Aktivering og bøjning af opløselige polysaccharider ved hjælp af 1-Cyano-4-Dimethylaminopyridine Tetrafluoroborat (CDAP)

Summary

Proteiner og aminholdige ligander kan være kovalent forbundet med polysaccharider aktiveret af cyanylation reagens, 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat (CDAP), til at danne kovalent protein (ligand)-polysaccharid konjugates. I denne artikel beskrives en forbedret protokol til udførelse af kontrolleret CDAP-aktivering ved 0 °C og varierende pH og efterfølgende bøjning af de aktiverede polysaccharider.

Abstract

Konjugatvacciner er bemærkelsesværdige fremskridt inden for vaccinologi. Til fremstilling af polysaccharidkonjugatvacciner kan polysaccharider bekvemt funktionaliseres og forbindes med vaccinebærerproteiner ved hjælp af 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat (CDAP), et cyanylende reagens, der er let at håndtere. CDAP aktiverer polysaccharider ved at reagere med kulhydrathydrathydrxylgrupper ved pH 7-9. Stabiliteten og reaktiviteten af CDAP er meget pH-afhængige. Reaktionens pH-fejl falder også under aktiveringen på grund af hydrolysen af CDAP, hvilket gør god pH-styring af nøglen til reproducerbar aktivering. Den oprindelige CDAP-aktiveringsprotokol blev udført ved stuetemperatur i ikke-byggede pH 9-løsninger.

På grund af den hurtige reaktion under denne tilstand (<3 min) og det medfølgende hurtige pH-fald fra den hurtige CDAP-hydrolyse var det udfordrende hurtigt at justere og vedligeholde målreaktions-pH'en inden for den korte tidsramme. Den forbedrede protokol, der er beskrevet her, udføres ved 0 °C, hvilket bremser CDAP-hydrolyse og forlænger aktiveringstiden fra 3 min til ~ 15 min. Dimethylaminopyridin (DMAP) blev også brugt som buffer til at justere polysaccharidopløsningen til målaktiverings-pH'en, før CDAP-reagenset blev tilføjet. Den længere reaktionstid kombineret med den langsommere CDAP-hydrolyse og brugen af DMAP-buffer gør det lettere at opretholde aktiverings-pH'en i hele aktiveringsprocessens varighed. Den forbedrede protokol gør aktiveringsprocessen mindre hektisk, mere reproducerbar og mere modtagelig for opskalering.

Introduction

Konjugatvacciner, såsom dem, der består af polysaccharider, der er kovalent forbundet med et bæreprotein, er blandt de bemærkelsesværdige fremskridt inden for vaccinologi^1,2. Polysaccharider, som T-celle-uafhængige antigener, er dårligt immunogene hos spædbørn og fremkalder ikke hukommelse, klasseskift eller affinitetsmodning af antistoffer³. Disse mangler overvindes i polysaccharid konjugatvacciner⁴. Da de fleste polysaccharider ikke har et praktisk kemisk håndtag til bøjning, skal de først gøres reaktive eller "aktiveres". Den aktiverede polysaccharid forbindes derefter enten direkte med proteinet (eller modificeret protein) eller funktionaliseres til yderligere derivatisering før^{bøjning 4}. De fleste licenserede polysaccharid konjugatvacciner bruger enten reduktiv amination eller cyanylation til at aktivere polysaccharid hydroxyls. Cyanogenbromid (CNBr), et reagens, der tidligere var blevet brugt til at aktivere kromatografiharpikser, blev oprindeligt brugt til polysaccharidderivatisering. CNBr kræver dog høj pH, typisk ~ pH 10,5 eller derover, for delvist at deprotonere polysaccharid hydroxyls, så de er tilstrækkeligt nukleophilic til at angribe cyanogruppen. Den høje pH-fejl kan være skadelig for basis-labile polysaccharider, og hverken CNBr eller den aktive cyano-ester, der oprindeligt blev dannet, er tilstrækkelig stabil ved så høj pH.

CDAP (1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat; Figur 1) blev indført af Lees et al. til brug som cyanylerende middel til aktivering af polysaccharider^5,6. CDAP, som er krystallinsk og let at håndtere, viste sig at aktivere polysaccharider ved en lavere pH end CNBr og med færre bivirkninger. I modsætning til CNBr kan CDAP-aktiverede polysaccharider konjugeres direkte til proteiner, hvilket forenkler synteseprocessen. CDAP-aktiverede polysaccharider kan funktionaliseres med en diamin (f.eks. hexanediamin) eller et dihydrazid (f.eks. adipic dihydrazid, ADH) for at fremstille amino- eller hydrazidderivatiserede polysaccharider. En høj koncentration af det homobifunktionelle reagens bruges til at undertrykke krydskædning af polysaccharider. Amino polysaccharider kan derefter konjugers ved hjælp af nogen af de utallige teknikker, der anvendes til protein bøjning. Hydrazid-derivatiserede polysaccharider er ofte koblet til proteiner ved hjælp af et carbodiimid reagens (f.eks. 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC))⁷. Yderligere optimering af CDAP polysaccharid aktivering er blevet beskrevet af Lees et al.⁸ og er indarbejdet i protokollen beskrevet her.

OVERSIGT OVER CDAP-bøjning
CDAP-protokollen kan konceptualiseres som to faser: (1) aktivering af polysaccharid og (2) bøjning af det aktiverede polysaccharid med et protein eller ligand (figur 2). Målet med det første skridt er effektivt at aktivere polysaccharid, mens målet med det andet er effektivt at konjugere til den aktiverede polysaccharid. Den aktiverede polysaccharid binder de to trin sammen. Denne konceptualisering hjælper med at fokusere på de kritiske elementer i hvert trin. Figur 2 udvider denne konceptualisering, der viser de ønskede aktiverings- og koblingsreaktioner sammen med hydrolysereaktionerne og bivirkningerne.

I aktiveringsfasen er de tre største bekymringer CDAP-stabilitet, CDAP-reaktion med polysaccharidhydrxyl og stabiliteten af det aktiverede polysaccharid (figur 3). CDAP hydrolyse stiger med pH, ligesom hydrolyse af den aktiverede polysaccharid og sidereaktionerne. CDAP-reaktionen med polysaccharid lettes dog ved at øge pH-markedet. Effektiv aktivering af polysaccharider med CDAP kræver en balance mellem 1) polysaccharidens og CDAP's reaktivitet og 2) hydrolyse og sidereaktioner fra både reagenset og det aktiverede polysaccharid.

I den oprindelige CDAP-aktiveringsprotokol, der er beskrevet af Lees et al.⁵, blev CDAP-aktivering af polysaccharider udført ved stuetemperatur i ukøbt pH 9-opløsning. Aktiveringshastigheden viste sig at være hurtig under denne betingelse, og aktiveringen ville være komplet inden for 3 min. Reaktionen blev også ledsaget af hurtig hydrolyse af CDAP, hvilket forårsagede et hurtigt pH-fald i den ikke-byggede reaktionsløsning. Det var udfordrende hurtigt at hæve og opretholde reaktionen pH på målværdien i så kort tid. I den beskrevne protokol blev aktiveringen udført ved at tilføje CDAP fra en 100 mg / mL lageropløsning til den ikke-byggede polysaccharidopløsning. pH blev hævet 30 s senere med "et lige volumen på 0,2 M triethylamin". Protein, der skal konjugers blev derefter tilsat efter 2,5 min til aktiveringsreaktionen. Navnlig var pH-adressen på aktiveringstrinnet ikke velkontrolleret og overskred sandsynligvis oprindeligt mål-pH'en. Den hurtige reaktion, der kræver hurtig pH-justering, gjorde aktiveringsprocessen vanskelig at kontrollere og udfordrende at skalere op.

I modsætning til den oprindelige protokol har den ændrede protokol, der er beskrevet her, to store forbedringer. For det første er polysaccharidopløsningens pH-pH-side justeret til målaktivering af pH ved hjælp af DMAP som buffer før tilsætning af CDAP. DMAP har en pKa på 9,5 og har således god buffereffekt omkring pH 9, og i modsætning til mange andre buffere blev DMAP ikke fundet at fremme CDAP hydrolyse⁸. Desuden er DMAP allerede en proces mellemliggende og tilføjer derfor ikke en ny komponent til reaktionsblandingen. Forjustering af pH-vedligeholdelsen, før cdap tilføjes, eliminerer det store pH-sving i begyndelsen af reaktionen og giver mulighed for en mere effektiv vedligeholdelse af mål-pH'en under reaktionen. Den anden forbedring er at udføre aktiveringsreaktionen ved 0 °C, hvor CDAP-hydrolysehastigheden er markant langsommere end ved stuetemperatur. Med den længere halveringstid i reagens ved 0 °C øges aktiveringstiden fra 3 min til 15 min for at kompensere for den langsommere aktiveringshastighed ved den lavere temperatur. Den længere reaktionstid gør det igen lettere at opretholde reaktions-pH-virksomheden. Anvendelsen af 0 °C forsinker også nedbrydningen af pH-følsomme polysaccharider, hvilket gør det muligt at forberede konjuger af denne type polysaccharid. Forbedringerne i protokollen gør aktiveringsprocessen mindre hektisk, lettere at kontrollere, mere reproducerbar og mere modtagelig for opskalering.

I denne artikel beskrives den forbedrede protokol til udførelse af kontrolleret CDAP-aktivering af polysaccharid ved 0 °C og ved en bestemt mål-pH-værdi og efterfølgende derivatisering af de aktiverede polysaccharider med ADH. Også beskrevet er en trinitrobenzene sulfatsyre (TNBS) assay, baseret på metoden qi et al.⁹, til bestemmelse af hydrazid niveau på den modificerede polysaccharid. En modificeret analyse for hexoser baseret på resorcinol og svovlsyre¹⁰ er også beskrevet, som kan bruges til bestemmelse af en bredere vifte af polysaccharider. For mere information om CDAP aktivering og bøjning, læseren henvises til tidligere publikationer^5,6,8 af Lees et al.

Protocol

BEMÆRK: Forbered polysaccharidopløsningen, ADH-løsningen, DMAP-opløsningen og CDAP-lageropløsningen på forhånd, før du udfører polysaccharidaktiverings- og funktionaliseringsprocedurerne. Placer løsninger og udstyr på et organiseret, praktisk og logisk sted. Den beskrevne reaktion er for 10 mg polysaccharid og kan skaleres op eller ned. Det anbefales at evaluere protokollen i mindre målestok, før opskalering.

1. Klargør 5 mg/mL polysaccharidopløsning, 2 mL.

1. For lyophilized polysaccharid
   1. Lad polysaccharidbeholderen komme til stuetemperatur før åbning. Afvej 10 mg polysaccharid inde i en skrue-cap rør ved hjælp af en analytisk balance. Brug en statisk eliminator til lettere prøveudtagning og mere præcis vejning af pulveret.
   2. Der tilsættes 2 mL 0,15 M natriumchlorid (NaCl) til røret for at opløse polysacchariden. Cap og hvirvle røret.
      BEMÆRK: Natriumchlorid påvirker ikke CDAP-reaktionen, men det kan påvirke polysaccharid sekundære struktur. Nogle polysaccharider er mere opløselige ved forskellige saltkoncentrationer.
   3. Bland røret ved end-over-end rotation i 12-24 timer, afhængigt af polysaccharid molekylvægt, for at gøre det muligt for polysaccharid at hydrere fuldt ud. Varm om nødvendigt forsigtigt røret for at fremme solubilisering.
2. Til opløses polysaccharid i bufferopløsning
   BEMÆRK: For effektiv CDAP-aktivering må polysaccharidopløsningen ikke indeholde nogen buffer, især fosfation. Følg nedenstående procedure for at erstatte bufferen med vand eller en saltvandsopløsning og for at justere polysaccharidkoncentrationen til 5 mg/mL.
   1. Få fat i en 4 mL- eller 15 mL centrifugal-spin-filterenhed af den relevante molekylvægtsnedskæring (MWCO).
      BEMÆRK: MWCO er ideelt set 5-10 gange mindre end polysaccharidens molekylvægt.
   2. Tilsæt et volumen af den bufferede polysaccharidopløsning, der indeholder ~ 20 mg af polysaccharid til filterindsatsen. Fyld til det fulde mærke med vand eller en saltvandsopløsning. Hætte filteret tæt. Bland ved end-over-end et par gange.
   3. Centrifuge filterenheden ved den centrifugalkraft, som producenten foreslår. Sørg for, at centrifugeringstiden er lang nok til at opnå mindst 5 gange volumenreduktion efter hvert spin. Kassér gennemstrømningen. Saml filterenheden igen.
   4. Genopfyld filterindsatsen til det fulde mærke med ferskvands- eller saltvandsopløsning. Hætte filteret tæt. Bland indholdet i filteret efter end-over-end rotation ~ 10 gange eller ved blid hvirvlen; gentag spin.
      BEMÆRK: Polysaccharid kan ophobes i bunden af filterindsatsen på centrifugalanordningen og danne en gel. Det anbefales at blande retentanten inde i filterindsatsen igen med den friske genopfyldning inden næste spin.
   5. Gentag genopfyldnings- og spincyklussen i mindst 3 gange.
   6. Følg øvelsen nedenfor for at gendanne polysaccharid retentant fra filterindsatsen.
      1. Tilsæt ferskvand eller saltvand til filterindsatsen, så lydstyrken er ~1 mL. Bland ved pipetter op og ned eller ved blid hvirvlende.
      2. Overfør alle de blandede retentant til en 5 mL rør. Der tilsættes 1 mL ferskvand eller saltvand til filterindsatsen. Skyl filteret ved at pipetter op og ned eller ved at hvirvle. Overfør og kombiner alle skylninger med det genvundne polysaccharid.
   7. Polysaccharidkoncentrationen bestemmes (se polysaccharidanalysen i punkt 7.3). Polysaccharid fortyndes med ekstra vand eller saltvand til 5 mg/mL.
3. Når polysaccharidopløsningen er forberedt, afkøles røret, der indeholder polysaccharidopløsningen, i en isspand.

2. Tilbered 0,5 M adipic syre dihydrazid (ADH) opløsning, 10 mL.

1. Veje 0,87 g ADH i en analytisk balance, og opløses i 8 ml af 0,1 M HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonsyre), pH 8.
2. Juster til mål pH med 1 M natriumhydroxid (NaOH), overvåget af en pH-måler. Bring til 10 mL med ekstra buffer og re-bekræfte pH.

3. Klargør 2,5 M DMAP-opløsning, 10 mL.

BEMÆRK: DMAP er giftig og vil trænge ind i huden. Brug nitrilhandsker, når du udfører proceduren.

1. Afvejes forsigtigt 3 g DMAP i et 50 mL konisk rør. Tilsæt 5 ml vand til DMAP og bland ved hvirvlende i 5 min for at opnå en overskyet opløsning (~ 7 ml).
2. Under blanding tilsættes 50 μL-trin på 10 N saltsyre (HCl) til DMAP-opløsningen. Bland mellem hver tilføjelse. Stop med at tilføje, når løsningen bliver klar.
3. Tilføj 10 N NaOH i 25 μL-trin for at bringe DMAP-opløsningen til ~ pH 8.
4. Bring DMAP-opløsningen op på 10 mL med vand for at give en 2,5 M opløsning.
5. Finjuster pH-værdi for 2,5 M DMAP-løsningen.
   BEMÆRK: DMAP-opløsning pH ændringer med koncentration og ionisk styrke. Denne øvelse er at finjustere 2,5 M DMAP lager til en bestemt pH, så når det blandes med 10 mængder polysaccharid, den resulterende løsning er tæt på målet pH til aktivering.
   1. Der fremstilles en serie på 1,5 mL rør, der indeholder 1 mL vand eller NaCl-opløsningen, alt efter hvad der blev brugt til fremstilling af polysaccharidopløsningen. Slap af rørene på is.
   2. Der tilsættes 100 μL DMAP til et kølet rør. Vortex og måle pH med en pH-meter. Kassér derefter det målte rør.
   3. Hvis den målte pH-værdi ikke er tæt på målværdien, skal DMAP-aktiens pH-beholdning justeres med 1 M NaOH eller HCl efter behov. Gentag trin 3.5.2 og 3.5.3, indtil den målte pH er tæt på mål pH.

4. Klargør 100 mg/mL CDAP lageropløsning

BEMÆRK: CDAP-pulveret skal holdes tæt lukket og opbevares ved -20 °C og have lov til at komme til stuetemperatur før åbning. Brug nitrilhandsker, når du udfører proceduren.

1. Tare en 1,5 mL snap-cap mikrocentrifuge rør på en analytisk balance. Brug en lille spatel, vejer ud 10-140 mg CDAP i røret. Bemærk cdap's faktiske vægt.
2. Bestem mængden af acetonitril, der er nødvendig for at forberede 100 mg/ML CDAP. Åbn acetonitril i en røghætte.
3. Brug en passende volumenpipet, tegne og frigive acetonitrile at ekvilibrere sin damp i pipet spids. Vent på, at opløsningsmidlet drypper ud af pipetspidsen efter et par sekunder, og vær forberedt på at overføre det direkte til CDAP-røret. Tegn den beregnede mængde acetonitril og overfør den direkte til CDAP-røret. Sæt hætten lukket.
   BEMÆRK: Acetonitrile kan også overføres til CDAP-røret ved hjælp af en Hamilton-sprøjte eller tilsvarende af passende størrelse.
4. Vortex til fuldt ud at opløse CDAP. Placer CDAP-røret i en isspand.
   BEMÆRK: CDAP er stabil i acetonitrile i kulden. Opløselige lagre kan opbevares på -20 °C i >1 uge. Det er dog at foretrække at forberede friske CDAP-løsninger.

5. Aktivering af polysaccharid og hydrazidfunktionalisering

1. Sørg for, at alle følgende elementer er klar og løsninger kølet på is, før aktiveringen påbegyndes: 2 mL af en 5 mg/mL polysaccharidopløsning i en fladbundet, bredmundsbeholder, der indeholder en rørestang, placeret oven på en magnetisk omrører 100 mg/mL CDAP lageropløsning; 2,5 M DMAP lagerløsning; en pH-måler med en semimikro-pH-sonde, såsom sonden med en diameter på 6 mm, kalibreret til 0 °C i overensstemmelse med fabrikantens anvisninger en 100 μL-pipet, der er klar til brug en timer ryddet og klar til brug; et autotitratordispenserhoved placeret eller 10 μL pipet klar til brug 0,5 M ADH-løsning.
2. Forjuster polysaccharidens pH-pH til mål-pH'en ved hjælp af DMAP.
   1. Placer pH-sonden i polysaccharidopløsningen, og lad den være i opløsningen under hele aktiveringsproceduren.
   2. 200 μL af DMAP-lageropløsningen overføres til polysaccharidopløsningen ved dråbetilsætning under omrøring. Juster pH-adressen på løsningen til målaktiverings-pH-adressen. Tilføj 0,1 M HCl for at sænke pH og 0,1 M NaOH for at øge pH.'en. Undgå at overskride mål pH med mere end 0,1 pH-enhed, og hold reaktionen kølet i et isvandsbad under aktiveringen.
3. CDAP-aktivering
   1. Pipet 100 μL CDAP op og ned for at ekvilibrere dampen i pipetspidsen. Overfør 100 μL CDAP til polysaccharidopløsningen under omrøring.
      BEMÆRK: Denne aktivering bruger 1 mg CDAP for 1 mg polysaccharid som udgangsforhold. Forholdet kan øges eller reduceres ved optimering af aktiveringen.
   2. Start timeren, og overvåg pH-ændringen under hele aktiveringen. Bevar reaktionen ved mål-pH ved straks at tilsætte 10 μL-trin på 0,1 M NaOH til reaktionen ved hjælp af en autotitratordispenser (eller pipet).
      BEMÆRK: Det kan hjælpe med at reducere pH-responstiden for at røre forsigtigt med en pH-sonde. pH falder hurtigere i begyndelsen, og det kan være nødvendigt at tilføje 0,1 M NaOH oftere. Efterhånden som reaktionen fortsætter, bliver pH-faldet langsommere, og tilføjelsen bliver mindre hyppig. pH-adressen skal forblive stort set uændret, når den nærmer sig den optimale aktiveringstid, som er 10-15 min for pH 9 aktivering.
4. ADH-funktionalisering
   1. Når den optimale aktiveringstid er nået, tilsættes 2 mL på 0,5 M ADH på én gang til den aktiverede polysaccharid under omrøring. Kontroller, at pH er i målområdet (pH 8-9 for ADH).
      BEMÆRK: En tilføjelse med hurtig blanding minimerer sandsynligheden for, at begge ender af dihydraziden reagerer med det aktiverede polysaccharid, hvilket forhindrer polysaccharid crosslinking.
   2. Fortsæt med at røre reaktionsblandingen i mindst 1 time. Reaktionsblandingen overføres til 4 °C, men 0-20 °C er acceptabel.
      BEMÆRK: ADH-funktionaliseringsreaktionen er ikke stærkt afhængig af temperaturen. Da det store overskud af dihydrazid fungerer som quenching reagens, er det ikke nødvendigt at slukke det aktiverede polysaccharid yderligere. Når proteiner bøjes direkte, skal reaktionen dog slukkes, typisk med 1 M glycin, pH 8-9.

6. Rensning af ADH-funktionaliseret polysaccharid ved dialyse

BEMÆRK: Råproduktet fra ADH-funktionaliseringsreaktionen indeholder en høj koncentration af ADH (0,5 M), som kan fjernes mest effektivt ved omfattende dialyse. Gelfiltrering, enten med en kolonne eller en spindesaltinganordning, er ikke så effektiv, især når det er nødvendigt at fjerne den resterende ADH-forurening.

1. Bestem mwco af dialysemembranen. Brug en 3 kDa cutoff til mindre polysaccharider.
   BEMÆRK: Dialysemembranens MWCO er ideelt 5-10 gange mindre end MW af polysaccharid.
2. Vælg det ønskede dialyseformat (kassetter eller slanger) og den korrekte enhedskapacitet. Sørg for, at enhedens kapacitet er 2 gange større end prøvevolumen. Se producentens anvisninger til brug af enheden.
3. Hydrer dialysemembranen i vand før brug. Overfør den rå derivatiserede polysaccharidopløsning til dialyseenheden i henhold til producenternes anvisninger.
   BEMÆRK: Brug nitrilhandsker for at undgå kontakt med DMAP.
4. Dialyze i en beholder fyldt med 2-4 L på 1 M NaCl og en stir bar. Anbring beholderen på en omrøresplade i et koldt rum eller inde i et køleskab. Rør i dialyset forsigtigt og kontinuerligt under dialyse.
5. Efter opkald i mindst 4 timer skal du skifte til frisk 1 M NaCl og ringe i mindst 12 timer. Dialyze mod 2 ændringer på 0,15 M saltvand, hver i mindst 12 timer. Hvis det ønskes, skal du ringe op mod 2 ændringer af vand.
6. Kontroller, om al ADH fjernes ved at teste den daglige dialysate ved hjælp af en hurtig TNBS-test.
   1. Få fat i 3 borosilicatrør, mærk dem som henholdsvis negativ kontrol (ctrl), positiv ctrl og prøve.
   2. Til det negative ctrl rør tilsættes 975 μL på 0,1 M borat, pH 9.
   3. Til det positive ctrlrør tilsættes 100 μL på 0,05 mM ADH (0,1 mM hydrazid) og 875 μL på 0,1 M borat, pH 9.
   4. Til prøverøret tilsættes 500 μL af det natske diasat og 475 μL på 0,1 M borat, pH 9.
   5. Der tilsættes 25 μL på 1% TNBS til alle tre rør. Bland godt. Placer i mørket i 1 time.
   6. Sammenlign farveintensiteten af de 3 rør i 1 time. Sørg for, at prøverørets farveintensitet er mellem den positive ctrl og den negative ctrl, hvilket indikerer, at ADH-forureningen er nede på 0,01 mM eller derunder. Dialyze en gang til.
      BEMÆRK: Det er klogt at reducere niveauet af ADH-forurenende stoffer så meget som muligt, således at ADH-hydrazid tegner sig for mindre end 1% af den samlede hydrazid i det rensede hydrazid-polysaccharid.
   7. Genvind den derivatiserede polysaccharid fra dialyse. Bestem koncentrationen af polysaccharider og hydrazid. Hydrazid/polysaccharidforholdet beregnes (se afsnit 7). Hvis det dialyzed polysaccharid skal koncentreres til 5-10 mg/mL, henvises til punkt 1.2.

7. Analyse af hydrazid-derivatiserede polysaccharider

BEMÆRK: Formålet med den analyse, der er beskrevet her, er at bestemme polysaccharidkoncentrationen, hydrazidkoncentrationen og hydrazidderivatiseringsniveauet med hensyn til hydrazid/ polysaccharidforholdet.

1. Prøveforberedelse
   BEMÆRK: Polysaccharider, der skal analyseres, skal være fri for lav molekylvægtsathydrat, amin eller hydrazid urenheder. Lyfile prøver skal være tørre og saltfri for at sikre nøjagtig vægtmåling. Normalt ~ 1 mL af en 1-2 mg/mL opløsning er tilstrækkelig til assays.
   1. Der afvejes mindst 10 mg af den lyophilized polysaccharidprøve på en analytisk balance ved hjælp af en ikke-statisk spatel eller en statisk eliminator. Polysaccharid opløses i vand eller saltvand i en koncentration (f.eks. 2 mg/mL), således at analysesignalerne falder inden for standardkurvens lineære område.
   2. Bland end-over-end og giv tilstrækkelig tid til, at prøven kan opløses helt. Udfør natten hydrering afhængigt af polysaccharid molekylvægt.
2. Polysaccharid assay: resorcinol / svovlsyre metode
   BEMÆRK: Den relevante analyse for polysaccharider vil afhænge af polymerernes kulhydratsammensætning. Den oprindelige resorcinol/svovlsyreanalyse var beregnet til hæssukker¹⁰. Analysen blev ændret her ved at hæve temperaturen på varmetrinnet fra 90 °C til 140 °C. Ved denne højere temperatur, analysen mister nogle specificitet, men kan bruges til at analysere mange sukkerarter. Det er dog stadig nødvendigt at fastslå, om analysen er egnet til en bestemt polysaccharid. Triplikater anbefales til hvert punkt, men nogle boliger kan være nødvendige på grund af varmeblokkens kapacitet.
   1. Forbered 75% svovlsyre
      BEMÆRK: Koncentreret svovlsyre er ekstremt ætsende og kan forårsage alvorlige forbrændinger. Udfør denne procedure i en kemisk røghætte. Hæld altid koncentreret syre i vand, ikke omvendt!
      1. Tilsæt 50 mL vand til en 200 mL glasflaske. Placer flasken i et koldt vandbad. Tilsæt langsomt 150 mL svovlsyre. Cap flasken, så den er udluftet.
      2. Lad opløsningen ekvilibrere til stuetemperatur. Brug opløsningen inden for 3 måneder.
   2. Forbered kulhydratstandarder
      1. Den uændrede polysaccharidopløsning forberedes ved 1 mg/mL, der skal anvendes som standard. Alternativt kan du bruge en blanding af individuelle sukkerarter i det forhold, der findes i polysaccharidens gentagne enhed, ved 1 mg/mL af den samlede sukkerkoncentration, som standard.
         BEMÆRK: Selv om sukkerblandingen normalt vil give det samme resultat som kulhydratpolymeren med identisk sukkersammensætning, bør dette bekræftes eksperimentelt.
   3. Sørg for, at varmeblokken med rørholdere til 13 x 100 borosilicat reagensglas fungerer. Brug en beskyttende pude under og omkring varmeblokken i tilfælde af syreudslip. Forvarm varmeblokken til 140 °C i mindst 1 time for at opnå stabil, ensartet temperatur gennem alle de anvendte blokke.
   4. Etiket 13 x 100 borosilicat reagensglas, tredolicere for hver standard og hver prøve. Der tilsættes 0, 2,5, 5, 7,5, 10 μg (eller μL) af 1 mg/mL kulhydratstandarden til de tilsvarende mærkede standardrør. Tilsæt vand til hvert rør for at bringe volumen til 100 μL.
      BEMÆRK: Den genererede farve er afhængig af specifikke sukkerarter. Da nogle sukkerarter kræver mere masse for at generere det fulde absorbansinterval, kan de faktiske mængder, der anvendes til standardkurven, variere.
   5. Der skal opstilles prøveanalyser ved at tilføje et volumen, der indeholder ~5 μg af det derivatiserede polysaccharid, til tre prøverør, og det samlede volumen op på 100 μL med vand. Alternativt, hvis polysaccharidkoncentrationen i prøven er ukendt, skal du udføre en række 4-fold fortyndinger. Test 100 μL af hver fortynding i tredotel.
   6. Der fremstilles frisk resorcinol ved 6 mg/mL i deioniseret (dI) vand umiddelbart før brug. Vortex indtil resorcinol er i opløsning. Der tilsættes 100 μL på 6 mg/mL resorcinol til hvert rør.
   7. Hæld forsigtigt den anslåede mængde på 75% svovlsyre i et lille bægerglas.
      BEMÆRK: Brug en kittel, nitrilhandsker og sikkerhedsbriller. Vær forsigtig med drypper, spild og stænk. Hold våde papirhåndklæder handy at tørre op eventuelle drypper. Da svovlsyreaktiviteten ændrer sig ved udvidet eksponering for luft, skal du bruge en ensartet blanding af svovlsyre til hele analysen.
   8. Ved hjælp af en gentagen pipettor tilsættes ensartet 300 μL 75% svovlsyre til hvert rør. Vortex rørene kraftigt at blande godt, peger røret væk, mens hvirvler. Placer rørene i en varmelegemeblok i et stabilt tempo i rækkefølge. Når alle rørene er i, skal du indstille timeren i 3 minutter med det samme.
   9. På 3 min, fjerne rørene i et stabilt tempo i samme rækkefølge, og placere dem direkte i et rack i et isvand bad. Lad rørene stå, indtil de er iskolde. Fjern rørene og lad dem ekvilibrere til stuetemperatur i ~ 5 min for at forhindre kondens på cuvette under læsning.
   10. Indstil et UV/VIS-spektrofotometer til at aflæse absorbansen ved 430 nm ved hjælp af et 10 mm patlength cuvette. Tom med et nul standardrør. Absorbansen af alle rørene ved 430 nm.
       BEMÆRK: Engangsplast cuvettes er praktisk at bruge.
   11. Konstruere en standard kurve ved at plotte μg af kulhydrat standard vs A₄₃₀. Se figur 4 for en typisk standardkurve, der bruger glukose som referencestandard.
   12. Brug prøveanalyserørene med A_{430-værdier,} der falder inden for standardkurvens lineære område, og beregn mængden af det ukendte polysaccharid i prøveanalyserørene ud fra standardkurveligningen. Bestemme koncentrationen af den ukendte polysaccharid fra mængden af den ukendte tilsat, tegner sig for fortyndinger. Konverter koncentrationen til mg/mL eller μM-gentagelsesenheder efter behov.
3. Hydrazid assay ved hjælp af trinitrobenzene sulfatsyre (TNBS)
   1. 0,9 % NaCl indeholder 0,02 % natriumhyrde (prøvebuffer) ved opløsning af 9 g NaCl og 200 mg natriumhyrd i dI H₂O til et endeligt volumen på 1 L.
   2. 0,1 M natriumborat, pH 9 (Assay buffer), ved at blande 100 mL 0,5 M natriumborat, pH 9, med 400 mL dI H₂O. Bekræft, at opløsningen pH er 9 ± 0,1; justeres, hvis det er nødvendigt.
   3. 1% TNBS ved fortynding af 200 μL på 5% 2,4,6-trinitrobenzene suldonsyreopløsning til 1 mL med dI H₂O. Marker røret som 1% TNBS og opbevar ved 4 °C i mørke i en uge.
   4. Forbered 50 mM ADH lager (svarende til 100 mM hydrazid).
      1. 871 mg adipic dihyrazinpulver (ADH) afvejes ved hjælp af en analytisk balance. Pulveret opløses i en reagensflaske ved at tilsætte prøvebuffer til 100 mL ved hjælp af en toplæsserbalance.
      2. Mærk flasken som 100 mM hydrazid/50 mM ADH. Hætten tæt og opbevares ved 4 °C i 1 år.
   5. Udarbejde hydrazidstandarder (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 og 0,6 mM hydrazid).
      1. Forbered 6 hydrazidstandarder ved at fortynde 100 mM hydrazidlageret med prøvebuffer ved hjælp af en toplæsserbalance. Forbered 100 mL af hver standard for at minimere koncentrationsfejl. Luk flaskerne tæt og opbevares ved 4 °C i 1 år.
   6. Opsætning af analysereaktioner
      BEMÆRK: TNBS-analysen køres med et reaktionsvolumen på 1 mL. Hvert analyserør består af 100 μL af en prøve (eller en standard), 875 μL assaybuffer og 25 μL 1% TNBS-opløsning. Alle assay reaktioner (for både prøver og standarder) er oprettet i tredotel.
      1. Mærk 3 borosilicatglasrør (12 x 75 mm) for hver standard, herunder nulstandarden. Sorter og arranger standardrørene i rørstativet for at øge koncentrationen. Brug en kalibreret 100 μL eller 200 μL mikropipette til præcist at tilføje 100 μL af standarderne til hvert tilsvarende rør. For nulstandarden skal du bruge 100 μL prøvebuffer.
      2. Mærke 3 borosilicatglasrør (12 x 75 mm) for hver fortyndet prøve, der skal analyseres. Sorter og arranger prøverørene i rørstativet i overensstemmelse hermed. Brug en kalibreret 100 μL eller 200 μL mikropipette til nøjagtigt at tilføje 100 μL af prøven til hvert tilsvarende prøverør.
      3. Brug en kalibreret 1000 μL mikropipette til præcist at tilføje 875 μL assay buffer til alle analyse rør: standarder og prøverne.
   7. For at starte analysens reaktion skal du bruge en kalibreret 100 μL-mikropipette til nøjagtigt at tilføje 25 μL på 1% TNBS til hvert analyserør. Start fra nul standardrørene, flyt til standardrørene for at øge koncentrationen og derefter til prøverørene i henhold til den forudbestemte rækkefølge. Skift tip, når du starter en ny standard eller en ny prøve og holde den tid, der bruges på at tilføje TNBS til alle rørene til inden for 5 min.
      1. Vortex alle assay rør til 2 s ved høj hastighed eller ved en hastighed indstilling gør det muligt for væsken inde i analysen røret til at hvirvle opad for at nå en højde på 1/2 tommer fra røret åbning.
      2. Optag analysens starttidspunkt, og indstil timeren til 2 timer. Anbring analyserørsstativet i mørke ved stuetemperatur i 2 timer. Når tiden er forbi, hvirvle alle rørene endnu en gang og gå videre til dataindsamling.
   8. Dataindsamling
      1. Lad UV/VIS-spektrofotometeret varme op og baseline stabilisere sig. Indstil detektionsbølgelængden til 500 nm for hydrazidanalysen. Brug en 1 mL kvarts cuvette på 1 cm patlength for alle absorbansmålinger for hele analysen.
      2. Start dataindsamlingen ved at overføre en nul standardanalyse til cuvette; instrumentet (indstil absorbansen til nul).
      3. Udfør en enkelt læsning på hvert rør, og registrer absorbansværdierne i en datatabel. Fjern eventuel restvæske fra cuvette, før du læser en ny prøve. Start fra nulstandarderne, gå til standarderne for stigende koncentration og derefter til prøverne. Når det er startet, skal du udføre alle trin effektivt uden at stoppe og læse alle rør inden for 10 minutter.
   9. Analyse af eksempeldata
      1. Opret en standardkurve ved at plotte mM hydrazid standard vs A₅₀₀. Find standardkurveligningen i form af y = enx + b, hvor y repræsenterer mM hydrazid, og x repræsenterer A₅₀₀. Se figur 4 for en typisk standardkurve.
      2. Beregn mM hydrazid i prøverne ved hjælp af standardkurveligningen og juster for fortyndingsfaktorerne. Vælg kun prøveanalyserørene med A_{500-værdier,} der falder inden for standardkurvens lineære område til beregningen.
      3. Molarforholdet mellem hydrazid/polysaccharid beregnes ved hjælp af ligningen (1).
         Hydrazid/polysaccharid = h / c × MW (1)
         Hvor h er mM hydrazid, c er mg/mL koncentrationen af polysaccharid, og MW er polysaccharid molekylvægt i kDa.
      4. Hydrazidmærkningstætheden pr. 100 kDa polysaccharid beregnes ved hjælp af ligning (2).
         Mærkningstæthed pr. 100 kDa polysaccharid = h / c × 100 (2)
         Hvor h er mM hydrazid, og c er mg/mL-koncentrationen af polysaccharid.
         BEMÆRK: For nemheds skyld kan polysaccharider anses for at have en molekylvægt på 100.000 dalton. Dette gør det muligt at overveje en "mærkningstæthed" ved sammenligning af niveauet af derivatisering af forskellige polysaccharider.
      5. Beregn hydrazidmærkningstætheden som vægtprocent ADH.
         1. Bestem den effektive mg/mL-koncentration af ADH ved hjælp af ligningen (3).
            mg/mL ADH = (mM hydrazid / 1000) × 174 (3)
            hvor 174 er MW af ADH.
         2. VægtprocentEN ADH beregnes ved hjælp af ligningen (4).
            vægtprocent ADH = (mg/mL ADH) / (mg/mL polysaccharid) × 100 (4)

Representative Results

For at illustrere aktivering og derivatisering af en polysaccharid ved hjælp af CDAP kemi, dextran blev aktiveret på 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran. For hver reaktion blev en 10 mg/mL dextranopløsning i vand kølet på is, og 1/10^th volumen af en 2,5 M DMAP lager (fremstillet som beskrevet i afsnit 3) blev tilføjet. Den endelige løsning blev bragt til pH 9 ved tilsætning af 0,1 M NaOH i 10 μL aliquots. Opløsningen blev kølet og omrørt, CDAP tilsat, og pH opretholdes ved pH 9 ved at tilsætte 10 μL aliquots på 0,1 M NaOH i 15 min. Kun 0,25 mL på 0,5 M ADH ved pH 9 blev tilføjet (mindre end det sædvanlige beløb), og reaktionen fik lov til at fortsætte natten over ved 4 °C.

Den mærket dextran blev derefter sekventielt dialyzed mod 1 M NaCl, 0,15 M NaCl, og vand som beskrevet i afsnit 6. ADH-dextran blev derefter analyseret for dextran ved hjælp af resorcinol/svovlsyreanalysen (punkt 7.2). En typisk standardkurve, der bruger glukose som sukkerstandard, er vist i figur 4A. Hydrazidindholdet blev bestemt ved hjælp af TNBS-analysen, der er beskrevet i afsnit 7.3. En typisk hydrazidstandardkurve, der bruger ADH som standard, er angivet i figur 4B.

Repræsentative beregninger fra aktivering af dextran på de to aktiveringsniveauer er vist i figur 4A, B. Dataene præsenteres som både hydrazider pr. 100 kDa dextran polymer og som en vægtprocent af ADH til dextran, som beskrevet i henholdsvis afsnit 7.9.3.4 og 7.9.3.5 i figur 4C. Graden af derivatisering blev omtrent fordoblet, da CDAP-forholdet blev fordoblet.

Figur 1: Cdap's kemiske struktur. CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Proces med CDAP-aktivering og bøjning. Processen er konceptuelt opdelt i to faser, med den aktiverede polysaccharid fælles for begge. Under grundlæggende forhold aktiverer CDAP polysaccharid hydroxyls og frigiver DMAP (reaktion 1). CDAP hydrolyse frigiver også DMAP (reaktion 3). Selvom der vises en cyano-ester, er dette muligvis ikke det faktiske mellemprodukt. Mellemproduktet kaldes derfor (CDAP) "aktiveret" polysaccharid. I den første aktiveringsfase kan det aktiverede polysaccharid hydrolysere (reaktion 4) eller gennemgå bivirkninger (reaktion 5). I den anden bøjningsfase (reaktion 2) reagerer det aktiverede polysaccharid med en amin for at danne en stabil isoureabinding ud over reaktioner 4 og 5. Forkortelser: CDAP = 1-cyano-4-dimethylaminopyridin tetrafluoroborat; DMAP = 4-dimethylaminopyridine; R-NH₂ = amin. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: CDAP-aktivering og bøjning. Processen kræver afbalancering af CDAP-reaktivitet med polysaccharid, stabiliteten af CDAP og aktiveret polysaccharid samt reaktiviteten af det aktiverede polysaccharid med aminens. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Repræsentative resultater for CDAP-aktivering af dextran. Typiske standardkurverfor resorcinol/svovlsyre (B) TNBS- analyserne. Analysen resultater for dextran aktiveret med 0,25 og 0,5 mg CDAP/mg dextran er vist. Glukose blev anvendt som standard for resorcinolanalysen. Dextran, i mg/mL, divideres med 100 kDa for at give en molarkoncentration. Hydrazidkoncentrationen bestemmes ved hjælp af ADH som standard og resultaterne udtrykt som μM Hz. (C) Beregning af hydrazid: dextranforhold. Niveauet af derivatisering blev beregnet som hydrazider pr. 100 kDa dextran for at lette sammenligningen mellem polymerer af forskellige gennemsnitlige molekylvægte. Vægtprocenten for g ADH/g dextran blev beregnet ved hjælp af en MW på 174 g/mole til ADH. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

CDAP er en bekvem reagens til at derivatize og konjugere polysaccharider. I denne artikel beskrives den generelle metode til at bruge CDAP til at derivatisere polysaccharider med hydrazider (PS-ADH) og indeholder nyligt offentliggjorte forbedringer⁸. For det første understreger teknikken vigtigheden af at opretholde mål-pH'en for at styre aktiveringsprocessen. Vi fandt ud af, at mens mange almindelige buffere forstyrrer CDAP-aktiveringsreaktionen, kunne DMAP med succes bruges som buffer til at administrere pH⁸. Desuden er DMAP allerede et reaktionsbiprodukt af CDAP-aktivering. Endelig letter buffering af polysaccharidopløsningen med DMAP, før CDAP tilføjes, præcis målretning og vedligeholdelse af reaktions-pH'en. Som vi beskriver, er det nyttigt at justere pH af den koncentrerede DMAP lageropløsning, så når den fortyndes, når den den målrettede pH. For det andet bremsede udførelsen af processen i kulden reaktionstiden, hvilket gjorde aktiveringsprocessen mindre hektisk og mere tilgivende. Lavere temperatur faldt hastigheden af CDAP hydrolyse, og den optimale aktiveringstid ved pH 9 stiger fra ~ 3 min til ~ 15 min. Derudover kræves der mindre CDAP for at opnå det samme aktiveringsniveau, end når det udføres ved stuetemperatur.

ADH-derivatiserede polysaccharider kan konjugeres til proteiner ved hjælp af carbodiimider (f.eks. For eksempel bruger flere godkendte Hæmophilus influenzae b (Hib) vacciner polyribosylribitolphosphat (PRP), derivatized med ADH til at konjugatere til stivkrampe toksoid ved hjælp af EDAC. CNBR blev oprindeligt ansat, men CDAP er et meget lettere reagens at bruge til dette formål. Det er vores erfaring, at et godt målområde for ADH-derivatisering er 10-30 hydrazider pr. 100 kDa polysaccharid eller ~ 1-3% ADH efter vægt.

Den samme proces kan bruges til at derivatisere polysaccharider med primære aminer ved at erstatte ADH for en diamin. Det anbefales at bruge hexandiamin til at derivatisere polysaccharider med aminer⁸. Den aminerede polysaccharid (PS-NH₂) kan konjugeres ved hjælp af reagenser udviklet til proteinbøjning¹¹. Typisk er PS-NH₂ derivatiseret med en maleimid (f.eks. succinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-carboxylat (SMCC) eller N-γ-maleimidobutyryl-oxysuccinimid ester (GMBS)), og proteinet thioleres (f.eks. med succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)propionat (SPDP)). Thiol-maleimide kemi er meget effektiv.

Proteiner kan også være direkte koblet til CDAP-aktiverede polysaccharider via ɛ-amine på lysiner. Mens den anvendte aktiveringsprotokol generelt ligner den, der er beskrevet her, er det nødvendigt at optimere aktiveringsniveauet, polysaccharid og proteinkoncentration samt protein:polysaccharidforholdet^5,6,8.

Dextran er en af de nemmeste polysaccharider at aktivere med CDAP på grund af sin relativt høje tæthed af hydroxylgrupper, men nogle polysaccharider, såsom Vi antigen, kan være udfordrende. Derfor er der ingen enkelt "bedste" protokol for CDAP bøjning direkte til proteiner. Vi foreslår først at udvikle en protokol for at opnå passende niveauer af aktivering, som bestemt af omfanget af hydrazid derivatization, og derefter fortsætter med at direkte protein bøjning til CDAP-aktiveret polysaccharid.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetonitrile	Sigma	34851
Adipic acid dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Amicon Ultra 15 10 kDa	Millipore	UFC901008	MW cutoff can be 30 kDa for 200 kDa PS
Analytical balance
Autotitrator or electronic pipet
Beaker  2-4 L
CDAP	SAFC	RES1458C	Sigma
DMAP	Sigma	107700	MW 122.2
Flake ice
HCl 1 M	VWR	BDH7202-1
Micro stir bar	VWR	76001-878
Microfuge tube (for CDAP)	VWR	87003-294
NaCl	VWR	BDH9286
NaOH 1 M	Sigma	1099130001
NaOH 10 M	Sigma	SX0607N-6
pH meter
pH probe	Cole Parmer	55510-22	6 mm x 110 mm Epoxy single junction
pH temperature probe
Pipets & tips
Saline or PBS
Small beaker 5-20 mL	VWR	10754-696	A 10 mL beaker allows room for pH probe & pipet
Small ice bucket
Small spatula
Stir plate
Resorcinol assay
Combitip	Eppendorf	10 ml
DI water
Dialysis tubing	Repligen	132650T	Spectra/Por 6-8kDa
Dialysis tubing clips	Repligen	142150
Heating block
Nitrile gloves	VWR
Repeat pipettor	Eppendorf	M4
Resorcinol	Sigma	398047
Sugar standard		As appropriate
Sulfuric acid 75%	VWR	BT126355-1L
Timer
TNBS assay
Adipic dihydrazide	Sigma	A0638	MW 174
Borosilcate test tubes 12 x 75	VWR	47729-570
Sodium borate, 0.5 M pH 9	Boston Biologicals	BB-160
TNBS 5% w/v	Sigma	P2297	MW 293.17