Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Directe detectie van isolevuglandinen in weefsels met behulp van een D11 scFv-alkalisch fosfatasefusie-eiwit en immunofluorescentie

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62603
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,6, 4, 5, 3, 4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Dit artikel biedt een gedetailleerde methodologie voor de meting van isolevuglandinen in weefsels door immunofluorescentie met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde ScFv D11-antilichamen. Hypertensiemodellen bij zowel muizen als mensen worden gebruikt om de stapsgewijze procedures en fundamentele principes uit te leggen die verband houden met isolevuglandinemeting in weefselmonsters.

Abstract

Isolevuglandinen (IsoLGs) zijn zeer reactieve gamma-ketoaldehyden gevormd uit H2-isoprostanen door lipideperoxidatie en crosslink-eiwitten die leiden tot ontsteking en verschillende ziekten, waaronder hypertensie. Detectie van IsoLG-accumulatie in weefsels is cruciaal om licht te werpen op hun betrokkenheid bij de ziekteprocessen. Het meten van IsoLGs in weefsels is echter uiterst moeilijk en de momenteel beschikbare hulpmiddelen, waaronder massaspectrometrie-analyse, zijn arbeidsintensief en extreem duur. Hier beschrijven we een nieuwe methode voor in situ detectie van IsoLGs in weefsels met behulp van alkalische fosfatase-geconjugeerde D11 ScFv en een recombinant faag-display antilichaam geproduceerd in E. coli door immunofluorescente microscopie. Vier controles werden gebruikt voor het valideren van de kleuring: (1) kleuring met en zonder D11, (2) kleuring met bacterieel periplasmatisch extract met de alkalische fosfataselinker, (3) irrelevante scFV-antilichaamkleuring en (4) concurrerende controle met IsoLG voorafgaand aan de kleuring. We tonen de effectiviteit aan van de alkalische fosfatase-geconjugeerde D11 in zowel menselijke als muisweefsels met of zonder hypertensie. Deze methode zal waarschijnlijk dienen als een belangrijk hulpmiddel om de rol van IsoLGs in een breed scala van ziekteprocessen te bestuderen.

Introduction

Isolevuglandinen (IsoLGs), ook bekend als isoketalen, zijn isomeren van de 4-ketoaldehydefamilie, die producten zijn van lipideperoxidatie, en reageren met en adducteren naar primaire amines op eiwitten 1,2. IsoLGs zijn betrokken bij verschillende ziekten, waaronder cardiovasculaire, Alzheimer, long- en leverziekten en vele soorten kanker3. IsoLGs zijn het meest uitgebreid bestudeerd in hun bijdrage aan hart- en vaatziekten (CVD), wat wereldwijd een aanzienlijke gezondheids- en economische last is, inclusief de Verenigde Staten. Er wordt geschat dat 92,1 miljoen Amerikaanse volwassenen ten minste één type HVZ hebben, met geschatte projecties voor 2030 die oplopen tot 43,9% van de Amerikaanse volwassen bevolking4. Het verlagen van de bloeddruk, cholesterol en stoppen met roken vermindert het algehele risico en het optreden van CVD-gebeurtenissen5.

Hoge bloeddruk of hypertensie is een belangrijke risicofactor voor hart- en vaatziekten en treft ongeveer de helft van de Amerikaanse bevolking6. Eerdere studies hebben aangetoond dat ontsteking een onderliggende oorzaak is van hypertensie en dat IsoLGs een rol spelen7. Hypertensieve stimuli, waaronder angiotensine II, catecholamines, aldosteron en overtollig voedingszout, induceren IsoLG-accumulatie in antigeen presenterende cellen, waaronder dendritische cellen (DC's), die op hun beurt T-cellen activeren om te prolifereren en inflammatoire cytokines te produceren die bijdragen aan hypertensie 8,9.

Eerder werden IsoLGs gemeten door immunohistochemie, massaspectrometrie, enzymgebonden immunosorbenttest en flowcytometrie10,11. Om de meting van IsoLGs te vergemakkelijken, werd een single-chain fragment variable (scfv) recombinant antilichaam (D11) ontwikkeld tegen IsoLGs12. Aanvankelijk bevatte dit D11-antilichaam een 11-aminozuur E-tag en was een secundair antilichaam nodig voor immunohistochemische detectie11. Het was echter moeilijk om een betrouwbaar secundair antilichaam tegen de E-tag te vinden na het staken van de productie door de fabrikant. Daarom hebben we een betrouwbaar protocol ontwikkeld voor immunofluorescente kleuring van IsoLGs met behulp van D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase (D11-AP), dat we hebben aangetoond in muizen- en menselijke weefsels met en zonder hypertensie.

Protocol

Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee keurde alle procedures goed die in dit manuscript worden beschreven. Muizen worden gehuisvest en verzorgd volgens de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle proefpersonen gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voordat ze zich inschreven voor de studie zoals goedgekeurd door de Institutional Review Board van Vanderbilt University. Alle procedures werden uitgevoerd volgens de Verklaring van Helsinki.

1. Bereiding van plasmiden die coderen voor D11-alkalisch fosfatasefusie-eiwit en negatieve controlevectoren

  1. Construeer een aangepaste versie van het pCANTAB5E plasmide13,14 waarin het segment single chain fragment variable (scFv) aan het 3'-uiteinde is gekoppeld aan een sequentie die codeert voor bacteriële alkalische fosfatase (AP).
    OPMERKING: Direct na de NotI-beperkingslocatie van de scFv-sequentie bevat het gemodificeerde plasmide niet langer de coderingsvolgorde van de E-tag en codeert in plaats daarvan de linkersequentie GGSGGHMGSGG, gevolgd door de sequentie voor AP (GenBank-toetredingsnummer AXY87039.1, T16-K464)15,16. Stroomafwaarts van AP codeert het plasmide 8xHis en DYKDDDDK-tags. Aan het 3'-uiteinde van de tags eindigt de coderingsvolgorde met een Amber-stopcodon. Het gemodificeerde plasmide wordt pCANTAB5-AP genoemd.
  2. Kloon D11 scFv (GenBank toetredingsnummer AAW28931.1) in pCANTAB5-AP met de SfiI/NotI beperkingssites.
  3. Kloon D20 scFv in pCANTAB5-AP met de SfiI/NotI-beperkingssites.
    OPMERKING: D20 scFv is een negatieve controle die is ontworpen om het weefselinteractiepatroon van een irrelevante scFv te beoordelen. Deze scFv werd oorspronkelijk geselecteerd door faagweergave vanwege zijn vermogen om te interageren met een glycaangroep die bekend staat als A2.
  4. Genereer een "lege" vector door het scFv-gedeelte volledig uit het plasmide te verwijderen en te vervangen door een "AP-linker" -coderingssequentie bestaande uit aminozuren GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. Transformeer alle plasmiden in competente TG1 E. coli en kweek bacteriën 's nachts bij 30 °C, op 0,5% agarplaten met 2xYT aangevuld met 100 μg / ml ampicilline en 2% glucose (2xYTAG) medium.
    OPMERKING: Stammen met het supE-gen (zoals TG1 E. coli) onderdrukken het amberkleurige stopcodon niet 100%. Schattingen variëren van 0,8 - 20% van de tijd, dus er is nog steeds veel product dat net stroomafwaarts van BAP eindigt, omdat het bedoeld is voor deze experimenten17. TG1 E. coli worden voornamelijk gebruikt om praktische redenen, zoals de vermindering van tijd en kosten, hun compatibiliteit met het pCANTAB-eiwitexpressiesysteem en hun gebruik in faagweergave, die vaak in het laboratorium wordt uitgevoerd. Stroomafwaarts van het amberkleurige stopcodon volgend op BAP is een sequentie voor genIII. GeneIII-fusie-eiwitten hoeven zelden tot expressie te worden gebracht om faagweergave te laten functioneren zoals bedoeld, omdat scFv-genIII-fusie-eiwitten interfereren met dat specifieke genIII-eiwit om naïeve bacteriën opnieuw te infecteren. Daarom moeten fusievrije genIII-eiwitten bestaan tijdens virionassemblage voor het genereren van functionerende faag, d.w.z. scFv-geneIII-eiwitproducten zijn meestal relatief zeldzaam in de bacterie. D11-AP, D20-AP, lege vector en alle constructen die in dit artikel worden gebruikt, worden allemaal op dezelfde manier beïnvloed door de occasionele genIII-fusie-eiwitexpressie. Er zijn nog steeds waargenomen verschillen in hoe deze eiwitten zich gedragen.
  6. Kies een individuele kolonie en ent een verse 5 ml 2xYTAG-cultuur. Laat bacteriën een nacht groeien bij 30 °C en schudden bij 150 tpm.
  7. Pellet de cellen door centrifugeren bij 3.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet in 2 ml van 85% 2xYTAG en 15% glycerol.
  8. Houd de glycerolvoorraden op peil in een vriezer van -80 °C.

2. Eiwitexpressie en generatie van periplasmatisch extract

OPMERKING: Generatie van het periplasmatisch extract is een veelgebruikte methode voor eiwitexpressie in faagweergave, voornamelijk omdat de vorming van disulfidebindingen belangrijk is bij het genereren van scFv en antilichamen. De methode vermijdt de noodzaak om lysaten te genereren (meestal bevattende insluitingslichamen) en zorgt ervoor dat eiwitten goed worden gevouwen. pCANTAB heeft een gIII-signaalsequentie stroomopwaarts van het scFv-gedeelte van het D11-BAP-fusie-eiwit. De signaalsequentie zorgt ervoor dat het eiwit naar de periplasmatische ruimte van de bacterie wordt gebracht en vervolgens wordt de signaalsequentie gesplitst. De periplasmatische ruimte biedt een oxiderende omgeving, die cruciaal is voor de juiste vorming van disulfidebruggen. Osmotische shock wordt gebruikt om periplasmatische extracten af te leiden omdat het het buitenmembraan voldoende verstoort om de periplasmatische eiwitten in het omringende medium vrij te geven, terwijl de bacterie intact blijft.

  1. Ent TG1 E. coli glycerolvoorraden met de relevante plasmiden in een 60 ml cultuur van 2xYTAG en kweek 's nachts bij 30 °C met schudden bij 150 tpm.
  2. Om eiwitexpressie te induceren, pellet bacterieculturen bij 3.000 x g gedurende 10 minuten, resuspenderend in 60 ml 2xYTA-medium en 's nachts kweken bij 30 °C met schudden bij 150 tpm.
    OPMERKING: De overstap van 2xTYAG naar 2xYTA medium helpt bij voldoende inductie van eiwitexpressie18. Wanneer glucose aanwezig is in het bacteriële medium, wordt de lac-promotor onderdrukt omdat bacteriën bij voorkeur glucose consumeren en lactose negeren, omdat glucose minder energie kost om te verwerken. Wanneer glucose wordt verwijderd na de mediumwissel, vertrouwen bacteriën op de koolhydraten die door het 2xYT-medium worden geleverd. Gistextract (de Y-component in 2xYT) bevat koolhydraten, waaronder lactose, en is daarom in staat om eiwitexpressie door de lacpromotor te sturen. IPTG is niet nodig met het pCANTAB-construct en kan resulteren in overmatige eiwitexpressie, samen met inclusielichamen die resulteren in niet-functionele eiwitten.
  3. Genereer periplasmatische extracten via osmotische shock.
    1. Pellet bacterieculturen op 3.000 x g gedurende 10 min.
    2. Resuspendeer in 20 ml 1xTES (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M sucrose) en incubeer gedurende 1 uur op ijs.
    3. Pellet opnieuw op 3.000 x g gedurende 10 minuten en resuspensie in 15 ml van 0,05 M Tris, pH 7,6.
  4. Incubeer deze suspensie gedurende 1 uur op ijs en verduidelijk vervolgens door centrifugeren bij 5.000 x g gedurende 10 minuten.
  5. Breng supernatanten over in een verse buis en bewaar bij -20 °C totdat ze nodig zijn voor zuivering of direct gebruik in experimenten.
  6. Beoordeel de cellysis aan de hand van de aanwezigheid van actieve D11-BAP in de ELISA. Voeg 3-5 μL van het periplasmatische extract toe aan één ml pNPP en observeer vervolgens of er in de volgende 10 minuten een kleurverandering optreedt (kleur gaat van heldergeel naar intens geel).
    OPMERKING: De kleur kan naast elkaar worden vergeleken met een buis pNPP die geen lysaat heeft ontvangen of een buis pNPP die lysaat van naïeve TG1-bacteriën heeft ontvangen. Kwantificeren met absorptie bij 405 nm.

4. Karakterisering van D11-AP titer in ELISA

  1. Bedek een polystyreenplaat met 384 putten gedurende een nacht bij 4 °C met 25 μL/bronfosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (1,8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na 2 HPO4,2,7mM KCl, 137 mM NaCl) met 5 μg/ml muisserumalbumine (MSA) (negatieve controle) of 5 μg/ml IsoLG/MSA (positieve controle).
  2. Maak het bord leeg en kraan droog. Was eenmaal met PBS + 0,1% Tween (PBS-T). Maak het bord leeg en kraan droog.
  3. Vul de plaat met PBS-T als blokkeringsbuffer (120 μL/put). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Maak het bord leeg en kraan droog. Breng seriële 1:2 verdunningen van D11-AP periplasmatische extracten aan bij 25 μL/well en verdund in PBS-T. Neem één put op die alleen PBS-T bevat als negatieve controle.
    OPMERKING: Typische verdunningsbereiken voor periplasmatische extracten zijn 1:8 - 1:4096. Begin voor een testvolume van 25 μL met 50 μL van de beginconcentratie "1:8": 6,25 μL periplasmatisch extract en 43,75 μL PBS-T. Voer vervolgens een 2-voudige verdunning uit door 25 μL van deze oplossing te verwijderen en toe te voegen aan de volgende put met 25 μL PBS-T en pipetteer deze op en neer. Deze put bevat nu de "1:16" verdunning. Blijf de 2-voudige verdunning herhalen om de beschreven 1:2 verdunningsreeks te genereren.
  5. Incubeer gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
  6. Maak het bord leeg en kraan droog. Was 5 keer met PBS-T. Leeg en kraan droog.
  7. Bereid pNPP-oplossing door 1 g pNPP op te lossen in 1 L van 930 mM diethanolamine (98% stockoplossing verdund 1:10 in H 2 O), met 0,5 mM MgCl2en aangepast tot pH 9,5 met HCl.
  8. Breng 25 μL/put pNPP-oplossing aan om AP te ontwikkelen. Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en bepaal de absorptie bij 405 nm in elke put met behulp van een compatibele plaatlezer.
  9. Vergelijk het signaal dat wordt gegenereerd door de IsoLG/MSA-putten met de ruis die wordt gegenereerd door de MSA-putten en vind het bereik van verdunningen waarin het signaal minstens 5 keer hoger is dan de ruis.
  10. Plot deze D11-AP-signaalverdunningsreeks op een grafiek, bepaal het lineaire bereik van de curve en stel de verdunning vast waar 50% van het signaal kan worden waargenomen.
    OPMERKING: Als deze verdunning overeenkomt met ongeveer 1:1.000, kan de D11-AP-oplossing worden gebruikt in een concentratie van 1:10 in IHC/IF.

5. Immunofluorescentie

  1. Snijd seriële secties van in muizen en menselijke paraffine ingebedde weefsels (5 μm dik) met behulp van een microtoom en plaats in een warmwaterbad (37 °C). Monteer weefselsecties op glasplaten en laat een nacht drogen.
    OPMERKING: Voor deze studie werden aorta's verkregen van muizen. Colonsecties van normotensieve en hypertensieve mensen werden verkregen van het Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network.
  2. Dompel dia's drie keer gedurende 5 minuten onder in xyleen om weefsels te deparaffiniseren.
  3. Rehydrateer weefsels in 2 wasbeurten elk van 95%, 70% en 50% ethanol in H2O.
  4. Was dia's in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 0,1% Tween20 (TBST) drie keer met snelle wasbeurten door de schuifhouder te vullen met TBST en vervolgens TBST weg te gooien.
    OPMERKING: Gehydrateerde dia's kunnen niet langer dan een week in TBST bij 4 °C worden bewaard voordat het antigeen wordt opgehaald.
  5. Om warmte-geïnduceerde antigeen retrieval van dia's uit te voeren, plaatst u dia's in voorverwarmde (80-95 °C) natriumcitraatbuffer (10 mM natriumcitraat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) en incubeert u in een snelkookpan die is ingesteld op 4 minuten op hoge druk voor een totale antigeenophaaltijd van 20 minuten.
  6. Verwijder de dia's uit de snelkookpan en laat ze 20 minuten afkoelen tot kamertemperatuur.
  7. Was dia's in TBST drie keer met snelle wasbeurten.
    OPMERKING: Dia's kunnen na het ophalen van antigeen niet langer dan een week voor kleuring in TBST worden opgeslagen.
  8. Voeg 2% BSA opgelost in TBST toe om dia's te blokkeren. Dek de dia's af met een strook paraffinefolie en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  9. Gooi de blokkeringsbuffer van de dia's weg.
  10. Voeg 200 μL 1:10 D11-AP in TBST toe aan de dia's en dek af met een strook paraffinefilm.
  11. Incubeer in een bevochtigde kamer om de verdamping van de antilichaamoplossing gedurende 3 uur bij kamertemperatuur te minimaliseren.
  12. Was dia's drie keer in TBST.
  13. Ontwikkelen met een colorimetrische of fluorescerende alkalische fosfatase-ontwikkelaar voor respectievelijk immunohistochemie of immunofluorescentie. Was dia's eenmaal met TBST om overtollige ontwikkelaar te verwijderen en verdere kleurontwikkeling te voorkomen.
  14. Counterstain glijdt met Hoechst nucleaire kleuring bij 1 μg/ml in PBS voor immunofluorescentie. Was de dia's eenmaal in TBST om overtollige tegenvlekken te verwijderen.
  15. Breng coverslips aan met behulp van het montagemedium.
  16. Bekijk dia's onder een omgekeerd licht microscoop voor immunohistochemie of een confocale fluorescerende microscoop voor immunofluorescentie.

6. Negatieve controles

OPMERKING: Vier negatieve controle-experimenten kunnen worden uitgevoerd om de specificiteit van D11-AP-kleuring voor IsoLG te bevestigen. Negatieve controle-experimenten moeten worden uitgevoerd in dezelfde kleuringsset onder dezelfde omstandigheden.

  1. In het eerste negatieve controle-experiment incubeer je weefsels met D11-AP verdund in TBST of TBST alleen.
  2. Incubeer weefsels met verdund D11-AP in TBST en bacterieel periplasmatisch extract zonder D11-AP (AP Linker) verdund in TBST.
  3. Voer een competitieve test uit met IsoLG/MSA of niet-geadduceerde MSA zoals eerder beschreven12.
    1. Bereid IsoLG en IsoLG geadduceerd tot muisserumalbumine (MSA) zoals eerder beschreven19, met een molaire verhouding van 8 IsoLG: 1 MSA (8:1 IsoLG/MSA).
    2. Verdun D11-AP 1:10 in TBST.
    3. Incubeer verdund D11-AP met 50 μg/ml IsoLG/MSA of niet-geadduceerde MSA gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    4. Voeg D11-AP met IsoLG/MSA of D11-AP met niet-geadduceerde MSA toe aan weefsels voor kleuring.
  4. Gebruik irrelevant scFv-antilichaam, D20, om weefsels te kleuren voor de uiteindelijke negatieve controleset.

Representative Results

In representatieve experimenten werd D11 scfv met een alkalische fosfataseconjugatie (D11-AP) gebruikt in immunofluorescentie om IsoLGs te detecteren die aanwezig zijn in met angiotensine II behandelde muizen in vergelijking met normale schijnmuizen en mensen met hypertensie in vergelijking met normotensieve mensen. Muizen werden behandeld met angiotensine II in een dosis van 490 ng / kg / min gedurende twee weken, en hypertensie werd bevestigd met verhoogde systolische bloeddruk in vergelijking met schijnmuizen10. Om de specificiteit van D11-AP te garanderen, werden weefsels gekleurd met of zonder de aanwezigheid van D11-AP. Zoals aangetoond door D11-AP-kleuring, vertoonde de aorta van muizen met angiotensine II-geïnduceerde hypertensie een verhoogde concentratie van IsoLGs in vergelijking met controlemuizen (figuur 1). Achtergrondkleuring of autofluorescentie was beperkt, zoals blijkt uit negatieve controles die niet waren gekleurd met D11-AP.

D11-AP werd gebruikt om IsoLGs te detecteren die aanwezig zijn in darmweefsels van menselijke patiënten met hypertensie (HTN) of normotensieve mensen (NTN). Hypertensie status werd vastgesteld uit de ziekenhuisrecords als systolische bloeddruk boven 140 en diastolische bloeddruk boven 80 mmHg. Onderzoekers die immunofluorescentieprotocol voor D11-AP ontwikkelden, waren blind voor de hypertensiestatus van menselijke weefsels. Secties werden gekleurd in de aan- en afwezigheid van D11-AP om antilichaamspecificiteit te garanderen en achtergrondkleuring of autofluorescentie te vertonen. Zoals te zien is in figuur 2, vonden we dat weefsels van patiënten met HTN verhoogde concentraties IsoLGs hadden in vergelijking met patiënten met NTN. Kleuring zonder D11-AP vertoonde ook minimale achtergrondkleuring en autofluorescentie. Endogene alkalische fosfatase wordt uitgedrukt door darmepitheel, dus de beperkte fluorescentie van weefsels gekleurd zonder D11-AP toont aan dat het antigeen ophalen dat in dit protocol wordt gebruikt, voldoende was bij het inactiveren van endogene alkalische fosfatase in weefsels. In combinatie met de resultaten bij muizen tonen deze resultaten ook aan dat het immunofluorescentieprotocol effectief verhoogde IsoLGs bij hypertensie laat zien in vergelijking met de normotensieve status.

D11-AP werd geïsoleerd en opgeslagen in het bacteriële periplasmatische extract. Muis- en menselijke weefsels werden gekleurd met D11-AP en periplasmatisch extract dat de AP-linker zonder D11 bevat om ervoor te zorgen dat andere factoren die aanwezig kunnen zijn in het periplasmatisch extract, zoals overtollig of niet-geconjugeerd alkalisch fosfatase, niet bijdragen aan de kleuring die wordt waargenomen in weefsels die zijn behandeld met D11-AP (figuur 3). Weefsels gekleurd met D11-AP resulteerden in helderdere kleuring in vergelijking met weefsels gekleurd met periplasmatisch extract. Deze resultaten bevestigen dat D11-AP de weefsels kleurt, en de kleuring is niet te wijten aan niet-geconjugeerde bacteriële alkalische fosfatase die mogelijk aanwezig kan zijn in het periplasmatische extract en resulteert in valse kleuring van IsoLGs of bijdraagt aan achtergrondkleuring.

Een competitieve controle werd uitgevoerd door D11-AP vooraf te incuberen met IsoLG geadduceerd naar MSA of niet-geadduceerde MSA voordat weefsels werden gekleurd om de specificiteit van D11-AP voor IsoLG aan te tonen. Als D11-AP specifiek is voor IsoLG, zou het antilichaam binden aan IsoLG-MSA, wat resulteert in een uitgeputte beschikbaarheid van D11-AP om weefsels te kleuren, en D11-AP geïncubeerd met niet-geadduceerde MSA zou een vergelijkbare kleuring hebben als normale D11-AP. In weefsels gekleurd met D11-AP voorgeïncubeerd met de IsoLG-concurrent, vonden we verminderde kleuring in vergelijking met weefsels die waren gekleurd met D11-AP zonder enige preïncubatie (figuur 4). In weefsels gekleurd met D11-AP voorgeïncubeerd met niet-geadduceerde MSA, vonden we kleuring vergelijkbaar met kleuring waargenomen in weefsels met D11-AP. Deze resultaten tonen de specificiteit van D11-AP voor IsoLGs als gevolg van verminderde kleuring van weefsels wanneer D11-AP vooraf was geïncubeerd met IsoLG / MSA, maar niet met niet-geadduceerde MSA. Bij de uiteindelijke negatieve controle werd muizenweefsel gekleurd met D11-AP of irrelevant scFv-antilichaam, D20. Kleuring van muisaorta met D11-AP resulteerde in sterke kleuring in vergelijking met D20, wat wijst op de specificiteit van D11-AP voor IsoLGs in hypertensieve aortae (figuur 5).

Figure 1
Figuur 1: Immunofluorescentie van de aorta bij hypertensieve en normotensieve muizen. Slagaders van angiotensine II en sham-geïnfundeerde muizen werden gekleurd met en zonder D11-AP (D11) om de aanwezigheid van IsoLGs aan te tonen. (A) slagader van een met angiotensine II behandelde muis die werd gesondeerd met D11-AP (groen) en nucleaire tegenkleur (magenta), (B) slagader van een met controle met schijn behandelde muis die werd onderzocht met D11-AP, (C) slagader van een met angiotensine II behandelde muis zonder D11-AP, (D) slagader van een met controle sham behandelde muis zonder D11-AP (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Immunofluorescentie van menselijke darmweefsels van hypertensieve en normotensieve patiënten. Weefsels van patiënten met hypertensie (HTN) en normotensieve mensen (NTN) werden gekleurd met en zonder D11-AP (D11) om de aanwezigheid van IsoLGs bij patiënten met HTN aan te tonen. (A) HTN-weefsels gekleurd met D11-AP (groen) en nucleaire tegenkleur (magenta), (B) NTN-weefsels gekleurd met D11-AP, (C) HTN-weefsels gekleurd zonder D11-AP, (D) NTN-weefsels gekleurd zonder D11-AP (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Muis en menselijke weefsels gekleurd met periplasmatisch extract met en zonder D11-AP. Muis- en menselijke weefsels werden gekleurd met periplasmatische extracten met en zonder D11-AP. Afbeeldingen tonen beperkte kleuring van weefsels met periplasmatisch extract zonder D11-AP, waaruit blijkt dat kleuring meestal te wijten is aan D11-AP-binding in plaats van een andere component die aanwezig kan zijn in periplasmatisch extract. (A) Ang muisaorta gekleurd met D11-AP (groen) en nucleaire tegenkleur (magenta), (B) Ang muisaorta gekleurd met periplasmatisch extract, (C) Schijnmuisaorta gekleurd met D11-AP, (D) Schijnmuisaorta gekleurd met periplasmatisch extract, (E) hypertensief menselijk darmweefsel gekleurd met D11-AP, (F) hypertensief menselijk darmweefsel gekleurd met periplasmatisch extract, (G) normotensief menselijk darmweefsel gekleurd met D11-AP, (H) normotensief menselijk darmweefsel gekleurd met periplasmatisch extract (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Concurrentiecontrole in vaten van Ang en Sham muizen. In deze competitieve controle werd D11-AP vooraf geïncubeerd met IsoLG-geadduceerde MSA of niet-geadduceerde MSA. D11-AP zonder enige pre-incubatie werd gebruikt als controle. Deze resultaten tonen de specificiteit van D11-AP voor IsoLGs omdat er minder kleuring van weefsels is met de IsoLG-MSA-concurrent in vergelijking met D11-AP. Deze reductie is te wijten aan IsoLG en niet aan MSA omdat de niet-geadduceerde MSA pre-incubatie resulteerde in kleuring vergelijkbaar met D11-AP-controle. Angiotensine II (A) en Sham (B) muisaortae gekleurd met D11-AP (groen) en nucleaire tegenvlek (magenta), Angiotensine II (C) en Sham (D) muisaortae gekleurd met D11-AP na incuberen met IsoLG-MSA, Angiotensine II (E) en Sham (F) muisaortae gekleurd met D11-AP na incuberen met niet-geadduceerde MSA (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Muisaortae gekleurd met D11 en irrelevante scFv, D20. Muisweefsel werd gekleurd met D11-AP en vergeleken met een irrelevant controleantilichaam, D20, dat specifiek is voor glycoproteïne A2. Kleuring van weefsel met D11-AP (groen) en nucleaire tegenkleur (magenta) (A) resulteerde in intense immunofluorescentie in vergelijking met D20 (groen) en nucleaire tegenkleur (magenta) (B), wat duidt op specificiteit van D11-AP tot IsoLGs (schaalbalk = 100 μm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

D11 is op grote schaal gebruikt om IsoLG-geadduceerde eiwitten in cellen of weefsels te detecteren als een marker voor ontsteking of oxidatieve stress bij ziekte 8,9,20. Voorheen bevatte D11 een E-tag en IHC-ontwikkeling vereiste het gebruik van een secundair anti-E-tag-antilichaam geconjugeerd met HRP10,20,21. Hier hebben we een protocol ontwikkeld en geoptimaliseerd voor de detectie van IsoLG-geadduceerde eiwitten met behulp van het D11-antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase in plaats van de E-tag, waardoor een secundaire antilichaamincubatie niet meer nodig is.

Om de specificiteit van D11-AP te bepalen, werden vier negatieve controle-experimenten uitgevoerd. We voerden het protocol uit zonder de aanwezigheid van D11 en hadden minimale ontwikkeling. Deze resultaten hebben een tweevoudige indicatie: endogene alkalische fosfatase draagt niet bij aan de ontwikkeling en de waargenomen kleuring is te wijten aan D11 en niet aan een andere bijdragende factor. Vervolgens hebben we dia's gekleurd met de AP-linker zonder D11. Dit experiment resulteerde in weinig kleuring, wat aangeeft dat vrije AP of andere factoren in het periplasmatische extract niet de vlek veroorzaken die we waarnemen in de aanwezigheid van D11. Om de specificiteit van D11 naar IsoLG te garanderen, hebben we D11-AP voorgeïncubeerd met gezuiverde IsoLG voordat we dia's kleurden. We zagen een afname in de ontwikkeling die aangeeft dat de D11-AP gebonden was aan IsoLG-eiwit, waardoor de hoeveelheid vrije D11-AP om te binden aan IsoLG in het weefsel werd uitgeput. Ten slotte, om ervoor te zorgen dat D11-AP zich aan IsoLG bindde en niet aan het MSA-eiwit waaraan IsoLG was gebonden, hebben we D11-AP alleen met MSA voorgeïncubeerd. Er waren geen veranderingen in de ontwikkeling, wat aangeeft dat D11-AP niet bindend was aan MSA, maar aan het IsoLG-eiwit. Ten slotte waren onderzoekers die het kleuringsprotocol ontwikkelden blind voor de hypertensieve status van menselijk darmweefsel. De waargenomen verschillen in kleuring tussen patiënten met hypertensie en patiënten met normotensie waren niet te wijten aan bias en zijn eerder beschreven22,23.

Hoewel ons protocol voor de detectie van IsoLG-geadduceerde eiwitten met behulp van het D11-antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase in plaats van de E-tag rigoureus en robuust is en de noodzaak van een secundaire antilichaamincubatie elimineert, heeft het enkele beperkingen. Een beperking is dat we D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase in het periplasmatische extract hebben gebruikt, en er kan valse kleuring van endogene alkalische fosfatase zijn in het periplasmatische extract of bepaalde weefsels, zoals darm24. De eerste stap om dit protocol te ontwikkelen omvatte echter het uitschakelen van endogene alkalische fosfatase die aanwezig kan zijn in weefsels25. Aanvankelijk werden koud azijnzuur, BME en Levamisole26 getest op efficiëntie. Geen van deze verminderde volledig de aanwezigheid van actieve endogene alkalische fosfatase. Warmte is gebruikt om alkalische fosfatase27 te deactiveren, dus we hebben warmtedeactivering van alkalische fosfatase in verschillende buffers getest. We vonden dat verwarming gemonteerde en gehydrateerde dia's in citraatbuffer de meeste endogene alkalische fosfatase elimineerden. Dia's werden aanvankelijk ontwikkeld met behulp van een chemiluminescent / fluorescerend substraat, maar wanneer ze zonder dit substraat werden afgebeeld, was er een hoge hoeveelheid autofluorescentie. VectorRed is een substraat dat zich ontwikkelt in de aanwezigheid van alkalische fosfatase om een chromogeen te produceren dat kan worden gevisualiseerd in het Texas Red / TRITC-kanaalbereik. Met behulp van dit substraat konden we gemakkelijker signaal waarnemen boven achtergrondautofluorescentie. Tijdens het kleuringsproces moet voorzichtig worden geweest om artefactuele vlekken te minimaliseren. Drogen van weefsels op dia's na hydratatie totdat beeldvorming heeft geresulteerd in een verhoogde ontwikkeling. D11-AP moet worden gealiquoteerd en bewaard bij -20 °C. Meerdere vries-dooicycli moeten worden vermeden bij het werken met D11-AP. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) kan ook de enzymatische activiteit van alkalische fosfatase beïnvloeden en mag niet worden gebruikt als wasbuffer28. Zoals bij elke op antilichamen gebaseerde aanpak, moeten grondige tests en optimalisatie worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de kleuring specifiek is en dat het signaal niet over- of onderversterkt is.

Kortom, we hebben een krachtig, rigoureus en robuust geoptimaliseerd protocol ontwikkeld om IsoLG-geadduceerde eiwitten te detecteren met behulp van het D11-antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase in plaats van de E-tag. Dit protocol biedt verschillende voordelen: ten eerste is het gebruik van D11 als alkalisch fosfatasefusie-eiwit goedkoper. D11 was oorspronkelijk afgeleid van een faagantilichaambibliotheek die niet kon worden gecommercialiseerd en duur was om te zuiveren. Hoewel D11 in E. coli periplasmatisch extract een goedkoop alternatief kon bieden, was het in de meeste testen niet effectief. Ten tweede zorgt de alkalische fosfatasefusiebenadering ervoor dat D11 scfv een nuttige reporter15 (alkalische fosfatase) ermee versmolten en niet hoeft te worden gezuiverd voor gebruik in immunoassays omdat substraten in de handel verkrijgbaar zijn. Ten derde vormt de E. coli alkalische fosfatase dimeren29. Dus D11, wanneer gefuseerd met de alkalische fosfatase zou ook dimeren vormen en dit verhoogt de aviditeit en bindingsactiviteit van het antilichaam30. Ten slotte kan D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase in periplasmatisch extract gemakkelijk worden gereinigd met Cibacron Blue Sepharose. D11 heeft een hoog iso-elektrisch punt (~9,2 pH). Als zodanig is het positief geladen en kan het binden aan Cibacron Blue door pi-cation interacties. De meeste onzuiverheden in het E. coli periplasmatisch extract kunnen van de hars worden geëlueerd. De D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase kan vervolgens worden geëlueerd met behulp van hoog zout (~ 1,5 M NaCl) in water. Het geëlueerde D11 geconjugeerd met alkalische fosfatase is vrij stabiel bij 4-8 °C in de zoutrijke oplossing. Daarom hebben we een protocol ontwikkeld dat niet alleen het D11-antilichaam tegen lage kosten beschikbaar maakt, maar ook de extra stappen en noodzaak voor de secundaire antilichaamincubatie elimineert. Dit protocol vergemakkelijkt reproduceerbare meting van IsoLGs, die zich ophopen in weefsels bij meerdere ziekten waarbij verhoogde oxidatieve stress een rol speelt.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health subsidies K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 en R03HL155041 aan A.K. We bedanken de Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 voor visualisatie en diascanning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) Cytiva 28953766
200 Proof Ethanol Pharmco 111000200
2xYT powder MP Biomedicals 3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates ThermoFisher (NUNC) 242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) Carbosynth EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) Carbosynth EB09335
Ampicillin, sodium salt Research Products International (RPI) A40040
Bovine Serum Albumin RPI A30075
Chemically competent TG1 E. coli Amid Biosciences TG1-201
Diethanolamine, >98% Sigma-Aldrich D8885
EDTA Sigma-Aldrich ED
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Mouting medium
Glucose Research Products International (RPI) G32045
Glycerol Sigma-Aldrich G7893
Histoclear National Diagnostics HS-200 Xylene alternative
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals ThermoFisher MK-2624-212
Imidazole Research Products International (RPI) I52000
MgCl2 (anhydrous) Sigma-Aldrich M8266
Mouse Serum Albumin (MSA) Sigma-Aldrich/Calbiochem 126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Carbosynth EN13587
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Pressure Cooker Cuisinart CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml ThermoFisher 66380
Sodium chloride (NaCl) Research Products International (RPI) S23020
Sodium Citrate Sigma-Aldrich 1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Research Products International (RPI) S23100
Sucrose Research Products International (RPI) S24065
Tris base Research Products International (RPI) T60040
Tris-buffered Saline Boston Bio-Products 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl Research Products International (RPI) T60050
Tween20 Sigma-Aldrich P9416
Vector Red Vector Labs SK-5105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Tags

Biologie isolevuglandinen immunofluorescentie alkalische fosfatase geconjugeerd ScFv D11-antilichaam en hypertensie

Erratum

Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Directe detectie van isolevuglandinen in weefsels met behulp van een D11 scFv-alkalisch fosfatasefusie-eiwit en immunofluorescentie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic,… More

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic, L., Pitzer, A., Davies, S. S., Layer, J. H., Mernaugh, R. L., Kirabo, A. Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (173), e62603, doi:10.3791/62603 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter