Summary
A capacidade de detectar com precisão componentes de junção neuromuscular é crucial na avaliação de modificações em sua arquitetura devido a processos patológicos ou de desenvolvimento. Aqui apresentamos uma descrição completa de um método simples para obter imagens de alta qualidade de junções neuromusculares de montagem inteira que podem ser usadas para realizar medições quantitativas.
Abstract
A junção neuromuscular (NMJ) é um ponto de contato especializado entre o nervo motor e o músculo esquelético. Esta sinapse periférica exibe alta plasticidade morfológica e funcional. Em numerosos distúrbios do sistema nervoso, nMJ é um alvo patológico precoce resultando em falha de neurotransmissão, fraqueza, atrofia e até mesmo na morte da fibra muscular. Devido à sua relevância, a possibilidade de avaliar quantitativamente certos aspectos da relação entre os componentes do NMJ pode ajudar a compreender os processos associados à sua montagem/desmontagem. O primeiro obstáculo ao trabalhar com músculos é obter a expertise técnica para identificar e dissecar rapidamente sem danificar suas fibras. O segundo desafio é utilizar métodos de detecção de alta qualidade para obter imagens NMJ que possam ser usadas para realizar análise quantitativa. Este artigo apresenta um protocolo passo-a-passo para dissecar extensor digitorum longus e soleus músculos de ratos. Também explica o uso da imunofluorescência para visualizar elementos pré e postingaptáticos de NMJs de montagem integral. Os resultados obtidos demonstram que essa técnica pode ser usada para estabelecer a anatomia microscópica da sinapse e identificar alterações sutis no status de alguns de seus componentes em condições fisiológicas ou patológicas.
Introduction
A junção neuromuscular do mamífero (NMJ) é uma grande sinapse tripartite colinérgica composta pelo nervo do neurônio motor, a membrana pós-sináptica na fibra muscular esquelética e as células schwann terminais1,2,3. Esta sinapse apresenta alta plasticidade morfológica e funcional4,5,6,7,8, mesmo durante a idade adulta, quando os NMJs podem sofrer modificações estruturais dinâmicas. Por exemplo, alguns pesquisadores têm mostrado que terminações nervosas motoras mudam continuamente sua forma na escala de micrômetros9. Também foi relatado que a morfologia do NMJ responde aos requisitos funcionais, uso alterado, envelhecimento, exercício ou variações na atividade locomotor4,10,11,12,13,14,15. Assim, o treinamento e a falta de uso representam estímulos essenciais para modificar algumas características do NMJ, como seu tamanho, comprimento, dispersão de vesículas e receptores sinápticos, bem como ramificação terminal nervoso14,16,17,18,19,20.
Além disso, foi demonstrado que qualquer alteração estrutural ou degeneração dessa junção vital poderia resultar em morte celular do neurônio motor e atrofia muscular21. Acredita-se também que a comunicação alterada entre nervos e músculos poderia ser responsável pelas alterações fisiológicas relacionadas à idade do NMJ e possivelmente por sua destruição em estados patológicos. O desmantelamento da junção neuromuscular desempenha um papel crucial no surgimento da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA), doença neurodegenerativa que constitui um dos melhores exemplos de interação músculo-nervo prejudicada3. Apesar dos inúmeros estudos realizados sobre a disfunção do neurônio motor, ainda se debate se a deterioração observada na ELA ocorre devido ao dano direto no neurônio motor e, em seguida, estende-se às projeções cortico-espinhais22; ou se deve ser considerada como uma axonopatia distal onde a degeneração começa nas terminações nervosas e progride em direção ao neurônio motor somas23,24. Dada a complexidade da patologia da ELA, é lógico considerar que ocorre uma mistura de processos independentes. Como o NMJ é o ator central da interação fisiopatológica entre músculo e nervo, sua desestabilização representa um ponto crucial na origem da doença que é relevante a ser analisada.
O sistema neuromuscular de mamíferos é funcionalmente organizado em unidades motoras discretas, consistindo de um neurônio motor e as fibras musculares que são exclusivamente inervadas pelo seu terminal nervoso. Cada unidade motora possui fibras com propriedades estruturais e funcionais semelhantes ou idênticas25. O recrutamento seletivo do neurônio motor permite otimizar a resposta muscular às demandas funcionais. Agora está claro que os músculos esqueléticos dos mamíferos são compostos de quatro tipos diferentes de fibras. Alguns músculos são nomeados de acordo com as características de seu tipo de fibra mais abundante. Por exemplo, o soleus (um músculo posterior do membro posterior envolvido na manutenção da postura corporal) possui a maioria das unidades de contração lenta (tipo 1) e é reconhecido como um músculo lento. Em vez disso, o extensor digitorum longus (EDL) é essencialmente composto de unidades com propriedades semelhantes de contração rápida (fibras tipo 2) e é conhecido como um músculo rápido especializado para movimentos filásticos necessários para a locomoção. Em outras palavras, embora os músculos adultos sejam de natureza plástica devido às influências hormonais e neurais, sua composição de fibras determina a capacidade de realizar diferentes atividades, como visto no soleus que experimenta atividade contínua de baixa intensidade e EDL que exibe uma contração única mais rápida. Outras características que são variáveis entre diferentes tipos de fibras musculares estão relacionadas à sua estrutura (conteúdo mitocondrial, extensão do ânticulo sarcoplasmático, espessura da linha Z), teor de myosina ATPase e composição da cadeia pesada de miosina26,27,28,29.
Para os NMJs roedores, há diferenças significativas entre os músculos28,29. Análises morfométricas realizadas em soleus e EDL de ratos revelaram uma correlação positiva entre a área sináptica e o diâmetro da fibra (ou seja, a área sináptica em fibras lentas soleus é maior do que nas fibras rápidas EDL), mas a razão entre a área de NMJ e o tamanho da fibra é semelhante em ambos os músculos30,31. Além disso, em relação aos terminais nervosos, as áreas absolutas da placa endplate nas fibras tipo 1 foram menores do que nas fibras tipo 2, enquanto a normalização por diâmetro de fibras fez áreas de terminais nervosos nas fibras tipo 1 as maiores32.
No entanto, pouquíssimos estudos se concentram na análise morfométrica para mostrar as evidências de mudanças em alguns dos componentes do NMJ33,34. Assim, devido à relevância do NMJ na função do organismo, cuja morfologia e fisiologia são alteradas em diversas patologias, é importante otimizar protocolos de dissecção de diferentes tipos de músculos com qualidade suficiente para permitir a visualização de toda a estrutura do NMJ. Também é necessário avaliar a ocorrência de alterações pré ou pós-sinápticas em diferentes situações experimentais ou condições como envelhecimento ou exercício35,36,37,38. Além disso, pode ser útil evidenciar alterações mais sutis em componentes do NMJ, como a fosforilação de neurofilamento alterada nas terminações nervosas terminais terminais, conforme relatado na ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos animais foram realizados de acordo com as diretrizes da Lei Nacional nº 18.611 para cuidados com animais utilizados para fins experimentais. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional (CEUA IIBCE, Protocolo nº 004/09/2015).
1. Dissecção muscular (Dia 1)
NOTA: Antes de começar, faça 40 mL de paraformaldeído (PFA), pH 7,4 na solução salina fosfato de Dulbecco (DPBS). Opcionalmente, faça 20 mL de 4% pfa. Prepare 5 mL aliquots e congele a -20 °C. No dia da dissecção, descongele uma alíquota de 4% e adicione 35 mL de DPBS para obter 40 mL de 0,5% de PFA.
-
Isolamento do EDL (músculo de contração rápida)
- Eutanize um rato. Coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos do pé em direção ao membro traseiro.
NOTA: Neste caso, uma injeção intraperitoneal de 90:10 mg/Kg de cetamina:xilazina foi dada para eutanásia do rato, mas outras opções de anestesia também são permitidas. - Retire a pele, puxando-a para cima até que o joelho do rato seja exposto.
- Para encontrar o EDL, siga os tendões do pé até o ligamento anular. Este ligamento circunda dois tendões. Corte o ligamento entre os dois tendões com tesoura uniband (ou similar). Identifique o tendão edl levantando ambos e escolha o que faz os dedos se moverem para cima.
- Corte o tendão com uma tesoura uniband. Em seguida, mantendo o tendão com pinças biológicas finas, comece a separar lentamente o músculo EDL da tíbia anterior, do peroneus brevis e peroneus longus40 (ver Figura 1A).
NOTA: Certifique-se de que o músculo está separado sem qualquer dano. Faça isso cortando o resto dos músculos laterais para abrir um caminho entre eles (o EDL não tem uma localização superficial) enquanto segura e levanta o músculo EDL. - Para isolar completamente o músculo, corte o tendão preso ao joelho do rato com uma tesoura uniband.
- Mergulhe o músculo dissecado em 5 mL de 0,5% PFA e deixe por 24h a 4 °C. Opcionalmente, grampeie o músculo em um pedaço de papelão e gire-o com o músculo virado para baixo. Em seguida, mergulhe-o completamente em 8 mL da solução fixativa. Esta etapa ajuda na manutenção do músculo alongado durante o processo de fixação.
- Eutanize um rato. Coloque o animal com o abdômen voltado para cima. Faça uma incisão inicial usando uma lâmina cirúrgica entre os dedos dos dedos do pé em direção ao membro traseiro.
-
Isolamento do soleus (músculo de contração lenta)
- Vire o animal (o abdômen está agora voltado para baixo). Através da pele, corte o tendão calcâneo usando uma lâmina cirúrgica.
- Com a ajuda da pinça biológica e da tesoura uniband, separe o músculo gastrocnemius dos ossos, criando uma "tampa muscular". O soleus estará no lado interno da tampa muscular. Pode ser identificado porque é de cor vermelha e tem uma morfologia plana.
- Com um par de pinças biológicas, alcance e levante o tendão do soleus que fica acima do gastrocnemius (ver Figura 1B).
- Corte o tendão com uma tesoura uniband. Levante todo o músculo enquanto corta alguns dos pontos de apego fracos (ou seja, elementos neurovasculares). Por fim, para libertar completamente o músculo soleus, corte o soleus fascicle que forma o tendão calcâneo com tesoura uniband.
- Repita o passo 1.1.6 para fixar o músculo s soleus dissecado.
2. Preparação de fibras provocadas (dia 2)
- Após 24 horas de fixação, enxágue os músculos com 6 mL de solução DPBS 3x por 10 minutos cada antes de isolar as fibras musculares.
- Para isolar as fibras, coloque um músculo em um slide de microscópio. Usando um estereótipo, segure suavemente um dos tendões com um par de pinças biológicas. Em seguida, com as outras pinças biológicas, comece a beliscar o tendão lentamente para separar as fibras musculares. Depois disso, puxe lentamente o tecido apertado para cima em direção ao tendão muscular oposto. Será necessário repetir esta ação várias vezes até obter vários pequenos pacotes isolados.
- Coloque-os cuidadosamente em um slide pré-tratado (silanizado). É necessário manter todas as fibras em ordem para que elas não se sobreponham. Neste ponto, seque as fibras por 24 h.
3. Imunofluorescência
-
Incubação primária de anticorpos (Dia 3)
NOTA: Todas as etapas foram realizadas em temperatura ambiente, exceto se indicado de outra forma. A maneira mais eficiente de remover as diferentes soluções sem separar fibras do slide é usar uma seringa de insulina.- Para iniciar o processo de imunossuagem, cerque as fibras musculares isoladas secas com uma caneta pap para criar uma barreira impermeável.
- Para hidratar as fibras musculares, adicione 200 μL de água destilada por 5 minutos e, em seguida, troque a água para 200 μL de DPBS para a próxima incubação de 5 minutos. Neste ponto, inicie a rotulagem de imunofluorescência.
- Incubar fibras com 300 μL de um tampão de bloqueio (BB) contendo 50 mM de glicato, 1% BSA e 1% Triton X-100 por 30 min.
- Substitua o BB pelo anticorpo primário em uma concentração sugerida pelos fabricantes. Use o BB para diluir o anticorpo. Este experimento utilizou 400 μL de SMI 32 ou SMI 31 que reconheceram o neurofilamento não fosforilado (NF) ou fosforilado (Phos-Nf) em diluição de 1/800 para detectar o componente pressináptico NMJ.
NOTA: Ao decidir reconhecer todo o elemento pré-sináptico em vez de avaliar a fosforilação neurofilamental, escolha anticorpos contra sinapsina, sinaptofisina ou SV2a que foram previamente empregados. - Incubar as fibras com a diluição do anticorpo primário a 4 °C durante a noite (opcionalmente, a incubação pode ser realizada a 37 °C por 1 h). Em ambos os casos, será importante realizar a incubação utilizando uma câmara úmida.
-
Imunofluorescência: Incubação de anticorpos secundários (Dia 4)
- Remova o anticorpo primário e enxágue as fibras 3x por 10 minutos cada uma com 500 μL de DPBS e a última vez com BB.
- Remova esta última lavagem e adicione o anticorpo secundário rotulado fluorescente diluído em BB. Para este experimento, foi utilizado 500 μL de anti-rato de cabra Alexa Fluor 488 a 1/1000 diluição em BB. Para ver o elemento postsinápico dos NMJs, 1:300 α-Bungarotoxina (Btx) conjugado biotin-XX foi adicionado à diluição de anticorpos secundários.
NOTA: A adição de Btx-biotin XX permite melhores imagens de sinal a ruído uma vez detectadas com streptavidin que amplifica o sinal. Além disso, a conjugação de streptavidin a diferentes fluoroforos aumentou as combinações de cores em ensaios de co-rotulagem. Alternativamente, o Btx fluorescentemente rotulado permite obter imagens de qualidade semelhante. - Incubar o anticorpo secundário e o Btx por 2h em temperatura ambiente ou 1h a 37 °C protegido da luz.
- Remova o anticorpo secundário e o Btx. Wash 3x por 10 min cada com 500 μL de DPBS e o último enxágue com BB.
- Incubar com 500 μL de Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 diluição com BB por 1h em temperatura ambiente. Neste ponto, se desejar, adicione uma sonda para contra-conter os núcleos, como diaminofenilimale em uma concentração final de 1 μg/mL.
- Remova a solução de incubação e lave fibras 3x por 10 minutos cada com 500 μL de DPBS. Então, monte as fibras.
-
Montagem
- Coloque 4 pontos de esmalte transparente no slide do microscópio como se fossem os vértices de um quadrado. Deixe-os secar 1-2 min. Estes serão os pontos onde as tampas descansarão, ajudando a evitar o esmagamento de tecidos.
- Remova a última lavagem DPBS e adicione mídia de montagem suficiente (~ 200 μL) para cobrir as fibras; evite a secagem.
NOTA: Para preparar 10 mL da mistura de mídia de montagem, use Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerol em um 4:1 (v:v). - Use uma ponta de pipeta de 200 μL para espalhar cuidadosamente a mídia de montagem sobre as fibras para garantir uma imersão completa de todas elas. Antes de colocar o vidro de cobertura, remova as bolhas de ar.
- Coloque a mancha nas amostras tentando evitar a geração de bolhas de ar. Esse movimento pode ser feito com a ajuda de fórceps.
4. Microscopia e análise morfométrica
- Imagem os preparos de fibra provocado usando microscopia confocal a laser.
- Pegue uma série de seções ópticas (pilhas Z de 30 μm) em toda a sinapse usando um intervalo de um micrômetro. Para definir a pilha, use o sinal Btx. Imagem mínima de 15-20 NMJs para cada condição muscular com uma resolução 2048 px x 2048 px. Este método foi escolhido para obter imagens com qualidade óptica e resolução suficientes para a análise morfométrica.
- Para realizar as medições, use as imagens de projeção de pilhas com qualquer software de análise.
NOTA: Embora a análise morfométrica explicada tenha sido feita manualmente, existem duas ferramentas recém-desenvolvidas baseadas em Imagem J para estudar muitos aspectos diferentes da morfologia NMJ pré e postinástica33,34. - Para obter os valores totais da área do NMJ, selecione a borda externa (contorno externo da área manchada, consulte a Figura 2) da placa final usando a ferramenta de laço Magnético Photoshop e determine o número de pixels selecionados na janela Histograma. Em seguida, as áreas de pixel podem ser convertidas em micrômetros quadrados usando a escala especificada pelo software confocal.
- Com a mesma ferramenta de laço, selecione a borda interna (contornos da área manchada dentro da placa final, consulte a Figura 2) e determine a área não manchada em toda a estrutura (ou área vazia) conforme detalhado acima (passo 4.4.). Os valores da Área Pós-Sináptica serão obtidos após subtrair a área total da área vazia de cada NMJ.
- Obtenha a Área Pré-Sináptica, que é definida como a área com imunofluorescência anti-neurofilamento, de forma semelhante à área total do NMJ.
NOTA: Todos esses parâmetros foram utilizados para determinar o índice de densidade pós-sináptica (Área Pós-Sináptica/Área Total) e a Cobertura NMJ (Área Pré-Sináptica/Área Pós-Sináptica). Um índice de densidade pós-sináptica mais alto implica uma placa final mais densa ou mais compacta, enquanto uma cobertura NMJ menor reflete uma interação muito pior entre terminal nervoso e placa final (ambas compatíveis com um processo de denervação). No caso aqui mostrado, uma vez que foram detectadas formas fosfoiladas e não fosfoiladas de neurofilamentos no nível terminal nervoso, calculou-se a razão de sinal presintolético fosfoilado/não fosfoilado e a razão de cobertura fosfoilada/não fosfoilada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Este protocolo oferece um método simples para isolar e imunostain fibras musculares de dois tipos diferentes de músculos (músculos de contração rápida e lenta, ver Figura 1). Utilizando os marcadores e/ou sondas corretos, os componentes do NMJ podem ser detectados e avaliados, uma vez que um ponto de vista quantitativo para avaliar algumas das alterações morfológicas que podem ocorrer como consequência da progressão da doença ou de um tratamento medicamentoso específico. No presente estudo, os componentes pré-sinápticos e pós-sinápticos do NMJ foram rotulados fluorescentemente utilizando anticorpos anti-NF ou anti-Phos-Nf e Btxrespectivamente (Figura 2, painéis superiores). Cada imagem confocal de alta resolução de um NMJ obtida após a imunossuagem foi usada para determinar as medidas e índices morfométricos especificados na seção Protocolo (Tabela 1) aplicando os parâmetros descritos nos painéis inferiores da Figura 2.
Para demonstrar que essa preparação de NMJ de montagem inteira manteve perfeitamente a arquitetura sinapse, permitindo a visualização do efeito que tem uma doença progressiva do sistema nervoso sobre ele, as fibras provocadas de ratos transgênicos que expressam o gene humano SOD1G93A (um modelo de ELA) foram imunoss detidas usando o protocolo(Figura 3). As imagens mescladas de sinais pré e pós-sinápticos com os núcleos manchados com DAPI mostraram que as diferenças entre os NMJs entre animais transgênicos e não transgênicos compatíveis com a idade são claramente visíveis e compatíveis com os resultados esperados pela literatura.
Além disso, a qualidade das imagens possibilitou quantificar as alterações observadas com a realização da análise morfométrica. Por exemplo, a Figura 4 mostra evidências de que o sinal pós-sináptico em animais transgênicos parece ser mais compacto (aproximadamente 20%), principalmente devido à redução da área total do NMJ.
Por outro lado, a Figura 5 mostra que a área pré-sináptica dos NMJs em animais transgênicos também é reduzida. A qualidade dessa preparação de NMJ de todo o monte foi evidenciada pela análise da extensão da retração do terminal nervoso e pela detecção de alterações relativas aos estados de fosforilação neurofilado. Este fato será importante para obter uma visão profunda do processo de desmontagem do NMJ relacionado à doença de ELA no modelo empregado. A menor área pré-sináptica detectada foi aquela rotulada com neurofilamento antifosforilato(Figura 5B, E, C, F).
O uso do índice de cobertura (Figura 6) possibilitou estabelecer que os NMJs transgênicos foram parcialmente desinervados. Além disso, poderia determinar que os índices de cobertura do neurofilamento fosfoilado são inferiores aos obtidos com neurofilamento não fosforilato. Esses resultados mostram o status do NMJ de todo o monte e que poderia ser útil introduzir o estudo do estado de fosforilação neurofilament (um importante determinante da plasticidade e estabilidade do filamento) usando esta preparação de NMJ de todo o monte.
Por fim, os métodos apresentados neste trabalho oferecem a maior qualidade de NMJ para identificar, avaliar e avaliar até mesmo mudanças sutis no NMJ como um todo ou em um de seus componentes.
Figura 1: EDL e soleus marcos anatômicos. Destaque da imagem (A) Localização do soleus EDL e (B)entre os outros músculos do membro traseiro inferior do rato. Insets mostram esquemas dos músculos do membro traseiro próximos aos músculos EDL (vermelho) e soleus (verde). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Junção neuromuscular de montagem total de fibras musculares EDL. (A) Componente pós-sináptico do NMJ detectado usando alfa-bungarotoxina (Btx, magenta), uma sonda que se liga especificamente aos receptores de acetilcolina (AChR). (B) Terminal motor detectado utilizando antifilamentos (anti-Nf, verde). (C,D) Os componentes sinápticos são esquematizados para ilustrar os parâmetros (bordas externas e internas) que definiram as medidas (Área Total, Área Pré-Sináptica e Área Não Sináptica) utilizadas para a análise morfométrica detalhada no protocolo. Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Alterações pré e postiáticas observadas em NMJs de um modelo de ELA. Imagens confocal representativas obtidas de NMJs de montagem inteira obtidas em preparações de fibras musculares EDL manchadas para detectar neurofilamentos (verdes), AChR (magenta) e núcleo (azul) de ratos não transgênicos (-/-) ou transgênicos (hSOD1G93A/-) ratos. (A,C) Ratos não transgênicos têm morfologia NMJ normal (forma de pretzel) tanto quando a extremidade do motor é visualizada usando anti-Phos-Nf (A) ou anti-Nf(C). (B,D) Ratos transgênicos apresentam área pós-sináptica mais compacta e terminais pré-sinápticos menores com redução do sinal de fosforilação neurofilament. Barra de escala = 50 μm.
Figura 4: Avaliação morfométrica do elemento nmj postynaptic em músculos EDL a partir de 180 dias de idade ratos hSOD1G93A de idade. Imagens confocal representativas de componentes postsinápticos em animais transgênicos(A,D)não transgênicos e(B,E). Avaliação da área postsináptica(C)e (F) índice de densidade anti-sináptica em NMJs de animais não transgênicos (colunas sólidas) e transgênicos (colunas listradas). Enquanto a área pós-sináptica foi ligeiramente reduzida em animais transgênicos, o índice pós-sináptico aumentou em maior proporção destacando o grau de compactação do NMJ, conforme indicado pela redução da área total em animais transgênicos, conforme mostrado na Tabela 1. Barra de escala = 50 μm. Os dados representados são ± SEM. (*) e (***) indicados p<0,05 e p<0.001, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Avaliação morfométrica do elemento pré-sináptico NMJ nos músculos EDL a partir de ratos de 180 dias de idade machos hSOD1G93A. Dada a importância da desmontagem do NMJ na doença de ELA, a qualidade da preparação foi avaliada por meio da análise, não apenas da extensão da retração do terminal nervoso, mas também da possibilidade de detectar alterações na fosforilação do elemento pressinápico do NMJ. Imagens confocal representativas do componente pré-sináptico em(A,D) animais transgênicos e(B,E)detectados usando(A,B) anti-Phos-Nf ou (D,E) anticorpos anti-Nf. Avaliação da Área Pré-Sináptica delimitada por (C) fosforilados e (F) neurofilamentos não fosforilalatados em NMJs de animais não transgênicos (colunas sólidas) e transgênicos (colunas listradas). Observe que essas áreas são muito semelhantes em animais não transgênicos, enquanto apresentam uma redução significativa nos NMJs de animais transgênicos. Barra de escala = 50 μm. Os dados representados são ± SEM. (****) indicado p<0.0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Avaliação do estado de inervação em NMJs de montagem inteira das fibras EDL hSOD1G93A. O índice de cobertura é amplamente utilizado para avaliar o estado de inervação. Considera-se que as NMJs "totalmente inervadas" apresentam um índice de cobertura 
de 50%, enquanto as "parcialmente inervadas" têm coberturas entre ≥ 20% e ≤50% e as desocupadas são consideradas "denervadas". Imagens confocal representativas de (A,D) NMJs transgênicos e(B,E)transgênicos mostrando elementos pré-sinápticos e postsinápticos detectados usando(A,B) anticorpos anti-Phos-Nf ou(D,E)anti-Nf para observar o terminal motor. Avaliação da cobertura utilizando(C)neurofilamentos não fosfoilados em NMJs de animais não transgênicos (colunas sólidas) e transgênicos (colunas listradas). As imagens e gráficos mostram evidências de que os NMJs de animais transgênicos apresentam um índice de cobertura menor do que os não transgênicos. Além disso, em animais transgênicos, os índices de cobertura de neurofilamentos fosfoilados são menores ( 18%) do que os obtidos quando a forma não fosforilada (25%) é detectada. Este fato é corroborado com a relação entre ambos os índices, conforme mostrado na Tabela 1. Note-se que a qualidade dos preparativos permite obter 50% do índice de cobertura estipulado para os NMJs esperados como "totalmente inervados". Barra de escala = 50 μm. Os dados representados são ± SEM. (***) e (****) indicados p<0.001 e p<0.0001, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Mesa 1. Parâmetros e razões morfométricas obtidas de NMJs de montagem integral de fibras EDL não transgênicas e transgênicas. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste artigo, apresentamos um protocolo detalhado para a dissecção de dois músculos esqueléticos de ratos (um contração lenta e outro de contração rápida), isolamento muscular de fibras e detecção de imunofluorescência de marcadores pré e pós-sinápticos para avaliar quantitativamente as alterações do NMJ, bem como processos de montagem/desmontagem. Esse tipo de protocolo pode ser útil nos modelos de roedores41,42 para avaliar nmj durante processos fisiológicos ou patológicos como exemplificado aqui em um modelo de degeneração do neurônio motor, como encontrado nos ratos ALS hSOD1G93A.
Para obter sucesso e resultados benéficos, é necessário ter em mente algumas dicas. Por exemplo, o protocolo descrito permite o uso imediato de músculos dissecados. No entanto, quando necessário para preservar o músculo, o uso de DPBS com 0,05% de azida de sódio mais 4 °C de armazenamento permite prolongar a excelente preservação muscular até 4 semanas. Ao utilizar esta opção, devem ser feitas lavagens extensivas com DPBS (5x, 10 min cada) antes de iniciar o processo de coloração. Outra opção útil para obter imagens de boa qualidade inclui a redução da concentração de PFA em 0,5% porque reduziu a autofluorescência muscular. Este deve ser acompanhado de fixação mais longa até 24 h a 4 °C.
Em relação ao isolamento das fibras, grupos menores de fibras produzem melhores qualidades de imunodetecção. As fibras secas em lâminas silanizadas devem ser utilizadas dentro de 2 a 3 dias. Após esse tempo, as imunodetecções não são de boa qualidade.
Uma alternativa às fibras secas em lâminas silanizadas é gerar um conjunto de fibras parcialmente isoladas que são mantidas juntas pelo tecido tendinoso em uma das fibras finais (um "tufo" de fibras musculares) e realizar incubações em tubos de microcentrifuge pelo método "free-floating". Utilizando esta opção é necessário aumentar o tempo de incubação de anticorpos em várias horas (24-48 h) bem como o número de lavagens (pelo menos 6 de 10 min cada).
Em relação ao isolamento da fibra sem danos, é necessário realizar a "provocação" removendo as extremidades onde o tendão é suavemente puxado em direções opostas para alcançar a separação da fibra.
Outro passo crítico para melhorar a imunodeseção é a adição de 1% Triton X-100 e 50 mM de glycina no BB. Isso é importante para obter preparações que tenham coloração homogênea e um pouco de fundo. Vale ressaltar também que ter um pouco de fundo pode ser benéfico quando fibras não manchadas precisam ser imagens. O diâmetro da fibra é bom para ser medido longe do campo NMJ, uma vez que é descrito que pode ser aumentado neste nível. Portanto, determine o diâmetro da fibra a uma distância igual ao valor de um perfil NMJ.
Utilizando o procedimento apresentado é possível identificar e quantificar componentes do NMJ em condições fisiológicas. Também permite estudar eventos patológicos importantes precoces como o desmantelamento do NMJ24 e a perda de neurofilamento fosforilato em terminações terminais39, conforme descrito na patogênese da ALS. Por essa razão, o protocolo descrito oferece uma abordagem alternativa e simples para ajudar a entender melhor a remodelação do NMJ, sugerindo que as características morfológicas visualizadas podem ser ferramentas úteis para diagnosticar o estado degenerado dos NMJs ou para avaliar diferentes abordagens terapêuticas. Também é aplicável a outros modelos de doenças, como os de Charcot-Marie-Tooth41 e atrofia muscularespinhal 42 que apresentam interrupção do NMJ.
Além disso, abordagens descritas neste trabalho podem ser empregadas para identificar as células Schwann que integram essa sinapse tripartite e, eventualmente, avaliar alguns de seus papéis durante a remodelação doNMJ 43. Estudos podem ser feitos em recém-nascidos até adultos, em condições fisiológicas ou como resposta a diferentes tratamentos que impactam no sistema neuromuscular.
Finalmente, apesar do excelente manuseio necessário para dissecar e rotular amostras juntamente com o tempo consumido para fazer medições manuais, a metodologia aqui apresentada permite uma rotulagem ideal dos diferentes componentes NMJ devido à penetração facilitada de anticorpos e sondas. Embora uma melhor penetração possa ser obtida em preparações musculares seccionadas, a provocação preserva a integridade morfológica 3D de todos os componentes sinápticos que podem ser perdidos em seções musculares. Também evita toda a preparação necessária para fazer seções como a inclusão da peça muscular e a recuperação de antígenos para obter o reconhecimento viável. Além disso, quando comparada com preparações de montagem inteiras que preservam os padrões completos de inervação, a provocação permite o estudo de fibras isoladas. Isso pode ser uma vantagem significativa quando necessário para avaliar a heterogeneidade da fibra relatada em condições patológicas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Muito obrigado ao CSIC e ao PEDECIBA pelo apoio financeiro dado a este trabalho; para Natalia Rosano para suas correções manuscritos; para Marcelo Casacuberta que faz o vídeo e para Nicolás Bolatto por emprestar sua voz para ele.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
