ من البوليساكريد ويمكن توسيع نطاقها صعودا أو أسفل. يوصى بتقييم البروتوكول على نطاق صغير قبل التوسع.

1. إعداد محلول البوليساكريد 5 ملغم/مل، 2 مل.

  1. لتعدد السكريات الليوفيلي
    1. السماح للحاوية البوليساكريد أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة قبل فتح. تزن 10 ملغ من البوليساكريد داخل أنبوب المسمار كاب باستخدام التوازن التحليلي. استخدام مزيل ثابت لأخذ العينات أسهل ووزن أكثر دقة من مسحوق.
    2. أضف 2 مل من كلوريد الصوديوم 0.15 M (NaCl) إلى الأنبوب لإذابة البوليساكريد. كاب ودوامة الأنبوب.
      ملاحظة: كلوريد الصوديوم لا يؤثر على رد فعل CDAP، ولكنه قد يؤثر على البنية الثانوية للبوليساكريد. بعض السكريات هي أكثر قابلة للذوبان في تركيزات الملح المختلفة.
    3. اخلط الأنبوب عن طريق الدوران النهائي لمدة 12-24 ساعة ، اعتمادا على الوزن الجزيئي للبوليساكريد ، للسماح للبوليساكريد بالترطيب الكامل. إذا لزم الأمر، دافئة بلطف أنبوب لتعزيز solubilization.
  2. لتعدد الشاريد solubilized في حل المخزنة مؤقتا
    ملاحظة: لتنشيط CDAP فعالة، يجب أن لا يحتوي الحل البوليساكريد أي المخزن المؤقت، خاصة أيونات الفوسفات. اتبع الإجراء أدناه لاستبدال العازلة بالماء أو محلول ملحي وضبط تركيز البوليساكريد إلى 5 ملغم / مل.
    1. الحصول على جهاز تصفية 4 مل أو 15 مل من جهاز تصفية الطرد المركزي من قطع الوزن الجزيئي المناسب (MWCO).
      ملاحظة: MWCO هو مثالي 5-10 مرات أصغر من الوزن الجزيئي للبوليساكريد.
    2. إضافة وحدة تخزين من محلول السكريات المخزنة مؤقتا التي تحتوي على ~ 20 ملغ من السكريد إلى إدراج عامل التصفية. ملء إلى العلامة الكاملة بالماء أو محلول ملحي. قم بوضع حد أقصى للفلتر بإحكام. تخلط من قبل نهاية أكثر من نهاية عدة مرات.
    3. طرد مركزي جهاز التصفية في قوة الطرد المركزي التي اقترحها الشركة المصنعة. تأكد من أن وقت الطرد المركزي طويل بما يكفي لتحقيق خفض حجم 5 أضعاف على الأقل بعد كل دورة. تجاهل التدفق من خلال. إعادة تجميع جهاز التصفية.
    4. إعادة تعبئة إدراج مرشح إلى العلامة الكاملة مع المياه العذبة أو محلول ملحي. قم بوضع حد أقصى للفلتر بإحكام. امزج المحتوى في الفلتر عن طريق الدوران النهائي ~ 10 مرات أو عن طريق الدوامة اللطيفة؛ كرر الدوران.
      ملاحظة: يمكن أن تتراكم السكريات المتعددة في الجزء السفلي من إدراج عامل التصفية لجهاز الطرد المركزي، وتشكيل هلام. فمن المستحسن لإعادة خلط المتكأ داخل إدراج مرشح مع إعادة تعبئة جديدة قبل تدور المقبل.
    5. كرر دورة إعادة التعبئة والدوران لمدة 3 مرات على الأقل.
    6. اتبع التمرين أدناه لاسترداد المزيل متعدد الشاريد من إدراج عامل التصفية.
      1. إضافة المياه العذبة أو المالحة لإدراج مرشح بحيث يكون حجم ~ 1 مل. مزيج عن طريق pipetting صعودا وهبوطا أو عن طريق دوامة لطيف.
      2. نقل كل من المزيل المختلط إلى أنبوب 5 مل. أضف 1 مل من الماء العذب أو المالح إلى إدراج الفلتر. شطف مرشح عن طريق pipetting صعودا وهبوطا أو عن طريق دوامة لطيف. نقل والجمع بين جميع الشطف مع البوليساكريد المستردة.
    7. تحديد تركيز البوليساكريد (راجع المقايسة البوليساكريد في القسم 7.3). تمييع البوليساكريد بماء إضافي أو ملحي إلى 5 ملغم/مل.
  3. عندما يتم إعداد محلول السكريات، قم بتبريد الأنبوب الذي يحتوي على محلول البوليساكريد في دلو جليدي.

2. إعداد 0.5 M حمض الديهيدرازيد الديهيدرازيد (ADH) الحل، 10 مل.

  1. وزن 0.87 ز ADH في توازن تحليلي، وslubilize في 8 مل من 0.1 M HEPES (4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك)، درجة الحموضة 8.
  2. ضبط إلى درجة الحموضة المستهدفة مع هيدروكسيد الصوديوم 1 M (NaOH)، التي رصدها متر درجة الحموضة. إحضار إلى 10 مل مع المخزن المؤقت إضافية ثم إعادة تأكيد رقم الحموضة.

3. إعداد 2.5 M DMAP الحل، 10 مل.

ملاحظة: DMAP سامة وسوف تخترق الجلد. ارتداء قفازات النتريل عند تنفيذ الإجراء.

  1. تزن بعناية 3 غرام من DMAP في أنبوب مخروطي 50 مل. أضف 5 مل من الماء إلى DMAP واخلطها بواسطة الدوامة لمدة 5 دقائق للحصول على محلول غائم (~ 7 مل).
  2. أثناء الخلط، أضف 50 ميكرولتر من 10 حمض هيدروكلوريك N (HCl) إلى محلول DMAP. مزيج بين كل إضافة. توقف عن إضافة عندما يصبح الحل واضحا.
  3. أضف 10 N NaOH بزيادات 25 ميكرولتر لجلب حل DMAP إلى ~pH 8.
  4. أحضر محلول DMAP إلى 10 مل مع الماء لإعطاء حل 2.5 M.
  5. ضبط رقم الحموضة لحل DMAP 2.5 M.
    ملاحظة: يتغير درجة الحموضة في حل DMAP بتركيز وقوة أيونية. هذا التمرين هو لضبط المخزون DMAP 2.5 M إلى الرقم PH معينة بحيث عندما يتم خلطه مع 10 وحدات تخزين من polysaccharide، الحل الناتج هو قريب من الرقم الحموضة الهدف للتنشيط.
    1. إعداد سلسلة من أنابيب 1.5 مل تحتوي على 1 مل من الماء أو محلول NaCl، أيهما كان يستخدم لإعداد محلول البوليساكريد. تبريد الأنابيب على الجليد.
    2. أضف 100 ميكرولتر من DMAP إلى أنبوب مبرد. دوامة وقياس رقم الحموضة مع مقياس الحموضة. ثم، تجاهل الأنبوب المقاس.
    3. إذا لم يكن الرقم PH المقاس قريبا من القيمة المستهدفة، فاضبط الرقم H لمخزون DMAP ب 1 M NaOH أو HCl حسب الاقتضاء. كرر الخطوتين 3.5.2 و3.5.3 حتى يقترب الرقم الحموض المقاس من الرقم PH المستهدف.

4. إعداد 100 ملغ / مل CDAP حل الأسهم

ملاحظة: يجب أن يبقى مسحوق CDAP مغلقا بإحكام ومخزنا عند -20 درجة مئوية ويسمح له بالدخول إلى درجة حرارة الغرفة قبل الفتح. ارتداء قفازات النتريل عند تنفيذ الإجراء.

  1. Tare أنبوب مكافحة الطاردات الدقيقة 1.5 مل المفاجئة كاب على توازن تحليلي. باستخدام ملعقة صغيرة، تزن من 10-140 ملغ من CDAP في الأنبوب. لاحظ الوزن الفعلي CDAP.
  2. تحديد حجم الأسيتونيتريل اللازمة لإعداد 100 ملغم/ مل CDAP. فتح أسيتونيتريل في غطاء الدخان.
  3. باستخدام ماصة حجم المناسبة، رسم والإفراج عن أسيتونيتريل لتوازن بخارها في تلميح pipet. انتظر المذيب بالتنقيط من طرف pipet بعد بضع ثوان، وتكون على استعداد لنقله إلى أنبوب CDAP مباشرة. رسم حجم محسوب من أسيتونيتريل ونقله مباشرة إلى أنبوب CDAP. التقط الغطاء مغلقا.
    ملاحظة: يمكن أيضا نقل أسيتونيتريل إلى أنبوب CDAP باستخدام حقنة هاملتون أو ما يعادلها من حجم مناسب.
  4. دوامة لتليين كامل CDAP. ضع أنبوب CDAP في دلو الثلج.
    ملاحظة: CDAP مستقرة في أسيتونيتريل في البرد. يمكن الاحتفاظ بالمخزونات القابلة للذوبان عند -20 درجة مئوية لمدة أسبوع >1. ومع ذلك، فمن الأفضل إعداد حلول CDAP جديدة.

5. تنشيط البوليساكريد والوظيفية هيدرازيد

  1. تأكد من أن جميع العناصر التالية جاهزة والحلول المبردة على الجليد قبل بدء التنشيط: 2 مل من محلول البوليساكريد 5 ملغم / مل في حاوية مسطحة القاع واسعة الفم تحتوي على شريط ضجة، وضعت على رأس ستيرر المغناطيسي. 100 ملغم/مل حل مخزون CDAP; 2.5 M DMAP الأسهم الحل؛ مقياس درجة الحموضة مع مسبار درجة الحموضة شبه الدقيقة، مثل مسبار قطر 6 مم، معايرته لمدة 0 درجة مئوية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة؛ a 100 ميكرولتر ماصة جاهزة للاستخدام; جهاز ضبط وقت مسح وجاهزة للاستخدام؛ رئيس موزع أوتوتيتراتور وضعه أو 10 ميكرولتر ماصة جاهزة للاستخدام; 0.5 M ADH الحل.
  2. قم بضبط درجة الحموضة لتعدد الشاريد مسبقا إلى الرقم PH الهدف باستخدام DMAP.
    1. ضع مسبار pH في محلول السكريات واتركه في الحل أثناء إجراء التنشيط بأكمله.
    2. نقل 200 ميكرولتر من محلول مخزون DMAP إلى محلول السكرييد عن طريق إضافة دروبياسي تحت التحريك. ضبط الرقم الحموضة للحل إلى الرقم الحموضة التنشيط الهدف. أضف 0.1 م HCl لخفض درجة الحموضة و 0.1 M NaOH لزيادة درجة الحموضة. تجنب تجاوز الرقم الحموضة المستهدف بأكثر من 0.1 درجة حمى الحموضة، والحفاظ على رد الفعل مبردة في حمام الماء المثلج لمدة التنشيط.
  3. تنشيط CDAP
    1. Pipet 100 μL CDAP صعودا وهبوطا لتوازن البخار في طرف pipet. نقل 100 ميكرولتر من CDAP إلى محلول السكرييد مع التحريك.
      ملاحظة: يستخدم هذا التنشيط 1 ملغ من CDAP ل 1 ملغ من البوليساكريد كنسبة بداية. يمكن زيادة النسبة أو تقليلها عند تحسين التنشيط.
    2. بدء تشغيل المؤقت ومراقبة تغيير رقم الحموضة أثناء التنشيط بأكمله. الحفاظ على رد الفعل عند درجة الحموضة المستهدفة عن طريق إضافة زيادات 10 ميكرولتر على الفور من 0.1 M NaOH إلى رد الفعل ، بمساعدة موزع الأوتيتراتور (أو ماصة).
      ملاحظة: قد يساعد على تقليل وقت استجابة الحموضة لتحريك مع مسبار pH بلطف. تنخفض درجة الحموضة بسرعة أكبر في البداية، وقد يكون من الضروري إضافة 0.1 M NaOH بشكل أكثر تكرارا. كما يمضي رد الفعل، وانخفاض درجة الحموضة يصبح أبطأ، وإضافة يصبح أقل تواترا. يجب أن يظل رقم الحموضة دون تغيير عند الاقتراب من وقت التنشيط الأمثل ، وهو 10-15 دقيقة لتنشيط pH 9.
  4. تشغيل ADH
    1. عند الوصول إلى وقت التنشيط الأمثل، أضف 2 مل من 0.5 M ADH في وقت واحد إلى البوليساكريد المنشط تحت التحريك. تحقق من أن الرقم الحموضة في النطاق المستهدف (الرقم الحموضة 8-9 لDH).
      ملاحظة: إضافة واحدة مع خلط سريع يقلل من احتمال لكلا طرفي ديهيدرازيد للرد مع البوليساكريد تنشيط منع الربط المتداخل polysaccharide.
    2. الاستمرار في تحريك خليط التفاعل لمدة 1 ساعة على الأقل. نقل خليط التفاعل إلى 4 °C ، ولكن 0-20 درجة مئوية مقبول.
      ملاحظة: لا يعتمد تفاعل وظيفية ADH بشكل كبير على درجة الحرارة. كما الفائض الكبير من ديهيدرازيد بمثابة كاشف التبريد، فإنه ليس من الضروري لمزيد من إخماد البوليساكريد المنشط. ومع ذلك ، عند اقتران البروتينات مباشرة ، يجب إخماد رد الفعل ، عادة مع 1 M glycine ، درجة الحموضة 8-9.

6. تنقية السكريات متعددة الوظائف في ADH عن طريق غسيل الكلى

ملاحظة: يحتوي المنتج الخام الناتج عن تفاعل التشغيل في ADH على تركيز عال من ADH (0.5 M) ، والذي يمكن إزالته بأكبر قدر من الكفاءة عن طريق غسيل الكلى الواسع النطاق. الترشيح هلام، إما مع عمود أو جهاز تحلية تدور، ليست فعالة، وخصوصا عندما يكون مطلوبا لإزالة الملوثات ADH المتبقية.

  1. تحديد MWCO من غشاء غسيل الكلى. استخدام قطع 3 كيلودا لأصغر السكريات.
    ملاحظة: MWCO من غشاء غسيل الكلى هو مثالي 5-10 مرات أصغر من ميغاواط من البوليساكريد.
  2. اختر تنسيق غسيل الكلى المطلوب (أشرطة الكاسيت أو الأنابيب) وسعة الجهاز الصحيحة. تأكد من أن سعة الجهاز أكبر مرتين من حجم العينة. راجع تعليمات المصنوعات لاستخدام الجهاز.
  3. هيدرات غشاء غسيل الكلى في الماء قبل الاستخدام. نقل محلول السكريات المشتقة من النفط الخام إلى جهاز غسيل الكلى وفقا لتعليمات المصنعين.
    ملاحظة: ارتداء قفازات النتريل لتجنب الاتصال مع DMAP.
  4. Dialyze في حاوية مليئة 2-4 لتر من 1 M NaCl وشريط ضجة. ضع الحاوية على طبق تحريك في غرفة باردة أو داخل ثلاجة. تحريك dialysate بلطف وباستمرار أثناء غسيل الكلى.
  5. بعد dialyzing لمدة 4 ساعة على الأقل، وتغيير إلى الطازجة 1 M NaCl، و dialyze لمدة 12 ساعة على الأقل. ديايزي ضد 2 تغييرات من 0.15 م المالحة، كل لمدة 12 ساعة على الأقل. إذا رغبت في ذلك، dialyze ضد 2 تغييرات من الماء.
  6. تحقق مما إذا تمت إزالة كافة ADH عن طريق اختبار dialysate بين عشية وضحاها باستخدام اختبار TNBS سريع.
    1. الحصول على 3 أنابيب borosilicate، تسمية لهم السيطرة السلبية (ctrl)، ctrl إيجابية، وعينة، على التوالي.
    2. إلى أنبوب ctrl السلبي، أضف 975 ميكرولتر من 0.1 M بورات، درجة الحموضة 9.
    3. إلى أنبوب ctrl الإيجابي، أضف 100 ميكرولتر من 0.05 mM ADH (0.1 mM هيدرازيد) و 875 ميكرولتر من 0.1 M بورات، درجة الحموضة 9.
    4. إلى أنبوب العينة، أضف 500 ميكرولتر من dialysate بين عشية وضحاها و 475 ميكرولتر من 0.1 M بورات، درجة الحموضة 9.
    5. أضف 25 ميكرولتر من 1٪ TNBS إلى جميع الأنابيب الثلاثة. تخلط جيدا. ضعه في الظلام لمدة ساعة واحدة.
    6. قارن كثافة لون الأنابيب 3 في 1 ساعة. تأكد من أن كثافة لون أنبوب العينة بين شدة ال ctrl الإيجابية والإشارة السالبة ، مما يشير إلى أن ملوث ADH انخفض إلى 0.01 mM أو أقل. دياليزي مرة أخرى.
      ملاحظة: من الحكمة تقليل مستوى ملوث ADH قدر الإمكان بحيث يمثل هيدرازيد ADH أقل من 1٪ من إجمالي الهيدرازيد في الهيدرازيد النقي.
    7. استرداد الشاريد المشتق من غسيل الكلى. تحديد تركيز السكريات والهيدرازيد. حساب نسبة الهيدرازيد/السكريد (انظر القسم 7). إذا كان يجب أن تتركز السكريد dialyzed إلى 5-10 ملغ / مل، راجع القسم 1.2.

7. تحليل السكريات المشتقة من الهيدرازيد

ملاحظة: الغرض من التحليل الموضح هنا هو تحديد تركيز البوليساكريد وتركيز الهيدرازيد ومستوى اشتقاق الهيدرازيد من حيث نسبة الهيدرازيد/البوليساكريد.

  1. إعداد العينة
    ملاحظة: السكريات المتعددة التي يجب فحصها يجب أن تكون خالية من الكربوهيدرات منخفضة الوزن الجزيئي، الأمين، أو شوائب الهيدرازيد. يجب أن تكون العينات الليوفيلية جافة وخالية من الملح لضمان قياس الوزن بدقة. عادة، ~ 1 مل من محلول 1-2 ملغم/ مل كافية للمقاايسات.
    1. وزن ما لا يقل عن 10 ملغ من عينة السكريات الليوفيلية على توازن تحليلي، وذلك باستخدام ملعقة غير ثابتة أو مزيل ثابت. حل البوليساكريد في الماء أو المالحة إلى تركيز (على سبيل المثال، 2 ملغم / مل) بحيث إشارات المقايسة تقع ضمن النطاق الخطي للمنحنى القياسية.
    2. مزيج نهاية أكثر من نهاية والسماح بما يكفي من الوقت للعينة لتذوب تماما. أداء الترطيب بين عشية وضحاها اعتمادا على الوزن الجزيئي البوليساكريد.
  2. فحص السكريات: طريقة ريسورسينول/حمض الكبريتيك
    ملاحظة: يعتمد المقايسة المناسبة للبوليساكريد على تكوين الكربوهيدرات للبوليمرات. كان المقصود من المقايسة الأصلية حمض ريسورسينول / الكبريتيك للسكرات hexose10. تم تعديل المقايسة هنا عن طريق رفع درجة حرارة خطوة التدفئة من 90 درجة مئوية إلى 140 درجة مئوية. في هذه درجة الحرارة العالية ، يفقد المقايسة بعض خصوصية ولكن يمكن استخدامها في فحص العديد من السكريات. ومع ذلك، فإنه لا يزال من الضروري تحديد مدى ملاءمة الفحص ل polysaccharide معينة. يوصى بالسخونات الثلاثية لكل نقطة، ولكن قد يكون من الضروري توفير بعض أماكن الإقامة نظرا لقدرة كتلة التدفئة.
    1. إعداد حمض الكبريتيك بنسبة 75٪
      ملاحظة: حمض الكبريتيك المركزة هو تآكل للغاية ويمكن أن يسبب حروق شديدة. إجراء هذا الإجراء في غطاء الدخان الكيميائي. صب حمض مركزة دائما في الماء، وليس العكس بالعكس!
      1. أضف 50 مل من الماء إلى زجاجة سعة 200 مل. ضع الزجاجة في حمام ماء بارد. أضف ببطء 150 مل من حمض الكبريتيك. قم بوضع غطاء للزجاجة بحيث يتم تنفيسها.
      2. السماح للحل بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة. استخدم الحل في غضون 3 أشهر.
    2. إعداد معايير الكربوهيدرات
      1. إعداد محلول السكريات المتعددة غير المعدلة في 1 ملغ / مل لاستخدامها كمعيار. بدلا من ذلك، استخدم مزيجا من السكريات الفردية في النسبة الموجودة في وحدة تكرار البوليساكريد، في 1 ملغم/ مل من إجمالي تركيز السكر، كمعيار.
        ملاحظة: على الرغم من أن مزيج السكر عادة ما يعطي نفس النتيجة مثل البوليمر الكربوهيدرات من تكوين السكر متطابقة، وينبغي تأكيد هذا تجريبيا.
    3. تأكد من أن كتلة التدفئة مع أصحاب أنبوب لأنابيب اختبار بوروسيليكاتي 13 × 100 يعمل. استخدم وسادة واقية تحت كتلة التدفئة المحيطة بها في حالة انسكاب الحمض. قبل تسخين كتلة التدفئة إلى 140 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة لتحقيق مستقرة، ودرجة حرارة موحدة من خلال جميع الكتل المستخدمة.
    4. تسمية 13 × 100 أنابيب اختبار borosilicate، ثلاثة كلورات لكل معيار وكل عينة. أضف 0 أو 2.5 أو 5 أو 7.5 أو 10 ميكروغرام (أو μL) من معيار الكربوهيدرات 1 ملغم/مل إلى الأنابيب القياسية المسماة في المقابل. أضف الماء إلى كل أنبوب لرفع مستوى الصوت إلى 100 ميكرولتر.
      ملاحظة: يعتمد اللون الذي تم إنشاؤه على سكريات معينة. وبما أن بعض السكريات تتطلب كتلة أكبر لتوليد نطاق الامتصاص الكامل، فقد تختلف الكميات الفعلية المستخدمة في المنحنى القياسي.
    5. إعداد عينة المقايسات بإضافة وحدة تخزين تحتوي على ~ 5 ميكروغرام من السكريد المشتق إلى ثلاثة أنابيب عينة وبذلك يصل إجمالي الحجم إلى 100 ميكرولتر مع الماء. بدلا من ذلك، إذا كان تركيز البوليساكريد في العينة غير معروف، قم بإجراء سلسلة من التخفيفات ذات 4 أضعاف. اختبار 100 ميكرولتر من كل تخفيف في ثلاثية.
    6. إعداد ريسورسينول الطازجة في 6 ملغ / مل في المياه deionized (dI) مباشرة قبل الاستخدام. دوامة حتى ريسورسينول في الحل. إضافة 100 ميكرولتر من 6 ملغ / مل ريسورسينول إلى كل أنبوب.
    7. صب بعناية الكمية المقدرة من حمض الكبريتيك 75٪ في كوب صغير.
      ملاحظة: ارتداء معطف المختبر، قفازات النتريل، ونظارات السلامة. كن حذرا من القطرات والانسكابات والبقع. الحفاظ على المناشف الورقية الرطبة مفيد لمسح أي يقطر. كما يتغير نشاط حمض الكبريتيك على التعرض الموسع للهواء، واستخدام خليط موحد من حمض الكبريتيك للمقايسة بأكملها.
    8. باستخدام ماسورة تكرار، إضافة موحدة 300 ميكرولتر من حمض الكبريتيك 75٪ إلى كل أنبوب. دوامة الأنابيب بقوة لخلط جيدا، مشيرا إلى أنبوب بعيدا في حين دوامة. ضع الأنابيب في كتلة سخان بوتيرة ثابتة في ترتيب تسلسلي. مرة واحدة في جميع الأنابيب، تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 3 دقائق على الفور.
    9. في 3 دقائق، وإزالة الأنابيب بوتيرة ثابتة في نفس الترتيب، ووضعها مباشرة في رف في حمام الماء المثلج. اترك الأنابيب حتى تصبح باردة الجليد. إزالة الأنابيب والسماح لهم بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة ل ~ 5 دقيقة لمنع التكثيف على cuvette أثناء القراءة.
    10. تعيين مطياف الأشعة فوق البنفسجية / VIS لقراءة امتصاص في 430 نانومتر باستخدام 10 ملم pathlength cuvette. فارغة مع أنبوب قياسي صفر. قراءة امتصاص جميع الأنابيب في 430 نانومتر.
      ملاحظة: cuvettes البلاستيك المتاح هي مريحة للاستخدام.
    11. بناء منحنى قياسي من خلال رسم ميكروغرام من الكربوهيدرات القياسية مقابلA 430. انظر الشكل 4 للحصول على منحنى قياسي نموذجي باستخدام الجلوكوز كمعيار مرجعي.
    12. استخدام أنابيب فحص العينة مع قيمA 430 تقع ضمن النطاق الخطي للمنحنى القياسي، وحساب كمية ميكروغرام من البوليساكريد غير معروف في أنابيب المقايسة عينة من معادلة منحنى القياسية. تحديد تركيز البوليساكريد غير معروف من حجم غير معروف المضافة، والمحاسبة عن التخفيفات. تحويل التركيز إلى وحدات تكرار ملغ / مل أو ميكرومتر حسب الحاجة.
  3. اختبار هايدرازيد باستخدام حمض كبرتونيك ترينيتروبنزين (TNBS)
    1. إعداد 0.9٪ NaCl تحتوي على 0.02٪ azide الصوديوم (عينة العازلة) عن طريق حل 9 غرام من NaCl و 200 ملغ من أزيد الصوديوم في DI H2O إلى حجم نهائي من 1 L.
    2. إعداد 0.1 M بورات الصوديوم، الأس الحموضة 9 (مخزن المقايسة)، عن طريق خلط 100 مل من 0.5 M بورات الصوديوم، الأس الحموضة 9، مع 400 مل من DI H2O. تأكد من أن الأس الحموضة الحل هو 9 ± 0.1؛ ضبط إذا لزم الأمر.
    3. إعداد 1٪ TNBS عن طريق تخفيف 200 ميكرولتر من 5٪ 2،4،6-trinitrobenzene محلول حمض الكبريتيك إلى 1 مل مع DI H2O. وضع علامة على الأنبوب كما 1٪ TNBS وتخزينها في 4 درجة مئوية في الظلام لمدة أسبوع.
    4. إعداد مخزون 50 mM ADH (أي ما يعادل 100 مليمتر هيدروهيد).
      1. تزن 871 ملغ من مسحوق ديهيرازيد الديهرازيدي (ADH) باستخدام التوازن التحليلي. حل مسحوق في زجاجة كاشف بإضافة عينة العازلة إلى 100 مل مع المعونة من رصيد محمل أعلى.
      2. تسمية الزجاجة كما 100 mM هيدرازيد / 50 م م. قم بوضع غطاء للزجاجة بإحكام واحفظها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة عام واحد.
    5. إعداد معايير الهيدرازيد (0.1، 0.2، 0.3، 0.4، 0.5، و 0.6 م هيدرازيد).
      1. إعداد معايير هيدرازيد 6 عن طريق تخفيف المخزون هيدرازيد 100 mM مع عينة العازلة مع المعونة من رصيد محمل أعلى. إعداد 100 مل من كل معيار لتقليل خطأ التركيز. أغلق الزجاجات بإحكام وخزنها عند 4 درجات مئوية لمدة عام واحد.
    6. إعداد ردود فعل المقايسة
      ملاحظة: يتم تشغيل المقايسة TNBS في حجم رد فعل من 1 مل. يتكون كل أنبوب مقايسة من 100 ميكرولتر من عينة (أو معيار) و875 ميكرولتر من المخزن المؤقت للآسايه و25 ميكرولتر من محلول TNBS بنسبة 1٪. يتم إعداد جميع ردود الفعل المقايسة (لكل من العينات والمعايير) في ثلاثة نسخ.
      1. تسمية 3 أنابيب الزجاج borosilicate (12 × 75 ملم) لكل معيار، بما في ذلك معيار الصفر. فرز وترتيب أنابيب القياسية في رف أنبوب في ترتيب زيادة التركيز. استخدم 100 ميكرولتر أو 200 ميكروبايت معايرة لإضافة 100 ميكرولتر من المعايير بدقة إلى كل أنبوب مناظر. بالنسبة لمعيار الصفر، استخدم 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة.
      2. تسمية 3 أنابيب الزجاج borosilicate (12 × 75 ملم) لكل عينة مخففة ليتم تقييمها. فرز وترتيب أنابيب العينة في رف أنبوب وفقا لذلك. استخدم 100 ميكرولتر أو 200 ميكروبايت معايرة لإضافة 100 ميكرولتر من العينة بدقة إلى كل أنبوب عينة مناظر.
      3. استخدام معايرة 1000 ميكروبايت ميكروبايت لإضافة بدقة 875 ميكرولتر من المخزن المؤقت للآسايه لجميع أنابيب المقايسة: المعايير والعينات.
    7. لبدء رد فعل المقايسة، استخدم 100 ميكروبايت ميكروبايت معايرة لإضافة 25 ميكرولتر بدقة من 1٪ TNBS إلى كل أنبوب مقايسة. تبدأ من أنابيب القياسية صفر، والانتقال إلى أنابيب القياسية من أجل زيادة التركيز، ثم إلى أنابيب العينة وفقا لترتيب محدد مسبقا. تغيير نصائح عند بدء معيار جديد أو عينة جديدة والحفاظ على الوقت الذي يقضيه في إضافة TNBS إلى جميع الأنابيب في غضون 5 دقائق.
      1. دوامة جميع أنابيب الفحص لمدة 2 ثانية بسرعة عالية أو في إعداد السرعة مما يسمح للسائل داخل أنبوب المقايسة لدوامة صعودا للوصول إلى ارتفاع 1/2 بوصة من فتح أنبوب.
      2. تسجيل وقت بدء المقايسة وتعيين جهاز ضبط الوقت إلى 2 ساعة. ضع حامل أنبوب المقايسة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عندما ينتهي الوقت، دوامة جميع الأنابيب مرة أخرى والمضي قدما في جمع البيانات.
    8. جمع البيانات
      1. دع مطياف الأشعة فوق البنفسجية/VIS يسخن واستقرار خط الأساس. تعيين الطول الموجي للكشف في 500 نانومتر لاريس الهيدرازيد. استخدم كوفيت كوارتز 1 مل من 1 سم باثلينجث لجميع قياسات الامتصاص للمقاولات بأكملها.
      2. بدء جمع البيانات عن طريق نقل المقايسة القياسية صفر إلى cuvette; فارغة الصك (تعيين امتصاص إلى الصفر).
      3. قم بإجراء قراءة واحدة على كل أنبوب وسجل قيم الامتصاص في جدول بيانات. إزالة أي السائل المتبقية من cuvette قبل قراءة عينة جديدة. تبدأ من المعايير الصفر، والانتقال إلى معايير زيادة التركيز، ومن ثم إلى العينات. بمجرد البدء، قم بتنفيذ جميع الخطوات بكفاءة دون إيقاف وقراءة جميع الأنابيب في غضون 10 دقائق.
    9. تحليل بيانات العينة
      1. إنشاء منحنى قياسي عن طريق رسم مقياس الهيدرازيد mM مقابل A500. اعثر على معادلة المنحنى القياسية في شكل y =x + b، حيث تمثل y هيدرازيد mM وتمثل x A500. انظر الشكل 4 للحصول على منحنى قياسي نموذجي.
      2. حساب هيدرازيد mM في العينات باستخدام معادلة منحنى القياسية، وتعديل لعوامل التخفيف. اختر فقط أنابيب فحص العينة التي تقع قيم A500 ضمن النطاق الخطي للمنحنى القياسي للحساب.
      3. حساب نسبة الضرس من الهيدرازيد / البوليساكريد باستخدام المعادلة (1).
        هيدرازايد/بوليساكريد = ح / ج × ميجاوات (1)
        حيث ح هو هيدرازيد mM، ج هو تركيز ملغ / مل من البوليساكريد، وميغاواط هو الوزن الجزيئي البوليساكريد في KDa.
      4. حساب كثافة وضع العلامات هيدرازيد لكل 100 كيلودا من البوليساكريد باستخدام المعادلة (2).
        كثافة وضع العلامات لكل 100 kDa البوليساكريد = ح / ج × 100 (2)
        حيث ح هو هيدرازيد mM، وجيم هو تركيز ملغ / مل من البوليساكريد.
        ملاحظة: للراحة، يمكن اعتبار السكريات أن يكون لها وزن جزيئي من دالتون 100،000. وهذا يسمح للمرء أن ينظر في "كثافة وضع العلامات" في مقارنة مستوى اشتقاق السكريات المختلفة.
      5. حساب كثافة وضع العلامات هيدرازيد كنسبة الوزن ADH.
        1. تحديد تركيز ملغم / مل الفعال من ADH باستخدام المعادلة (3).
          ملغم/مل ADH = (mM هيدرازيد / 1000) × 174 (3)
          حيث 174 هي ميغاواط من ADH.
        2. حساب الوزن ٪ ADH باستخدام المعادلة (4).
          الوزن ٪ ADH = (ملغم/ مل ADH) / (ملغم/ مل بوليساكريد) × 100 (4)

Representative Results

لتوضيح تفعيل واشتقاق البوليساكريد باستخدام كيمياء CDAP ، تم تنشيط dextran في 0.25 و 0.5 ملغ CDAP / ملغ dextran. لكل رد فعل، تم تبريد محلول ديكتران 10 ملغم/مل في الماء على الجليد، وأضيف المجلد1/10 من مخزون DMAP 2.5 M (الذي تم إعداده كما هو موضح في القسم 3). تم جلب الحل النهائي إلى درجة الحموضة 9 بإضافة 0.1 M NaOH في 10 ميكرولتر aliquots. وأضاف CDAP أن الحل كان مبردا ومثارا، وحافظت درجة الحموضة على درجة الحموضة 9 بإضافة 10 ميكرولتر aliquots من 0.1 M NaOH لمدة 15 دقيقة.

ثم تم الاتصال ب dextran المسمى بشكل تسلسلي مقابل 1 M NaCl و 0.15 M NaCl والمياه كما هو موضح في القسم 6. ثم تم فحص ADH-dextran لdxtran باستخدام المقايسة حمض ريسورسينول / الكبريتيك (القسم 7.2). يظهر منحنى قياسي نموذجي باستخدام الجلوكوز كمعيار السكر في الشكل 4A. تم تحديد محتوى الهيدرازيد باستخدام المقايسة TNBS الموضحة في القسم 7.3. منحنى معياري نموذجي للهيدرازيد باستخدام ADH كما هو معطى المعيار في الشكل 4B.

تظهر الحسابات التمثيلية من تنشيط dextran على مستويي التنشيط في الشكل 4A، B. يتم تقديم البيانات على أنها هيدرازيدس لكل 100 كيلودا من البوليمر ديكتران وكوزن في المئة من ADH إلى dextran، كما هو موضح في القسمين 7.9.3.4 و 7.9.3.5، على التوالي، في الشكل 4C. وتضاعفت درجة الاشتقاق تقريبا مع تضاعف نسبة CDAP.

Figure 1
الشكل 1: التركيب الكيميائي للCDAP. CDAP = 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبريدين رباعي فلوريبوروبورات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: عملية تفعيل CDAP و اقترانها. وتنقسم العملية من الناحية المفاهيمية إلى مرحلتين، مع البوليساكريد المنشط المشترك بين كليهما. في ظل الظروف الأساسية، CDAP ينشط هيدروكسيلات السكريد، والإفراج عن DMAP (رد فعل 1). كما يصدر التحلل المائي CDAP DMAP (رد الفعل 3). على الرغم من أن يظهر سيانو-استر، وهذا قد لا يكون الوسيط الفعلي. المتوسط هو، لذلك، يشار إلى (CDAP) "تنشيط" البوليساكريد. خلال مرحلة التنشيط الأولى ، يمكن للبوليساكريد المنشط التحلل المائي (رد الفعل 4) أو الخضوع لتفاعلات جانبية (رد الفعل 5). في مرحلة اقتران الثاني (رد فعل 2), يتفاعل البوليساكريد المنشط مع أمين لتشكيل رابطة ايسوريا مستقرة بالإضافة إلى ردود الفعل 4 و 5. المختصرات: CDAP = 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين رباعي فلوريدورات; DMAP = 4-ديميثيلامينوبيريدين; R-NH2 = أمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3:تفعيل CDAP و اقترانها. تتطلب العملية موازنة التفاعل CDAP مع البوليساكريد واستقرار CDAP وبوليساكريد المنشط ، وكذلك التفاعل بين البوليساكريد المنشط وبوليساكريد المنشط مع أمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: النتائج التمثيلية لتفعيل CDAP من dextran. منحنيات قياسية نموذجية ل (A) ريسورسينول / حامض الكبريتيك و (B) TNBS المقايسات. تظهر نتائج الفحص لdxtran تفعيلها مع 0.25 و 0.5 ملغ CDAP / ملغ dextran. تم استخدام الجلوكوز كمعيار لالقايس ريسورسينول. Dextran, في ملغ / مل, وينقسم إلى 100 كيلودا لإعطاء تركيز الضرس. يتم تحديد تركيز الهيدرازيد باستخدام ADH كمعيار والنتائج المعبر عنها على أنها μM Hz. (C) حساب الهيدرازيد: نسب الدكستران. تم حساب مستوى الاشتقاق على أنه هيدرازيدات لكل 100 كيلودا من ديكتران لتسهيل المقارنة بين البوليمرات من الأوزان الجزيئية المتوسطة المختلفة. تم حساب نسبة الوزن ل g ADH/g dextran باستخدام ميغاواط من 174 جم/مول ل ADH. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

CDAP هو كاشف مريحة ل derivatize وترافق السكريات. توضح هذه المقالة الأسلوب العام لاستخدام CDAP اشتقاق السكريات مع الهيدرازيدات (PS-ADH) ويتضمن التحسينات المنشورة مؤخرا8. أولا، تؤكد التقنية على أهمية الحفاظ على الرقم PH الهدف للتحكم في عملية التنشيط. وجدنا أنه في حين أن العديد من المخازن المؤقتة المشتركة تتداخل مع رد فعل تنشيط CDAP ، يمكن استخدام DMAP بنجاح كعازل لإدارة درجة الحموضة8. وعلاوة على ذلك، DMAP هو بالفعل نتيجة ثانوية رد فعل لتفعيل CDAP. وأخيرا، التخزين المؤقت حل السكريات مع DMAP قبل إضافة CDAP يسهل الاستهداف الدقيق والحفاظ على درجة الحموضة رد الفعل. كما نقوم بوصف ذلك، من المفيد ضبط درجة الحموضة في محلول مخزون DMAP المركز بحيث عندما يتم تخفيفه، يصل إلى درجة الحموضة المستهدفة. ثانيا، أدى أداء العملية في البرد إلى إبطاء وقت التفاعل، مما جعل عملية التنشيط أقل جنونا وأكثر تسامحا. انخفاض درجة الحرارة انخفض معدل التحلل المائي CDAP، ووقت التنشيط الأمثل في درجة الحموضة 9 يزيد من ~ 3 دقيقة إلى ~ 15 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، مطلوب CDAP أقل لتحقيق نفس المستوى من التنشيط مما كانت عليه عند تنفيذها في درجة حرارة الغرفة.

يمكن اقتران السكريات المشتقة من ADH بالبروتينات باستخدام الكاربيديميدات (على سبيل المثال، EDAC)7. على سبيل المثال، تستخدم العديد من لقاحات الأنفلونزا الهيموفلوس B (Hib) المرخصة فوسفات البولي ريبوسيلريبيتولات (PRP) المشتق من ADH للترافق مع توكسويد الكزاز باستخدام EDAC. تم استخدام CNBr في البداية ، ولكن CDAP هو كاشف أسهل بكثير لاستخدامه لهذا الغرض. في تجربتنا، مجموعة أهداف جيدة ل ADH اشتقاق هو 10-30 هيدرازيد لكل 100 كيلودا البوليساكريد أو ~ 1-3٪ ADH حسب الوزن.

ويمكن استخدام نفس العملية لاستخلاص السكريات مع الأمينات الأولية عن طريق استبدال ADH لديامين. فمن المستحسن استخدام الهيكسان ديامين ل derivatize السكريات مع الأمينات8. يمكن اقتران البوليساكريد الأميني (PS-NH2)باستخدام الكواشف المطورة لالترابط البروتيني11. عادة، يتم اشتقاق PS-NH2 مع maleimide (على سبيل المثال، succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]سيكلوهيكسان-1-كاربوكسيلات (SMCC) أو N-γ-ماليميدوبوترييل-أوكسيسوتشينيميد استر (GMBS))، ويتم ثيولاتيد البروتين (على سبيل المثال، مع succinimidyl 3-(2-بيريديلديثيو)بروبيونات (SPDP)). كيمياء ثيول ماليميد فعالة جدا.

ويمكن أيضا أن يقترن مباشرة البروتينات إلى السكريات البوليساكريد CDAP تنشيط عن طريق ɛ أمين على اليسينات. في حين أن بروتوكول التنشيط المستخدم يشبه بشكل عام البروتوكول الموضح هنا ، فمن الضروري تحسين مستوى التنشيط والبوليساكاريد وتركيز البروتين ، وكذلكنسبةالبروتين: البوليساكريد 5و6و8.

Dextran هي واحدة من أسهل السكريات لتنشيط مع CDAP نظرا لكثافة عالية نسبيا من مجموعات الهيدروكسيل، ولكن بعض السكريات، مثل مستضد Vi، يمكن أن يكون تحديا. وبالتالي، لا يوجد بروتوكول "أفضل" واحد لإقران CDAP مباشرة بالبروتينات. نقترح أولا تطوير بروتوكول لتحقيق مستويات مناسبة من التنشيط ، كما يحددها مدى اشتقاق الهيدرازيد ، ثم الشروع في توجيه اقتران البروتين إلى البوليساكريد المنشط CDAP.

Disclosures

أندرو ليس هو مؤسس ومالك فينا Biosolutions. وهو يحمل العديد من براءات الاختراع المتعلقة بكيمياء CDAP ويستفيد من ترخيص الكيمياء والدراية اقتران CDAP.

Acknowledgments

تم تمويل العمل الموصوف هنا من قبل شركة فينا Biosolutions ذ.م.م.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile Sigma 34851
Adipic acid dihydrazide Sigma A0638 MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa Millipore UFC901008 MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS
Analytical balance
Autotitrator or electronic pipet
Beaker  2-4 L
CDAP SAFC RES1458C Sigma
DMAP Sigma 107700 MW 122.2
Flake ice
HCl 1 M VWR BDH7202-1
Micro stir bar VWR 76001-878
Microfuge tube (for CDAP) VWR 87003-294
NaCl VWR BDH9286
NaOH 1 M Sigma 1099130001
NaOH 10 M Sigma SX0607N-6
pH meter
pH probe Cole Parmer 55510-22 6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH temperature probe
Pipets & tips
Saline or PBS
Small beaker 5-20 mL VWR 10754-696 A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet
Small ice bucket
Small spatula
Stir plate
Resorcinol assay
Combitip Eppendorf 10 ml
DI water
Dialysis tubing Repligen 132650T Spectra/Por 6-8kDa
Dialysis tubing clips Repligen 142150
Heating block
Nitrile gloves VWR
Repeat pipettor Eppendorf M4
Resorcinol Sigma 398047
Sugar standard As appropriate
 Sulfuric acid 75% VWR BT126355-1L
Timer
TNBS assay
Adipic dihydrazide Sigma A0638 MW 174
Borosilcate test tubes 12 x 75 VWR 47729-570
Sodium borate, 0.5 M pH 9 Boston Biologicals BB-160
TNBS 5% w/v Sigma P2297 MW 293.17

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ellis, R. W., Granoff, D. M. Development and clinical uses of Haemophilus B conjugate vaccines. , CRC Press. (1994).
  2. Goebel, W. F., Avery, O. T. Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. Journal of Experimental Medicine. 50 (4), 533-550 (1929).
  3. Mond, J. J., Vos, Q., Lees, A., Snapper, C. M. T cell independent antigens. Current Opinion in Immunology. 7 (3), 349-354 (1995).
  4. Conjugate Vaccines. Cruse, J. M., Lewis, R. E. 10, Karger. Basel. (1989).
  5. Lees, A., Nelson, B. L., Mond, J. J. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. Vaccine. 14 (3), 190-198 (1996).
  6. Shafer, D. E., et al. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano-4-dimethylaminopyridinium tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. II. Selective crosslinking of proteins to CDAP-activated polysaccharides. Vaccine. 18 (13), 1273-1281 (2000).
  7. Schneerson, R., Barrera, O., Sutton, A., Robbins, J. B. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide-protein conjugates. Journal of Experimental Medicine. 152 (2), 361-376 (1980).
  8. Lees, A., Barr, J. F., Gebretnsae, S. Activation of soluble polysaccharides with 1-cyano- 4-dimethylaminopyridine tetrafluoroborate (CDAP) for use in protein-polysaccharide conjugate vaccines and immunological reagents. III Optimization of CDAP activation. Vaccines. 8 (4), 777 (2020).
  9. Qi, X. -Y., Keyhani, N. O., Lee, Y. C. Spectrophotometric determination of hydrazine, hydrazides, and their mixtures with trinitrobenzenesulfonic acid. Analytical biochemistry. 175 (1), 139-144 (1988).
  10. Monsigny, M., Petit, C., Roche, A. C. Colorimetric determination of neutral sugars by a resorcinol sulfuric acid micromethod. Analytical biochemistry. 175 (2), 525-530 (1988).
  11. Hermanson, G. Bioconjugate Techniques. 3rd ed. , Academic Press. (2013).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 172،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP)
Posted by JoVE Editors on 07/09/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP). A figure was updated.

Figure 4 was updated from:

Figure 4
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Figure 4
Figure 4: Representative results for CDAP activation of dextran. Typical standard curves for the (A) resorcinol/sulfuric acid and (B) TNBS assays. The assay results for dextran activated with 0.25 and 0.5 mg CDAP/mg dextran are shown. Glucose was used as the standard for the resorcinol assay. Dextran, in mg/mL, is divided by 100 kDa to give a molar concentration. The hydrazide concentration is determined using ADH as the standard and the results expressed as µM Hz. (C) Calculation of hydrazide: dextran ratios.The level of derivatization was calculated as hydrazides per 100 kDa of dextran to facilitate the comparison between polymers of different average molecular weights. The % weight ratio of g ADH/g dextran was calculated using a MW of 174 g/mole for ADH. Please click here to view a larger version of this figure.

تفعيل وارتقاط السكريات المتعددة القابلة للذوبان باستخدام 1-سيانو-4-ديميثيلامينوبيريدين تترافلوروبورات (CDAP)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lees, A., Zhou, J. Activation and… More

Lees, A., Zhou, J. Activation and Conjugation of Soluble Polysaccharides using 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborate (CDAP). J. Vis. Exp. (172), e62597, doi:10.3791/62597 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter