Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Direkte påvisning af isolevuglandiner i væv under anvendelse af et D11 scFv-alkalisk fosfatasefusionsprotein og immunofluorescens

Published: July 5, 2021 doi: 10.3791/62603
Automatic Translation
*1, *2, 3, 4,6, 4, 5, 3, 4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne artikel indeholder en detaljeret metode til måling af isolevuglandiner i væv ved immunofluorescens under anvendelse af alkalisk phosphatase-konjugeret ScFv D11-antistof. Hypertensionsmodeller hos både mus og mennesker bruges til at forklare de trinvise procedurer og grundlæggende principper forbundet med isolevuglandinmåling i vævsprøver.

Abstract

Isolevuglandiner (IsoLG'er) er stærkt reaktive gamma ketoaldehyder dannet af H2-isoprostaner gennem lipidperoxidering og tværbundne proteiner, der fører til betændelse og forskellige sygdomme, herunder hypertension. Påvisning af IsoLG-akkumulering i væv er afgørende for at kaste lys over deres involvering i sygdomsprocesserne. Måling af IsoLG'er i væv er imidlertid ekstremt vanskelig, og de nuværende tilgængelige værktøjer, herunder massespektrometrianalyse, er besværlige og ekstremt dyre. Her beskriver vi en ny metode til in situ-påvisning af IsoLG'er i væv ved anvendelse af alkalisk fosfatase-konjugeret D11 ScFv og et rekombinant fagdisplay-antistof produceret i E. coli ved immunofluorescerende mikroskopi. Fire kontroller blev brugt til validering af farvningen: (1) farvning med og uden D11, (2) farvning med bakterielt periplasmatisk ekstrakt med den alkaliske fosfataselinker, (3) irrelevant scFV-antistoffarvning og (4) konkurrencedygtig kontrol med IsoLG før farvningen. Vi demonstrerer effektiviteten af den alkaliske fosfatase-konjugerede D11 i både humant væv og musevæv med eller uden hypertension. Denne metode vil sandsynligvis tjene som et vigtigt redskab til at studere IsoLGs rolle i en lang række sygdomsprocesser.

Introduction

Isolevuglandiner (IsoLG'er), også kendt som isoketaler, er isomerer af 4-ketoaldehydfamilien, som er produkter af lipidperoxidation og reagerer med og addukterer til primære aminer på proteiner 1,2. IsoLG'er har været impliceret i flere sygdomme, herunder hjerte-kar-, Alzheimers-, lunge- og leversygdomme og mange typer kræft3. IsoLG'er er blevet mest grundigt undersøgt i deres bidrag til hjerte-kar-sygdomme (CVD), som er en betydelig sundhedsmæssig og økonomisk byrde globalt, herunder USA. Det anslås, at 92.1 millioner amerikanske voksne har mindst en type CVD, hvor estimerede fremskrivninger i 2030 når op på 43.9% af den amerikanske voksne befolkning4. Sænkning af blodtryk, kolesterol og rygestop reducerer den samlede risiko og forekomst af CVD-hændelser5.

Højt blodtryk eller hypertension er en væsentlig risikofaktor for hjerte-kar-sygdomme og påvirker ca. halvdelen af den amerikanske befolkning6. Tidligere undersøgelser har vist, at inflammation er en underliggende årsag til hypertension, og at IsoLG'er spiller en rolle7. Hypertensive stimuli, herunder angiotensin II, catecholaminer, aldosteron og overskydende kostsalt, inducerer IsoLG-akkumulering i antigenpræsenterende celler, herunder dendritiske celler (DC'er), som igen aktiverer T-celler til at proliferere og producere inflammatoriske cytokiner, der bidrager til hypertension 8,9.

Tidligere er IsoLG'er blevet målt ved immunhistokemi, massespektrometri, enzymbundet immunosorbentassay og flowcytometri10,11. For at lette målingen af IsoLG'er blev der udviklet et enkeltkædet fragmentvariabelt (scfv) rekombinant antistof (D11) mod IsoLGs12. Oprindeligt indeholdt dette D11-antistof et 11 aminosyre E-tag og krævede et sekundært antistof til immunhistokemisk detektion11. Det var imidlertid svært at finde et pålideligt sekundært antistof mod E-mærket efter producentens afbrydelse af produktionen. Derfor har vi udviklet en pålidelig protokol til immunfluorescerende farvning af IsoLG'er ved hjælp af D11 konjugeret med alkalisk fosfatase (D11-AP), som vi har demonstreret i muse- og humanvæv med og uden hypertension.

Protocol

Vanderbilt University's Institutional Animal Care and Use Committee godkendte alle procedurer beskrevet i dette manuskript. Mus anbringes og plejes i overensstemmelse med vejledningen om pasning og brug af forsøgsdyr. Alle forsøgspersoner gav skriftligt informeret samtykke, før de tilmeldte sig undersøgelsen som godkendt af Institutional Review Board of Vanderbilt University. Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med Helsingfors-erklæringen.

1. Fremstilling af plasmider, der koder for D11-alkalisk phosphatasefusionsprotein og negative kontrolvektorer

  1. Konstruer en modificeret version af pCANTAB5E-plasmidet13,14, hvor segmentet med enkeltkædefragment (scFv) er bundet i sin 3'-ende til en sekvens, der koder for bakteriel alkalisk fosfatase (AP).
    BEMÆRK: Umiddelbart nedstrøms for scFv-sekvensens NotI-begrænsningssted indeholder det modificerede plasmid ikke længere kodningssekvensen for E-tagget og koder i stedet linkersekvensen GGSGGHMGSGG, efterfulgt af sekvensen for AP (GenBank-tiltrædelsesnummer AXY87039.1, T16-K464)15,16. Nedstrøms for AP vil plasmidet kode for 8xHis og DYKDDDDK tags. I 3'-enden af taggene slutter kodningssekvensen med et gult stopkodon. Det modificerede plasmid kaldes pCANTAB5-AP.
  2. Klon D11 scFv (GenBank-tiltrædelsesnummer AAW28931.1) til pCANTAB5-AP med SfiI/NotI-begrænsningswebstederne.
  3. Klon D20 scFv i pCANTAB5-AP med SfiI / NotI-begrænsningswebstederne.
    BEMÆRK: D20 scFv er en negativ kontrol designet til at vurdere vævsinteraktionsmønsteret for en irrelevant scFv. Denne scFv blev oprindeligt valgt af fagvisning for sin evne til at interagere med en glykangruppe kendt som A2.
  4. Generer en "tom" vektor ved at fjerne scFv-delen helt fra plasmidet og erstatte den med en "AP-linker" kodningssekvens bestående af aminosyrerne GGGGSGRAGSGGGGS.
  5. Omdan alle plasmider til kompetent TG1 E. coli og dyrk bakterier natten over ved 30 °C på 0,5% agarplader indeholdende 2xYT suppleret med 100 μg/ml ampicillin og 2% glucose (2xYTAG) medium.
    BEMÆRK: Stammer med supE-genet (såsom TG1 E. coli) undertrykker ikke det gule stopcodon 100%. Estimater spænder fra 0,8 - 20% af tiden, så der er stadig meget produkt, der slutter lige nedstrøms for BAP, da det er beregnet til disse eksperimenter17. TG1 E. coli bruges hovedsageligt af praktiske årsager, såsom reduktion af tid og omkostninger, deres kompatibilitet med pCANTAB-proteinekspressionssystemet og deres anvendelse i fagvisning, som almindeligvis udføres i laboratoriet. Nedstrøms for det gule stopkodon efter BAP er en sekvens for genIII. GeneIII-fusionsproteiner skal udtrykkes sjældent, for at fagvisning fungerer efter hensigten, fordi scFv-geneIII-fusionsproteiner interfererer med det pågældende genIII-protein for at geninficere naive bakterier. Derfor skal fusionsfrie genIII-proteiner eksistere under virionsamling for at generere fungerende, dvs. scFv-geneIII-proteinprodukter er normalt relativt sjældne inde i bakterien. D11-AP, D20-AP, tom vektor og alle konstruktioner, der anvendes i denne artikel, påvirkes alle på samme måde af lejlighedsvis geneIII-fusionsproteinekspression. Der er stadig observerede forskelle i, hvordan disse proteiner opfører sig.
  6. Vælg en individuel koloni og pod en frisk 5 ml 2xYTAG-kultur. Lad bakterierne vokse natten over ved 30 °C og omrystes ved 150 o/min.
  7. Pellet cellerne ved centrifugering ved 3.000 x g i 10 min ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 2 ml 85% 2xYTAG og 15% glycerol.
  8. Opbevar glycerollagrene i en fryser til -80 °C.

2. Proteinekspression og generering af periplasmatisk ekstrakt

BEMÆRK: Generering af det periplasmatiske ekstrakt er en almindeligt anvendt metode til proteinekspression i fagvisning, hovedsageligt fordi dannelsen af disulfidbindinger er vigtig i scFv og antistofgenerering. Metoden undgår behovet for at generere lysater (almindeligvis indeholdende inklusionsorganer) og sikrer, at proteiner foldes korrekt. pCANTAB har en gIII-signalsekvens opstrøms for scFv-delen af D11-BAP-fusionsproteinet. Signalsekvensen sikrer, at proteinet overføres til bakteriens periplasmatiske rum, og derefter spaltes signalsekvensen. Det periplasmatiske rum giver et oxiderende miljø, hvilket er afgørende for korrekt dannelse af disulfidbroer. Osmotisk chok bruges til at udlede periplasmatiske ekstrakter, fordi det forstyrrer den ydre membran nok til at frigive de periplasmatiske proteiner i det omgivende medium, samtidig med at bakterien holdes intakt.

  1. TG1 E. coli-glycerolstammer, der indeholder de relevante plasmider, podes i en 60 ml kultur af 2xYTAG og dyrkes natten over ved 30 °C med omrystning ved 150 omdr./min.
  2. For at inducere proteinekspression resuspenderes pelletbakteriekulturer ved 3.000 x g i 10 minutter, resuspenderes i 60 ml 2xYTA-medium og dyrkes natten over ved 30 °C med omrystning ved 150 omdr./min.
    BEMÆRK: Skift fra 2xTYAG til 2xYTA-medium hjælper med tilstrækkelig induktion af proteinekspression18. Når glukose er til stede i bakteriemediet, undertrykkes lac-promotoren, fordi bakterier fortrinsvis forbruger glukose og ignorerer lactose, da glukose tager mindre energi at behandle. Når glukose fjernes efter mediumkontakten, er bakterier afhængige af kulhydraterne fra 2xYT-mediet. Gærekstrakt (Y-komponenten i 2xYT) indeholder kulhydrater, blandt dem lactose, og er derfor i stand til at drive proteinekspression gennem lac-promotoren. IPTG er ikke nødvendigt med pCANTAB-konstruktionen og kan resultere i overdreven proteinekspression sammen med inklusionsorganer, der resulterer i ikke-funktionelt protein.
  3. Generer periplasmatiske ekstrakter via osmotisk shock.
    1. Pillebakteriekulturer ved 3.000 x g i 10 min.
    2. Resuspenderes i 20 ml 1xTES (0,2 M Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 0,5 M saccharose) og inkuberes i 1 time på is.
    3. Pellet igen ved 3.000 x g i 10 min, og resuspender i 15 ml 0,05 M Tris, pH 7,6.
  4. Denne suspension inkuberes på is i 1 time, hvorefter den klargøres ved centrifugering ved 5.000 x g i 10 minutter.
  5. Supernatanterne overføres til et frisk glas og opbevares ved -20 °C, indtil de skal bruges til enten rensning eller direkte anvendelse til forsøg.
  6. Cellelysen vurderes ved tilstedeværelsen af aktiv D11-BAP i ELISA. Tilsæt 3-5 μL af det periplasmatiske ekstrakt til en ml pNPP, og observer derefter, om der sker en farveændring i løbet af de næste 10 minutter (farven går fra klar gul til intens gul).
    BEMÆRK: Farven kan sammenlignes side om side med et rør af pNPP, som ikke har modtaget noget lysat eller et rør af pNPP, som modtog lysat af naive TG1-bakterier. Der kvantificeres med absorbans ved 405 nm.

4. Karakterisering af D11-AP-titer i ELISA

  1. Overtræk en polystyrenplade med 384 brønde natten over ved 4 °C med 25 μL/brønd fosfatbufret saltvand (PBS) (1,8 mM KH 2 PO 4, 10 mM Na 2 HPO4,2,7mM KCl, 137 mM NaCl) indeholdende enten 5 μg/ml museserumalbumin (MSA) (negativ kontrol) eller 5 μg/ml IsoLG/MSA (positiv kontrol).
  2. Tøm pladen og tryk tør. Vask én gang med PBS + 0,1% Tween (PBS-T). Tøm pladen og tryk tør.
  3. Pladen fyldes med PBS-T som blokerende buffer (120 μL/hul). Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
  4. Tøm pladen og tryk tør. Der påføres serielle 1:2 fortyndinger af D11-AP periplasmatiske ekstrakter ved 25 μL/hul og fortyndes i PBS-T. Medtag et hul, der kun indeholder PBS-T, som en negativ kontrol.
    BEMÆRK: Typiske fortyndingsområder for periplasmatiske ekstrakter er 1:8 - 1:4096. For et 25 μL assayvolumen startes med 50 μL af startkoncentrationen "1:8": 6,25 μL periplasmatisk ekstrakt og 43,75 μL PBS-T. Udfør derefter en 2 gange fortynding ved at fjerne 25 μL af denne opløsning og tilføje den til det næste hul, der indeholder 25 μL PBS-T, og pipette den op og ned. Denne brønd indeholder nu "1:16" fortynding. Bliv ved med at gentage den 2-dobbelte fortynding for at generere den beskrevne 1:2 fortyndingsserie.
  5. Inkuber i 1,5 timer ved stuetemperatur.
  6. Tøm pladen og tryk tør. Vask 5 gange med PBS-T. Tøm og tryk tørt.
  7. Der fremstilles pNPP-opløsning ved at opløse 1 g pNPP i 1 liter 930 mM diethanolamin (98 % stamopløsning fortyndet 1:10 iH2O) med 0,5 mMMgCl2 og justeret til pH 9,5 med HCl.
  8. Der anvendes 25 μL/brønd pNPP-opløsning til udvikling af AP. Der inkuberes i 1 time ved stuetemperatur, og absorbansen bestemmes ved 405 nm i hvert hul ved hjælp af en kompatibel pladelæser.
  9. Sammenlign signalet fra IsoLG/MSA-brøndene med støjen fra MSA-brøndene, og find det fortyndingsområde, hvor signalet er mindst 5 gange højere end støjen.
  10. Denne D11-AP-signalfortyndingsserie plottes på en graf, bestemmer kurvens lineære område og etablerer fortyndingen, hvor 50% af signalet kan observeres.
    BEMÆRK: Hvis denne fortynding svarer til ca. 1:1.000, kan D11-AP-opløsningen anvendes i en koncentration på 1:10 i IHC/IF.

5. Immunofluorescens

  1. Serielle sektioner af muse- og humant paraffinindlejret væv (5 μm tykt) skæres ved hjælp af et mikrotomt og anbringes i varmtvandsbad (37 °C). Monter vævssektioner på glasskinner og lad dem tørre natten over.
    BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev aortae opnået fra mus. Tyktarmssektioner af normotensive og hypertensive mennesker blev opnået fra Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network.
  2. Dyp dias i xylen tre gange i 5 minutter for at afparaffinisere væv.
  3. Rehydratvæv i 2 vaske hver af 95%, 70% og 50% ethanol i H2O.
  4. Vask dias i Tris-bufret saltvand (TBS) med 0,1% Tween20 (TBST) tre gange med hurtigvask ved at fylde diasholderen med TBST og derefter kassere TBST.
    BEMÆRK: Hydrerede dias kan opbevares i TBST ved 4 °C i højst en uge før antigenudtagning.
  5. For at udføre varmeinduceret antigenhentning af dias anbringes objektglas i forvarmet (80-95 °C) natriumcitratbuffer (10 mM natriumcitrat, 0,05% Tween 20, pH 6,0) og inkuberes i en trykkoger, der er indstillet til 4 minutter ved højt tryk for en samlet antigenudtagningstid på 20 min.
  6. Fjern gliderne fra trykkogeren, og lad dem køle af i 20 minutter til stuetemperatur.
  7. Vask dias i TBST tre gange med hurtigvask.
    BEMÆRK: Dias kan opbevares i TBST efter antigenhentning i højst en uge før farvning.
  8. Tilsæt 2% BSA opløst i TBST for at blokere dias. Dæk dias med en strimmel paraffinfilm og inkuber ved stuetemperatur i 15 min.
  9. Kassér blokeringsbufferen fra diasene.
  10. Der tilsættes 200 μL 1:10 D11-AP i TBST til diasene og dækkes med en strimmel paraffinfilm.
  11. Inkuberes i et befugtet kammer for at minimere fordampningen af antistofopløsningen i 3 timer ved stuetemperatur.
  12. Vask dias tre gange i TBST.
  13. Udvikle med en kolorimetrisk eller fluorescerende alkalisk fosfataseudvikler til henholdsvis immunhistokemi eller immunofluorescens. Vask dias én gang med TBST for at fjerne overskydende udvikler og forhindre yderligere farveudvikling.
  14. Modpletter glider med Hoechsts kernefarve ved 1 μg/ml i PBS til immunfluorescens. Vask dias en gang i TBST for at fjerne overskydende tællerpletter.
  15. Påfør dæksler ved hjælp af monteringsmediet.
  16. Se dias under et omvendt lysmikroskop til immunhistokemi eller et konfokal fluorescerende mikroskop til immunofluorescens.

6. Negativ kontrol

BEMÆRK: Fire negative kontroleksperimenter kan udføres for at bekræfte specificiteten af D11-AP-farvning for IsoLG. Negative kontrolforsøg bør udføres i samme farvningssæt under de samme betingelser.

  1. I det første negative kontrolforsøg inkuberes væv med D11-AP fortyndet i TBST eller TBST alene.
  2. Inkubere væv med fortyndet D11-AP i TBST og bakterielt periplasmatisk ekstrakt uden D11-AP (AP Linker) fortyndet i TBST.
  3. Udfør et konkurrencedygtigt assay med IsoLG/MSA eller ikke-addukteret MSA som tidligere beskrevet12.
    1. IsoLG og IsoLG fremstilles addukteret til museserumalbumin (MSA) som tidligere beskrevet19 i et molært forhold på 8 IsoLG: 1 MSA (8:1 IsoLG/MSA).
    2. Fortynd D11-AP 1:10 i TBST.
    3. Der inkuberes fortyndet D11-AP med 50 μg/ml IsoLG/MSA eller ikke-addukteret MSA i 1 time ved stuetemperatur.
    4. Tilsæt D11-AP med IsoLG/MSA eller D11-AP med ikke-addukteret MSA til væv til farvning.
  4. Brug irrelevant scFv-antistof, D20, til at plette væv til det endelige negative kontrolsæt.

Representative Results

I repræsentative forsøg blev D11 scfv med en alkalisk fosfatasekonjugering (D11-AP) anvendt i immunofluorescens til påvisning af IsoLG'er til stede i angiotensin II-behandlede mus sammenlignet med normale skinmus og mennesker med hypertension sammenlignet med normotensive mennesker. Mus blev behandlet med angiotensin II i en dosis på 490 ng/kg/min i to uger, og hypertension blev bekræftet med forhøjet systolisk blodtryk sammenlignet med skinmus10. For at sikre specificiteten af D11-AP blev væv farvet med eller uden tilstedeværelse af D11-AP. Som påvist ved D11-AP-farvning viste aorta hos mus med angiotensin II-induceret hypertension forhøjet koncentration af IsoLG'er sammenlignet med kontrolmus (figur 1). Baggrundsfarvning eller autofluorescens var begrænset, som det fremgår af negative kontroller, der ikke var farvet med D11-AP.

D11-AP blev anvendt til at påvise IsoLG'er til stede i tarmvæv hos humane patienter med hypertension (HTN) eller normotensive mennesker (NTN). Hypertensionsstatus blev fastslået ud fra hospitalets journaler som systolisk blodtryk over 140 og diastolisk blodtryk over 80 mmHg. Forskere, der udviklede immunfluorescensprotokol for D11-AP, blev blindet for hypertensionsstatus for humant væv. Sektioner blev farvet i nærvær og fravær af D11-AP for at sikre antistofspecificitet og vise baggrundsfarvning eller autofluorescens. Som vist i figur 2 fandt vi, at væv fra patienter med HTN havde forhøjede koncentrationer af IsoLG'er sammenlignet med patienter med NTN. Farvning uden D11-AP viste også minimal baggrundsfarvning og autofluorescens. Endogen alkalisk fosfatase udtrykkes af tarmepitel, så den begrænsede fluorescens af væv farvet uden D11-AP viser, at antigenudtagningen, der blev anvendt i denne protokol, var tilstrækkelig til at inaktivere endogen alkalisk fosfatase, der var til stede i væv. I kombination med resultaterne i mus viser disse resultater også, at immunofluorescensprotokollen effektivt viser forhøjede IsoLG'er i hypertension sammenlignet med normotensiv status.

D11-AP blev isoleret og opbevaret i det bakterielle periplasmatiske ekstrakt. Væv fra mus og mennesker blev farvet med D11-AP og periplasmatisk ekstrakt indeholdende AP-linkeren uden D11 for at sikre, at andre faktorer, der kan være til stede i det periplasmatiske ekstrakt, såsom overskydende eller ikke-konjugeret alkalisk fosfatase, ikke bidrager til farvningen observeret i væv behandlet med D11-AP (figur 3). Væv farvet med D11-AP resulterede i lysere farvning sammenlignet med væv farvet med periplasmatisk ekstrakt. Disse resultater bekræfter, at D11-AP farver vævene, og farvningen skyldes ikke ikke-konjugeret bakteriel alkalisk fosfatase, der potentielt kan være til stede i det periplasmatiske ekstrakt og resultere i falsk farvning af IsoLG'er eller bidrage til baggrundsfarvning.

En konkurrencedygtig kontrol blev udført ved præinkubation af D11-AP med IsoLG addukteret til MSA eller ikke-addukteret MSA før farvning af væv for at vise specificiteten af D11-AP til IsoLG. Hvis D11-AP er specifikt for IsoLG, vil antistoffet binde sig til IsoLG-MSA, hvilket resulterer i en udtømt tilgængelighed af D11-AP til pletvæv, og D11-AP inkuberet med ikke-addukteret MSA vil have lignende farvning som normal D11-AP. I væv farvet med D11-AP præinkuberet med IsoLG-konkurrenten fandt vi formindsket farvning sammenlignet med væv, der var farvet med D11-AP uden præinkubation (figur 4). I væv farvet med D11-AP præinkuberet med ikke-addukteret MSA fandt vi, at farvning svarede til farvning observeret i væv med D11-AP. Disse resultater viser specificiteten af D11-AP til IsoLG'er på grund af reduceret farvning af væv, når D11-AP blev præinkuberet med IsoLG/MSA, men ikke ikke-addukteret MSA. I den endelige negative kontrol blev musevæv farvet med D11-AP eller irrelevant scFv-antistof, D20. Farvning af museaorta med D11-AP resulterede i stærk farvning sammenlignet med D20, hvilket indikerer specificiteten af D11-AP til IsoLG'er i hypertensive aortae (figur 5).

Figure 1
Figur 1: Immunofluorescens af aorta hos hypertensive og normotensive mus. Arterier fra angiotensin II og sham infunderede mus blev farvet med og uden D11-AP (D11) for at vise tilstedeværelse af IsoLG'er. (A) arterie fra en angiotensin II-behandlet mus undersøgt med D11-AP (grøn) og nuklear modplet (magenta), (B) arterie fra en kontrolskin-behandlet mus undersøgt med D11-AP, (C) arterie fra en angiotensin II-behandlet mus uden D11-AP, (D) arterie fra en kontrolskinbehandlet mus uden D11-AP (skalabjælke = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Immunofluorescens af humant tarmvæv fra hypertensive og normotensive patienter. Væv fra patienter med hypertension (HTN) og normotensive mennesker (NTN) blev farvet med og uden D11-AP (D11) for at vise tilstedeværelse af IsoLG'er hos patienter med HTN. A) HTN-væv farvet med D11-AP (grøn) og nuklear modfarvning (magenta), B) NTN-væv farvet med D11-AP, C) HTN-væv farvet uden D11-AP, D) NTN-væv farvet uden D11-AP (skalastang = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Væv fra mus og mennesker farvet med periplasmatisk ekstrakt med og uden D11-AP. Mus og humant væv blev farvet med periplasmatiske ekstrakter med og uden D11-AP. Billeder viser begrænset farvning af væv med periplasmatisk ekstrakt uden D11-AP, hvilket viser, at farvning hovedsagelig skyldes D11-AP-binding snarere end en anden komponent, der kan være til stede i periplasmatisk ekstrakt. (A) Ang mus aorta farvet med D11-AP (grøn) og nuklear modfarve (magenta), (B) Ang mus aorta farvet med periplasmatisk ekstrakt, (C) Sham mus aorta farvet med D11-AP, (D) Sham mus aorta farvet med periplasmatisk ekstrakt, (E) hypertensive humane tarmvæv farvet med D11-AP, (F) hypertensive humane tarmvæv farvet med periplasmatisk ekstrakt, (G) normotensivt humant tarmvæv farvet med D11-AP, H) normotensivt humant tarmvæv farvet med periplasmatisk ekstrakt (skalastang = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Konkurrencekontrol i fartøjer med Ang- og Sham-mus. I denne konkurrencekontrol blev D11-AP præinkuberet med IsoLG-addukteret MSA eller ikke-addukteret MSA. D11-AP uden præinkubation blev anvendt som kontrol. Disse resultater viser specificiteten af D11-AP til IsoLG'er, fordi der er reduceret farvning af væv med IsoLG-MSA-konkurrenten sammenlignet med D11-AP. Denne reduktion skyldes IsoLG og ikke MSA, fordi den ikke-addukterede MSA-præinkubation resulterede i farvning svarende til D11-AP-kontrol. Angiotensin II (A) og Sham (B) museaortae farvet med D11-AP (grøn) og nuklear modplet (magenta), Angiotensin II (C) og Sham (D) museaortae farvet med D11-AP efter inkubation med IsoLG-MSA, Angiotensin II (E) og Sham (F) museaortae farvet med D11-AP efter inkubation med ikke-addukteret MSA (skalastang = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Musens aortae farvet med D11 og irrelevant scFv, D20. Musevæv blev farvet med D11-AP og sammenlignet med et irrelevant kontrolantistof, D20, som er specifikt for glycoprotein A2. Farvning af væv med D11-AP (grøn) og nuklear modfarve (magenta) (A) resulterede i intens immunfluorescens sammenlignet med D20 (grøn) og nuklear modfarve (magenta) (B), hvilket indikerer specificitet af D11-AP til IsoLG'er (skalabjælke = 100 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

D11 er blevet anvendt i vid udstrækning til at detektere IsoLG-addukterede proteiner i celler eller væv som markør for inflammation eller oxidativt stress ved sygdom 8,9,20. Tidligere indeholdt D11 et E-mærke, og IHC-udvikling krævede brug af et sekundært anti-E-tag-antistof konjugeret med HRP10,20,21. Her har vi udviklet og optimeret protokol til påvisning af IsoLG-addukterede proteiner ved hjælp af D11-antistoffet konjugeret med alkalisk fosfatase i stedet for E-tagget, hvilket eliminerer behovet for en sekundær antistofinkubation.

For at bestemme specificiteten af D11-AP blev der udført fire negative kontroleksperimenter. Vi udførte protokollen uden tilstedeværelse af D11 og havde minimal udvikling. Disse resultater har en dobbelt indikation: endogen alkalisk fosfatase bidrager ikke til udvikling, og den observerede farvning skyldes D11 og ikke en anden medvirkende faktor. Dernæst farvede vi dias med AP-linkeren uden D11. Dette eksperiment resulterede i lidt farvning, hvilket indikerer, at fri AP eller andre faktorer i det periplasmatiske ekstrakt ikke forårsager den plet, vi observerer i nærvær af D11. For at sikre specificiteten af D11 til IsoLG præinkuberede vi D11-AP med renset IsoLG før farvning af dias. Vi så et fald i udviklingen, hvilket indikerer, at D11-AP var bundet til IsoLG-protein, hvilket udtømte mængden af fri D11-AP til at binde til IsoLG, der var til stede i vævet. Endelig, for at sikre, at D11-AP var bindende til IsoLG og ikke MSA-proteinet, som IsoLG var bundet til, præinkuberede vi kun D11-AP med MSA. Der var ingen ændringer i udviklingen, hvilket indikerer, at D11-AP ikke var bindende for MSA, men IsoLG-proteinet. Endelig var forskere, der udviklede farvningsprotokollen, blinde for hypertensive status af humant tarmvæv. Forskellene i farvning observeret mellem patienter med hypertension og patienter med normotension skyldtes ikke bias og er tidligere beskrevet22,23.

Selvom vores protokol til påvisning af IsoLG-addukterede proteiner ved hjælp af D11-antistoffet konjugeret med alkalisk fosfatase i stedet for E-mærket er streng og robust og eliminerer behovet for en sekundær antistofinkubation, har den nogle begrænsninger. En begrænsning er, at vi brugte D11 konjugeret med alkalisk fosfatase i det periplasmatiske ekstrakt, og der kunne være falsk farvning af endogen alkalisk fosfatase i det periplasmatiske ekstrakt eller visse væv, såsom tarm24. Det første skridt til at udvikle denne protokol omfattede imidlertid deaktivering af endogen alkalisk fosfatase, der kan være til stede i væv25. Indledningsvis blev kold eddikesyre, BME og Levamisol26 testet for effektivitet. Ingen af disse mindskede fuldstændigt tilstedeværelsen af aktiv endogen alkalisk fosfatase. Varme er blevet brugt til at deaktivere alkalisk fosfatase27, så vi testede varmedeaktivering af alkalisk fosfatase i forskellige buffere. Vi fandt, at opvarmningsmonterede og hydrerede dias i citratbuffer eliminerede mest endogene alkaliske fosfatase. Slides blev oprindeligt udviklet ved hjælp af et kemiluminescerende / fluorescerende substrat, men når det blev afbildet uden dette substrat, var der en høj mængde autofluorescens. VectorRed er et substrat, der udvikler sig i nærvær af alkalisk fosfatase for at producere et kromogen, som kan visualiseres i Texas Red / TRITC-kanalområdet. Ved hjælp af dette substrat var vi i stand til lettere at observere signal over baggrundsautofluorescens. Der skal udvises forsigtighed under farvningsprocessen for at minimere kunstig farvning. Tørring af væv på dias efter hydrering, indtil billeddannelse har resulteret i øget udvikling. D11-AP skal alikveres og opbevares ved -20 °C. Flere fryse-optøningscyklusser bør undgås, når du arbejder med D11-AP. Fosfatbufret saltvand (PBS) kan også påvirke alkalisk fosfatases enzymatiske aktivitet og bør ikke anvendes som vaskebuffer28. Som med enhver antistofbaseret tilgang skal der udføres grundig test og optimering for at sikre, at farvning er specifik, og at signalet ikke er over eller under forstærket.

Afslutningsvis har vi udviklet en kraftfuld, streng og robust optimeret protokol til påvisning af IsoLG-addukterede proteiner ved hjælp af D11-antistoffet konjugeret med alkalisk fosfatase i stedet for E-tag. Denne protokol giver flere fordele: For det første er det billigere at bruge D11 som et alkalisk fosfatasefusionsprotein. D11 stammer oprindeligt fra et fagantistofbibliotek, der ikke kunne kommercialiseres og var dyrt at rense. Selvom D11 i E. coli periplasmatisk ekstrakt kunne give et billigt alternativ, var det ineffektivt i de fleste assays. For det andet tillader alkalisk fosfatasefusionstilgang, at D11 scfv har en nyttig reporter15 (alkalisk fosfatase) smeltet til sig og ikke behøver at blive renset til brug i immunoassays, da substrater er kommercielt tilgængelige. For det tredje danner E. coli alkalisk fosfatase dimerer29. Så D11, når det smeltes sammen med den alkaliske fosfatase, ville også danne dimerer, og dette øger antistoffets aviditet og bindingsaktivitet30. Endelig kan D11 konjugeret med alkalisk fosfatase i periplasmatisk ekstrakt let rengøres ved hjælp af Cibacron Blue Sepharose. D11 har et højt isoelektrisk punkt (~9,2 pH). Som sådan er det positivt ladet og kan binde til Cibacron Blue gennem pi-kationinteraktioner. De fleste urenheder i E. coli periplasmatisk ekstrakt kan elueres af harpiksen. D11 konjugeret med alkalisk fosfatase kan derefter elueres ved hjælp af højt salt (~ 1,5M NaCl) i vand. Den eluerede D11 konjugeret med alkalisk fosfatase er ret stabil ved 4-8 °C i højsaltopløsningen. Derfor har vi udviklet en protokol, der ikke kun gør D11-antistoffet tilgængeligt til en lav pris, men også eliminerer de ekstra trin og behovet for den sekundære antistofinkubation. Denne protokol letter reproducerbar måling af IsoLG'er, som akkumuleres i væv i flere sygdomme, hvor øget oxidativt stress spiller en rolle.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health-tilskud K01HL130497, R01HL147818, R01HL144941 og R03HL155041 til A.K. Vi takker Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN https://www.vumc.org/dhsr/46298 for visualisering og diasscanning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 ml TALON HiTrap column (Cobalt-CMA) Cytiva 28953766
200 Proof Ethanol Pharmco 111000200
2xYT powder MP Biomedicals 3012-032
384-well, clear, flat-bottom polystyrene microplates ThermoFisher (NUNC) 242757
4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate (pNPP) Carbosynth EN08508
5-Bromo-4-chloro-3indoxyl phosphate, p-toluidine salt (BCIP) Carbosynth EB09335
Ampicillin, sodium salt Research Products International (RPI) A40040
Bovine Serum Albumin RPI A30075
Chemically competent TG1 E. coli Amid Biosciences TG1-201
Diethanolamine, >98% Sigma-Aldrich D8885
EDTA Sigma-Aldrich ED
Fluoromount-G SouthernBiotech 0100-01 Mouting medium
Glucose Research Products International (RPI) G32045
Glycerol Sigma-Aldrich G7893
Histoclear National Diagnostics HS-200 Xylene alternative
Hoechst 33342 ThermoFisher H3570 stock solution = 10 mg/mL
Hydrochloric acid (HCl), 30%, Macron Fine Chemicals ThermoFisher MK-2624-212
Imidazole Research Products International (RPI) I52000
MgCl2 (anhydrous) Sigma-Aldrich M8266
Mouse Serum Albumin (MSA) Sigma-Aldrich/Calbiochem 126674
Nitroblue tetrazolium chloride (NBT) Carbosynth EN13587
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P4504
Potassium phosphate, monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich P0662
Pressure Cooker Cuisinart CPC-600
Slide-a-Lyzer Dialysis cassettes, 10K MWCO, 3 ml ThermoFisher 66380
Sodium chloride (NaCl) Research Products International (RPI) S23020
Sodium Citrate Sigma-Aldrich 1064461000
Sodium phosphate, dibasic (Na2HPO4) Research Products International (RPI) S23100
Sucrose Research Products International (RPI) S24065
Tris base Research Products International (RPI) T60040
Tris-buffered Saline Boston Bio-Products 25mM Tris, 2.7mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4
Tris-HCl Research Products International (RPI) T60050
Tween20 Sigma-Aldrich P9416
Vector Red Vector Labs SK-5105

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56 (2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650 (2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418 (2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46 (2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241 (2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

Tags

Biologi udgave 173 isolevuglandiner immunofluorescens alkalisk fosfatasekonjugeret ScFv D11-antistof og hypertension

Erratum

Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 04/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

Direkte påvisning af isolevuglandiner i væv under anvendelse af et D11 scFv-alkalisk fosfatasefusionsprotein og immunofluorescens
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic,… More

Warden, C., Simmons, A. J., Pasic, L., Pitzer, A., Davies, S. S., Layer, J. H., Mernaugh, R. L., Kirabo, A. Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues Using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (173), e62603, doi:10.3791/62603 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter