Summary
Здесь мы устанавливаем протокол для одновременной визуализации и анализа нескольких комплексов SMAD с использованием анализа бесконтактной перевязки (PLA) в эндотелиальных клетках, подверженных патологическим и физиологическим условиям сдвига жидкости.
Abstract
Трансформирующий фактор роста β (TGFβ)/Костной морфогенетический белок (BMP) передачи сигналов жестко регулируется и сбалансирован во время развития и гомеостаза сосудистой системы Поэтому дерегуляция в этом сигнальном пути приводит к тяжелым сосудистым патологиям, таким как гипертония легочной артерии, наследственная геморрагическая телеангиэктазия и атеросклероз. Эндотелиальные клетки (ЭК), как самый внутренний слой кровеносных сосудов, постоянно подвергаются воздействию напряжения сдвига жидкости (SS). Было показано, что аномальные паттерны жидких SS усиливают передачу сигналов TGFβ / BMP, которые вместе с другими стимулами индуцируют атерогенез. В связи с этим было обнаружено, что атеропрон, низкий ламинарный SS усиливает передачу сигналов TGFβ / BMP, в то время как атеропротекторный, с высоким ламинарной SS уменьшает эту сигнализацию. Для эффективного анализа активации этих путей мы разработали рабочий процесс для исследования образования комплексов транскрипционного фактора в условиях низкого ламинарного SS и высокого ламинарного SS с использованием коммерчески доступной пневматической насосной системы и анализа бесконтактного лигирования (PLA).
Активная TGFβ/BMP-сигнализация требует формирования тримерных SMAD-комплексов, состоящих из двух регуляторных SMAD (R-SMAD); SMAD2/3 и SMAD1/5/8 для сигнализации TGFβ и BMP соответственно) с общим медиатором SMAD (co-SMAD; СМАД4). Используя PLA, нацеленную на различные субъединицы тримерного SMAD-комплекса, т.е. либо R-SMAD/co-SMAD, либо R-SMAD/R-SMAD, образование активных комплексов факторов транскрипции SMAD может быть измерено количественно и пространственно с помощью флуоресцентной микроскопии.
Использование проточных слайдов с 6 небольшими параллельными каналами, которые могут быть соединены последовательно, позволяет исследовать формирование комплекса транскрипционного фактора и включать необходимые элементы управления.
Рабочий процесс, описанный здесь, может быть легко адаптирован для исследований, направленных на близость SMAD к другим факторам транскрипции или к комплексам факторов транскрипции, отличным от SMAD, в различных условиях жидкого SS. Рабочий процесс, представленный здесь, показывает быстрый и эффективный способ изучения жидкостной SS-индуцированной сигнализации TGFβ /BMP в EC, как количественно, так и пространственно.
Introduction
Белки трансформирующего фактора роста бета (TGFβ) суперсемейства являются плейотропными цитокинами с различными членами, включая TGFβs, костные морфогенетические белки (BMP) и активины1,2. Связывание лигандов индуцирует образование рецепторных олигомеров, приводящих к фосфорилированию и, тем самым, активации цитозольного регулятора SMAD (R-SMAD). В зависимости от подсемейства лигандов активируются различные R-SMAD1,2. В то время как TGFβs и активины в основном индуцируют фосфорилирование SMAD2/3, BMP индуцируют фосфорилирование SMAD1/5/8. Тем не менее, накапливаются доказательства того, что BMP и TGFβs/Activins также активируют R-SMAD соответствующих других подсемейств в процессе, называемом «боковой сигнализацией»3,4,5,6,7,8, и что существуют смешанные комплексы SMAD, состоящие как из SMAD1/5, так и из SMAD2/3, членов3,9 . Два активированных R-SMAD впоследствии образуют тримерные комплексы с общим медиатором SMAD4. Эти комплексы транскрипционных факторов затем способны транслоцироваться в ядро и регулировать транскрипцию генов-мишеней. SMAD могут взаимодействовать с различными транскрипционными коактиваторами и ко-репрессорами, что приводит к диверсификации возможностей регулирования генов-мишеней10. Дерегулирование передачи сигналов SMAD имеет серьезные последствия при различных заболеваниях. В соответствии с этим, несбалансированная передача сигналов TGFβ / BMP может привести к тяжелым сосудистым патологиям, таким как гипертония легочной артерии, наследственная геморрагическая телеангиэктазия или атеросклероз3,11,12,13,14.
Эндотелиальные клетки (ЭК) образуют самый внутренний слой кровеносных сосудов и, следовательно, подвергаются напряжению сдвига (SS), силе трения, оказываемой вязким потоком крови. Интересно, что ЭК, находящиеся в частях сосудистой системы, которые подвергаются воздействию высоких уровней однородных, ламинаров СС, содержатся в гомеостатическом и спокойном состоянии. Напротив, ЭК, которые испытывают низкий, неоднородный SS, например, при бифуркациях или меньшем искривлении дуги аорты, являются пролиферативными и активируют воспалительные пути15. В свою очередь, участки дисфункциональных ЭК склонны к развитию атеросклероза. Интересно, что EC в этих атеропроновых областях демонстрируют аберрантно высокие уровни активированных SMAD2/3 и SMAD1/516,17,18. В этом контексте было обнаружено, что усиленная передача сигналов TGFβ/BMP является ранним событием в развитии атеросклеротических поражений19, и было обнаружено, что интерференция передачи сигналов BMP заметно снижает воспаление сосудов, образование атеромы и связанное с этим кальцификацию20.
Анализ бесконтактного лигирования (PLA) является биохимическим методом для изучения белково-белковых взаимодействий in situ21,22. Он опирается на специфичность антител различных видов, которые могут связывать интересующие белки-мишени, что позволяет высокоспецифично обнаруживать эндогенные белковые взаимодействия на уровне одной клетки. Здесь первичные антитела должны связываться со своим целевым эпитопом на расстоянии менее 40 нм, чтобы обеспечить обнаружение23. Таким образом, PLA очень полезен по сравнению с традиционными подходами коиммунопреципитации, где для обнаружения эндогенных белковых взаимодействий требуется несколько миллионов клеток. В PLA видоспецифические вторичные антитела, ковалентно связанные с фрагментами ДНК (называемые зондами Plus и Minus), связывают первичные антитела, и если интересующие белки взаимодействуют, зонды Plus и Minus находятся в непосредственной близости. ДНК перевязывается на следующем этапе, и становится возможным амплификация круговой ДНК. Во время амплификации флуоресцентно меченые комплементарные олигонуклеотиды связываются с синтезированной ДНК, что позволяет визуализировать эти белковые взаимодействия с помощью обычной флуоресцентной микроскопии.
Описанный здесь протокол позволяет ученым количественно сравнивать количество активных транскрипционных комплексов SMAD в условиях атеропротектора и атеропрона SS in vitro с использованием PLA. SS генерируется с помощью программируемой пневматической насосной системы, которая способна генерировать ламинарный однонаправленный поток определенных уровней и позволяет поэтапно увеличивать скорость потока. Этот метод позволяет обнаруживать взаимодействия между SMAD1/5 или SMAD2/3 с SMAD4, а также смешанными R-SMAD комплексами. Он может быть легко расширен для анализа взаимодействий SMAD с транскрипционными сорегуляторами или для транскрипционных факторных комплексов, отличных от SMAD. На рисунке 1 показаны основные этапы протокола, представленные ниже.
Рисунок 1: Схематическое представление описанного протокола. (A) Ячейки, засеянные в 6-канальные слайды, подвергаются сдвиговому напряжению с помощью пневматической насосной системы. (B) Фиксированные ячейки используются для эксперимента PLA или для контрольных условий. (C) Изображения экспериментов PLA получаются с помощью флуоресцентного микроскопа и анализируются с помощью программного обеспечения для анализа ImageJ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Воздействие клеточной культуры и напряжения сдвига жидкости
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве примера для изучения взаимодействия SMAD, индуцированного SS, были использованы EC ВЕН человека (HUVECs). Протокол, описанный ниже, может быть применен к каждому типу ячеек, реагирующих на SS.
- Покрыть 6-канальный слайд 0,1% желатином свиной кожи в PBS в течение 30 мин при 37 °C.
- Семена HUVECs в предварительно покрытых 6-канальных слайдах при плотности 2,5 x 106 клеток на мл в 30 мкл полной среды M199.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о том, как засеять ячейки на слайде потока, см. ссылку24. - Дайте клеткам прилипнуть в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
- Добавьте 60 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в каждый из резервуаров.
- Культивировать в течение 2 дней, с мягким средним обменом один раз в день, при 37 °C в увлажненном инкубаторе.
- Аспирировать резервуары полностью, добавить 120 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в один из резервуаров и аспирировать с другой стороны.
- Добавьте 60 мкл предварительно нагретой полной среды M199 в оба резервуара.
- Соберите и запустите настройку потока, как описано в ссылке 25.
- Монтаж НКТ на жидкостных агрегатах. Здесь силиконовые трубки диаметром 0,8 мм и 1,6 мм используются для применения напряжения сдвига 1 дин/см2 и 30 дин/см2 соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Материал и длина трубки должны оставаться постоянными, так как изменения могут влиять на возникающее напряжение сдвига. В общем, можно использовать другие комбинации насосных систем и трубок, если известно результирующее напряжение сдвига, и насос создает устойчивый ламинарный поток. - Заполните резервуары соответствующим количеством предварительно нагретой полной среды M199 (минимум 10 мл).
- Подключите жидкостные блоки с трубкой к насосной системе и выполните предварительный запуск без ячеек, чтобы уравновесить среду и удалить оставшийся воздух25.
- Последовательно соединяйте одиночные каналы на 6-канальном затворе друг с другом с помощью трубки последовательного подключения. Первый и последний канал на слайде будут соединены с трубкой, собранной в 1.6.1 (схему см. на рисунке 1А ). Будьте осторожны, чтобы не вводить воздух в систему, так как это может серьезно повредить клетки. Дополнительную информацию о последовательном соединении можно найти в ссылке26.
- Для воздействия на клетки высоких уровней напряжения сдвига (>20 дин/см2) используют фазу рампы, т. е. увеличивают напряжение сдвига поэтапно с фазами адаптации. Ступени могут быть установлены с шагом 5 дин/см2 в течение 30 мин.
- Монтаж НКТ на жидкостных агрегатах. Здесь силиконовые трубки диаметром 0,8 мм и 1,6 мм используются для применения напряжения сдвига 1 дин/см2 и 30 дин/см2 соответственно.
2. Фиксация
- Отсоедините слайды от насосов после воздействия жидкости SS. Используйте зажимы на трубке при отсоединении, чтобы избежать разлива среды в инкубаторе.
- Сразу же передача потока скользит по льду, в то время как оставшаяся трубка отсоединяется последовательно. При извлечении трубки из резервуаров резервуар с другой стороны следует держать закрытым пальцем, чтобы избежать улавливания пузырьков воздуха в канале. Это может помешать шагам фиксации.
- Удерживая клетки на льду, тщательно аспирируйте среду из резервуаров, но не из канала, где находятся клетки. Впоследствии промывку образцов холодной стерильной ПБС (4 °C) с трехкратным увеличением объема канала (90 мкл). Добавьте PBS в один резервуар и осторожно аспирируйте из другого резервуара. Повторите этот шаг в каждом из 6 каналов на слайд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех этапов промывки и инкубации соответствующий раствор добавляют в один из резервуаров, что приводит к обмену растворами в канале. Чтобы обеспечить полную замену растворов в канале, избыточный раствор затем аспирируется из другого резервуара. Раствор сверху клеток в канале не удаляется. Клетки не должны высыхать в любое время. Поэтому важно тщательно мыть без введения пузырьков воздуха в слайды. - Зафиксируйте клетки, добавив 90 мкл буферного 4% раствора PFA в тот же резервуар, куда PBS был добавлен предварительно, и аналогичным образом аспирируйте жидкость из другого резервуара. Повторите этот шаг на каждом канале каждого слайда. После добавления раствора PFA перенесите образцы изо льда до комнатной температуры (RT) и инкубируйте в течение 20 мин.
ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен обрабатываться осторожно. Используйте перчатки и работайте под вытяжным капюшоном. - Промывайте ячейки 3x pBS (RT), добавляя их в один резервуар и осторожно аспирируя из другого резервуара. Опустошите только водоемы, следя за тем, чтобы канал не пересыхал. Повторите этот шаг для каждого из 6 каналов на слайд.
- Погасить фиксацию ПФА путем добавления 90 мкл 50 мМ хлорида аммония в ПБС в одном из резервуаров. Аспирировать избыточный раствор из другого резервуара. Повторите для каждого канала на слайде. Инкубируйте образцы в течение 10 минут на RT.
- Промывайте, как описано в шаге 2.5.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе образцы могут храниться при температуре 4 °C в течение ночи, или протокол может быть немедленно продолжен с блокированием и первичной инкубацией антител (см. этап 3).
3. Блокирование и первичная инкубация антител
- Чтобы пропитать клетки, добавьте 90 мкл 0,3% Тритона-Х-100 в PBS в опорожненном резервуаре и аспират из другого резервуара для каждого канала. Инкубировать в течение 10 мин на РТ.
- Промывайте, как описано в шаге 2.5.
- Добавить 90 мкл стерильного блокирующего раствора PLA в один резервуар канала и аспирировать с другой стороны. Повторите этот шаг для каждого канала. Блок на 1 ч при 37 °С в увлажненной камере.
- Чтобы сделать увлажненную камеру, используйте 10-сантиметровую посуду с влажной тканью, запечатанную восковой пленкой, и поместите посуду в инкубатор. В качестве альтернативы могут использоваться другие форматы камер влажности, которые обеспечивают влажную атмосферу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, можно использовать самодельный блокирующий раствор (например, 3% (мас./об.) BSA в PBS, стерильный фильтрованный).
- Чтобы сделать увлажненную камеру, используйте 10-сантиметровую посуду с влажной тканью, запечатанную восковой пленкой, и поместите посуду в инкубатор. В качестве альтернативы могут использоваться другие форматы камер влажности, которые обеспечивают влажную атмосферу.
- Получают первичные антитела (1:100) в разбавителе антител PLA. Приготовьте 30 мкл раствора на канал. Добавьте оба первичных антитела одновременно и вихревые.
ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно может быть использован самодельный разбавитель антител (например, 1% (мас./об.) BSA в PBS). Антитела, используемые здесь, представляют собой комбинации SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 и фосфо-SMAD1/5-SMAD4. Подробную информацию можно найти в Таблице материалов. - Перед применением первичных антител аспирируют блокирующий раствор из резервуаров, а также, осторожно, из русла. Пипетка 30 мкл раствора первичного антитела сразу же попадает в пустой канал путем наклона канала при добавлении раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняют удаление блокирующего раствора и добавление раствора антитела канал за каналом, чтобы клетки не пересыхали между ними. - Инкубировать образцы с первичными антителами в течение ночи в увлажненных камерах при 4 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубация также может быть выполнена в течение 1 ч при комнатной температуре, если вы заинтересованы в продолжении следующих шагов в тот же день.
4. Инкубация зонда PLA
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах, указанных в разделах 4.1-7.3, моющие буферы А и В хранятся при температуре 4°С и должны быть нагреты до РТ перед использованием.
- Разбавляют PLA-зонды (+)-мыши и (-)-кролика до 1:5 в растворе разбавителя антител PLA (или 1% BSA). Приготовьте 30 мкл на канал.
- Промывайте образцы 2x в течение 5 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A на RT, добавляя его в один из резервуаров и осторожно аспирируя из другого резервуара. Повторите этот шаг для каждого из 6 каналов на слайд.
- Тщательно аспирируйте промывочный буфер А и добавьте 30 мкл зондового раствора PLA (приготовленного на стадии 4.1), аналогично добавлению первичных антител на стадии 3.5.
- Инкубировать образцы в течение 1 ч при 37 °C в увлажненной камере.
5. Перевязка
- Промывайте образцы 2x в течение 5 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A при RT, как описано в 4.2.
- Приготовьте разбавление лигационного буфера в 1:5 в деионизированной воде. Используйте этот буфер для разбавления фермента лигазы до 1:40 (на льду). Используйте 30 мкл на канал.
- Полностью аспирировать промывочный буфер А и добавить раствор для лигирования, как описано в 3.5.
- Инкубировать образцы в течение 30 мин при 37 °C в увлажненной камере.
6. Усиление
- Промывайте образцы 2x в течение 2 мин, используя 90 мкл промывочного буфера A при RT, как описано в 4.2.
- Подготовьте буфер амплификации, разбавив его 1:5 в деионизированной воде и используйте его для разбавления фермента полимеразы до 1:80 (на льду). Защита от света. Приготовьте 30 мкл на канал.
- Аспирировать промывочный буфер А полностью и сразу же добавить приготовленный амплификационный раствор в пустой канал, как описано в 3.5. Инкубировать образцы в течение 100 мин при 37 °C в увлажненной камере.
7. Монтаж
- Промывайте образцы 2x в течение 10 мин, используя 90 мкл wash Buffer B на RT, как описано в 4.2. Добавьте DAPI (1:500) из 1 мг/мл исходного раствора (в деионизированной воде) при первой промывке, чтобы окрасить ядра. Не сушите канал.
- Разбавьте промывочный буфер B в деионизированной воде (1:10) и промыть 1x 90 мкл 0,1x буферного раствора B, как описано в 4.2.
- Аспирировать промывочный буфер В полностью и сразу же добавить 2-3 капли жидкой монтажной среды в один резервуар. Распределите его по каналу, наклонив слайд. Храните образцы при температуре 4 °C во увлажненной среде до получения изображения.
8. Получение изображений
- Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Убедитесь, что соответствующие фильтры, устанавливающие флуоресцентные датчики PLA, доступны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Полезно использовать конфокальный микроскоп, если это возможно, так как полученные пятна PLA более определены. Это также поддерживает дальнейшую обработку изображений и анализ данных.
9. Анализ и количественная оценка изображений с использованием ImageJ/FIJI
- Обрабатывайте экспортированные изображения (.tiff) с помощью программы обработки изображений, такой как ImageJ27.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все скрипты, используемые в этом исследовании и необходимые для автоматического подсчета клеточных, ядерных и всех событий PLA (на ячейку), можно найти в репозитории GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. Выполняйте статистический анализ с помощью любой подходящей программы или инструмента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ранее мы использовали PLA для обнаружения взаимодействий различных белков SMAD3 и анализировали изменения фосфорилирования SMAD28, вызванные напряжением сдвига28.
Здесь оба способа были объединены с протоколом, описанным выше. HUVEC подвергали сдвиговому напряжению 1 дин/см2 и 30 дин/см2 и анализировали на предмет взаимодействия факторов транскрипции SMAD. Показано, что по сравнению с высоким напряжением сдвига (30 дин/см2) низкое напряжение сдвига (1 дин/см2) приводит к значительному увеличению взаимодействий SMAD1-SMAD2/3, так называемых смешанных smad-комплексов как в цитозоле, так и в ядрах анализируемых клеток (рисунок 2A, нижняя панель). События PLA видны как отдельные пятна в обоих образцах, и можно различить цитозольные и ядерные события со ссылкой на окрашивание DAPI (рисунок 2A, верхняя панель). Напротив, контроль антител, где инкубировались только одно из обоих первичных антител, но все же оба зонда PLA, показал незначительное количество сигналов PLA (рисунок 2B). Таким образом, можно сделать вывод, что эксперимент прошел успешно.
Рисунок 2: SMAD2/3-SMAD1 PLA сравнение различных концентраций антител. (A) Конфокальные флуоресцентные изображения и количественная оценка SMAD2/3-SMAD1-PLA в HUVECs, подвергшихся воздействию 24 ч указанных уровней SS. Коэффициент разведения антител: 1:100. (B) Конфокальные изображения контроля одиночных антител для PLA в A. (C) Конфокальные флуоресцентные изображения и количественная оценка SMAD2/3-SMAD1-PLA в HUVECs, подвергшихся воздействию 24 ч указанных уровней SS. Коэффициент разведения антител: 1:50. Шкала для A-C: 20 мкм и 10 мкм в увеличении. Дин равен дину/см2. Использовались антитела против кролика против SMAD2/3 и мыши против SMAD1 (см. Таблицу материалов). Для каждого условия для получения изображения использовались 5 случайных участков вдоль центра проточного канала. N=1 биологическая репликация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы показать, как различные концентрации антител изменяют результаты PLA, тот же эксперимент был проведен с разведением антител 1:50 вместо 1:100. В этих условиях удвоенное количество антител приводит к более чем в четыре раза более высоким сигналам PLA на клетку (сравните рисунок 2A и рисунок 2C). Разница в сигналах между 1 дин/см2 и 30 дин/см2 уменьшается при использовании более высокой концентрации антител и потере статистической значимости для общих и цитозольных событий PLA (рисунок 2A, нижняя панель; Рисунок 2C, нижняя панель). Это может быть связано с объединением сигналов и проблемами различения событий НОАК. Если такое накопление сигналов происходит, концентрации антител должны быть снижены.
Кроме того, мы показали, что самодельные буферы для блокирования и разбавления антител могут использоваться в качестве альтернативы коммерческим буферам, включенным в наборы PLA in situ. Сравнивали события PLA на ячейку для комплексов SMAD1-SMAD2/3 (рисунок 3A и рисунок 3D), SMAD2/3-SMAD4 (рисунок 3B по сравнению с рисунком 3E) и pSMAD1/5-SMAD4 (рисунок 3C против рисунка 3F) до 1 дин/см2 и 30 дин/см2 с использованием либо коммерческих решений (рисунок 3A-C), либо самодельных решений на основе BSA/PBS (рисунок 3D-F) ). Количественные оценки как для коммерческих, так и для самодельных разбавляющих/ блокирующих решений показывают одинаковую тенденцию сигналов PLA в цитозольных и ядерных областях. Однако общее количество событий PLA на ячейку выше при использовании коммерческих решений (рисунок 3A-C, нижние панели по сравнению с рисунком 3D-F, нижние панели).
Рисунок 3: Эксперимент PLA по сравнению коммерческих и самодельных буферов антител. Конфокальные изображения (верхняя часть каждой панели) и количественная оценка (нижняя часть каждой панели) различных PLA SMAD-SMAD в HUVEC, подвергающихся воздействию 24-часовых указанных уровней напряжения сдвига. (А-С) Коммерческие буферы (см. Таблицу материалов). (Д-Ф) Самодельные буферы (3% BSA в PBS для блокировки, 1% BSA в PBS для разведения антителами). Все первичные антитела разбавляли 1:100. Шкала, 20 мкМ (10 мкМ для увеличения). Статистическая значимость рассчитывалась с помощью двустороннего t-Test. ns - несущественные, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Значения отображаются как среднее + SEM. Dyne равно dyn/cm2. Использовались антитела против кролика против SMAD2/3, мыши против SMAD1, против кролика против фосфо SMAD1/5 и против мыши против SMAD4 (см. Таблицу материалов). Для каждого условия для получения изображения использовались 5 случайных участков вдоль центра проточного канала. N=1 биологическая репликация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Мы также включили пример неудачного эксперимента PLA. Здесь комбинация антител SMAD2/3-SMAD4 использовалась там, где антитело SMAD4 не подходило для проведения иммунофлуоресцентных экспериментов. По сравнению с контролем с одним антителом не наблюдалось увеличения пятен ни в образцах 1 дин/см2, ни в образцах 30 дин/см2 (Рисунок 4А по сравнению с Рисунком 4В). Поскольку образование комплексов SMAD2/3-SMAD4 индуцируется напряжением сдвига (см. Рисунок 3B,E), можно сделать вывод, что этот эксперимент PLA был неудачным. Это подчеркивает важность выбора правильных комбинаций антител для обнаружения событий PLA, поскольку ориентация и расстояние связанных антител могут иметь решающее значение для успешного отжига олигонуклеотидных зондов.
Рисунок 4: Пример неудачного эксперимента PLA. Конфокальные изображения, шкала: 20 мкм и 10 мкм с увеличением. (A) SMAD2/3-SMAD4 PLA. (B) Контроль одиночных антител. Использовались антитела против мышиного анти-SMAD2/3 и кролика против SMAD4 (см. Таблицу материалов). Дин равен дину/см2. Для каждого условия для получения изображения использовались 5 случайных участков вдоль центра проточного канала. N=1 биологическая репликация. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол на основе PLA, описанный здесь, предлагает эффективный способ определения непосредственной близости двух белков (например, их прямого взаимодействия) в ЭК, подверженных сдвиговому напряжению с количественным и пространственным разрешением. Используя проточные слайды с несколькими параллельными каналами, можно одновременно исследовать несколько различных белковых взаимодействий в клетках в одинаковых механических условиях. В отличие от этого, системы проточных камер, изготовленные на заказ, часто используют один канал, построенный вокруг стеклянного крышки, что позволило бы провести только один эксперимент PLA без необходимых элементов управления для каждого слайда и насоса. Хотя этот протокол фокусируется на обнаружении взаимодействий SMAD, он может быть адаптирован для обнаружения любых других белковых взаимодействий. Тем не менее, анализ результатов должен быть выполнен осторожно, так как два белка могут также находиться в непосредственной близости, не образуя комплексов. Если желательны определенные утверждения о взаимодействиях белков, эксперименты PLA должны быть дополнены дополнительными методами, такими как коиммунопреципитация. Кроме того, PLA не может быть использован для обнаружения белково-белкового взаимодействия в живых клетках, поскольку образцы должны быть зафиксированы для последующих этапов связывания антител и амплификации ДНК.
Для успешного обнаружения белковых взаимодействий с помощью PLA наиболее важным шагом является выбор комбинации первичных антител, которые удовлетворяют нескольким критериям: (1) Антитела, обнаруживающие отдельных белковых партнеров, должны генерироваться у разных видов (например, у мыши или кролика), поскольку вторичные антитела являются видоспецифичными; в идеале антитела уже были успешно протестированы с помощью обычной иммунофлуоресцентной микроскопии; (2) расстояние между эпитопными связанными антителами должно составлять <40 нм23; (3) поскольку сродство к связыванию антител с эпитопом может отличаться, конечная концентрация используемых антител должна быть скорректирована для каждой экспериментальной установки, как показано здесь (Рисунок 2А, нижняя панель, по сравнению с Рисунком 2С, нижняя панель). Поэтому, если обнаружено очень мало, но специфических событий PLA, возможно, стоит увеличить количество используемых антител. Однако это должно быть тщательно титровано, чтобы избежать перенасыщения и неспецифических связывающих событий. Кроме того, концентрация антител, используемая в контрольных образцах, должна соответствовать концентрации, используемой в образцах PLA.
Как и для любого другого биохимического анализа, подходящие средства контроля незаменимы в PLA. Неспецифическое связывание используемых антител может, например, привести к сигналам PLA, исходящим только от одного первичного антитела. Таким образом, основные средства контроля антител для экспериментов PLA должны включать добавление только одного из двух первичных антител, но обоих зондов PLA (плюс и минус). Кроме того, контроль без добавления антител может быть использован для определения неспецифического связывания зондов PLA с образцом. В целом, эти технические средства контроля должны не давать очень немногим сигналам НОАК. Если наблюдается несколько сигналов, концентрация используемого первичного антитела и его специфичность должны быть пересмотрены. Кроме того, полезно включить положительный биологический контроль, если это возможно. В протоколе, описанном выше, это может быть стимуляция лигандом BMP, который, как известно, индуцирует фосфорилирование SMAD и, следовательно, образование тримерного комплекса с SMAD4.
Для экспериментов PLA обычно рекомендуется использовать клетки, которые на 50-70% сливаются, так как это упрощает проникновение реагентов. Однако при проведении экспериментов с ЭК мы будем строго возражать против этого, за исключением случаев, когда полуслияние является частью экспериментальной установки. In vivo ЕС образуют монослои с плотными межклеточными соединениями, которые необходимы для Гомеостаза ЕС и механотрансдукции29. Поэтому эксперименты на несмеющихся ЭК могут привести к ложным результатам. Кроме того, несмешивающиеся клетки более склонны к отрыву от слайдов канала потока, если во время эксперимента используются высокие уровни напряжения сдвига. Мы советуем засевать клетки (2-2,5 х 106 клеток / мл, см. этап протокола 1,2) за два-три дня до начала эксперимента, так как монослоям ЕС требуется время для формирования и развития зрелых соединений. Поэтому мы бы не рекомендовали сеять большее количество клеток (>2,5 х 106 клеток / мл) в проточные каналы всего за один день до эксперимента, чтобы достичь сливающегося монослоя.
Хотя существуют различные жидкие монтажные среды, содержащие DAPI, стоит включить отдельный этап окрашивания DAPI и смонтировать ячейки с жидкой монтажной средой без DAPI, по крайней мере, если используются проточные слайды на полимерной основе. Это предотвращает тяжелые фоновые сигналы во время получения изображения. Изображения должны быть получены из положений в центре канала, а не по краям, поскольку напряжение сдвига неоднородно на стенках канала. Мы рекомендуем сделать не менее 5-10 снимков на биологическую репликату и состояние случайных участков вдоль центральной области. 3 или более биологических реплик обычно используются для получения статистической значимости. Для анализа изображений советуем использовать макрофункцию ImageJ/FIJI. В протоколе выше мы упомянули макрос ImageJ, который подходит для подсчета цитозольных и ядерных событий PLA на основе окрашивания DAPI. Пользователи должны знать, что такие параметры, как размер частиц, должны быть скорректированы в зависимости от размера ядра или больших / меньших точек PLA. Макрос сохраняет пороговые изображения и маски PLA, которые следует сравнивать с необработанными изображениями для оценки специфики обнаружения сигнала PLA.
В заключение, представленный здесь метод позволяет проводить быстрый и эффективный пространственный и количественный анализ образования комплекса транскрипционного фактора в условиях атеропротекторного и атеропронного СС. Это позволит ученым в дальнейшем расшифровать влияние образования комплекса SMAD на атерогенез и сосудистые заболевания в целом. Кроме того, он может быть адаптирован для исследования последствий близости различных белков при этих сосудистых патологиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Марию Райхенбах и д-ра Кристиана Хипена за их поддержку в системе настройки потока, а также Элеонору Фокс и Юньюнь Сяо за критическое прочтение рукописи. P-L.M. финансировалась международной исследовательской школой Макса Планка IMPRS-Biology and Computation (IMPRS-BAC). ПК получила финансирование от DFG-SFB1444. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide VI 0.4 | ibidi | 80606 | 6-channel slide |
| Ammonium Chloride | Carl Roth | K298.1 | Quenching |
| Bovine Serum Albumin | Carl Roth | 8076.4 | Blocking |
| DAPI | Sigma Aldrich/ Merck | D9542 | Stain DNA/Nuclei |
| DPBS | PAN Biotech | P04-53500 | PBS |
| Duolink In Situ Detection Reagents Green | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92014 | PLA kit containing Ligase, ligation buffer, polymerase and amplification buffer (with green labeled oligonucleotides) |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92004 | MINUS probe |
| Duolink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma Aldrich/ Merck | DUO92002 | PLUS probe |
| Duolink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma Aldrich/ Merck | DUO82049 | PLA wash buffers A and B |
| Endothelial Cell Growth Supplement | Corning | supplement for medium (ECGS) | |
| Fetal calf Serum | supplement for medium | ||
| FIJI | Image Analysis software | ||
| Formaldehyde solution 4% buffered | KLINIPATH/VWR | VWRK4186.BO1 | PFA |
| Full medium | M199 basal medium +20 % FCS +1 % P/S + 2 nM L-Glu + 25 µg/mL Hep + 50 µg/mL ECGS | ||
| Gelatin from porcine skin, Type A | Sigma Aldrich | G2500 | Use 0.1% in PBS for coating of flow channels |
| GraphPad Prism v.7 | GarphPad | Statistical Program used for the Plots and statistical calculations | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H4784-250MG | supplement for medium (Hep) |
| HUVECs | |||
| ibidi Mounting Medium | ibidi | 50001 | Liquid mounting medium |
| ibidi Pump System | ibidi | 10902 | pneumatic pump |
| Leica TCS SP8 | Leica | confocal microscope | |
| L-Glutamin 200mM | PAN Biotech | P04-80100 | supplement for medium (L-Glu) |
| Medium 199 | Sigma Aldrich | M2154 | Base medium |
| mouse anti- SMAD1 Antibody | Abcam | ab53745 | Suited for PLA |
| mouse anti- SMAD2/3 Antibody | BD Bioscience | 610843 | Not suited for PLA in combination with CST 9515 |
| mousee anti- SMAD4 Antibody | Sanata Cruz Biotechnology | sc-7966 | Suited for PLA |
| Penicillin 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml | PAN Biotech | P06-07100 | supplement for medium (P/S) |
| Perfusion Set WHITE | ibidi | 10963 | Tubings used for 1 dyn/cm2 |
| Perfusion Set YELLOW and GREEN | ibidi | 10964 | Tubings used for 30 dyn/cm2 |
| rabbit anti- phospho SMAD1/5 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9516 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD2/3 XP Antibody | Cell Signaling Technologies | 8685 | Suited for PLA |
| rabbit anti- SMAD4 Antibody | Cell Signaling Technologies | 9515 | Not suited for PLA in combination with BD 610843 |
| Serial Connector for µ-Slides | ibidi | 10830 | serial connection tubes |
| Triton X-100 | Carl Roth | 6683.1 | Permeabilization |
References
- Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
- Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor signaling. Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).
- Hiepen, C., et al. BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics. PLoS Biology. 17 (12), 3000557 (2019).
- Hildebrandt, S., et al. ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib. Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).
- Goumans, M. J., et al. Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors. The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).
- Goumans, M. J., et al. Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling. Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).
- Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth. Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).
- Ramachandran, A., et al. TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition. eLife. 7, 31756 (2018).
- Flanders, K. C., et al. Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).
- Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).
- Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989 (2018).
- Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P.
- Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations. Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).
- MacCarrick, G., et al. Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management. Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Min, E., et al. Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling. bioRxiv. , 691980 (2019).
- Zhou, J., et al. BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).
- Zhou, J., et al. Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).
- van Dijk, R. A., et al. Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation. Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).
- Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).
- Fredriksson, S., et al. Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays. Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).
- Söderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Alam, M. S.
- Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf (2012).
- Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf (2019).
- ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. ibidi. , (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reichenbach, M., et al. Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes. Advanced Biology. 5 (2), 2000051 (2021).
- Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology. Cells. 9 (9), 1965 (2020).
