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Neuroscience

पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के इम्यूनोफ्लोरेटेंट और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एकल कंकाल मांसपेशी फाइबर का विच्छेदन

Published: August 14, 2021 doi: 10.3791/62620
Automatic Translation
*1, *2, 1,2
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura
* These authors contributed equally

Summary

पैथोलॉजिकल या विकासात्मक प्रक्रियाओं के कारण इसकी वास्तुकला में संशोधनों का मूल्यांकन करने में न्यूरोमस्कुलर जंक्शन घटकों का सटीक पता लगाने की क्षमता महत्वपूर्ण है। यहां हम पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों की उच्च गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए एक सीधी विधि का पूरा विवरण प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग मात्रात्मक माप करने के लिए किया जा सकता है।

Abstract

न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) मोटर तंत्रिका और कंकाल की मांसपेशियों के बीच संपर्क का एक विशेष बिंदु है। यह परिधीय सिनैप्स उच्च रूपात्मक और कार्यात्मक प्लास्टिसिटी प्रदर्शित करता है। कई तंत्रिका तंत्र विकारों में, एनएमजे एक प्रारंभिक रोग लक्ष्य है जिसके परिणामस्वरूप न्यूरोट्रांसमिशन विफलता, कमजोरी, शोष, और यहां तक कि मांसपेशियों में फाइबर की मौत हो जाती है। इसकी प्रासंगिकता के कारण, एनएमजे घटकों के बीच संबंधों के कुछ पहलुओं का मात्रात्मक रूप से आकलन करने की संभावना इसकी असेंबली/डिस्असेम्बली से जुड़ी प्रक्रियाओं को समझने में मदद कर सकती है । मांसपेशियों के साथ काम करते समय पहली बाधा तकनीकी विशेषज्ञता हासिल करना है ताकि उनके फाइबर को नुकसान पहुंचाए बिना जल्दी से पहचान और विच्छेदन किया जा सके। दूसरी चुनौती एनएमजे छवियों को प्राप्त करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले पता लगाने के तरीकों का उपयोग करना है जिसका उपयोग मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। यह लेख चूहों से एक्सटेंसर डिजोरम लॉन्गस और सोलियस मांसपेशियों को विच्छेदन करने के लिए एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह पूरे माउंट एनएमजे के पूर्व और पोस्टसिनैप्टिक तत्वों की कल्पना करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस के उपयोग के बारे में भी बताता है । प्राप्त परिणामों से यह प्रदर्शित होता है कि इस तकनीक का उपयोग सिनैप्सिस की सूक्ष्म शरीर रचना विज्ञान स्थापित करने और शारीरिक या रोग स्थितियों के तहत इसके कुछ घटकों की स्थिति में सूक्ष्म परिवर्तनों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है ।

Introduction

स्तनपायी न्यूरोमस्कुलर जंक्शन (एनएमजे) मोटर न्यूरॉन तंत्रिका समाप्त होने से बना एक बड़ा कोलिनेर्गिक त्रिपक्षीय सिनैप्स, कंकाल मांसपेशी फाइबर पर पोस्टसिनैप्टिक झिल्ली, और टर्मिनल श्वान कोशिकाएं1,2,3है। यह सिनैप्स वयस्कता के दौरान भी उच्च रूपात्मक और कार्यात्मक प्लास्टिसिटी4,5,6,7, 8प्रदर्शित करता है, जब एनएमजे गतिशील संरचनात्मक संशोधनों से गुजर सकता है। उदाहरण के लिए, कुछ शोधकर्ताओं ने दिखाया है कि मोटर तंत्रिका अंत लगातार माइक्रोमीटर पैमाने9पर अपने आकार को बदलते हैं । यह भी बताया गया है कि एनएमजे की आकृति कार्यात्मक आवश्यकताओं, परिवर्तित उपयोग, उम्र बढ़ने, व्यायाम या लोकोमोटर गतिविधि4,10, 11, 12,13,14,15में भिन्नता का जवाब देती है। इस प्रकार, प्रशिक्षण और उपयोग की कमी एनएमजे की कुछ विशेषताओं को संशोधित करने के लिए आवश्यक उत्तेजना का प्रतिनिधित्व करती है, जैसे कि इसका आकार, लंबाई, सिनैप्टिक वेसिकल्स और रिसेप्टर्स का फैलाव, साथ ही तंत्रिका टर्मिनल ब्रांचिंग14,16,17,18,19,20।

इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि इस महत्वपूर्ण जंक्शन के किसी भी संरचनात्मक परिवर्तन या पतन के परिणामस्वरूप मोटर न्यूरॉन सेल मृत्यु और मांसपेशियों की शोष21हो सकती है। यह भी सोचा है कि नसों और मांसपेशियों के बीच बदल संचार शारीरिक आयु से संबंधित NMJ परिवर्तन और संभवतः रोग राज्यों में इसके विनाश के लिए जिंमेदार हो सकता है । न्यूरोमस्कुलर जंक्शन को खत्म करना एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) की शुरुआत में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है, जो एक न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी है जो बिगड़ा मांसपेशियों-तंत्रिका परस्पर क्रिया3के सर्वोत्तम उदाहरणों में से एक है। मोटर न्यूरॉन डिसफंक्शन पर किए गए कई अध्ययनों के बावजूद, यह अभी भी बहस है कि क्या एएलएस में देखी गई गिरावट मोटर न्यूरॉन में प्रत्यक्ष क्षति के कारण होती है और फिर कॉर्टिको-स्पाइनल अनुमानों तक फैली हुई है22; या यदि इसे डिस्टल एक्सोनोपैथी माना जाना चाहिए जहां डिजनरेशन तंत्रिका अंत में शुरू होता है और मोटर न्यूरॉन सोमस23,24की ओर बढ़ता है । एएलएस पैथोलॉजी की जटिलता को देखते हुए, यह विचार करना तर्कसंगत है कि स्वतंत्र प्रक्रियाओं का मिश्रण होता है। चूंकि एनएमजे मांसपेशियों और तंत्रिका के बीच फिजियोपैथोलॉजिकल परस्पर क्रिया का केंद्रीय खिलाड़ी है, इसलिए इसका अस्थिरता उस बीमारी की उत्पत्ति में एक निर्णायक बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है जिसका विश्लेषण किया जाना प्रासंगिक है।

स्तनपायी न्यूरोमस्कुलर सिस्टम को कार्यात्मक रूप से असतत मोटर इकाइयों में व्यवस्थित किया जाता है, जिसमें एक मोटर न्यूरॉन और मांसपेशियों के फाइबर होते हैं जो विशेष रूप से इसके तंत्रिका टर्मिनल द्वारा आंतरिक होते हैं। प्रत्येक मोटर इकाई में समान या समान संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों वाले फाइबर होते हैं25. मोटर न्यूरॉन चयनात्मक भर्ती कार्यात्मक मांगों के लिए मांसपेशियों की प्रतिक्रिया को अनुकूलित करने की अनुमति देता है। अब यह स्पष्ट है कि स्तनधारी कंकाल की मांसपेशियां चार अलग-अलग फाइबर प्रकारों से बनी होती हैं। कुछ मांसपेशियों को उनके सबसे प्रचुर मात्रा में फाइबर प्रकार की विशेषताओं के अनुसार नामित किया जाता है। उदाहरण के लिए, सोलियस (शरीर की मुद्रा के रखरखाव में शामिल हिंद अंग की एक पीछे की मांसपेशी) धीमी चिकोटी इकाइयों (प्रकार 1) के बहुमत भालू और एक धीमी मांसपेशियों के रूप में पहचाना जाता है । इसके बजाय, एक्सटेंसर डिजोरम लॉन्गस (ईडीएल) अनिवार्य रूप से समान तेज-चिकोटी गुणों (टाइप 2 फाइबर) वाली इकाइयों से बना है और इसे लोकोमोशन के लिए आवश्यक चरणबद्ध आंदोलनों के लिए विशेष एक तेज मांसपेशी के रूप में जाना जाता है। दूसरे शब्दों में, हालांकि हार्मोनल और तंत्रिका प्रभावों के कारण वयस्क मांसपेशियों की प्रकृति में प्लास्टिक हैं, इसकी फाइबर संरचना विभिन्न गतिविधियों को करने की क्षमता निर्धारित करती है, जैसा कि एकमात्र में देखा गया है जो निरंतर कम तीव्रता वाली गतिविधि और ईडीएल का अनुभव करता है जो अधिक तेजी से एकल चिकोटी प्रदर्शित करता है। विभिन्न प्रकार के मांसपेशी फाइबर के बीच परिवर्तनशील अन्य विशेषताएं उनकी संरचना (माइटोकॉन्ड्रियल सामग्री, सरकोप्लाज्मिक रेटिकुलम का विस्तार, जेड लाइन की मोटाई), मायोसिन एटीपेस सामग्री, और मायोसिन भारी श्रृंखला संरचना26,27,28,29से संबंधित हैं।

कृंतक एनएमजेएस के लिए, मांसपेशियों के बीच महत्वपूर्ण अंतर हैं28,29। चूहों से सोलियस और ईडीएल में किए गए मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषणों से सिनैप्टिक क्षेत्र और फाइबर व्यास के बीच सकारात्मक संबंध का पता चला (यानी, सोलियस स्लो फाइबर में सिनैप्टिक क्षेत्र ईडीएल फास्ट फाइबर की तुलना में अधिक है) लेकिन एनएमजे क्षेत्र और फाइबर आकार के बीच अनुपात दोनों मांसपेशियों30, 31में समान है। इसके अलावा, तंत्रिका टर्मिनलों के संबंध में, टाइप 1 फाइबर में एंडप्लेट निरपेक्ष क्षेत्र टाइप 2 फाइबर की तुलना में कम थे, जबकि फाइबर व्यास द्वारा सामान्यीकरण प्रकार 1 फाइबर में तंत्रिका टर्मिनलों के क्षेत्रों को सबसे बड़ा32बनाया गया था।

हालांकि, बहुत कम अध्ययन मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करते हैं ताकि एनएमजे घटकों में से कुछ में परिवर्तन के सबूत33,34कोदिखायाजा सके। इस प्रकार, जीव के कार्य में एनएमजे की प्रासंगिकता के कारण, जिसका आकृति विज्ञान और शरीर विज्ञान विभिन्न विकृतियों में बदल जाता है, पूरे एनएमजे संरचना के दृश्य की अनुमति देने के लिए पर्याप्त गुणवत्ता के साथ विभिन्न प्रकार की मांसपेशियों के विच्छेदन प्रोटोकॉल को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। विभिन्न प्रायोगिक स्थितियों या स्थितियों जैसे कि उम्र बढ़ने या व्यायाम 35,36 ,37,38में पूर्व या पोस्टसिनैप्टिक परिवर्तनों की घटना का मूल्यांकन करना भी आवश्यक है । इसके अलावा, यह एनएमजे घटकों में अधिक सूक्ष्म परिवर्तनों को सबूत देने के लिए उपयोगी हो सकता है जैसे कि टर्मिनल तंत्रिका अंत में परिवर्तित न्यूरोफिलामेंट फॉस्फोरिलेशन जैसा कि एएलएस39में रिपोर्ट किया गया है।

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Protocol

सभी पशु प्रक्रियाओं को प्रायोगिक प्रयोजनों के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की देखभाल के लिए राष्ट्रीय कानून एन ° 18611 के दिशानिर्देशों के अनुसार किया गया था। इस प्रोटोकॉल को इंस्टीट्यूशनल एथिकल कमेटी (सीईआ आईआईबीईई, प्रोटोकॉल नंबर 004/09/2015) ने मंजूरी दी थी ।

1. मांसपेशियों का विच्छेदन (दिन 1)

नोट: शुरू करने से पहले, 0.5% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए), पीएच 7.4 में दुलबेक्को के फॉस्फेट खारा (डीपीबीएस) की 40 एमएल बनाएं। वैकल्पिक रूप से, 4% पीएफए का 20 एमएल बनाएं। 5 एमएल एलिकोट तैयार करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें। विच्छेदन के दिन, 4% एलिकोट को डिफ्रॉस्ट करें और 0.5% पीएफए के 40 एमएल प्राप्त करने के लिए डीपीबीएस के 35 एमएल जोड़ें।

  1. ईडीएल का अलगाव (तेज झटकने वाली मांसपेशी)
    1. चूहे को इच्छामृत्यु दें। जानवर को ऊपर की ओर की ओर पेट के साथ रखें। हिंद अंग की ओर पैर की उंगलियों के बीच एक शल्य ब्लेड का उपयोग कर एक प्रारंभिक चीरा बनाओ।
      नोट: इस मामले में, चूहे को इच्छामृत्यु देने के लिए 90:10 मिलीग्राम/किलो केटामाइन का इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन दिया गया था, लेकिन संज्ञाहरण के अन्य विकल्पों की भी अनुमति है।
    2. त्वचा को छील लें, इसे ऊपर की ओर खींचें जब तक कि चूहा घुटने उजागर न हो जाए।
    3. ईडीएल को खोजने के लिए, पैर के टेंडन को वलयाकार स्नायु तक फॉलो करें। यह स्नायु दो कण्डरा बनाता है। यूनिबैंड कैंची (या इसी तरह) के साथ दो टेंडन के बीच स्नायु काटें। दोनों को उठाकर ईडीएल टेंडन की पहचान करें और पंजों को ऊपर की ओर ले जाने वाले एक को चुनें।
    4. यूनबैंड कैंची से टेंडन काट लें। फिर, ठीक जैविक चिमटी के साथ टेंडन को पकड़ते समय, धीरे-धीरे ईडीएल की मांसपेशियों को टिबियालिस पूर्वकाल, पेरोनियस ब्रेविस और पेरोनियस लॉन्गस40 (चित्रा 1 एदेखें) से अलग करना शुरू करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मांसपेशियों को बिना किसी नुकसान के अलग कर दिया गया है। ईडीएल मांसपेशियों को पकड़ते और उठाने के दौरान उनके बीच एक रास्ता खोलने के लिए पार्श्व मांसपेशियों के बाकी हिस्सों को काटकर ऐसा करें (ईडीएल में सतही स्थान नहीं है)।
    5. मांसपेशियों को पूरी तरह से अलग करने के लिए, यूनबैंड कैंची के साथ चूहे के घुटने से जुड़े कण्डरा को काट लें।
    6. विच्छेदित मांसपेशी को 0.5% पीएफए के 5 एमएल में विसर्जित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए छोड़ दें। वैकल्पिक रूप से, कार्डबोर्ड के एक टुकड़े में मांसपेशियों को स्टेपल करें और इसे मांसपेशियों के साथ नीचे की ओर घुमाें। फिर इसे पूरी तरह से फिक्सेटिव समाधान के 8 एमएल में विसर्जित कर दें। यह कदम निर्धारण प्रक्रिया के दौरान मांसपेशियों को बनाए रखने में मदद करता है।
  2. सोलियस का अलगाव (धीमी गति से चिकोटी मांसपेशी)
    1. जानवर को फ्लिप करें (पेट अब नीचे की ओर सामना कर रहा है)। त्वचा के माध्यम से, सर्जिकल ब्लेड का उपयोग करके कैल्कैनियल टेंडन को काटें।
    2. जैविक चिमटी और यूनिबैंड कैंची की मदद से, गैस्ट्रोकनेमियस मांसपेशी को हड्डियों से अलग करें, जिससे "मांसपेशियों का ढक्कन" बन जाए। सोलस पेशी के ढक्कन के आंतरिक पक्ष पर होगा। इसकी पहचान इसलिए की जा सकती है क्योंकि यह लाल रंग का होता है और इसमें फ्लैट आकृति विज्ञान होता है।
    3. जैविक चिमटी की एक जोड़ी के साथ, गैस्ट्रोकनेमियस (चित्रा 1Bदेखें) के ऊपर स्थित एकमात्र टेंडन तक पहुंचें और उठाएं।
    4. यूनबैंड कैंची से टेंडन काट लें। कुछ कमजोर अटैचमेंट पॉइंट्स (यानी न्यूरोवैस्कुलर एलिमेंट्स) को काटते हुए पूरी मांसपेशी को उठाएं। अंत में, सोलियस मांसपेशी को पूरी तरह से मुक्त करने के लिए, एकमात्र फासिले को काट दें जो यूनिबैंड कैंची के साथ कैल्कैनियल टेंडन बनाता है।
    5. विच्छेदित सोलियस मांसपेशी को ठीक करने के लिए चरण 1.1.6 दोहराएं।

2. छेड़ा फाइबर तैयारी (2 दिन)

  1. निर्धारण के 24 घंटे के बाद, मांसपेशियों के तंतुओं को अलग करने से पहले 10 मिनट के लिए डीपीबीएस समाधान 3x के 6 एमएल के साथ मांसपेशियों को कुल्ला करें।
  2. फाइबर को अलग करने के लिए, एक मांसपेशी को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें। एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके, धीरे-धीरे एक टेंडन को जैविक चिमटी की एक जोड़ी के साथ पकड़ें। फिर, अन्य जैविक चिमटी के साथ, मांसपेशियों के तंतुओं को अलग करने के लिए धीरे-धीरे कण्डरा को चुटकी लेना शुरू करें। उसके बाद धीरे-धीरे चुटकी ऊतक को विपरीत मांसपेशी कण्डरा की ओर ऊपर की ओर खींचें। कई छोटे, अलग बंडल प्राप्त करने तक इस कार्रवाई को कई बार दोहराना आवश्यक होगा।
  3. उन्हें ध्यान से एक पूर्व इलाज स्लाइड (silanized) पर रखें। सभी फाइबर को व्यवस्थित रखना आवश्यक है ताकि वे ओवरलैप न करें। इस बिंदु पर, हवा-24 घंटे के लिए फाइबर सूखी ।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. प्राथमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन (3 दिन)
    नोट: सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन किया गया, सिवाय अगर अंयथा कहा । स्लाइड से फाइबर अलग किए बिना विभिन्न समाधानों को हटाने का सबसे कारगर तरीका इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करना है।
    1. इम्यूनोस्टेटिंग प्रक्रिया शुरू करने के लिए, एक वाटरप्रूफ बाधा बनाने के लिए एक पीएपी पेन के साथ सूखे अलग मांसपेशियों के तंतुओं को घेरना।
    2. मांसपेशियों के तंतुओं को हाइड्रेट करने के लिए, 5 मिनट के लिए आसुत पानी के 200 माइक्रोन जोड़ें, और फिर अगले 5 मिनट इनक्यूबेशन के लिए पानी को डीपीबीएस के 200 माइक्रोन में बदलें। इस बिंदु पर, इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग शुरू करें।
    3. एक अवरुद्ध बफर (बीबी) के 300 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट फाइबर जिसमें 50 m m ग्लाइसिन, 1% बीएसए, और 30 मिनट के लिए 1% ट्राइटन एक्स-100 शामिल हैं।
    4. निर्माताओं द्वारा सुझाए गए एकाग्रता पर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ बीबी को बदलें। एंटीबॉडी को पतला करने के लिए बीबी का इस्तेमाल करें। इस प्रयोग में एनएमआई 32 या स्मि 31 के 400 माइक्रोन का उपयोग किया गया जो एनएमजे प्रीसाइनैप्टिक घटक का पता लगाने के लिए 1/800 कमजोर पड़ने पर गैर-फॉस्फोरिलेटेड (एनएफ) या फॉस्फोरिलेटेड (फॉस-एनएफ) न्यूरोफिलामेंट एच को मान्यता देता था।
      नोट: न्यूरोफिलामेंट फॉस्फोरिलेशन का मूल्यांकन करने के बजाय पूरे प्रेसिनैप्टिक तत्व को पहचानने का निर्णय लेते समय, सिनेप्सिन, सिनेप्टोफिजिन या एसवी 2ए के खिलाफ एंटीबॉडी चुनें जो पहले सफलतापूर्वक नियोजित थे।
    5. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने के साथ फाइबर को इनक्यूबेट करें (वैकल्पिक रूप से, इनक्यूबेशन 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर किया जा सकता है)। दोनों ही मामलों में, आर्द्र कक्ष का उपयोग करके इनक्यूबेशन करना महत्वपूर्ण होगा।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस: माध्यमिक एंटीबॉडी इनक्यूबेशन (4 दिन)
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी निकालें और डीपीबीएस के 500 माइक्रोन और बीबी के साथ आखिरी बार के साथ 10 मिनट प्रत्येक के लिए फाइबर 3x कुल्ला।
    2. इस अंतिम धोने को हटा दें और बीबी में पतला फ्लोरोसेंटी लेबल द्वितीयक एंटीबॉडी जोड़ें। इस प्रयोग के लिए बीबी में 1/1000 कमजोर पड़ने पर बकरी के एंटी माउस एलेक्सा फ्लोर 488 का 500 माइक्रोन का इस्तेमाल किया गया। एनएमजेएस के पोस्टसिनैप्टिक तत्व को देखने के लिए, 1:300 α-बंगारोटॉक्सिन (बीटीएक्स) बायोटिन-एक्सएक्स कंजूगेट को माध्यमिक एंटीबॉडी कमजोर पड़ने में जोड़ा गया था।
      नोट: बीटीएक्स-बायोटिन एक्सएक्स के अलावा बेहतर सिग्नल-टू-शोर छवियों को एक बार स्ट्रेप्टाविडिन के साथ पता लगाने की अनुमति देता है जो सिग्नल को बढ़ाता है। इसके अलावा, विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए स्ट्रेप्टाविडिन संयोजन ने सह-लेबलिंग परख में रंग संयोजन बढ़ाया। वैकल्पिक रूप से, फ्लोरोसेंटली लेबल बीटीएक्स समान गुणवत्ता की छवियों को प्राप्त करने की अनुमति देता है।
    3. माध्यमिक एंटीबॉडी और बीटीएक्स को कमरे के तापमान पर 2 घंटे या 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए प्रकाश से संरक्षित करें।
    4. माध्यमिक एंटीबॉडी और बीटीएक्स को हटा दें। डीपीबीएस के 500 माइक्रोन और बीबी के साथ अंतिम कुल्ला के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए 3x धोएं।
    5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए बीबी के साथ 1/1000 कमजोर पड़ने पर स्ट्रेप्टाविडिन एलेक्सा फ्लोर 55 के 500 माइक्रोन के साथ इनक्यूबेट। इस बिंदु पर, यदि वांछित है, तो नाभिक को प्रतिहपित करने के लिए जांच जोड़ें, जैसे कि 1 μg/mL की अंतिम एकाग्रता पर डायमिनोफेनिलिइंडोल ।
    6. इनक्यूबेशन समाधान निकालें और डीपीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ प्रत्येक 10 मिनट के लिए फाइबर 3x धोएं। फिर, फाइबर माउंट करें।
  3. बढ़ता हुआ
    1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ट्रांसपेरेंट नेल पॉलिश के 4 डॉट्स रखें जैसे कि वे किसी वर्ग के वर्टिक्स हों। उन्हें 1-2 मिनट सूखने दें। ये ऐसे बिंदु होंगे जहां कवरस्लिप आराम करेंगे, जिससे ऊतक कुचलने से बचने में मदद मिलेगी।
    2. पिछले डीपीबीएस धोने को हटा दें और फाइबर को कवर करने के लिए पर्याप्त बढ़ते मीडिया (~ 200 माइक्रोन) जोड़ें; सूखने से बचें।
      नोट: बढ़ते मीडिया मिश्रण के 10 एमएल तैयार करने के लिए, Tris-HCl 1,5 M पीएच 8,8: एक 4:1 (v:v) में ग्लिसरोल का उपयोग करें ।
    3. उन सभी का पूर्ण विसर्जन सुनिश्चित करने के लिए फाइबर पर बढ़ते मीडिया को सावधानीपूर्वक फैलाने के लिए 200 माइक्रोट टिप का उपयोग करें। कवर ग्लास रखने से पहले, हवा के बुलबुले हटा दें।
    4. हवा के बुलबुले की पीढ़ी को रोकने की कोशिश कर नमूनों पर कवरस्लिप रखें। यह आंदोलन संदंश की सहायता से किया जा सकता है।

4. माइक्रोस्कोपी और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण

  1. लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके छेड़ा फाइबर तैयारी छवि।
  2. एक माइक्रोमीटर अंतराल का उपयोग कर पूरे synapse भर में ऑप्टिकल वर्गों (30 μm Z ढेर) की एक श्रृंखला ले लो । स्टैक सेट करने के लिए, बीटीएक्स सिग्नल का उपयोग करें। छवि कम से कम 15-20 एनएमजे प्रत्येक मांसपेशी स्थिति के लिए एक 2048 px x 2048 px संकल्प के साथ. इस विधि को पर्याप्त ऑप्टिकल गुणवत्ता और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए संकल्प के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए चुना गया था।
  3. माप करने के लिए, किसी भी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ ढेर के प्रक्षेपण छवियों का उपयोग करें।
    नोट: हालांकि समझाया morphometric विश्लेषण मैन्युअल रूप से किया गया था, वहां दो हाल ही में विकसित छवि जे आधारित उपकरण पूर्व और पोस्टसिनैप्टिक एनएमजे आकृति विज्ञान३३,३४के कई अलग अलग पहलुओं का अध्ययन करने के लिए कर रहे हैं ।
  4. कुल एनएमजे क्षेत्र मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, फोटोशॉप मैग्नेटिक लासो टूल का उपयोग करके बाहरी सीमा (दाग क्षेत्र की बाहरी रूपरेखा, एंडप्लेट के चित्रा 2देखें) का चयन करें और हिस्टोग्राम विंडो में चयनित पिक्सेल की संख्या निर्धारित करें। फिर, पिक्सल क्षेत्रों को कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर द्वारा निर्दिष्ट पैमाने का उपयोग करके वर्ग माइक्रोमीटर में परिवर्तित किया जा सकता है।
  5. एक ही लासो उपकरण के साथ, आंतरिक सीमा (एंडप्लेट के भीतर दाग क्षेत्र की रूपरेखा, चित्रा 2देखें) का चयन करें और ऊपर विस्तृत (चरण 4.4)) के रूप में पूरी संरचना (या खाली क्षेत्र) में गैर-दाग क्षेत्र का निर्धारण करें। प्रत्येक एनएमजे के खाली क्षेत्र से कुल क्षेत्र को घटाकर पोस्टसिनैप्टिक क्षेत्र मूल्य प्राप्त किए जाएंगे।
  6. प्रेसिनैप्टिक क्षेत्र प्राप्त करें, जिसे एंटी-न्यूरोफिलामेंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस वाले क्षेत्र के रूप में परिभाषित किया गया है, इसी तरह से कि कुल एनएमजे क्षेत्र।
    नोट: इन सभी मापदंडों का उपयोग पोस्ट-सिनैप्टिक घनत्व सूचकांक (पोस्टसिनैप्टिक एरिया/टोटल एरिया) और एनएमजे कवरेज (प्रेसिनैप्टिक एरिया/पोस्टसिनैप्टिक एरिया) का निर्धारण करने के लिए किया गया था । एक उच्च पोस्टसिनैप्टिक घनत्व सूचकांक का तात्पर्य डेंजर-या अधिक कॉम्पैक्ट-एंडप्लेट से होता है, जबकि एक छोटा एनएमजे कवरेज तंत्रिका टर्मिनल और एंडप्लेट (दोनों एक denervation प्रक्रिया के साथ संगत) के बीच एक बहुत गरीब बातचीत को दर्शाता है । यहां दिखाए गए मामले में, चूंकि तंत्रिका टर्मिनल स्तर पर न्यूरोफिलामेंट्स के फॉस्फोरिलेटेड और गैर-फॉस्फोरिलेटेड रूपों का पता लगाया गया था, इसलिए फॉस्फोरिलेटेड/नॉन-फॉस्फोरिलेटेड प्रेस्सीनैप्टिक सिग्नल रेशियो और फॉस्फोरिलेटेड/नॉन-फॉस्फोरिलेटेड कवरेज रेशियो की गणना की गई ।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल दो अलग-अलग प्रकार की मांसपेशियों (तेज और धीमी गति से झटकने वाली मांसपेशियों, चित्र 1देखें) से मांसपेशियों के तंतुओं को अलग और इम्यूनोदाता करने के लिए एक सीधी विधि प्रदान करता है। सही मार्कर और/या जांच का उपयोग करना, एनएमजे घटकों का पता लगाया जा सकता है और देखने के एक मात्रात्मक बिंदु के बाद से मूल्यांकन के लिए कुछ रूपात्मक परिवर्तन है कि बीमारी प्रगति या एक विशिष्ट दवा उपचार के परिणाम के रूप में हो सकता है का आकलन । वर्तमान अध्ययन में, एनएमजे के प्रेसिनैप्टिक और पोस्टसिनैप्टिक घटकों को क्रमशः एंटी-एनएफ या एंटी-फॉस-एनएफ एंटीबॉडी और बीटीएक्स(चित्रा 2,ऊपरी पैनल) का उपयोग करके लेबल किया गया था। इम्यूनोस्टेटिंग के बाद प्राप्त एनएमजे की प्रत्येक उच्च-संकल्प कॉन्फोकल छवि का उपयोग प्रोटोकॉल अनुभाग(तालिका 1)में निर्दिष्ट मॉर्फोमेट्रिक माप और अनुक्रमित निर्धारित करने के लिए किया गया था, जो चित्र 2के निचले पैनलों में वर्णित मापदंडों को लागू करता है।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि इस पूरे माउंट एनएमजे तैयारी ने पूरी तरह से सिनेप्स आर्किटेक्चर को बनाए रखा, जिससे उस पर प्रगतिशील तंत्रिका तंत्र रोग के प्रभाव के दृश्य की अनुमति मिली, मानव जीन SOD1G93A (एएलएस मॉडल) को व्यक्त करने वाले ट्रांसजेनिक चूहों के फाइबर को छेड़ा गया प्रोटोकॉल(चित्र 3)का उपयोग करके इम्यूनो दाग दिया गया। DAPI के साथ दाग नाभिक के साथ पूर्व और पोस्टसिनैप्टिक संकेतों के विलय छवियों से पता चला है कि ट्रांसजेनिक और गैर-ट्रांसजेनिक उम्र से मेल खाने वाले जानवरों के बीच एनएमजे के बीच मतभेद स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं और साहित्य द्वारा अपेक्षित परिणामों के साथ संगत होते हैं।

इसके अलावा, छवियों की गुणवत्ता ने मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण करके देखे गए परिवर्तनों को निर्धारित करना संभव बनाया। उदाहरण के लिए, चित्रा 4 सबूत दिखाता है कि ट्रांसजेनिक जानवरों में पोस्टसाइनाप्टिक संकेत अधिक कॉम्पैक्ट (लगभग 20%) प्रतीत होता है, मुख्य रूप से एनएमजे कुल क्षेत्र की कमी के कारण।

दूसरी ओर, चित्रा 5 से पता चलता है कि ट्रांसजेनिक जानवरों में एनएमजेएस का प्रेसिनैप्टिक क्षेत्र भी कम हो गया है। इस पूरे माउंट एनएमजे तैयारी की गुणवत्ता तंत्रिका टर्मिनल रिऐक्शन की सीमा का विश्लेषण करके और न्यूरोफिलामेंट फॉस्फोरिलेशन राज्यों से संबंधित परिवर्तनों का पता लगाकर सबूत थी। इस तथ्य को नियोजित मॉडल में ALS रोग से संबंधित NMJ disassembly प्रक्रिया के लिए एक गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण होगा । सबसे छोटा प्रेसिनैप्टिक क्षेत्र का पता लगाया गया था जो एंटी-फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट(चित्रा 5बी, ई, सी, एफ) केसाथ लेबल किया गया था।

कवरेज इंडेक्स(चित्रा 6)के उपयोग ने यह स्थापित करना संभव बनाया कि ट्रांसजेनिक एनएमजेएस आंशिक रूप से विकृत थे। इसके अलावा, यह निर्धारित कर सकता है कि फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट के कवरेज इंडेक्स गैर-फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट के साथ प्राप्त की तुलना में कम हैं। ये परिणाम पूरे माउंट एनएमजे की स्थिति से संबंधित दिखाते हैं और इस पूरे माउंट एनएमजे तैयारी का उपयोग करके न्यूरोफिलामेंट फॉस्फोरिलेशन राज्य (फिलामेंट प्लास्टिसिटी और स्थिरता का एक महत्वपूर्ण निर्धारक) के अध्ययन को पेश करना उपयोगी हो सकता है।

अंत में, इस काम में प्रस्तुत तरीके एनएमजे में भी सूक्ष्म परिवर्तनों की पहचान करने, मूल्यांकन करने और मूल्यांकन करने के लिए सबसे बड़ी एनएमजे गुणवत्ता प्रदान करते हैं।

Figure 1
चित्रा 1:ईडीएल और सोलियस शारीरिक स्थल। चूहे के निचले अंग की अन्य मांसपेशियों के बीच छवि हाइलाइट(ए)ईडीएल और(बी)सोलेस स्थान। इनसेट ईडीएल (लाल) और सोलियस (हरे) की मांसपेशियों के करीब हिंद अंग की मांसपेशियों की योजनाएं दिखातेहैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:ईडीएल मांसपेशी फाइबर का संपूर्ण-माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शन। (ए)एनएमजे के पोस्टसिनैप्टिक घटक अल्फा-बंगारोटॉक्सिन (बीटीएक्स, मैजेंटा) का उपयोग करके पता लगाया गया, एक जांच जो विशेष रूप से एसीटिल्कोलिन रिसेप्टर्स (एसीएचआर) से बांधती है। (ख)मोटर टर्मिनल एंटी-न्यूरोफिलामेंट्स (एंटी-एनएफ, ग्रीन) का उपयोग करके पता लगाया गया। (C,D) प्रोटोकॉल में विस्तृत रूपोमेट्रिक विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले माप (कुल क्षेत्र, प्रेसिनैप्टिक और पोस्टसिनैप्टिक क्षेत्र) को परिभाषित करने वाले मापदंडों (बाहरी और आंतरिक सीमाओं) को चित्रित करने के लिए सिनैप्टिक घटकों को स्केमेट किया जाता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3:एएलएस मॉडल के एनएमजेएस में पूर्व और पोस्टसिनैप्टिक परिवर्तन मनाए गए। ईडीएल मांसपेशी फाइबर से तैयारियों में प्राप्त पूरे माउंट एनएमजेएस से प्राप्त प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां न्यूरोफिलमेंट्स (ग्रीन), एएचआर (मैजेंटा), और नाभिक (नीला) या तो गैर-ट्रांसजेनिक (-/-) या ट्रांसजेनिक (hSOD1G93A/-) चूहों से पता लगाने के लिए दागदार । (A,C) गैर-ट्रांसजेनिक चूहों में सामान्य एनएमजे आकृतिविज्ञान (प्रेट्ज़ेल आकार) होता है, जब मोटर अंत को एंटी-फॉस-एनएफ(ए)या एंटी-एनएफ(सी)का उपयोग करके कल्पना की जाती है। (B,D) ट्रांसजेनिक चूहे न्यूरोफिलामेंट फॉस्फोरिलेशन सिग्नल में कमी के साथ अधिक कॉम्पैक्ट पोस्टसिनैप्टिक क्षेत्र और छोटे प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों को पेश करते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन।

Figure 4
चित्रा 4:180 दिनों पुराने पुरुष hSOD1G93A चूहों से ईडीएल मांसपेशियों में एनएमजे पोस्टसिनैप्टिक तत्व का मॉर्फोमेट्रिक मूल्यांकन। (ए, डी)गैर-ट्रांसजेनिक और(बी, ई)ट्रांसजेनिक जानवरों में पोस्टसिनैप्टिक घटकों की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां। गैर-ट्रांसजेनिक (ठोस कॉलम) और ट्रांसजेनिक (धारीदार कॉलम) जानवरों के एनएमजेएस में(सी)पोस्टसिनैप्टिक क्षेत्र और(एफ)पोस्टसिनैप्टिक घनत्व सूचकांक का मूल्यांकन। जबकि ट्रांसजेनिक जानवरों में पोस्टसिनैप्टिक क्षेत्र थोड़ा कम हो गया था, पोस्टसिनैप्टिक इंडेक्स में अधिक अनुपात में वृद्धि हुई, जो एनएमजे कॉम्पैक्टेशन की डिग्री को उजागर करता है जैसा कि तालिका 1में दिखाए गए ट्रांसजेनिक जानवरों में कुल क्षेत्र में कमी से संकेत मिलता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। प्रतिनिधित्व किए गए डेटा का मतलब है ± SEM.< (*) और (***) ने क्रमशः पी<0.05 और पी<0.001 का संकेत दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5:180 दिनों पुराने पुरुष hSOD1G93A चूहों से ईडीएल मांसपेशियों में एनएमजे प्रेसिनैप्टिक तत्व का मॉर्फोमेट्रिक मूल्यांकन। एएलएस रोग में एनएमजे विघटन के महत्व को देखते हुए, तैयारी की गुणवत्ता का विश्लेषण करके मूल्यांकन किया गया था, न केवल तंत्रिका टर्मिनल रिऐक्शन की सीमा, बल्कि एनएमजे प्रेसिनैप्टिक तत्व के फॉस्फोरिलेशन में परिवर्तन का पता लगाने की संभावना भी थी। (ए, डी)गैर-ट्रांसजेनिक और(बी, ई)ट्रांसजेनिक जानवरों में प्रेसिनैप्टिक घटक की प्रतिनिधि कॉन्फोकल छवियां(ए, बी)एंटी-फॉस-एनएफ या(डी, ई)एंटी-एनएफ एंटीबॉडी का उपयोग करके पता लगाया गया है। गैर-ट्रांसजेनिक (ठोस कॉलम) और ट्रांसजेनिक (धारीदार कॉलम) जानवरों के एनएमजेएस में प्रेसिनैप्टिक एरिया डीलिमिटेड(सी)फॉस्फोरिलेटेड और(एफ)गैर-फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलमेंट्स का मूल्यांकन। ध्यान दें कि ये क्षेत्र गैर-ट्रांसजेनिक जानवरों में बहुत समान हैं जबकि वे ट्रांसजेनिक जानवरों के एनएमजे में काफी कमी पेश करते हैं । स्केल बार = 50 माइक्रोन। प्रतिनिधित्व डेटा का मतलब है ± SEM. (**) ने पी<0.0001 का संकेत दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6:ईडीएल hSOD1G93A फाइबर के पूरे माउंट एनएमजेएस में इनरवेशन स्थिति का मूल्यांकन। कवरेज सूचकांक व्यापक रूप से इनरवेशन की स्थिति का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह माना जाता है कि "पूरी तरह से इनरवेट" एनएमजेस एक कवरेज इंडेक्स Equation 1 50% पेश करते हैं, जबकि उन "आंशिक रूप से इनरवेट" में ≥20% और ≤50% के बीच कवरेज होता है और उन खाली को "denervated" माना जाता है। मोटर टर्मिनल का निरीक्षण करने के लिए(ए, डी)गैर-ट्रांसजेनिक और(बी, ई)ट्रांसजेनिक एनएमजेएस की प्रतिनिधि छवियां जिनमें प्रेसिनैप्टिक और पोस्टसिनैप्टिक तत्वों का उपयोग करके पता लगाया गया है।ए, बी,एंटी-फॉस-एनएफ या(डी, ई)एंटी-एनएफ एंटीबॉडी का उपयोग करके। गैर-ट्रांसजेनिक (ठोस कॉलम) और ट्रांसजेनिक (धारीदार कॉलम) जानवरों के एनएमजेएस में गैर-फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट्स(सी)फॉस्फोरिलेटेड और(एफ)गैर-फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट्स का उपयोग करके कवरेज का मूल्यांकन। छवियां और ग्राफिक्स इस बात के सबूत दिखाते हैं कि ट्रांसजेनिक जानवरों से एनएमजे गैर-ट्रांसजेनिक लोगों की तुलना में कम कवरेज इंडेक्स पेश करते हैं। इसके अलावा, ट्रांसजेनिक जानवरों में, फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट्स के कवरेज इंडेक्स कम Equation 1 (18%) प्राप्त होते हैं जब गैर-फॉस्फोरिलेटेड फॉर्म Equation 1 (25%) का पता चला है। यह तथ्य तालिका 1में दिखाए गए दोनों अनुक्रमितों के बीच संबंधों के साथ पुष्ट है । ध्यान दें कि तैयारी की गुणवत्ता एनएमजेएस के लिए निर्धारित कवरेज सूचकांक का 50% प्राप्त करने की अनुमति देती है जो Equation 1 "पूरी तरह से इनरवेटेड" के रूप में अपेक्षित है। स्केल बार = 50 माइक्रोन। प्रतिनिधित्व किए गए डेटा का मतलब है ± SEM. (***) और (*) ने क्रमशः पी<0.001 और पी<0.0001 का संकेत दिया। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 1. अफ़र्जनक EDL फाइबर के पूरे माउंट एनएमजे से प्राप्त मॉर्फोमेट्रिक पैरामीटर और अनुपात। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस लेख में, हम दो चूहे कंकाल की मांसपेशियों (एक धीमी गति से चिकोटी और अन्य तेजी से चिकोटी), फाइबर मांसपेशियों के अलगाव और पूर्व और पोस्टसिनैप्टिक मार्कर का इम्यूनोफ्लोरेसेंस का पता लगाने के विच्छेदन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ताकि एनएमजे परिवर्तनों के साथ-साथ असेंबली/डिस् असेंबली प्रक्रियाओं का मात्रात्मक रूप से आकलन किया जा सके। इस तरह का प्रोटोकॉल कृंतक मॉडल41,42 में उपयोगी हो सकता है ताकि शारीरिक या रोग प्रक्रियाओं के दौरान एनएमजे का मूल्यांकन किया जा सके, जैसा कि मोटर न्यूरॉन डिजनरेशन के मॉडल में उदाहरण दिया गया है जैसे कि एएलएस hSOD1G93A चूहों में पाया जाता है।

सफलता और लाभकारी परिणाम प्राप्त करने के लिए जरूरी है कि कुछ टिप्स का ध्यान रखें। उदाहरण के लिए, वर्णित प्रोटोकॉल विच्छेदित मांसपेशियों के तत्काल उपयोग की अनुमति देता है। हालांकि, मांसपेशियों को संरक्षित करने के लिए आवश्यक होने पर 0.05% सोडियम एजाइड प्लस 4 डिग्री सेल्सियस भंडारण के साथ डीपीबीएस का उपयोग 4 सप्ताह तक उत्कृष्ट मांसपेशियों के संरक्षण को लंबा करने की अनुमति देता है। इस विकल्प का उपयोग करते समय, धुंधला प्रक्रिया शुरू करने से पहले डीपीबीएस के साथ व्यापक वॉश (5x, 10 मिनट प्रत्येक) किया जाना चाहिए। अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों को प्राप्त करने के लिए एक अन्य उपयोगी विकल्प में पीएफए एकाग्रता को 0.5% पर कम करना शामिल है क्योंकि इससे मांसपेशियों की ऑटोफ्लोरेसेंस कम हो गई है। यह 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक लंबे समय तक निर्धारण के साथ होना चाहिए।

फाइबर अलगाव के बारे में, फाइबर के छोटे समूह बेहतर इम्यूनोडेटेक्शन गुणों का उत्पादन करते हैं। सिलनाइज्ड स्लाइड्स पर सूखे फाइबर का इस्तेमाल 2 से 3 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। इस समय के बाद, इम्यूनोडेटेक्शन अच्छी गुणवत्ता के नहीं हैं।

सिलनाइज्ड स्लाइड्स पर सूखे फाइबर का एक विकल्प आंशिक रूप से अलग-थलग फाइबर का एक सेट उत्पन्न करना है जो टिण्डन ऊतक द्वारा फाइबर के अंत (मांसपेशियों के तंतुओं का "टफ्ट" में से एक में एक साथ आयोजित किया जाता है और "मुक्त-फ्लोटिंग" विधि द्वारा माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में ऊष्मायन करता है। इस विकल्प का उपयोग करने के लिए एंटीबॉडी इनक्यूबेशन बार कई घंटे (24-48 घंटे) के साथ-साथ वॉश की संख्या (कम से कम 10 मिनट प्रत्येक) की संख्या बढ़ाने के लिए आवश्यक है।

नुकसान के बिना फाइबर अलगाव के संबंध में, यह सिरों को हटाने जहां कण्डरा धीरे विपरीत दिशाओं में खींच फाइबर जुदाई को प्राप्त करने के लिए है द्वारा "चिढ़ाने" प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है ।

इम्यूनोडिटेक्शन को बेहतर बनाने के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम बीबी में 1% ट्राइटन एक्स-100 और 50 एमएम ग्लाइसिन का जोड़ है। यह तैयारी है कि सजातीय धुंधला और एक छोटी सी पृष्ठभूमि है प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी उल्लेखनीय है कि एक छोटी सी पृष्ठभूमि होने फायदेमंद हो सकता है जब दागदार फाइबर छवि की जरूरत है लायक है । फाइबर व्यास को एनएमजे क्षेत्र से दूर मापा जाना अच्छा है क्योंकि यह वर्णित है कि इसे इस स्तर पर बढ़ाया जा सकता है। इसलिए, एक एनएमजे प्रोफ़ाइल के मूल्य के बराबर दूरी पर फाइबर व्यास निर्धारित करें।

प्रस्तुत प्रक्रिया का उपयोग करना यह संभव है कि शारीरिक परिस्थितियों में एनएमजे घटकों की पहचान और मात्रा निर्धारित की जा सके। यह एनएमजे विघटित24 के रूप में प्रारंभिक प्रमुख रोग घटनाओं का अध्ययन करने और टर्मिनल एंड्स39 में फॉस्फोरिलेटेड न्यूरोफिलामेंट के नुकसान की भी अनुमति देता है जैसा कि एएलएस रोगजनकों में वर्णित है। इस कारण से, वर्णित प्रोटोकॉल एनएमजे रिमॉडलिंग की बेहतर समझ प्राप्त करने में मदद करने के लिए एक वैकल्पिक और सरल दृष्टिकोण प्रदान करता है, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि एनएमजेएस की सामान्यीकृत स्थिति का निदान करने या विभिन्न चिकित्सीय दृष्टिकोणों का आकलन करने के लिए रूपात्मक विशेषताएं उपयोगी उपकरण हो सकती हैं। यह अन्य रोग मॉडलों जैसे चारकॉट-मैरी-टूथ41 और स्पाइनल मस्कुलर शोष42 पर भी लागू होता है जो एनएमजे व्यवधान पेश करते हैं।

इसके अलावा, इस काम में वर्णित दृष्टिकोण श्वान कोशिकाओं की पहचान करने के लिए नियोजित किया जा सकता है जो इस त्रिपक्षीय सिनेप्स को एकीकृत करते हैं और अंततः एनएमजे रिमॉडलिंग43के दौरान अपनी कुछ भूमिकाओं का आकलन करने के लिए। अध्ययन नवजात शिशुओं में वयस्कों तक, शारीरिक स्थितियों के तहत या न्यूरोमस्कुलर सिस्टम पर प्रभावित होने वाले विभिन्न उपचारों की प्रतिक्रिया के रूप में किया जा सकता है।

अंत में, मैनुअल माप बनाने के लिए उपभोग किए गए समय के साथ नमूनों को विच्छेदन और लेबल करने के लिए आवश्यक उत्कृष्ट हैंडलिंग के बावजूद, यहां प्रस्तुत पद्धति एंटीबॉडी और जांच के उपयोग की सुविधा के कारण विभिन्न एनएमजे घटकों की इष्टतम लेबलिंग को सक्षम बनाती है। यद्यपि अनुभागित मांसपेशियों की तैयारी में बेहतर प्रवेश प्राप्त किया जा सकता है, लेकिन चिढ़ा मांसपेशियों के वर्गों में खोए जा सकने वाले सभी सिनैप्टिक घटकों की 3 डी रूपात्मक अखंडता को बरकरार रखता है। यह मांसपेशियों के टुकड़े को शामिल करने और व्यवहार्य मान्यता प्राप्त करने के लिए आगे एंटीजन पुनर्प्राप्ति जैसे वर्गों को बनाने के लिए आवश्यक सभी तैयारी से भी बचा जाता है। इसके अलावा, जब पूरे इनरवेशन पैटर्न को संरक्षित करने वाली पूरी माउंट तैयारी की तुलना में, चिढ़ाने से अलग फाइबर का अध्ययन होता है। पैथोलॉजिकल स्थितियों में रिपोर्ट किए गए फाइबर विषमता का आकलन करने के लिए आवश्यक होने पर यह एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को दी गई वित्तीय सहायता के लिए सीएसआईसी और पीडेसीबीए को बहुत धन्यवाद; नतालिया रोसानो को उसकी पांडुलिपि सुधार के लिए; मार्सेलो कैसाकुबर्टा के लिए जो वीडियो बनाता है और निकोलस बोल्टो को इसके लिए अपनी आवाज उधार देने के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Stereomicroscope with cool light illumination Nikon SMZ-10A
Rocking platform Biometra (WT 16) 042-500
Cover glasses (24 x 32 mm) Deltalab D102432
Premium (Plus) microscope slides PORLAB PC-201-16
Tweezers F.S.T 11253-20
Uniband LA-4C Scissors 125mm E.M.S 77910-26
Disponsable surgical blades #10 Sakira Medical 1567
Disponsable sterile syringe (1 ml) Sakira Medical 1569
Super PAP pen E.M.S 71310
100 μl or 200 μl pipette Finnpipette 9400130
Confocal microscope Zeiss LSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats Taconic 2148-M
1X PBS (Dulbecco) Gibco 21600-010
Paraformaldehyde Sigma 158127
Triton X-100 Sigma T8787
Glycine Amresco 167
BSA Bio Basic INC. 9048-46-8
Glycerol Mallinckrodt 5092
Tris Amresco 497
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody BioLegend 801601 Previously Covance # SMI 31P
Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody BioLegend 801701 Previously Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) Thermo Scientific A11029
α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate Invitrogen B1196
Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen S32355
Diaminophenylindole (DAPI) Sigma D8417

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 174 न्यूरोमस्कुलर जंक्शन कंकाल मांसपेशी फाइबर छेड़ा फाइबर सोलियस एक्सटेंसर डिजियोरम लांगस विच्छेदन इम्यूनोफ्लोरेसेंस पूरे माउंट मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण
पूरे माउंट न्यूरोमस्कुलर जंक्शनों के इम्यूनोफ्लोरेटेंट और मॉर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए एकल कंकाल मांसपेशी फाइबर का विच्छेदन
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Bolatto, C., Olivera-Bravo, S.,… More

Bolatto, C., Olivera-Bravo, S., Cerri, S. Dissection of Single Skeletal Muscle Fibers for Immunofluorescent and Morphometric Analyses of Whole-Mount Neuromuscular Junctions. J. Vis. Exp. (174), e62620, doi:10.3791/62620 (2021).

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