Summary
تعد القدرة على الكشف بدقة عن مكونات التقاطع العصبي العضلي أمرا حاسما في تقييم التعديلات في هندسته المعمارية بسبب العمليات المرضية أو التنموية. هنا نقدم وصفا كاملا لطريقة مباشرة للحصول على صور عالية الجودة من تقاطعات الأعصاب العضلية جبل كامل التي يمكن استخدامها لأداء القياسات الكمية.
Abstract
التقاطع العصبي العضلي (NMJ) هو نقطة اتصال متخصصة بين العصب الحركي والعضلات الهيكلية. هذا المشبك الطرفية معارض عالية اللدونة مورفولوجية ووظيفية. في العديد من اضطرابات الجهاز العصبي ، NMJ هو هدف مرضي مبكر يؤدي إلى فشل التضمين العصبي والضعف والضمور وحتى في موت ألياف العضلات. ونظرا لأهميتها، فإن إمكانية تقييم جوانب معينة من العلاقة بين مكونات NMJ من الناحية الكمية يمكن أن تساعد على فهم العمليات المرتبطة بتجميعها/تفكيكها. العقبة الأولى عند العمل مع العضلات هو الحصول على الخبرة التقنية لتحديد وتشريح بسرعة دون الإضرار أليافها. ويتمثل التحدي الثاني في استخدام أساليب كشف عالية الجودة للحصول على صور NMJ التي يمكن استخدامها لإجراء تحليل كمي. تقدم هذه المقالة بروتوكول خطوة بخطوة لتشريح العضلات الرقمية الملحقة وعضلات سولوس من الفئران. كما أنه يفسر استخدام immunofluorescence لتصور العناصر قبل وبعد متشابك من NMJs جبل كامل. النتائج التي تم الحصول عليها تثبت أن هذه التقنية يمكن استخدامها لتحديد التشريح المجهري للتشابك وتحديد التغيرات الطفيفة في حالة بعض مكوناته في ظل ظروف فسيولوجية أو مرضية.
Introduction
تقاطع الثدييات العصبية والعضلية (NMJ) هو المشبك الثلاثي الكوليني كبيرة تتكون من نهاية العصب العصبي الحركي, غشاء postynaptic على ألياف العضلات الهيكل العظمي, ومحطة خلايا شوان1,2,3. هذا المشبك معارض عالية اللدونة المورفولوجية والوظيفية4،5،6،7،8، حتى خلال مرحلة البلوغ عندما NMJs يمكن أن تخضع لتعديلات هيكلية ديناميكية. على سبيل المثال، أظهر بعض الباحثين أن النهايات العصبية الحركية تغير شكلها باستمرار على مقياس ميكرومتر9. كما أفيد أن مورفولوجيا NMJ يستجيب لمتطلبات وظيفية، تغيير الاستخدام، والشيخوخة، وممارسة، أو الاختلافات في النشاط الحركي4،10،11،12،13،14،15. وهكذا، فإن التدريب وعدم الاستخدام يمثلان حافزا أساسيا لتعديل بعض خصائص NMJ، مثل حجمها وطولها وتشتت الحويصلات المتشابكة والمستقبلات، وكذلك محطةالأعصاب المتفرعة14و16و17و18و19و20.
وعلاوة على ذلك، فقد ثبت أن أي تغيير هيكلي أو انحطاط هذا التقاطع الحيوي يمكن أن يؤدي إلى موت الخلايا العصبية الحركية وضمور العضلات21. ويعتقد أيضا أن تغيير الاتصال بين الأعصاب والعضلات يمكن أن تكون مسؤولة عن التغيرات الفسيولوجية NMJ المرتبطة بالعمر وربما لتدميرها في الحالات المرضية. التفكيك تقاطع العصبية والعضلية يلعب دورا حاسما في بداية التصلب الجانبي الضموري (ALS), مرض تنكسي عصبي يشكل واحدا من أفضل الأمثلة على ضعف التفاعل بين العضلات والأعصاب3. على الرغم من العديد من الدراسات التي أجريت على خلل الخلايا العصبية الحركية, لا يزال موضع نقاش ما إذا كان التدهور لوحظ في ALS يحدث بسبب الضرر المباشر في الخلايا العصبية الحركية ومن ثم يمتد إلى توقعات القشرية الشوكي22; أو إذا كان ينبغي أن يعتبر اعتلال الاكسونوتاتي البعيدة حيث يبدأ الانحطاط في النهايات العصبية ويتقدم نحو الخلايا العصبية الحركية سوماس23,24. نظرا لتعقيد أمراض ALS ، فمن المنطقي النظر في حدوث مزيج من العمليات المستقلة. وبما أن NMJ هو اللاعب المركزي للتفاعل الفيزيولوجي بين العضلات والأعصاب ، فإن زعزعة استقراره تمثل نقطة محورية في أصل المرض الذي هو ذات صلة ليتم تحليلها.
يتم تنظيم نظام الثدييات العصبي العضلي وظيفيا في وحدات حركية منفصلة ، تتكون من خلية عصبية محركية وألياف العضلات التي يتم تنشيطها حصريا من خلال محطتها العصبية. كل وحدة المحرك والألياف مع خصائص هيكلية مماثلة أو متطابقةوظيفية 25. الخلايا العصبية الحركية التوظيف الانتقائي يسمح تحسين استجابة العضلات لمطالب وظيفية. الآن من الواضح أن عضلات الهيكل العظمي الثديية تتكون من أربعة أنواع مختلفة من الألياف. يتم تسمية بعض العضلات وفقا لخصائص نوع الألياف الأكثر وفرة. على سبيل المثال، السولوس (عضلة خلفية للطرف الخلفي المشاركة في الحفاظ على وضع الجسم) يحمل غالبية وحدات الارتعاش البطيء (النوع 1) ومعترف به كعضلات بطيئة. بدلا من ذلك، يتكون الطول الرقمي المموه (EDL) بشكل أساسي من وحدات ذات خصائص ارتعاش سريع مماثلة (ألياف من النوع 2) ويعرف باسم عضلة سريعة متخصصة في الحركات التدريجية اللازمة للحركة. وبعبارة أخرى، على الرغم من أن عضلات البالغين هي من البلاستيك في الطبيعة بسبب التأثيرات الهرمونية والعصبية، وتكوين الألياف يحدد القدرة على أداء أنشطة مختلفة، كما رأينا في الوحيد الذي يواجه النشاط المستمر منخفضة الكثافة وEDL الذي يظهر ارتعاش واحد أكثر سرعة. ترتبط الميزات الأخرى التي هي متغيرة بين أنواع مختلفة من ألياف العضلات لهيكلها (محتوى الميتوكوندريا، وتمديد reticulum الساركوبلازمي، سمك خط Z)، محتوى MYOSIN ATPase، وتكوين سلسلة ثقيلة myosin26،27،28،29.
بالنسبة للقوارض NMJs ، هناك اختلافات كبيرة بين العضلات28،29. كشفت التحليلات المورفومترية التي أجريت في سولوس وEDL من الفئران عن وجود علاقة إيجابية بين منطقة متشابك وقطر الألياف (أي أن منطقة متشابك في الألياف البطيئة الوحيدة أكبر مما كانت عليه في ألياف EDL السريعة) ولكن النسبة بين منطقة NMJ وحجم الألياف متشابهة في كلتا العضلتين30و31. أيضا، فيما يتعلق المحطات العصبية، كانت المناطق المطلقة endplate في ألياف النوع 1 أقل مما كانت عليه في ألياف النوع 2، في حين أن تطبيع قطر الألياف جعل مناطق من المحطات العصبية في نوع 1 الألياف أكبر32.
ومع ذلك، تركز دراسات قليلة جدا على التحليل المورفومتري لإظهار الأدلة على التغيرات في بعض مكونات NMJ33،34. وبالتالي ، نظرا لأهمية NMJ في وظيفة الكائن الحي ، الذي يتم تغيير مورفولوجيا وعلم وظائف الأعضاء في أمراض مختلفة ، من المهم تحسين بروتوكولات التشريح لأنواع مختلفة من العضلات بجودة كافية للسماح بتصور هيكل NMJ بأكمله. ومن الضروري أيضا لتقييم حدوث تغييرات قبل أو postynaptic في حالات تجريبية مختلفة أو ظروف مثل الشيخوخة أوممارسة 35،36،37،38. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون من المفيد أن الأدلة على تعديلات أكثر دهاء في مكونات NMJ مثل الفوسفور العصبي المتغيرة في النهايات العصبية الطرفية كما ورد في ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للمبادئ التوجيهية للقانون الوطني رقم 18611 لرعاية الحيوانات المستخدمة لأغراض تجريبية. تمت الموافقة على البروتوكول من قبل اللجنة الأخلاقية المؤسسية (CEUA IIBCE، البروتوكول رقم 004/09/2015).
1. تشريح العضلات (اليوم 1)
ملاحظة: قبل البدء، قم بإجراء 40 مل من 0.5٪ بارافورمالديهايد (PFA)، درجة الحموضة 7.4 في ملحي الفوسفات في دولبيكو (DPBS). اختياريا، وجعل 20 مل من PFA 4٪. إعداد 5 مل aliquots وتجميد في -20 درجة مئوية. في يوم تشريح، تذويب a 4٪ aliquot وإضافة 35 مل من DPBS للحصول على 40 مل من 0.5٪ PFA.
-
عزل EDL (العضلات سريعة الارتعاش)
- قتل فأر ضع الحيوان مع البطن التي تواجه صعودا. إجراء شق أولي باستخدام شفرة جراحية بين أصابع الساقين نحو الطرف الخلفي.
ملاحظة: في هذه الحالة، حقن داخل الصفاق من 90:10 ملغم/ كغ كيتامين: أعطيت xylazine للقتل الرحيم الجرذ، ولكن يسمح أيضا خيارات أخرى للتخدير. - قشر قبالة الجلد، وسحبه صعودا حتى يتم الكشف عن ركبة الفئران.
- للعثور على EDL، اتبع أوتار القدم حتى الرباط الحلقي. هذا الرباط يدور حول وترين. قطع الرباط بين الأوتار اثنين مع مقص uniband (أو ما شابه ذلك). تحديد وتر EDL عن طريق رفع كليهما واختيار واحد أن يجعل أصابع التحرك صعودا.
- قطع الوتر مع مقص أحادي النطاق. ثم، في حين عقد وتر مع ملاقط البيولوجية غرامة، تبدأ في فصل ببطء العضلات EDL من الأمامية الساق، وبريفيس peroneus، وبيرونيوس longus40 (انظر الشكل 1A).
ملاحظة: تأكد من فصل العضلات دون أي ضرر. القيام بذلك عن طريق قطع بقية العضلات الجانبية لفتح مسار بينهما (EDL ليس لديها موقع سطحي) في حين عقد ورفع العضلات EDL. - لعزل العضلات تماما، وقطع وتر تعلق على ركبة الفئران مع مقص uniband.
- تزج العضلات تشريح في 5 مل من 0.5٪ PFA وترك لمدة 24 ساعة في 4 درجة مئوية. اختياريا، تدبيس العضلات في قطعة من الورق المقوى وتحويلها مع العضلات التي تواجه أسفل. ثم تزج تماما في 8 مل من الحل المثبت. هذه الخطوة تساعد في الحفاظ على العضلات ممدود أثناء عملية التثبيت.
- قتل فأر ضع الحيوان مع البطن التي تواجه صعودا. إجراء شق أولي باستخدام شفرة جراحية بين أصابع الساقين نحو الطرف الخلفي.
-
عزل سوليوس (العضلات بطيئة الارتعاش)
- الوجه الحيوان (البطن تواجه الآن إلى أسفل). من خلال الجلد، وقطع وتر كالكانيكال باستخدام شفرة الجراحية.
- مع مساعدة من ملاقط البيولوجية ومقص uniband، فصل العضلات gastrocnemius من العظام، وخلق "غطاء العضلات". سوف يكون الوحيد على الجانب الداخلي من الغطاء العضلي. يمكن التعرف عليه لأنه أحمر اللون ويحتوي على مورفولوجيا مسطحة.
- مع زوج من الملاقط البيولوجية، والوصول إلى ورفع وتر الوحيد الذي يقع فوق gastrocnemius (انظر الشكل 1B).
- قطع الوتر مع مقص أحادي النطاق. رفع العضلات كلها مع قطع بعض نقاط التعلق ضعيفة (أي عناصر الأوعية الدموية العصبية). وأخيرا، لتحرير العضلات الوحيدة تماما، وقطع اللفافة الوحيدة التي تشكل وتر كالكانيال مع مقص uniband.
- كرر الخطوة 1.1.6 لإصلاح العضلات الوحيدة تشريح.
2. إعداد الألياف مثار (اليوم 2)
- بعد 24 ساعة من التثبيت، شطف العضلات مع 6 مل من حل DPBS 3x لمدة 10 دقيقة لكل منهما قبل عزل ألياف العضلات.
- لعزل الألياف، ضع عضلة على شريحة المجهر. باستخدام مجسم، عقد بلطف واحدة من الأوتار مع زوج واحد من الملاقط البيولوجية. ثم، مع ملاقط البيولوجية الأخرى، تبدأ قرصة وتر ببطء لفصل ألياف العضلات. بعد ذلك سحب ببطء الأنسجة مقروص صعودا نحو وتر العضلات المعاكس. سيكون من الضروري تكرار هذا الإجراء عدة مرات حتى الحصول على حزم صغيرة ومعزولة متعددة.
- وضعها بعناية على شريحة المعالجة مسبقا (silanized). فمن الضروري للحفاظ على جميع الألياف من أجل حتى لا تتداخل. عند هذه النقطة، الهواء الجاف الألياف لمدة 24 ساعة.
3. الفلورة المناعية
-
حضانة الأجسام المضادة الأولية (اليوم الثالث)
ملاحظة: تم تنفيذ كافة الخطوات في درجة حرارة الغرفة، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. الطريقة الأكثر فعالية لإزالة الحلول المختلفة دون فصل الألياف من الشريحة هي استخدام حقنة الأنسولين.- لبدء عملية التخسين المناعي، قم بتطويق ألياف العضلات المعزولة المجففة بقلم عنق الرحم لإنشاء حاجز مقاوم للماء.
- لترطيب ألياف العضلات، أضف 200 ميكرولتر من الماء المقطر لمدة 5 دقائق، ثم قم بتغيير الماء إلى 200 ميكرولتر من DPBS لاحتضان 5 دقائق القادمة. عند هذه النقطة، بدء وضع العلامات immunofluorescence.
- احتضان الألياف مع 300 ميكرولتر من العازلة حجب (BB) التي تحتوي على 50 مل الجليسين، 1٪ جيش استقلال البحرين، و 1٪ تريتون X-100 لمدة 30 دقيقة.
- استبدال BB مع الأجسام المضادة الأولية بتركيز اقترحه المصنعون. استخدام BB لتمييع الأجسام المضادة. استخدمت هذه التجربة 400 ميكرولتر من SMI 32 أو SMI 31 التي تعرفت على الترميز العصبي غير الفوسفوري (Nf) أو الفوسفوريلات (Phos-Nf) H في 1/800 تخفيف للكشف عن مكون NMJ presynaptic.
ملاحظة: عند اتخاذ قرار للتعرف على عنصر presynaptic كله بدلا من تقييم الفوسفور العصبي, اختيار الأجسام المضادة ضد المشبك, synaptophysin أو SV2a التي كانت تستخدم بنجاح سابقا. - احتضان الألياف مع تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها (اختياريا، يمكن إجراء الحضانة في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة). في كلتا الحالتين، سيكون من المهم إجراء الحضانة باستخدام غرفة رطبة.
-
الفلورة المناعية: حضانة الأجسام المضادة الثانوية (اليوم الرابع)
- إزالة الأجسام المضادة الأساسية وشطف الألياف 3x لمدة 10 دقيقة لكل منها مع 500 ميكرولتر من DPBS وآخر مرة مع BB.
- إزالة هذا الغسيل الأخير وإضافة الأجسام المضادة الثانوية المسمى fluorescently المخفف في BB. لهذه التجربة، تم استخدام 500 ميكرولتر من الماعز المضادة للفأرة اليكسا فلور 488 في 1/1000 تخفيف في BB. لعرض عنصر ما بعد متشابك من NMJs، 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) البيوتين العشرين تم إضافة اقتران إلى تخفيف الأجسام المضادة الثانوية.
ملاحظة: إضافة BTX-biotin XX يسمح أفضل إشارة إلى الضوضاء الصور مرة واحدة الكشف مع streptavidin أن تضخيم الإشارة. بالإضافة إلى ذلك، أدى اقتران الستريبتافيدين بالفلوروفوريس المختلفة إلى زيادة تركيبات الألوان في مقايسات الوسم المشترك. بدلا من ذلك ، يسمح Btx المسمى الفلوري بالحصول على صور ذات جودة مماثلة. - احتضان الأجسام المضادة الثانوية و Btx لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 1 ساعة في 37 درجة مئوية محمية من الضوء.
- إزالة الأجسام المضادة الثانوية وBtx. غسل 3x لمدة 10 دقيقة لكل مع 500 ميكرولتر من DPBS وشطف الماضي مع BB.
- احتضان مع 500 ميكرولتر من ستريبتافيدين اليكسا فلور 555 في تخفيف 1/1000 مع BB لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. عند هذه النقطة، إذا رغبت في ذلك، إضافة مسبار إلى مضادالنوى، مثل diaminophenylindole بتركيز نهائي قدره 1 ميكروغرام / مل.
- إزالة محلول الحضانة وغسل الألياف 3x لمدة 10 دقيقة لكل منها مع 500 ميكرولتر من DPBS. ثم، جبل الألياف.
-
تصاعد
- ضع 4 نقاط من طلاء الأظافر الشفاف على شريحة المجهر كما لو كانت رؤوس مربع. السماح لهم الجافة 1-2 دقيقة. وستكون هذه هي النقاط التي سوف تقع coverslips ، مما يساعد على تجنب سحق الأنسجة.
- إزالة غسل DPBS الماضي وإضافة ما يكفي من وسائل الإعلام تصاعد (~ 200 ميكرولتر) لتغطية الألياف. تجنب التجفيف.
ملاحظة: لإعداد 10 مل من مزيج الوسائط المتصاعدة، استخدم Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: الجلسيرول في 4:1 (v:v). - استخدام تلميح ماصة 200 ميكرولتر لنشر بعناية وسائل الإعلام المتصاعدة على الألياف لضمان الغمر الكامل لهم جميعا. قبل وضع الزجاج الغطاء، وإزالة فقاعات الهواء.
- ضع الغطاء على العينات في محاولة لمنع توليد فقاعات الهواء. ويمكن القيام بهذه الحركة بمساعدة ملقط.
4. التحليل المجهري والمورفومتري
- صورة الاستعدادات الألياف مثار باستخدام المجهر كونفوج الليزر.
- خذ سلسلة من المقاطع البصرية (30 ميكرومتر Z مكدسات) عبر المشبك بأكمله باستخدام فاصل زمني واحد ميكرومتر. لتعيين المكدس، استخدم إشارة Btx. صورة على الأقل 15-20 NMJs لكل حالة عضلة مع 2048 بكسل × 2048 بكسل القرار. وقد اختيرت هذه الطريقة للحصول على صور ذات جودة بصرية ودقة كافية للتحليل المورفومتري.
- لإجراء القياسات، استخدم صور الإسقاط للمداخن مع أي برنامج تحليل.
ملاحظة: على الرغم من أن التحليل المورفومتري وأوضح تم القيام به يدويا، وهناك نوعان من الأدوات التي وضعت مؤخرا صورة J المستندة إلى لدراسة العديد من الجوانب المختلفة من قبل وما بعد متشابك NMJ مورفولوجيا33،34. - للحصول على قيم منطقة NMJ الإجمالية، حدد الحدود الخارجية (المخطط الخارجي للمنطقة الملطخة، راجع الشكل 2)من اللوحة النهائية باستخدام أداة Photoshop Magnetic lasso وحدد عدد وحدات البكسل المحددة في إطار الرسم البياني. ثم، يمكن تحويل مناطق البكسل إلى ميكرومتر مربع باستخدام المقياس المحدد من قبل البرنامج confocal.
- باستخدام نفس أداة lasso، حدد الحدود الداخلية (الخطوط العريضة للمنطقة الملطخة داخل اللوحة النهائية، انظر الشكل 2)وحدد المنطقة غير الملطخة في الهيكل بأكمله (أو المنطقة الفارغة) كما هو مفصل أعلاه (الخطوة 4.4).). سيتم الحصول على قيم منطقة Postynaptic بعد طرح المساحة الإجمالية من المساحة الفارغة لكل NMJ.
- الحصول على منطقة Presynaptic، التي تعرف بأنها المنطقة مع مكافحة الفلورة المناعية neurofilament، بطريقة مماثلة أن منطقة مجموع NMJ.
ملاحظة: تم استخدام كافة هذه المعلمات لتحديد مؤشر الكثافة بعد متشابك (منطقة Postynaptic / منطقة إجمالي) وتغطية NMJ (منطقة Presynaptic / منطقة Postynaptic). مؤشر كثافة Postynaptic أعلى يعني لوحة نهاية أكثر كثافة - أو أكثر إحكاما - ، في حين أن تغطية NMJ أصغر يعكس تفاعلا أقل بكثير بين محطة الأعصاب ولوحة النهاية (كلاهما متوافق مع عملية إزالة الحبر). في الحالة الموضحة هنا ، منذ أن تم اكتشاف أشكال فوسفورية وغير فوسفورية من الفلترات العصبية على مستوى محطة الأعصاب ، تم حساب نسبة الإشارة الفوسفورية / غير الفوسفورية presynaptic ونسبة التغطية الفوسفورية / غير الفوسفورية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يقدم هذا البروتوكول طريقة مباشرة لعزل ألياف العضلات والحصول على المناعة من نوعين مختلفين من العضلات (عضلات سريعة وبطيئة الارتعاش ، انظر الشكل 1). باستخدام العلامات الصحيحة و / أو المسابير ، يمكن الكشف عن مكونات NMJ وتقييمها منذ وجهة نظر كمية لتقييم بعض التغيرات المورفولوجية التي يمكن أن تحدث نتيجة لتطور المرض أو علاج دواء معين. في هذه الدراسة، تم تسمية مكونات presynaptic و postsynaptic من NMJ الفلورية باستخدام المضادة للNF أو المضادة للفوس-NF الأجسام المضادة و Btx على التوالي(الشكل 2،لوحات العلوي). تم استخدام كل صورة confocal عالية الدقة من NMJ التي تم الحصول عليها بعد استيثار المناعة لتحديد القياسات والفهارس المورفومترية المحددة في قسم البروتوكول (الجدول 1) تطبيق المعلمات الموضحة في اللوحات السفلية من الشكل 2.
لإثبات أن هذا الإعداد NMJ كامل جبل احتفظ تماما العمارة المشبك، مما يسمح تصور التأثير الذي لديه مرض الجهاز العصبي التدريجي على ذلك، كانت ألياف مثار من الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن الجين البشري SOD1G93A (نموذج ALS) ملطخة بالمناعة باستخدام البروتوكول(الشكل 3). وأظهرت الصور المندمجة للإشارات السابقة والإشارات ما بعد المتشابكة مع النواة الملطخة بال DAPI أن الاختلافات بين NMJs بين الحيوانات المعدلة وراثيا وغير المعدلة وراثيا المتطابقة مع العمر واضحة للعيان ومتوافقة مع النتائج المتوقعة من قبل الأدب.
وبالإضافة إلى ذلك، أتاحت جودة الصور تحديد التغيرات التي لوحظت من خلال إجراء التحليل المورفومتري. على سبيل المثال، يظهر الشكل 4 أدلة على أن الإشارة ما بعد المتشابكة في الحيوانات المعدلة وراثيا تبدو أكثر إحكاما (حوالي 20٪)، ويرجع ذلك أساسا إلى انخفاض المساحة الإجمالية ل NMJ.
من ناحية أخرى، يظهر الشكل 5 أن منطقة presynaptic من NMJs في الحيوانات المعدلة وراثيا هو أيضا انخفاض. وقد تجلت نوعية هذا الإعداد NMJ كامل جبل من خلال تحليل مدى تراجع محطة الأعصاب والكشف عن التغيرات المتعلقة حالات الفوسفور العصبي. هذه الحقيقة ستكون مهمة للحصول على نظرة عميقة لعملية تفكيك NMJ المتعلقة بمرض ALS في النموذج المستخدم. أصغر منطقة presynaptic الكشف عن واحد وصفت مع مضادة للفوسفوريلات neurofilament (الشكل 5B، E، C، F).
وقد أتاح استخدام مؤشر التغطية(الشكل 6)إثبات أن ال NMJs المعدلة وراثيا قد تم تفكيكها جزئيا. أيضا، فإنه يمكن تحديد أن مؤشرات التغطية من الفوسفوريلات العصبية أقل من تلك التي تم الحصول عليها مع السمية العصبية غير الفوسفورية. تظهر هذه النتائج المتعلقة بحالة NMJ كامل جبل وأنه يمكن أن يكون من المفيد إدخال دراسة حالة الفوسفور neurofilament (محدد مهم لللدونة خيوط والاستقرار) باستخدام هذا الإعداد NMJ جبل كامل.
وأخيرا، فإن الأساليب المعروضة في هذا العمل توفر أكبر جودة NMJ لتحديد وتقييم وتقييم حتى التغيرات الطفيفة في NMJ ككل أو في أحد مكوناته.
الشكل 1: EDL والمعالم التشريحية الوحيدة. تسليط الضوء على الصورة (أ) EDL و (ب) موقع الوحيد بين العضلات الأخرى من الطرف الخلفي السفلي الجرذ. Insets تظهر مخططات عضلات الأطراف الخلفية على مقربة من EDL (الأحمر) والعضلات سوليوس (الأخضر).
الشكل 2: تركيب كامل تقاطع العصبية والعضلية من ألياف العضلات EDL. (A) مكون Postynaptic من NMJ الكشف عن استخدام ألفا bungarotoxin (بتكس, أرجواني), التحقيق الذي يربط على وجه التحديد لمستقبلات أستيل (AChR). (ب) محطة السيارات الكشف عن استخدام مضادات الأعصاب (المضادة للNF، الأخضر). (C, D) يتم تخطيط المكونات المتشابكة لتوضيح المعلمات (الحدود الخارجية والداخلية) التي حددت القياسات (المساحة الإجمالية ومنطقة ما قبل الاشتباك العصبي و Postsynaptic) المستخدمة في التحليل المورفومتري المفصل في البروتوكول. مقياس الشريط = 50 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: قبل والتعديلات postynaptic لوحظ في NMJs من نموذج ALS. صور كونفوجال تمثيلية تم الحصول عليها من NMJs كاملة التركيب تم الحصول عليها في التحضيرات من ألياف العضلات EDL الملطخة للكشف عن الخيوط العصبية (الخضراء) ، AChR (أرجواني) ، والنواة (الأزرق) من الفئران غير المعدلة وراثيا (-/-) أو المعدلة وراثيا (hSOD1G93A /-). (A, C) الفئران غير المعدلة وراثيا لديها مورفولوجيا NMJ العادي (شكل المعجنات) على حد سواء عندما يتم تصور نهاية المحرك باستخدام المضادة فوس-Nf (A) أو المضادة للNF (C). (B, D) الفئران المعدلة وراثيا تقديم منطقة أكثر إحكاما postynaptic وأصغر المحطات presynaptic مع انخفاض في إشارة الفوسفور العصبي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر.
الشكل 4: تقييم مورفومتري للعنصر NMJ postynaptic في عضلات EDL من 180 يوما من العمر الذكور hSOD1G93A الفئران. صور كونفوجكال تمثيلية لمكونات ما بعد متشابك في (A, D) غير المعدلة وراثيا و (B, E) الحيوانات المعدلة وراثيا. تقييم (C) منطقة ما بعد متشابك و (F) مؤشر الكثافة postynaptic في NMJs من غير المعدلة وراثيا (أعمدة صلبة) والحيوانات المعدلة وراثيا (أعمدة مخططة). في حين أن المنطقة ما بعد المتشابكة قد انخفضت قليلا في الحيوانات المعدلة وراثيا، ارتفع مؤشر ما بعد متشابك في نسبة أكبر تسليط الضوء على درجة ضغط NMJ كما هو مبين من خلال انخفاض المساحة الإجمالية في الحيوانات المعدلة وراثيا كما هو مبين في الجدول 1. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. البيانات الممثلة هي متوسط ± SEM.(*) و (***) المشار إليها p<0.05 و p<0.001 على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5:تقييم مورفومتري للعنصر ما قبل الاشتباك العصبي NMJ في عضلات EDL من الفئران الذكور 180 يوما من العمر hSOD1G93A. نظرا لأهمية تفكيك NMJ في مرض ALS ، تم تقييم جودة التحضير من خلال التحليل ، ليس فقط مدى تراجع محطة الأعصاب ، ولكن أيضا إمكانية اكتشاف التغيرات في الفوسفور لعنصر ما قبل الاشتباك العصبي NMJ. صور كونفوجكال تمثيلية للمكون المشبكي في (A, D) غير المعدلة وراثيا و (B, E) الحيوانات المعدلة وراثيا التي تم اكتشافها باستخدام (A, B) المضادة للفوس-Nf أو (D, E) المضادة للNF. تقييم منطقة Presynaptic محددة بواسطة (C) الفوسفورية و (F) الخيوط العصبية غير الفوسفورية في NMJs من الحيوانات غير المعدلة وراثيا (الأعمدة الصلبة) والحيوانات المعدلة وراثيا (أعمدة مخططة). لاحظ أن هذه المناطق متشابهة جدا في الحيوانات غير المعدلة وراثيا في حين أنها تمثل انخفاضا كبيرا في NMJs من الحيوانات المعدلة وراثيا. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. البيانات الممثلة هي متوسط ± SEM. (****) المشار إليها p<0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6:تقييم حالة الدمج في NMJs كاملة التركيب لألياف EDL hSOD1G93A. يستخدم مؤشر التغطية على نطاق واسع لتقييم حالة ال داخل. ويعتبر أن NMJs "الداخلية بالكامل" تقدم مؤشر تغطية 
50٪، في حين أن تلك "الداخلية جزئيا" لديها تغطيات بين ≥20٪ و ≤50٪ وتعتبر تلك الشاغرة "denervated". صور تمثيلية confocal من (A, D) غير المعدلة وراثيا و (B, E) NMJs المعدلة وراثيا تظهر عناصر presynaptic و postynaptic الكشف عن استخدام (A, B) المضادة فوس-Nf أو (D,E) المضادة للNF الأجسام المضادة لمراقبة محطة المحرك. تقييم التغطية باستخدام (C) الفوسفوريلات و (F) الخيوط العصبية غير الفوسفورية في NMJs من الحيوانات غير المعدلة وراثيا (الأعمدة الصلبة) والحيوانات المعدلة وراثيا (الأعمدة المخططة). وتظهر الصور والرسومات أدلة على أن ال NMJs من الحيوانات المعدلة وراثيا تقدم مؤشر تغطية أقل من تلك غير المعدلة وراثيا. بالإضافة إلى ذلك ، في الحيوانات المعدلة وراثيا ، تكون مؤشرات تغطية الخيوط العصبية الفوسفورية أقل (18٪) من تلك التي تم الحصول عليها عند اكتشاف الشكل غير الفوسفوري (25٪). وهذه الحقيقة مؤكدة مع العلاقة بين كلا المؤشرين كما هو مبين في الجدول 1. لاحظ أن جودة الاستعدادات تسمح بالحصول على 50٪ من مؤشر التغطية المنصوص عليه ل NMJs المتوقع أن يكون "معنونا بالكامل". شريط المقياس = 50 ميكرومتر. البيانات الممثلة هي متوسط ± SEM.(***) و (****) المشار إليها p<0.001 و p<0.0001 على التوالي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1 - الجداول المعلمات والنسب المورفومترية التي تم الحصول عليها من NMJs كاملة التركيب من ألياف EDL غير المعدلة وراثيا والمحورة وراثيا. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل لتشريح اثنين من عضلات الهيكل العظمي الفئران (واحد بطيء الارتعاش والآخر سريع نشل)، عزل العضلات الألياف والكشف عن المناعة من علامات ما قبل وما بعد متشابك لتقييم كميا التغييرات NMJ فضلا عن عمليات التجميع / تفكيك. هذا النوع من البروتوكول يمكن أن تكون مفيدة في نماذج القوارض41،42 لتقييم NMJ خلال العمليات الفسيولوجية أو المرضية كما هو موضح هنا في نموذج من انحطاط الخلايا العصبية الحركية مثل وجدت في الفئران HS hSOD1G93A.
للحصول على النجاح والنتائج المفيدة، فمن الضروري أن نضع في اعتبارنا بعض النصائح. على سبيل المثال، يسمح البروتوكول الموصوف بالاستخدام الفوري للعضلات المتشرخة. ومع ذلك، عند الضرورة للحفاظ على العضلات لفترة أطول استخدام DPBS مع 0.05٪ من الصوديوم azide بالإضافة إلى 4 °C التخزين يسمح إطالة المحافظة على العضلات ممتازة تصل إلى 4 أسابيع. عند استخدام هذا الخيار، يجب أن يتم غسل واسعة النطاق مع DPBS (5x، 10 دقيقة لكل منهما) قبل البدء في عملية تلطيخ. خيار آخر مفيد للحصول على صور ذات نوعية جيدة تشمل خفض تركيز PFA في 0.5٪ لأنه خفض العضلات autofluorescence. يجب أن يكون هذا مصحوبا تثبيت أطول تصل إلى 24 ساعة في 4 درجة مئوية.
فيما يتعلق بعزل الألياف، تنتج مجموعات أصغر من الألياف صفات أفضل للانتان المناعي. يجب استخدام الألياف المجففة على الشرائح silanized في غضون 2 إلى 3 أيام. بعد هذا الوقت ، فإن الشفط المناعي ليس من نوعية جيدة.
بديل واحد للألياف المجففة على الشرائح silanized هو توليد مجموعة من الألياف المعزولة جزئيا التي عقدت معا من قبل أنسجة الوتر في واحدة من نهاية الألياف ("خصلة" من ألياف العضلات) وتنفيذ الحضانات في أنابيب الطرد الدقيق عن طريق طريقة "العائمة الحرة". استخدام هذا الخيار ضروري لزيادة مرات حضانة الأجسام المضادة لعدة ساعات (24-48 ساعة) وكذلك عدد الغسيل (على الأقل 6 من 10 دقيقة لكل منهما).
فيما يتعلق عزل الألياف دون ضرر، فمن الضروري لأداء "ندف" عن طريق إزالة الغايات حيث يتم سحب وتر بلطف في اتجاهين متعاكسين لتحقيق فصل الألياف.
خطوة حاسمة أخرى لتحسين المناعة هي إضافة 1٪ تريتون X-100 و 50 mM الجليسين في BB. هذا مهم للحصول على الاستعدادات التي لديها تلطيخ متجانسة والقليل من الخلفية. ومن الجدير بالذكر أيضا أن وجود خلفية قليلا يمكن أن تكون مفيدة عندما الألياف غير الملطخة تحتاج إلى أن تكون مصورة. قطر الألياف جيد لقياسه بعيدا عن حقل NMJ حيث أنه يوصف أنه قد يتم زيادته على هذا المستوى. لذلك، تحديد قطر الألياف على مسافة مساوية لقيمة ملف تعريف NMJ.
باستخدام الإجراء المقدم فمن الممكن تحديد وكمية مكونات NMJ في ظل الظروف الفسيولوجية. كما أنه يسمح بدراسة الأحداث المرضية الرئيسية المبكرة مثل تفكيك NMJ24 وفقدان السمية العصبية الفوسفورية في النهايات الطرفية39 كما هو موضح في مسببات الأمراض ALS. لهذا السبب، يقدم البروتوكول الموصوف نهجا بديلا وبسيطا للمساعدة في الحصول على فهم أفضل لإعادة عرض NMJ، مما يشير إلى أن الميزات المورفولوجية المرئية يمكن أن تكون أدوات مفيدة لتشخيص حالة التدهور في NMJs أو لتقييم النهج العلاجية المختلفة. كما أنها تنطبق على نماذج الأمراض الأخرى مثل تلك التي شاركوت ماري الأسنان41 وضمور العضلات الشوكي42 التي تقدم اضطراب NMJ.
وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام النهج الموصوفة في هذا العمل لتحديد خلايا شوان التي تدمج هذا المشبك الثلاثي وفي نهاية المطاف لتقييم بعض أدوارها خلالNMJ إعادة عرض 43. يمكن إجراء الدراسات على حديثي الولادة حتى البالغين، في ظل ظروف فسيولوجية أو استجابة للعلاجات المختلفة التي تؤثر على الجهاز العصبي العضلي.
وأخيرا، وعلى الرغم من المعالجة الممتازة اللازمة لتشريح العينات وتسميتها جنبا إلى جنب مع الوقت المستهلك لإجراء القياسات اليدوية، فإن المنهجية المعروضة هنا تمكن من وضع العلامات المثلى لمختلف مكونات NMJ بسبب الاختراق الميسر للأجسام المضادة والمسابير. على الرغم من أنه يمكن الحصول على اختراق أفضل في الاستعدادات العضلات المقطعية، إغاظة يحافظ على سلامة مورفولوجية 3D من جميع المكونات متشابك التي يمكن أن تضيع في أقسام العضلات. كما أنه يتجنب كل التحضير اللازم لجعل أقسام مثل إدراج قطعة العضلات واسترجاع مستضد أخرى للحصول على الاعتراف ممكن. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع الاستعدادات جبل كله التي تحافظ على أنماط ال الداخلي كاملة، إغاظة تمكن من دراسة الألياف المعزولة. هذا يمكن أن يكون ميزة كبيرة عند الضرورة لتقييم التغايرية الألياف المبلغ عنها في الحالات المرضية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
شكرا جزيلا ل CSIC و PEDECIBA على الدعم المالي المقدم لهذا العمل. إلى ناتاليا روسانو لتصحيحاتها المخطوطة؛ إلى مارسيلو Casacuberta الذي يجعل الفيديو ونيكولاس بولاتو لإعارة صوته لذلك.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
