Summary
כתב יד זה מתאר את הניהול התוך-עבזי של חיידקים אורופתיוגניים עם לוקס אופרון כדי לגרום לדלקת בדרכי השתן בעכברים ואת אורך האורך שלאחר מכן בניתוח vivo של העומס החיידקי באמצעות הדמיית ביו-לומינציה.
Abstract
זיהומים בדרכי השתן (UTI) מדורגים בין הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בבני אדם ומטופלים באופן שגרתי באנטיביוטיקה אמפירית. עם זאת, בשל עמידות מיקרוביאלית גוברת, היעילות של האנטיביוטיקה הנפוצה ביותר ירדה. כדי למצוא אפשרויות טיפול חלופיות, יש צורך גדול בהבנה טובה יותר של פתוגנזה UTI ואת המנגנונים הקובעים רגישות UTI. על מנת לחקור את זה במודל בעלי חיים, הבדיקה הניתנת לשחזור, לא פולשנית כדי ללמוד את מהלך UTI היא הכרחית.
במשך שנים, תקן הזהב לספירת עומס חיידקים היה הקביעה של יחידות יוצרות מושבה (CFU) עבור נפח מדגם מסוים. טכניקה זו דורשת הומוגנטים של איברים לאחר המוות ודילול טורי, המגבילים את פלט הנתונים ואת יכולת הרבייה. כחלופה, הדמיית ביולומינציה (BLI) צוברת פופולריות כדי לקבוע את העומס החיידקי. תיוג פתוגנים עם לוקס אופרון מאפשר זיהוי וכימות רגישים באופן לא פולשני, ובכך מאפשר מעקב אורך. עד כה, האימוץ של BLI במחקר UTI נשאר מוגבל.
כתב יד זה מתאר את היישום המעשי של BLI במודל זיהום בדרכי השתן של העכבר. כאן, מדריך צעד אחר צעד עבור חיידקים culturing, הטמעה תוך-בסית והדמיה מסופק. המתאם in vivo עם CFU נבדק הוכחה של מושג מסופק על ידי השוואת העומס החיידקי של בעלי חיים נגועים מטופלים עם בעלי חיים מטופלים באנטיביוטיקה. יתר על כן, היתרונות, המגבלות והשיקולים הספציפיים ליישום BLI במודל IN VIVO UTI נדונים. היישום של BLI בתחום המחקר UTI יקל מאוד על המחקר על הפתוגנזה של UTI וגילוי דרכים חדשות למנוע ולטפל UTI.
Introduction
זיהומים בדרכי השתן (UTI) הם בין הזיהומים החיידקיים הנפוצים ביותר בבני אדם. כמעט מחצית מכל הנשים יחוו UTI סימפטומטי במהלך חייהם1. זיהומים המוגבלים לשלפוחית השתן יכולים לגרום לתסמינים בדרכי השתן כגון עלייה בתדירות השתן, דחיפות, המטוריה, בריחת שתן וכאב. כאשר הזיהום עולה למערכת השתן העליונה, חולים לפתח pyelonephritis, עם חולשה, חום, צמרמורות, וכאבי גב. יתר על כן, עד 20% מהחולים עם UTI סובלים מזיהומים חוזרים ונשנים וכתוצאה מכךירידהדרמטית ברגישות לאנטיביוטיקה 2,3,4. בשנים האחרונות, יש עניין גובר בטיפולים חדשניים לטיפול ומניעה של UTI חוזר. למרות הבנה טובה יותר של החסינות המולדת וההסתגלותית של דרכי השתן התחתונות ושל גורמי ארס החיידקים הדרושים לפלישה ולקולוניזציה, לא תורגמו שינויים רדיקליים במשטר הטיפול לפרקטיקה האורולוגית היומית2. על מנת ללמוד UTI פתוגנזה ורגישות ב vivo, בדיקת שחזור ולא פולשנית היא הכרחית.
מספר דגמי UTI של בעלי חיים תוארו החל נמטודות לפרימטים, אבל מודל מורין משמש בעיקר5,6. מודל זה מורכב צנתור טרנסאורתרלי של עכברים (נקבה) והטמעה לאחר מכן של השעיה חיידקית, לרוב אורופתיגני Escherichia coli (UPEC), ישירות לתוך לומן שלפוחית השתן7. לאחר החיסון, העומס החיידקי כותם באופן מסורתי על ידי קביעת יחידות יוצרות מושבה (CFU). טכניקה זו דורשת הקרבת בעלי חיים כדי להשיג הומוגנטים איברים לאחר המוות ודילול סדרתי, הגבלת תפוקת נתונים ושחזור. יתר על כן, מעקב אורך של עומס חיידקים בבעלי חיים בודדים אינו אפשרי באמצעות טכניקה זו.
בשנת 1995, Contag et al. הציע את השימוש בפתוגנים מתויגים bioluminescent כדי לפקח על תהליכי מחלה בבעלי חיים8,9. מאז, הדמיית ביולומינציה (BLI) הוחלה על מודלים זיהום רבים כגון דלקת קרום המוח, אנדוקרדיטיס, דלקת מפרקים ניוונית, עור, זיהומים רקמות רכות, וכו'10,11,12. במודל UTI מורין, זן UPEC עם לוקס אופרון מלא (luxCDABE) מ Photorhabdus luminescens ניתן להשתמש13. תגובה אנזימטית מזורזת על ידי לוציפראז חיידקי התלוי בחמצון של אלדהידים ארוכי שרשרת המגיבים עם מונונונוקלאוטיד פלאבין מופחת בנוכחות חמצן, מניב את הפלבין המחומצן, חומצת שומן ארוכת שרשרת ואור12. לוקס אופרון מקודד עבור לוציפראז ואנזימים אחרים הנדרשים לסינתזה של המצעים. לכן, כל החיידקים הפעילים מטבולית פולטים ברציפות אור ירוק כחול (490 ננומטר) ללא צורך בהזרקת מצע אקסוגני12. פוטונים הנפלטים מחיידקים מתויגים בלוקסניתנים לצילום באמצעות מצלמות מכשירים רגישים מאוד, מקוררים (CCD).
השימוש בחיידקים ביו-זוהרים במודל עבור UTI מאפשר כימות אורך ולא פולשני של העומס החיידקי, תוך השמטת הצורך בהקרבת בעלי חיים בנקודות זמן קבועות במהלך המעקב אחר קביעת CFU. למרות מגוון רחב של אפשרויות, צובר ראיות לחוסנה של טכניקת BLI זו בתחומים אחרים ויתרונותיה על פני מודלים קלאסיים של UTI, זה לא יושם באופן נרחב במחקר UTI. הפרוטוקול המוצג כאן מספק מדריך מפורט שלב אחר שלב ומדגיש את היתרונות של BLI עבור כל מחקר UTI עתידי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מועצת הקהילה של האיחוד האירופי ואושרו על ידי ועדת האתיקה של בעלי החיים של KU Leuven (P158/2018).
1. חיידקי פולחן (מותאם מ7,13,14)
- הכנה
- בחר זן UPEC זוהר המתאים בצורה הטובה ביותר לצרכים הניסיוניים.
הערה: כאן, לבודד דלקת שלפוחית השתן הקלינית, UTI89 (E. coli), נבחר בגלל יכולתו האורופתיוגנית הן בבני אדם והן במכרסמים, והשימוש הנפוץ בו במודלים UTI מורינים5,7,15. זן איזוגני bioluminescent הנושא את לוקס אופרון מלא (luxCDABE) מכונה עוד יותר UTI89-לוקס. אופרון זה נושא גם גנים התנגדות קנאמיצין גופרתי (ק"מ). לכן, ק"מ יכול לשמש לבחירת מושבות ביולומינסנט13. - הפוך עקומת מתאם עבור CFU וצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD 600 ננומטר) עבור זן חיידקי שנבחר7.
- כדי לעשות זאת, חיידקי תרבית (באמצעות הפרוטוקול להלן) ולעשות 8 דילולים שונים מלוחים חוצץ פוספט (PBS). למדוד את OD ב 600 ננומטר עבור כל דילול אלה צלחת אותם על לוחות לוריא-ברטאני (LB) כדי לקבוע את CFU.
- התווה את ערכי OD 600 ננומטר וערכי CFU כדי לקבוע את המתאם ולקבל עקומה סטנדרטית.
הערה: לניסויים עתידיים, למדוד את OD ב 600 ננומטר ולהשתמש בעקומה סטנדרטית זו כדי לקבל הערכה מיידית של CFU בתמיסה חיידקית.
זהירות: UPEC הם חיידקים פתוגניים, ודאו שהחדרים מצוידים כראוי והשתמשו בציוד מגן אישי.
- בחר זן UPEC זוהר המתאים בצורה הטובה ביותר לצרכים הניסיוניים.
- שלושה ימים לפני ההטמעה
- להשיג מושבות בודדות על ידי פסים את מלאי הגליצריל של חיידקים, באמצעות לולאת חיסון, על לוחות LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ק"מ ותרבות לילה ב 37 °C (57 °F). לאטום את הצלחות האלה עם סרט פרפין לאחסון ב 4 °C (70 °F) עד שבוע אחד.
- יומיים לפני ההטמעה
- מלא צינור תחתון עגול סטרילי 14 מ"ל עם כובעי הצמדה במיקום כפול עם 5 מ"ל של מרק LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל ק"מ. בחר מושבה חיידקית אחת עם לולאת חיסון והוסף את זה למרק LB. מערבולת ל -10 s כדי להבטיח ערבוב נכון.
- תרבות סטטית עם כובע הצמדה במצב פתוח ב 37 °C (50 °F) לילה.
הערה: צמיחה סטטית של E. coli מקדמת את הביטוי של סוג 1-פילי, שהם קריטיים לדבקות לפלישה לתאי אפיתל בדרכי השתן. - הכן ארלנמייר סטרילי או בקבוקון תרבות.
- יום אחד לפני ההטמעה
- לאחר הדגירה, מערבולת הצינור עבור 10 s כדי להבטיח הומוגניזציה נכונה של התרבות החיידקית. הפוך תת-תרבות ב Erlenmeyer על ידי הוספת 25 μL של השעיה חיידקית ל 25 מ"ל של מדיום LB טרי ללא אנטיביוטיקה.
- סגור את ארלנמאייר ואת התרבות סטטית ב 37 °C (50 °F) לילה.
- ביום ההטמעה
- מערבולת ארלנמאייר במשך 10 s כדי להבטיח ערבוב נכון.
- יוצקים את התרבות מארנמאייר לתוך צינור תרבות 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 3,000 x g ו 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות. דקאנט סופרנט ו resuspend גלולה חיידקית ב 10 מ"ל של PBS סטרילי ומערבולת שוב עבור 10 s.
- בחר את הריכוז הניסיוני של inoculum (CFU) ולהשתמש בעקומה הסטנדרטית המתקבלת בשלב 1.1.2 כדי לקבוע את OD המתאים 600 ננומטר.
- הוסף 1 מ"ל של תרבית חיידקים resuspended לתוך 9 מ"ל של PBS סטרילי ולבדוק את OD ב 600 ננומטר. התאם עוד יותר על ידי הוספת PBS סטרילי או פתרון חיידקי מרוכז, עד OD הרצוי 600 ננומטר הוא הגיע7.
הערה: לדוגמה, עבור UTI89-lux להתאים את התרבות על ידי הוספת PBS עד OD 600 ננומטר מגיע 0.45, המתאים 2 x 107 CFU / 50 μL. כדי לאמת את מספר יחידות ה-CFUs קיימא, הכינו דילול טורי פי 10 וצלחת 50 מיקרו-אל של הדילול החמישי והשישי פי 10 על לוחות LB במשולש כדי להשיג פחות מ-300 מושבות. לספור את המושבות המתקבלות למחרת לאחר דגירה לילה ב 37 °C.C. OD 600 ננומטר נותן קריאה מיידית החוצה אבל להשתמש CFU כמו בקרת איכות.
2. חיסון בעלי החיים (מותאם מ7,16)
- הכנת בעלי החיים
- בחר את זני העכבר הרצויים בהתאם לשאלת המחקר והזמינות של שורות נוק-אאוט, פרטים ניסיוניים והבדלים ברגישות UTI5,17. זכור כי צנתור טרנסאורתרלי קל יותר בעכברים הנשיים. אין להשתמש בבעלי חיים מתחת לגיל 8 שבועות, מכיוון שהם לא בוגרים מבחינה חיסונית. כאן נעשה שימוש בעכברים C57Bl/6J נקבות בנות 12 שבועות.
- להזמין בעלי חיים זמן רב מראש ולתת להם להתאקלם, באופן אידיאלי במשך 7 ימים. בעלי חיים ביתיים קבוצתיים בכלובים מאווררים בנפרד, בתנאים סטנדרטיים של 12 שעות בהירות/חושך.
- לגלח את אזור הבטן של בעלי החיים כדי להגביל את אובדן האות. אין להשתמש קרם להסרת שיער, כפי שהוא יכול לשרוף את העור של בעלי החיים במהירות. לרסן את החיה על ידי החזקה הדוקה של הגפיים הקשוחות והגפיים האחוריות עם היד הלא דומיננטית תוך כדי גילוח עם היד הדומיננטית. לחלופין, להתגלח תחת הרדמה איזופלוריין.
הערה: בעלי חיים גולחו יומיים לפני ההדמיה, בהתחשב בכך שבעלי החיים יטפחו את האזור המגולח עוד יותר. - לספק מים ומזון סטנדרטי ad libitum לאורך כל הניסוי. עם זאת, לשלול בעלי חיים ממים 2 שעות לפני ההטמעה כדי למזער את נפח שלפוחית השתן במהלך ההטמעה.
- הר טיפ אנגיוקטטר סטרילי 24 G על מזרק 100 μL ולמלא את המזרק עם פתרון חיידקי מוכן בשלב 1.5.3.
הערה: כדי לקבוע את luminescence הרקע, לקבל תמונה בסיסית לפני ההטמעה (ראה שלב 3, להלן).
- הטמעת בעלי החיים
- מניחים את בעלי החיים בתא אינדוקציה ומרדים אותם באמצעות שאיפת איזופלוראן עם חמצן טהור כגז נושא (אינדוקציה ב -3% ותחזוקה ב -1.5%).
- מניחים חיה אחת על משטח עבודה בתנוחת העל-סף ושומרים על הרדמה איזופלוריין יציבה באמצעות חרוט אף במהלך ההטמעה. החל את משחת העין.
- לגרש את השתן שיורית על ידי החלת דחיסה עדינה וביצוע תנועות מעגליות על האזור suprapubic. נקה את הבטן התחתונה עם 70% אתנול לפני ההטמעה.
- משמנים את קצה הצנתר עם תמיסת מלח רגילה. שים את האצבע המורה של היד הלא דומיננטית על הבטן ולדחוף אותו בעדינות כלפי מעלה. התחל את הצנתור של השופכה בזווית של 90° (אנכית) וברגע שנתקלים בהתנגדות, הטה אותה אופקית לפני הכנסתה עוד יותר (0.5 ס"מ).
הערה: לעולם אל תדחוף בכוח את הקטטר, שכן זה יגרום נזק לשופכה. תנועות סיבוב עדינות יכולות לעזור בהחדרת צנתר. מצד שני, חוסר התנגדות בדרך כלל מצביע על החדרה שגויה לתוך הנרתיק. - בצע הטמעה איטית (5 μL/s) של 50 μL של inoculum חיידקי (2 x 107 CFU).
הערה: נפחים גבוהים יותר או הטמעה מהירה יותר עלולים לגרום ריפלוקס לכליות. במהלך התרגול של הטכניקה, דיו כחול יכול לשמש להערכת ריפלוקס. - לאחר ההטמעה, לשמור על המזרק ואת הצנתר במקום עוד כמה שניות ולאחר מכן לסגת לאט כדי למנוע דליפה. תיעדו אי סדרים כגון כמות גבוהה של דליפה או בשר מדמם ואל תכלול בעלי חיים, במידת הצורך.
- מקם את החיה בתנוחה על-חושית בקונוס האף של תא ההדמיה וחזר על השלבים הקודמים 2.1.1-2.1.6 עבור כל בעלי החיים הנותרים. השתמש צנתר אחד לכל קבוצת ניסוי. ודא הרדמה נמשכת ולמזער את הזמן בין החיה הראשונה האחרונה.
- במידת הצורך, יש לתת אנטיביוטיקה או תרופות ניסיוניות, לפני או אחרי ההדמיה (שלב 3). לדוגמה, כדי לנהל enrofloxacin, להוסיף 40 μL של אנרופופלוקסצין (100 מ"ג / מ"ל) פתרון 3.96 מ"ל של תמיסת מלח פיזיולוגית כדי לקבל דילול 1/100. הזריק 100 μL/10 גרם תת עורית ב 9 בבוקר ו 5 pm כדי לנהל 10 מ"ג / קילוגרם של enrofloxacin פעמיים ביום במשך 3 ימים.
3. הדמיית ביו-לומינציה
- הכנה ובחירה של פרמטרי הדמיה
- פתח את תוכנת הרכישה שלBLI (ראה טבלת חומרים ) ולחץ על Initialize בהתקן ההדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק את המצלמה ואת מערכת בקר הבמה ולקרר את מצלמת ה- CCD ל - 90 °C (90 °C).
הערה: במהלך תהליך זה, הדלת נעולה, וניתן לעקוב אחר התקדמות האתחול בלוח הבקרה. אור ירוק מציין כי הטמפרטורה של -90 °C (50 °F). אזהרה תופיע אם נעשה ניסיון הדמיה לפני השלמת האתחול. - ודא שהנתונים נשמרים באופן אוטומטי: לחץ על שמירה אוטומטית של רכישה ובחר את התיקיה הנכונה.
- בחר זוהר וצילום. בדיקת הגדרות ברירת המחדל של ערך: הגדר מסנן עירור למסנן חסימה ופליטה כ'פתח'.
- הגדר את זמן החשיפה כ'אוטומטי' בעת צילום התמונה הראשונה, במיוחד כאשר מצפים לאות עמום כדי להבטיח מספר הולם של ספירות פוטון. למדידות ויוו ולאותות בהירים, הגדר את זמן החשיפה ל- ~30s. אם התמונה רוויה, תופיע אזהרה. אם זה קורה, צמצם את זמן החשיפה.
- בחר את הבינוני, F / stop 1 ובחר את שדה הראייה הנכון (FOV) (D עבור 5 בעלי חיים).
- הגדר את גובה הנושא ל- 1 ס"מ בעת הדמיית עכברים.
- לחץ על הוסף שלוש פעמים בלוח הבקרה של הרכישה כדי להשיג רצף של שלוש תמונות, כשכפול טכני.
- פתח את תוכנת הרכישה שלBLI (ראה טבלת חומרים ) ולחץ על Initialize בהתקן ההדמיה (ראה טבלת חומרים) כדי לבדוק את המצלמה ואת מערכת בקר הבמה ולקרר את מצלמת ה- CCD ל - 90 °C (90 °C).
- דימות
- מניחים עכברים בתא ההדמיה בתנוחת הסופים ומשתמשים בקונוס האף המגוזר כדי לשמור על הרדמה (איזופלוריין 1.5%) לאורך כל הניסוי. תמונה עד 5 עכברים בו זמנית ולהפריד את בעלי החיים באמצעות בלבל האור כדי למנוע השתקפות.
- סגור את הדלת ולחץ על רכוש כדי להתחיל את רצף ההדמיה.
- מלאו מידע מפורט על הניסוי (חיות מסוג בר ונוקאאוט, טיפולים, יום הדמיה וכו '). הגדרות ההדמיה, כגון זמן חשיפה, נשמרות באופן אוטומטי.
- מוציאים עכברים מתא ההדמיה ומחזירים אותם לכלוב שלהם. בדוק את ההחלמה המלאה לאחר הרדמה. בתוך דקות, בעלי החיים צריכים להיות ערים לחלוטין וחקרניים. אין לספק שך ים מכיוון שהדבר עלול להפריע לקורס UTI18.
- החזר את הכלובים למדפיים המאווררים עד מחזור ההדמיה הבא. לאחר השלמת הניסוי, להרדים את בעלי החיים על ידי חנק CO2 או נקע צוואר הרחם. לעשות זאת לפני ההתאוששות של הרדמה איזופלוריין כדי למזער את המצוקה.
- ניתוח התמונות
- הפעל את תוכנת ההדמיה וטען את הקובץ הניסיוני על ידי לחיצה על עיון.
- השתמשו בלוח הכלים להתאמת סרגל הצבעים של התמונה. תקן את ההיבט החזותי של התוצאות באמצעות אותן הגדרות עבור כל התמונות, כלומר, השתמש בקנה מידה לוגריתמי עם מינימום של 104 עד למקסימום של 107 פוטונים. התאמות אלה אינן משפיעות על הנתונים הגולמיים אלא רק על המצגת הגרפית.
- השתמש בכלי ROI כדי לצייר אזור עניין (ROI) בתמונה. ודאו שההמחיר על תנאי גדול מספיק כדי לכסות את האזור המלא ולהשתמש באותם ממדים עבור כל התמונות. כאן, ROI מרובע של 3.5 ס"מ x 4.5 ס"מ הונח מעל הבטן התחתונה.
- לחץ על מדידת ROI כדי לכמת את עוצמת האור (ספירה או שטף פוטון מוחלט). יצא נתונים אלה והשתמש בממוצע המשכפלים הטכניים.
הערה: ספירות מייצגות את מספר הפוטונים שזוהו על-ידי המצלמה ויש להשתמש בהן רק לבקרת איכות התמונה. כדי לדווח על נתונים, השתמש בשטף פוטון מוחלט. שטף פוטון כולל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית מכיוון שהוא מייצג את האור הנפלט מפני השטח והוא יחידה מכוילת, אשר מתוקנת לזמן החשיפה (לשנייה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In vivo BLI מתואם עם CFU של האינוקולום בזמן ההטמעה.
כדי להעריך את מגבלת הזיהוי של BLI in vivo ואת המתאם עם CFU של inoculum, עכברים נדבקו בריכוזים שונים של UTI89-לוקס ו- PBS כשליטה שלילית. לפני ההטמעה, בעלי חיים לא נגועים נסרקו כדי לקבוע את זוהר הרקע. התמונות הבאות התקבלו מיד לאחר ההטמעה (איור 1A). לאחר ההטמעה של UTI89-lux,ביולומינציה הייתה ניתנת לזיהוי חזק מעל 2 x 104 CFU ומתאם ליניארי בין CFU של אינוקולום ואת הביולומינציה הוקמה (איור 1B). לעומת זאת, שטף פוטון כולל היה דומה אותות רקע לבעלי חיים שהוחדירו PBS ובריכוז החיידקי הנמוך ביותר של 2 x 103 CFU.
BLI ככלי למעקב אורך במהלך הטיפול
כדי לקבוע אם ההשפעה הריפויית של טיפול אנטיביוטי מאומת ניתן להדגים באמצעות BLI אורך, 20 בעלי חיים נדבקו inoculum של 2 x 107 CFU / 50 μL, ו 10 של בעלי חיים אלה טופלו enrofloxacin 10 מ"ג / קילוגרם תת עורית פעמיים ביום במהלך 3 הימים הראשונים לאחר ההדבקה. הן את ההתפתחות הטבעית בקבוצת הביקורת הנגועה אך הלא מטופלת והן את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי על הזיהום הקינטיקה בקבוצה המטופלת ניתן לדמיין בפירוט (איור 2). ירידה מיידית בעומס החיידקים, כפי שנמדד על ידי שטף פוטון מוחלט, נראתה לאחר המנה הראשונה של enrofloxacin. אף אחת מהחיות שטופלו לא סבלה מעלייה בעומס החיידקים. השונות בין הנושאים בקבוצת הביקורת הנגועה אך לא מטופלת הייתה גבוהה יותר והירידה בעומס החיידקים הייתה איטית יותר. ביום 10, 8 מתוך 10 בעלי חיים מקבוצת הביקורת חזרו לאות BLI הדומה לרקע שלפני ההטמעה שלהם. העומס החיידקי הכולל עבור כל חיה חושב באמצעות האזור שמתחת לעקומה (AUC) של שטף הפוטון הכולל שהשתנה בולי עץ. הבדל משמעותי נצפה בין בעלי חיים שטופלו באנרופלוקסצין ובעלי חיים לא מטופלים במהלך 10 ימים. תוצאות אלה מראות כי BLI הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את ההשפעה של טיפול פוטנציאלי על מהלך המחלה של UTI.
איור 1: In vivo BLI מתואם עם CFU של האינוקולום בזמן ההטמעה. (A)תמונות מייצגות שהושגו עם in vivo BLI של עכברים נגועים בריכוזים הולכים וגדלים של inoculum (2 x 103-2 x 108 CFU) בתמונה מיד לאחר הטמעת חיידקים בשלפוחית השתן. יחידות יוצרות מושבה. (B)כימות של ביולומינציה הנפלטת מעל אזור שלפוחית השתן (שטף פוטון כולל) בהשוואה לריכוז ההנוקולום (CFU). אות BLI זוהה בחוזקה מעל 2 x 104 CFU (p = 0.0002 לעומת רקע ו- p = 0.015 בהשוואה לבקרת PBS, t-testלא משולף). מתאם פירסון עבור האינוקולי החל 2 x 103-2 x 108 CFU היה r = 0.9995 (p < 0.0001). BG = רקע, PBS = תמיסת מלח חוצץ פוספט, CFU = מושבה יוצר יחידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: BLI ככלי למעקב אורך במהלך הטיפול. (A)עקבות בודדים של שטף פוטון הכולל עבור בעלי חיים נגועים 2 x 107 CFU של UTI89-לוקס ומטופלים enrofloxacin 10 מ"ג / קילוגרם פעמיים ביום במשך 3 ימים (כחול) לעומת קבוצת ביקורת לא מטופלת (שחור), n = 10 לכל קבוצה. BG = רקע. (B)ניתוח עקבות מבעלי חיים המוצגים בפאנל A, דיווח על AUC של שטף פוטון מוחלט שעבר שינוי ביומן הן עבור enrofloxacin (כחול) וקבוצת ביקורת (שחור). N = 10 לכל קבוצה, ממוצע ± SD, t-testp < 0.0001 שלא פורסם. AUC = שטח מתחת לעקומה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היתרונות של BLI בהשוואה לספירת CFU
נתוני אורך
חיסרון מרכזי בשיטה המסורתית של ספירת CFU כדי לכמת את הנטל המיקרוביאלי הוא הדרישה של הומוגנטים איברים לאחר המוות, מתן נקודת נתונים חתך אחת בלבד לכל חיה. לעומת זאת, BLI מאפשר מעקב אורך לא פולשני של בעלי חיים נגועים. ניתן לדמיין את בעלי החיים 2 עד 3 פעמים ביום, ומספקים תובנה מפורטת על הקינטיקה של הזיהום. בנוסף, צעדים חוזרים ונשנים של אותה חיה מפחיתים באופן דרסטי את מספר בעלי החיים הדרושים לניסויים המופעלים כראוי. יתר על כן, החוקרים יכולים להתמקד בשוונות בין אינדיבידואלית ולפני בדיקה או טיפול בבעלי חיים עם סוכן חדשני, הם יכולים לבחור בעלי חיים עם עומס חיידקי מוגדר מראש באמצעות הנתונים בזמן אמת. מצד שני, שימוש ב- AUC של ניסוי מאפשר לחוקרים להתמקד בעומס החיידקי הכולל ולא בערך חתך אחד. אין אפשרות להפריז בערך המוסף של נתונים אורך ובזמן אמת בהגדרת UTI.
זיהוי של הפצת הזיהום
הרזולוציה המרחבית של התמונות שהושגו עם BLI מספיקה כדי לזהות אתרים אחרים המתיישבים על ידי פתוגנים לוקס או FLucמתויגים19. עבור UTI, זיהומים עולים לכליות או הפצה לדם הם ממצאים רלוונטיים מאוד. בסביבה ניסיונית זו, כל התפשטות של זיהומים הנגרמים על ידי UTI89-לוקס מעבר לדרכי השתן התחתונות לא נצפתה. זה היה צפוי בהתחשב זן זה בעיקר גורם דלקת שלפוחית השתן.
שחזור נתונים והשוואה
יכולת הרבייה של ניסויים גבוהה יותר בעת שימוש ב- BLI בהשוואה לספירת CFU. באופן קלאסי, טריפליקאטים של דילול סדרתי פי 10 של הומוגנטים מצופים ורק לוחות אלה עם 30 עד 300 CFU נספרים לאחר מכן כדי לחשב את המספר הכולל של CFU. שיטה זו מסורבלת, נוטה לשונות גבוהה, גורמת ללוחות חסרי תועלת רבים, והיא נוטה מאוד לטעויות אנוש. יתר על כן, אין קונצנזוס על איך לדווח על CFU, כלומר, לכל רקמת שלפוחית השתן גרם, לכל שלפוחית השתן, או לכל 1 מ"ל הומוגניט. זה הופך את ההשוואה של התוצאות של קבוצות שונות קשה מאוד יכול להיות משופר על ידי השימוש של BLI ושטף פוטון מוחלט.
שיקולים ומגבלות של השיטה
מלבד השיקולים הקלאסיים הקשורים BLI ב vivo כגון ספיגת פוטונים על ידי פרווה או המוגלובין, ישנם כמה שיקולים שיש לעשות כאשר מתאם BLI ו- CFU נחשב בזמן ההקרבה.
ראשית, פערים בין שתי השיטות בזמן ההקרבה נתקלים20, במיוחד כאשר טיפולים אנטיביוטיים משמשים. לכן, המתאם בין BLI ו- CFU נחשב בזמן ההקרבה יכול להיות תת-אופטימלי ואינו בהכרח רלוונטי. עבור BLI, שטף הפוטן הכולל יכול להיות נמוך מהצפוי, מכיוון שחיידקים מאותגרים יכולים להפנות את חילוף החומרים שלהם לתהליכי התאוששות ותיקון, ולא פליטת אור. בנוסף, מדידת BLI לוכדת תמונת מצב של החיידקים וחילוף החומרים שלהם בזמן אמת ויוו, וכתוצאה מכך אותות BLI נמוכים יותר אם חיידקים נמצאים במצב רדום או מוארך בזמן ההדמיה. מצד שני, לקביעת CFU, חיידקים מאותגרים בתרופות מגיבים באופן של הכל או כלום לאחר שהוסרו מבית הגידול הזיהומי שלהם (כלומר, ביופילם) ומצוות. לאחר הציפוי על אגר, החיידקים מאותגרים עלולים להיפגע באופן בלתי הפיך ולא להתפתח למושבות נצפות, וכתוצאה מכך CFU נמוך יותר סופר21. בנוסף, חיידקים מאותגרים יכולים להיכנס למצב בר קיימא אך לא ניתן לתחנת (VBNC). הם נשארים פעילים מטבולית ובת קיימא, אך אינם ניתנים עוד לפולחן באמצעי מעבדה סטנדרטיים. חיידקים שנכנסים למצב VBNC או המאורגנים ביופילמים ניתן לזהות בקלות עם BLI, בעוד ספירה של CFU דורש עיבוד נוסף21,22,23. לסיכום, ביולומינציה וספירות קיימא מודדים היבטים שונים של פיזיולוגיית התאים ואף אחד מהם לא צריך להיחשב כאינדיקטור הסופי של הכדאיותהתאית 21.
יתר על כן, ההגדרה של עומס חיידקי כפי שנמדד על ידי ספירת BLI או CFU שונה עקב הבדלים בעיבוד מדגם. בעת שימוש בספירת CFU, רק חיידקים השוכנים בתוך דופן שלפוחית השתן נכללים הומוגניים ונספרים. לעומת זאת, BLI לוכדת גם פוטונים הנפלטים מחיידקים בשתן ובשופכה. לדעתנו, האחרון הוא ייצוג נכון יותר מבחינה פיזיולוגית של העומס החיידקי הכולל כפי שהוא כולל את כל התאים הרלוונטיים מבחינה אנטומית (שלפוחית השתן, שתן, ושופכה).
בניגוד לספירת CFU, BLI דורשת ייצור של חיידקים זוהרים שהשתנו גנטית. בהתאם לאתר ההחדרה, סביר להניח כי המבוא של לוקס אופרון בגנום יכול לשנות את פוטנציאל virulence של זן חיידקי. לכן, בעת פיתוח זן bioluminescent חדש, virulence שלה ואת מאפייני הצמיחה יש להשוות את הזן ההורים10,13. עם זאת, ההתקדמות האחרונה בעריכת הגנום מאפשרת תיוג יעיל וחסר צלקות של כל הפתוגנים החיידקיים העיקריים, ובכך מגבילה את ההשפעה על התגובות או הטיפוליות. יתר על כן, הנדסה גנטית פותחת אפשרויות לביטוי מותנה של גנים עיתונאיים ביולומינציה, ולכן, במדידת vivo של תת אוכלוסין חיידקי רלוונטי, ביטוי גנים, וכו'24,25.
לבסוף, גישה למכשיר ההדמיה המתקדם ולתוכנת הרכישה עבור in vivo BLI עשויה להיות גורם מגביל בהשוואה לציוד הבסיסי הנדרש לספירת CFU. עם זאת, שיתופי פעולה עם ליבות הדמיה יכולים למזער את ההוצאות וההשקעות הדרושות עבור BLI.
שיקולים ספציפיים ליישום BLI במודל IN VIVO UTI
מודל בעלי חיים
היתרונות של מודל UTI מורין הם פי שלושה: הוא מאפשר ניטור של התקדמות המחלה בדרכי השתן של יונקים, בעלי החיים ותחזוקתם הם זולים יחסית, וקווים מוטנטיים זמינים. מצד שני, אינדוקציה של הזיהום בדרך כלל כרוך צנתור transurethral והטמעה לאחר מכן של מינון גבוה של חיידקים ישירות לתוך לומן שלפוחית השתן, ובכך לעקוף את התהליך הטבעי של התעלות דרך השופכה5.
דיור לבעלי חיים
ניתן לשכן בעלי חיים במהלך הניסוי. בדקנו את התרחשות ההעברה בין בעלי חיים מאותו כלוב, על ידי החדרת חיות זקיף לכלובים עם בעלי חיים נגועים. לאף אחת מבעלי החיים זקיף לא היה עומס חיידקי ניתן לגילוי, שנמדד הן עם CFU והן עם BLI.
נפח שלפוחית השתן
בעת שילוב מודל UTI מורין עם BLI, החוקרים צריכים לשמור על המאפיינים האנטומיים הייחודיים של שלפוחית השתן בראש. שלפוחית השתן היא איבר חלול המכיל נפח משתנה של שתן. במהלך UTI, נוכחות של שתן שורץ חיידקים יכול תיאורטית להשפיע על ספירת פוטון הכוללת בהתאם למידת מילוי שלפוחית השתן. עם זאת, התקינה של נפח שלפוחית השתן אינה מעשית ועלול להתערב עם העיצוב הניסיוני. יתר על כן, מניסיוננו, הבדלים בנפח שלפוחית השתן אינם גורמים להבדלים מובהקים סטטיסטית בשטף הפוטן הכולל.
טמפרטורת דגימה
במבחנה BLI (או כחלופה פשוטה וזולה יותר, מדידת ביו-לומינציה במד לומינומטר) יכולה לשמש גם לקביעת עומס חיידקי על הומוגנטים, שתן או השעיות חיידקיות המכילות UTI89-lux. עם זאת, הטמפרטורה של המדגם חשוב כמו פליטת פוטונים נובעת תגובה אנזימטית ולכן דורש פעילות מטבולית נוכחות של חמצן. יש להימנע משינויים דרסטיים בטמפרטורה במהלך קצירת איברים על ידי מתן אפשרות לדגימה לכייל בשלב המחומם (37 מעלות צלזיוס) 5 דקות לפני ההדמיה.
יישומים וחשיבות פוטנציאליים
לסיכום, השיטה המסורבלת של הספירה של CFU הייתה הגבלת הרבייה והיעילות של המחקר בתחום UTI. ההתקנה הניסיונית עם BLI תקדם במחקר VIVO UTI על פיזיולוגיה של שלפוחית השתן, פתוגנזה UTI, ורגישות על ידי מתן אפשרות למעקב אורך, תוך הפחתת מספר בעלי החיים הדרושים עבור סוגים אלה של מחקרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר - פלנדריה (FWO Vlaanderen; G0A6113N), מועצת המחקר של KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. ו- W.E.) וה-VIB (ל- T.V.). W.E. הוא חוקר קליני בכיר של קרן המחקר - פלנדריה (FWO Vlaanderen). הזן UTI89-lux היה מתנה נדיבה ממעבדתו של פרופ ' זרע13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Black Flat Bottom Polystyrene Plate | Corning | 3925 | for in vitro imaging |
| Aesculap ISIS | Aesculap | GT421 | hair trimmer, with GT608 cap |
| Anesthesia vaporizer | Harvard apparatus limited | N/A | https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html |
| Baytril 100 mg/mL | Bayer | N/A | Enrofloxacin |
| BD Insyte Autoguard 24 GA | BD | 382912 | Yellow angiocatheter, use sterile plastic tip for instillation |
| C57Bl/6J mice | Janvier | N/A | |
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | EP022628146 | |
| Dropsense 16 | Unchained Labs | Trinean | to measure OD 600nm |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Gibco | ThermoFisher Scientific | REF 14040-083 | |
| Ethanol 70% denaturated 5L | VWR international | 85825360 | |
| Falcon 14ml Round Bottom Polystyrene Tube, Snap-Cap | Corning | 352057 | |
| Falcon 50ml cellstart | Greiner | 227285 | |
| Hamilton GASTIGHT syringe, PTFE luer lock, 100 µL | Sigma-Aldrich | 26203 | to ensure slow bacterial instillation of 50 µL |
| Inoculation loop | Roth | 6174.1 | holder: Art. No. 6189.1 |
| Iso-Vet 1000mg/g | Dechra Veterinary products | N/A | Isoflurane |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | PerkinElmer | REF 124262 | imaging device |
| Kanamycine solution 50 mg/mL | Sigma-Aldrich | CAS 25389-94-0 | |
| Living Imaging Software | PerkinElmer | N/A | BLI acquisition software, version 4.7.3 |
| Luria Bertani Broth | Sigma-Aldrich | REF L3022 | alternatively can be made |
| Luria Bertani Broth with agar | Sigma-Aldrich | REF L2897 | alternatively can be made |
| Petri dish Sterilin 90mm | ThermoFisher Scientific | 101VR20 | to fill with LB agar supplemented with Km |
| Pyrex Culture flask 250 mL | Sigma-Aldrich | SLW1141/08-20EA | |
| Slide 200 Trinean | Unchained Labs | 701-2007 | to measure OD 600nm |
| UTI89-lux | N/A | N/A | Generous gift from Prof. Seed |
| Vortex | VWR international | 444-1372 |
References
- Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113 (1), 5-13 (2002).
- O'Brien, V. P., Hannan, T. J., Nielsen, H. V., Hultgren, S. J. Drug and vaccine development for the treatment and prevention of urinary tract infections. Microbiology Spectrum. 4 (1), 1128 (2016).
- Nielubowicz, G. R., Mobley, H. L. Host-pathogen interactions in urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (8), 430-441 (2010).
- Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
- Carey, A. J., et al. Urinary tract infection of mice to model human disease: Practicalities, implications and limitations. Crititical Reviews in Microbiology. 42 (5), 780-799 (2016).
- Barber, A. E., Norton, J. P., Wiles, T. J., Mulvey, M. A. Strengths and limitations of model systems for the study of urinary tract infections and related pathologies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 80 (2), 351-367 (2016).
- Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4 (8), 1230-1243 (2009).
- Contag, C. H., et al. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Molecular Microbiology. 18 (4), 593-603 (1995).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cellular Microbiology. 6 (4), 303-317 (2004).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cellular Microbiology. 9 (10), 2315-2322 (2007).
- Avci, P., et al. In-vivo monitoring of infectious diseases in living animals using bioluminescence imaging. Virulence. 9 (1), 28-63 (2018).
- Balsara, Z. R., et al. Enhanced susceptibility to urinary tract infection in the spinal cord-injured host with neurogenic bladder. Infection and Immunity. 81 (8), 3018-3026 (2013).
- Huang, Y. Y., et al. Antimicrobial photodynamic therapy mediated by methylene blue and potassium iodide to treat urinary tract infection in a female rat model. Scientific Reports. 8 (1), 7257 (2018).
- Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
- Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A murine model for E. coli urinary tract infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 83-100 (2016).
- Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. American Society for Microbiology. 66 (6), 2798 (1998).
- Zhang, Y., et al. Efficacy of Nonsteroidal Anti-inflammatory Drugs for Treatment of Uncomplicated Lower Urinary Tract Infections in Women: A Meta-analysis. Infectious Microbes & Diseases. 2 (2), 77-82 (2020).
- Vanherp, L., et al. Sensitive bioluminescence imaging of fungal dissemination to the brain in mouse models of cryptococcosis. Disease Models & Mechanisms. 12 (6), 039123 (2019).
- Keyaerts, M., Caveliers, V., Lahoutte, T. Bioluminescence imaging: looking beyond the light. Trends in Molecular Medicine. 18 (3), 164-172 (2012).
- Marques, C. N., Salisbury, V. C., Greenman, J., Bowker, K. E., Nelson, S. M. Discrepancy between viable counts and light output as viability measurements, following ciprofloxacin challenge of self-bioluminescent Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 56 (4), 665-671 (2005).
- Vande Velde, G., Kucharikova, S., Van Dijck, P., Himmelreich, U. Bioluminescence imaging increases in vivo screening efficiency for antifungal activity against device-associated Candida albicans biofilms. International Journal of Antimicrobial Agents. 52 (1), 42-51 (2018).
- Oliver, J. D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).
- Kucharikova, S., Van de Velde, G., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e52239 (2015).
- Van de Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., Van Dijck, P. Towards non-invasive monitoring of pathogen-host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular Microbiology. 16 (1), 115-130 (2014).
