Summary

Dissektion einzelner Skelettmuskelfasern für immunfluoreszierende und morphometrische Analysen von neuromuskulären Verbindungen am ganzen Berg

Published: August 14, 2021
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Summary

Die Fähigkeit, neuromuskuläre Verbindungskomponenten genau zu erkennen, ist entscheidend für die Bewertung von Modifikationen in ihrer Architektur aufgrund pathologischer oder Entwicklungsprozesse. Hier präsentieren wir eine vollständige Beschreibung einer einfachen Methode, um qualitativ hochwertige Bilder von neuromuskulären Verbindungen ganzer Mounts zu erhalten, die für quantitative Messungen verwendet werden können.

Abstract

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist ein spezialisierter Kontaktpunkt zwischen dem motorischen Nerv und der Skelettmuskulatur. Diese periphere Synapse weist eine hohe morphologische und funktionelle Plastizität auf. Bei zahlreichen Erkrankungen des Nervensystems ist NMJ ein frühes pathologisches Ziel, das zu Neurotransmissionsversagen, Schwäche, Atrophie und sogar zum Muskelfasertod führt. Aufgrund seiner Relevanz kann die Möglichkeit, bestimmte Aspekte der Beziehung zwischen NMJ-Komponenten quantitativ zu bewerten, dazu beitragen, die mit ihrer Montage / Demontage verbundenen Prozesse zu verstehen. Das erste Hindernis bei der Arbeit mit Muskeln besteht darin, das technische Know-how zu erwerben, um ihre Fasern schnell zu identifizieren und zu sezieren, ohne sie zu beschädigen. Die zweite Herausforderung besteht darin, qualitativ hochwertige Nachweismethoden zu verwenden, um NMJ-Bilder zu erhalten, die für quantitative Analysen verwendet werden können. Dieser Artikel stellt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zum Sezieren von Extensor digitorum longus und Soleusmuskeln von Ratten vor. Es erklärt auch die Verwendung von Immunfluoreszenz zur Visualisierung prä- und postsynaptischer Elemente von Ganz-Mount-NMJs. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass diese Technik verwendet werden kann, um die mikroskopische Anatomie der Synapse zu bestimmen und subtile Veränderungen im Status einiger ihrer Komponenten unter physiologischen oder pathologischen Bedingungen zu identifizieren.

Introduction

Die neuromuskuläre Säugetierverbindung (NMJ) ist eine große cholinerge dreigliedrige Synapse, die aus dem Nervenende des Motoneurons, der postsynaptischen Membran auf der Skelettmuskelfaser und den terminalen Schwannzellen1,2,3besteht. Diese Synapse weist eine hohe morphologische und funktionellePlastizität auf 4,5,6,7,8, auch im Erwachsenenalter, wenn NMJs dynamische strukturelle Veränderungen erfahren können. So haben einige Forscher gezeigt, dass motorische Nervenenden im Mikrometermaßstab9kontinuierlich ihre Form verändern. Es wurde auch berichtet, dass die Morphologie des NMJ auf funktionelle Anforderungen, veränderte Verwendung, Alterung, Bewegung oder Variationen der Bewegungsaktivität reagiert4,10,11,12,13,14,15. So stellen Training und mangelnde Verwendung einen wesentlichen Anreiz dar, um einige Eigenschaften des NMJ zu modifizieren, wie seine Größe, Länge, Dispersion von synaptischen Vesikeln und Rezeptoren sowie Nerventerminalverzweigungen14,16,17,18,19,20.

Darüber hinaus wurde gezeigt, dass jede strukturelle Veränderung oder Degeneration dieser lebenswichtigen Verbindung zum Tod von Motoneuronzellen und Muskelatrophie führen kann21. Es wird auch angenommen, dass eine veränderte Kommunikation zwischen Nerven und Muskeln für die physiologischen altersbedingten NMJ-Veränderungen und möglicherweise für ihre Zerstörung in pathologischen Zuständen verantwortlich sein könnte. Der Abbau neuromuskulärer Verbindungen spielt eine entscheidende Rolle beim Auftreten der Amyotrophen Lateralsklerose (ALS), einer neurodegenerativen Erkrankung, die eines der besten Beispiele für ein gestörtes Muskel-Nerven-Zusammenspiel darstellt3. Trotz der zahlreichen Studien, die zur Dysfunktion von Motoneuronen durchgeführt wurden, wird immer noch diskutiert, ob die bei ALS beobachtete Verschlechterung aufgrund der direkten Schädigung des Motoneurons auftritt und sich dann auf die kortiko-spinalen Projektionen erstreckt22; oder wenn es als distale Axonopathie betrachtet werden sollte, bei der die Degeneration in den Nervenenden beginnt und in Richtung des Motoneurons Somas23,24fortschreitet. Angesichts der Komplexität der ALS-Pathologie ist es logisch zu berücksichtigen, dass eine Mischung unabhängiger Prozesse auftritt. Da NMJ der zentrale Akteur des physiopathologischen Zusammenspiels zwischen Muskel und Nerv ist, stellt seine Destabilisierung einen dreh- und angelpunktlichen Entstehungspunkt der zu analysierenden Erkrankung dar.

Das neuromuskuläre System von Säugetieren ist funktionell in diskrete motorische Einheiten organisiert, die aus einem Motoneuron und den Muskelfasern bestehen, die ausschließlich von seinem Nerventerminal innerviert werden. Jede Motoreinheit hat Fasern mit ähnlichen oder identischen strukturellen und funktionalen Eigenschaften25. Die selektive Rekrutierung von Motoneuronen ermöglicht die Optimierung der Muskelreaktion auf funktionelle Anforderungen. Jetzt ist klar, dass die Skelettmuskulatur von Säugetieren aus vier verschiedenen Fasertypen besteht. Einige Muskeln werden nach den Eigenschaften ihres häufigsten Fasertyps benannt. Zum Beispiel trägt der Soleus (ein hinterer Muskel der Hintergliedmaße, der an der Aufrechterhaltung der Körperhaltung beteiligt ist) einen Großteil der langsam zuckenden Einheiten (Typ 1) und wird als langsamer Muskel erkannt. Stattdessen besteht Extensor digitorum longus (EDL) im Wesentlichen aus Einheiten mit ähnlichen schnell zuckenden Eigenschaften (Typ 2-Fasern) und ist als schneller Muskel bekannt, der auf phasische Bewegungen spezialisiert ist, die für die Fortbewegung benötigt werden. Mit anderen Worten, obwohl erwachsene Muskeln aufgrund der hormonellen und neuronalen Einflüsse plastischer Natur sind, bestimmt ihre Faserzusammensetzung die Fähigkeit, verschiedene Aktivitäten auszuführen, wie bei Soleus, der kontinuierliche Aktivität mit geringer Intensität erfährt, und EDL, die ein schnelleres einzelnes Zucken aufweist. Andere Merkmale, die zwischen verschiedenen Arten von Muskelfasern variabel sind, hängen mit ihrer Struktur zusammen (mitochondrialer Gehalt, Erweiterung des sarkoplasmatischen Retikulums, Dicke der Z-Linie), Myosin-ATPase-Gehalt und Myosin-Schwerkettenzusammensetzung26,27,28,29.

Bei Nagetier-NMJs gibt es signifikante Unterschiede zwischen den Muskeln28,29. Morphometrische Analysen, die an Soleus und EDL von Ratten durchgeführt wurden, zeigten eine positive Korrelation zwischen der synaptischen Fläche und dem Faserdurchmesser (dh der synaptische Bereich in soleus langsamen Fasern ist größer als in EDL schnellen Fasern), aber das Verhältnis zwischen NMJ-Fläche und Fasergröße ist in beiden Muskeln ähnlich30,31. Auch in Bezug auf die Nerventerminals waren die absoluten Endplattenbereiche in Typ-1-Fasern niedriger als in Typ-2-Fasern, während die Normalisierung durch Faserdurchmesser Bereiche von Nerventerminals in Typ-1-Fasern zu den größten32machte.

Nur sehr wenige Studien konzentrieren sich jedoch auf morphometrische Analysen, um den Nachweis von Veränderungen in einigen der NMJ-Komponenten33,34zu zeigen. Aufgrund der Relevanz des NMJ für die Funktion des Organismus, dessen Morphologie und Physiologie in verschiedenen Pathologien verändert sind, ist es daher wichtig, die Dissektionsprotokolle verschiedener Muskeltypen mit ausreichender Qualität zu optimieren, um die Visualisierung der gesamten NMJ-Struktur zu ermöglichen. Es ist auch notwendig, das Auftreten von prä- oder postsynaptischen Veränderungen in verschiedenen experimentellen Situationen oder Bedingungen wie Alterung oder Übung zu bewerten35,36,37,38. Darüber hinaus kann es hilfreich sein, subtilere Veränderungen in NMJ-Komponenten wie eine veränderte Neurofilament-Phosphorylierung in den terminalen Nervenenden nachzuweisen, wie in ALS39berichtet.

Protocol

Alle Tierversuche wurden gemäß den Richtlinien des nationalen Gesetzes Nr. 18611 für die Pflege von Tieren, die für Versuchszwecke verwendet werden, durchgeführt. Das Protokoll wurde von der Institutionellen Ethikkommission genehmigt (CEUA IIBCE, Protokollnummer 004/09/2015). 1. Muskeldissektion (Tag 1) HINWEIS: Bevor Sie beginnen, machen Sie 40 ml 0,5% Paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 in Dulbeccos Phosphatsalzlösung (DPBS). Optional machen Sie 20 ml 4% PFA. 5 ml A…

Representative Results

Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um Muskelfasern aus zwei verschiedenen Arten von Muskeln (schnell und langsam zuckende Muskeln, siehe Abbildung 1)zu isolieren und zu immunanimieren. Mit den richtigen Markern und / oder Sonden können NMJ-Komponenten aus quantitativer Sicht detektiert und bewertet werden, um einige der morphologischen Veränderungen zu beurteilen, die als Folge eines Krankheitsverlaufs oder einer spezifischen medikamentösen Behandlung auftreten können. In der…

Discussion

In diesem Artikel stellen wir ein detailliertes Protokoll für die Dissektion von zwei Rattenskeletten (eine langsame Zuckung und die andere schnell zucken), die Fasermuskelisolation und die Immunfluoreszenzdetektion von prä- und postsynaptischen Markern vor, um NMJ-Veränderungen sowie Montage- / Demontageprozesse quantitativ zu bewerten. Diese Art von Protokoll kann in den Nagetiermodellen41,42 nützlichsein,um NMJ während physiologischer oder pathologischer …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vielen Dank an CSIC und PEDECIBA für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit; an Natalia Rosano für ihre Manuskriptkorrekturen; an Marcelo Casacuberta, der das Video macht, und an Nicolás Bolatto, der ihm seine Stimme ge lieh.

Materials

Stereomicroscope with cool light illumination Nikon SMZ-10A
Rocking platform Biometra (WT 16) 042-500
Cover glasses (24 x 32 mm) Deltalab D102432
Premium (Plus) microscope slides PORLAB PC-201-16
Tweezers F.S.T 11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm E.M.S 77910-26
Disponsable surgical blades #10 Sakira Medical 1567
Disponsable sterile syringe (1 ml) Sakira Medical 1569
Super PAP pen E.M.S 71310
100 μl or 200 μl pipette Finnpipette 9400130
Confocal microscope Zeiss LSM 800 – AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats Taconic 2148-M
1X PBS (Dulbecco) Gibco 21600-010
Paraformaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 Sigma T8787
Glycine Amresco 167
BSA Bio Basic INC. 9048-46-8
Glycerol Mallinckrodt 5092
Tris Amresco 497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody BioLegend 801601 Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody BioLegend 801701 Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) Thermo Scientific A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate Invitrogen B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen S32355
Diaminophenylindole (DAPI) Sigma D8417

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Cite This Article
Bolatto, C., Olivera-Bravo, S., Cerri, S. Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (174), e62620, doi:10.3791/62620 (2021).

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