Summary
La capacità di rilevare con precisione i componenti della giunzione neuromuscolare è fondamentale per valutare le modifiche nella sua architettura a causa di processi patologici o di sviluppo. Qui presentiamo una descrizione completa di un metodo semplice per ottenere immagini di alta qualità di giunzioni neuromuscolari a montaggio intero che possono essere utilizzate per eseguire misurazioni quantitative.
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è un punto di contatto specializzato tra il nervo motorio e il muscolo scheletrico. Questa sinapsi periferica presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale. In numerosi disturbi del sistema nervoso, nmj è un bersaglio patologico precoce con conseguente fallimento della neurotrasmissione, debolezza, atrofia e persino nella morte delle fibre muscolari. A causa della sua rilevanza, la possibilità di valutare quantitativamente alcuni aspetti della relazione tra i componenti NMJ può aiutare a comprendere i processi associati al suo assemblaggio / smontaggio. Il primo ostacolo quando si lavora con i muscoli è quello di acquisire l'esperienza tecnica per identificare e sezionare rapidamente senza danneggiare le loro fibre. La seconda sfida consiste nell'utilizzare metodi di rilevamento di alta qualità per ottenere immagini NMJ che possono essere utilizzate per eseguire analisi quantitative. Questo articolo presenta un protocollo passo-passo per sezionare i muscoli extensor digitorum longus e soleus dai ratti. Spiega anche l'uso dell'immunofluorescenza per visualizzare elementi pre e postinaptici di NMJs a montaggio intero. I risultati ottenuti dimostrano che questa tecnica può essere utilizzata per stabilire l'anatomia microscopica della sinapsi e identificare sottili cambiamenti nello stato di alcuni dei suoi componenti in condizioni fisiologiche o patologiche.
Introduction
La giunzione neuromuscolare del mammifero (NMJ) è una grande sinapsi tripartita colinergica composta dalla terminazione nervosa del motoneurone, dalla membrana postssinaptica sulla fibra muscolare scheletrica e dalle cellule terminali di Schwann1,2,3. Questa sinapsi presenta un'elevata plasticità morfologica e funzionale4,5,6,7,8,anche durante l'età adulta quando gli MN possono subire modifiche strutturali dinamiche. Ad esempio, alcuni ricercatori hanno dimostrato che le terminazioni nervose motorie cambiano continuamente la loro forma alla scala micrometrica9. È stato anche riferito che la morfologia della NMJ risponde a requisiti funzionali, uso alterato, invecchiamento, esercizio fisico o variazioni nell'attivitàlocomotoria 4,10,11,12,13,14,15. Pertanto, l'allenamento e la mancanza di utilizzo rappresentano uno stimolo essenziale per modificare alcune caratteristiche della NMJ, come le sue dimensioni, lunghezza, dispersione di vescicole sinaptiche e recettori, così come la ramificazione terminalenervosa 14,16,17,18,19,20.
Inoltre, è stato dimostrato che qualsiasi cambiamento strutturale o degenerazione di questa giunzione vitale potrebbe causare la morte delle cellule dei motoneuroni e l'atrofiamuscolare 21. Si pensa anche che la comunicazione alterata tra nervi e muscoli potrebbe essere responsabile dei fisiologici cambiamenti di NMJ legati all'età e possibilmente della sua distruzione in stati patologici. Lo smantellamento della giunzione neuromuscolare gioca un ruolo cruciale nell'insorgenza della sclerosi laterale amiotrofica (SLA), una malattia neurodegenerativa che costituisce uno dei migliori esempi di interazione muscolo-nervosa compromessa3. Nonostante i numerosi studi condotti sulla disfunzione dei motoneuroni, si discute ancora se il deterioramento osservato nella SLA si verifichi a causa del danno diretto al motoneurone e poi si estenda alle proiezioni cortico-spinali22; o se deve essere considerato come un'assonopatia distale in cui la degenerazione inizia nelle terminazioni nervose e progredisce verso il somasdel motoneurone 23,24. Data la complessità della patologia della SLA, è logico considerare che si verifica un mix di processi indipendenti. Poiché nmj è il protagonista dell'interazione fisiopatologica tra muscolo e nervo, la sua destabilizzazione rappresenta un punto cardne dell'origine della malattia che è rilevante per essere analizzata.
Il sistema neuromuscolare dei mammiferi è funzionalmente organizzato in unità motorie discrete, costituite da un motoneurone e dalle fibre muscolari che sono esclusivamente innervate dal suo terminale nervoso. Ogni unità motore ha fibre con proprietà strutturali e funzionali simili o identiche25. Il reclutamento selettivo dei motoneuroni consente di ottimizzare la risposta muscolare alle esigenze funzionali. Ora è chiaro che i muscoli scheletrici dei mammiferi sono composti da quattro diversi tipi di fibre. Alcuni muscoli sono nominati in base alle caratteristiche del loro tipo di fibra più abbondante. Ad esempio, il soleo (un muscolo posteriore dell'arto posteriore coinvolto nel mantenimento della postura del corpo) porta la maggior parte delle unità a contrazione lenta (tipo 1) ed è riconosciuto come un muscolo lento. Invece, l'estensore digitorum longus (EDL) è essenzialmente composto da unità con proprietà simili a contrazione rapida (fibre di tipo 2) ed è noto come muscolo veloce specializzato per i movimenti fasici necessari per la locomozione. In altre parole, sebbene i muscoli adulti siano di natura plastica a causa delle influenze ormonali e neurali, la sua composizione in fibra determina la capacità di svolgere diverse attività, come si vede nel soleus che sperimenta un'attività continua a bassa intensità e L'EDL che mostra una singola contrazione più rapida. Altre caratteristiche che sono variabili tra i diversi tipi di fibre muscolari sono correlate alla loro struttura (contenuto mitocondriale, estensione del reticolo sarcoplasmatico, spessore della linea Z), contenuto di miosina ATPasi e composizione della catena pesante della miosina26,27,28,29.
Per i NMJ roditori, ci sono differenze significative tra imuscoli 28,29. Le analisi morfometriche eseguite in soleus ed EDL dai ratti hanno rivelato una correlazione positiva tra l'area sinaptica e il diametro delle fibre (cioè, l'area sinaptica nelle fibre lente soleus è maggiore che nelle fibre veloci EDL) ma il rapporto tra l'area NMJ e la dimensione della fibra è simile in entrambi imuscoli 30,31. Inoltre, in relazione ai terminali nervosi, le aree assolute della piastra terminale nelle fibre di tipo 1 erano inferiori rispetto alle fibre di tipo 2, mentre la normalizzazione per diametro delle fibre ha reso le aree dei terminali nervosi nelle fibre di tipo 1 lepiù grandi 32.
Tuttavia, pochissimi studi si concentrano sull'analisi morfometrica per mostrare l'evidenza dei cambiamenti in alcuni dei componentiNMJ 33,34. Pertanto, a causa della rilevanza della NMJ nella funzione dell'organismo, la cui morfologia e fisiologia sono alterate in varie patologie, è importante ottimizzare i protocolli di dissezione di diversi tipi di muscoli con qualità sufficiente a consentire la visualizzazione dell'intera struttura NMJ. È inoltre necessario valutare il verificarsi di cambiamenti pre o postinaptici in diverse situazioni o condizioni sperimentali come l'invecchiamento ol'esercizio fisico 35,36,37,38. Inoltre, può essere utile evidenzare alterazioni più sottili nei componenti NMJ come la fosforilazione del neurofilamento alterato nelle terminazioni nervose terminali come riportato nella SLA39.
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Protocol
Tutte le procedure animali sono state eseguite secondo le linee guida della legge nazionale n. 18611 per la cura degli animali utilizzati a fini sperimentali. Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale (CEUA IIBCE, Protocollo Numero 004/09/2015).
1. Dissezione muscolare (Giorno 1)
NOTA: Prima di iniziare, fare 40 mL di paraformaldeide (PFA) allo 0,5%, pH 7,4 nella soluzione salina fosfato di Dulbecco (DPBS). Opzionalmente, fare 20 mL del 4% di PFA. Preparare aliquote da 5 mL e congelare a -20 °C. Il giorno della dissezione, scongelare un'aliquota del 4% e aggiungere 35 mL di DPBS per ottenere 40 mL dello 0,5% di PFA.
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Isolamento dell'EDL (muscolo a contrazione rapida)
- Eutanasia di un topo. Posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso l'arto posteriore.
NOTA: In questo caso, è stata somministrata un'iniezione intraperitoneale di 90:10 mg/Kg di chetamina:xirazina per eutanasiare il ratto, ma sono consentite anche altre opzioni di anestesia. - Staccare la pelle, tirandolo verso l'alto fino a quando il ginocchio del ratto non è esposto.
- Per trovare l'EDL, seguire i tendini del piede fino al legamento anulare. Questo legamento circonda due tendini. Tagliare il legamento tra i due tendini con forbici uniband (o simili). Identificare il tendine EDL sollevando entrambi e scegliere quello che fa muovere le dita dei piedi verso l'alto.
- Tagliare il tendine con forbici uniband. Quindi, mentre si tiene il tendine con pinzette biologiche fini, iniziare a separare lentamente il muscolo EDL dal tibialis anteriore, dal peroneus brevis e dal peroneus longus40 (vedi figura 1A).
NOTA: Assicurarsi che il muscolo sia separato senza alcun danno. Fallo tagliando il resto dei muscoli laterale per aprire un percorso tra di loro (l'EDL non ha una posizione superficiale) mentre si tiene e si solleva il muscolo EDL. - Per isolare completamente il muscolo, tagliare il tendine attaccato al ginocchio del topo con forbici uniband.
- Immergere il muscolo sezionato in 5 mL dello 0,5% di PFA e lasciare per 24 ore a 4 °C. Facoltativamente, graffettare il muscolo in un pezzo di cartone e girarlo con il muscolo rivolto verso il basso. Quindi immergerlo completamente in 8 mL della soluzione fissante. Questo passaggio aiuta a mantenere il muscolo allungato durante il processo di fissazione.
- Eutanasia di un topo. Posizionare l'animale con l'addome rivolto verso l'alto. Effettuare un'incisione iniziale utilizzando una lama chirurgica tra le dita dei piedi verso l'arto posteriore.
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Isolamento del soleo (muscolo a contrazione lenta)
- Capovolgere l'animale (l'addome è ora rivolto verso il basso). Attraverso la pelle, tagliare il tendine calcaneale usando una lama chirurgica.
- Con l'aiuto delle pinzette biologiche e delle forbici uniband, separare il muscolo gastrocnemio dalle ossa, creando un "coperchio muscolare". Il soleo sarà sul lato interno del coperchio muscolare. Può essere identificato perché è di colore rosso e ha una morfologia piatta.
- Con un paio di pinzette biologiche, raggiungere e sollevare il tendine soleo che si trova sopra il gastrocnemio (vedi figura 1B).
- Tagliare il tendine con forbici uniband. Sollevare l'intero muscolo mentre si tagliano alcuni dei punti di attacco deboli (cioè gli elementi neurovascolari). Infine, per liberare completamente il muscolo soleo, tagliare il fasccle soleus che forma il tendine calcaneale con forbici uniband.
- Ripetere il passaggio 1.1.6 per fissare il muscolo soleo sezionato.
2. Preparazione della fibra presa in giro (Giorno 2)
- Dopo 24 ore di fissazione, sciacquare i muscoli con 6 mL di soluzione DPBS 3x per 10 minuti ciascuno prima di isolare le fibre muscolari.
- Per isolare le fibre, mettere un muscolo su uno scivolo al microscopio. Usando uno stereomicroscopio, tenere delicatamente uno dei tendini con una coppia di pinzette biologiche. Quindi, con le altre pinzette biologiche, inizia a pizzicare lentamente il tendine per separare le fibre muscolari. Dopo di che tirare lentamente il tessuto pizzicato verso l'alto verso il tendine muscolare opposto. Sarà necessario ripetere questa azione più volte fino a ottenere più piccoli fasci isolati.
- Posizionarli con cura su una diapositiva pretrattata (silanizzata). È necessario mantenere tutte le fibre in ordine in modo che non si sovrappongano. A questo punto, asciugare all'aria le fibre per 24 ore.
3. Immunofluorescenza
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Incubazione di anticorpi primari (Giorno 3)
NOTA: Tutti i passaggi sono stati eseguiti a temperatura ambiente, tranne se altrimenti indicato. Il modo più efficiente per rimuovere le diverse soluzioni senza staccare le fibre dallo scivolo è utilizzare una siringa per insulina.- Per iniziare il processo di immunostaining, circondare le fibre muscolari isolate essiccate con una pap pen per creare una barriera impermeabile.
- Per idratare le fibre muscolari, aggiungere 200 μL di acqua distillata per 5 minuti, quindi cambiare l'acqua a 200 μL di DPBS per la successiva incubazione di 5 minuti. A questo punto, avviare l'etichettatura dell'immunofluorescenza.
- Incubare le fibre con 300 μL di un tampone di blocco (BB) contenente glicina 50 mM, 1% BSA e 1% Tritone X-100 per 30 min.
- Sostituire BB con l'anticorpo primario a una concentrazione suggerita dai produttori. Utilizzare il BB per diluire l'anticorpo. Questo esperimento ha utilizzato 400 μL di SMI 32 o SMI 31 che riconoscevano il neurofilamento H non fosforilato (Nf) o fosforilato (Phos-Nf) a 1/800 diluizione per rilevare la componente presnaptica NMJ.
NOTA: Quando decidi di riconoscere l'intero elemento presinattico invece di valutare la fosforilazione del neurofilamento, scegli gli anticorpi contro sinapsina, sinaptofisina o SV2a che sono stati precedentemente utilizzati con successo. - Incubare le fibre con la diluizione dell'anticorpo primario a 4 °C durante la notte (facoltativamente, l'incubazione può essere eseguita a 37 °C per 1 h). In entrambi i casi, sarà importante eseguire l'incubazione utilizzando una camera umida.
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Immunofluorescenza: Incubazione anticorpale secondaria (Giorno 4)
- Rimuovere l'anticorpo primario e risciacquare le fibre 3 volte per 10 minuti ciascuna con 500 μL di DPBS e l'ultima volta con BB.
- Rimuovere quest'ultimo lavaggio e aggiungere l'anticorpo secondario etichettato fluorescentmente diluito in BB. Per questo esperimento, sono stati utilizzati 500 μL di capra anti-topo Alexa Fluor 488 a 1/1000 diluizione in BB. Per visualizzare l'elemento postssinattico dei NMJ, 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotina-XX coniugato è stato aggiunto alla diluizione anticorpale secondaria.
NOTA: L'aggiunta di Btx-biotina XX consente migliori immagini segnale-rumore una volta rilevate con streptavidina che amplifica il segnale. Inoltre, la coniugazione di streptavidina a diversi fluorofori ha aumentato le combinazioni di colori nei test di co-etichettatura. In alternativa, Btx con etichetta fluorescente consente di ottenere immagini di qualità simile. - Incubare l'anticorpo secondario e il Btx per 2 ore a temperatura ambiente o 1 h a 37 °C protetto dalla luce.
- Rimuovere l'anticorpo secondario e il Btx. Lavare 3 volte per 10 minuti ciascuno con 500 μL di DPBS e l'ultimo risciacquo con BB.
- Incubare con 500 μL di Streptavidin Alexa Fluor 555 a 1/1000 diluizione con BB per 1 h a temperatura ambiente. A questo punto, se lo si desidera, aggiungere una sonda per controsostenere i nuclei, come il diaminofenillindolo ad una concentrazione finale di 1 μg/mL.
- Rimuovere la soluzione di incubazione e lavare le fibre 3 volte per 10 minuti ciascuna con 500 μL di DPBS. Quindi, montare le fibre.
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Montante
- Posizionare 4 punti di smalto trasparente sul vetrino del microscopio come se fossero i vertici di un quadrato. Lasciarli asciugare 1-2 minuti. Questi saranno i punti in cui i coprispalli riposeranno, aiutando ad evitare la frantumazione dei tessuti.
- Rimuovere l'ultimo lavaggio DPBS e aggiungere abbastanza supporti di montaggio (~ 200 μL) per coprire le fibre; evitare l'asciugatura.
NOTA: Per preparare 10 mL del mix di supporti di montaggio, utilizzare Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glicerolo in un 4:1 (v:v). - Utilizzare una punta di pipetta da 200 μL per distribuire con cura i supporti di montaggio sulle fibre per garantire una completa immersione di tutti loro. Prima di posizionare il vetro di copertura, rimuovere le bolle d'aria.
- Posizionare il coverslip sui campioni cercando di prevenire la generazione di bolle d'aria. Questo movimento può essere fatto con l'aiuto di forcep.
4. Microscopia e analisi morfometrica
- Immagini i preparati in fibra presa in giro usando la microscopia confocale laser.
- Prendere una serie di sezioni ottiche (pile Z da 30 μm) attraverso l'intera sinapsi usando un intervallo di un micrometro. Per impostare lo stack, utilizzare il segnale Btx. Immagine di almeno 15-20 NMJ per ogni condizione muscolare con una risoluzione px x 2048 px 2048 2048. Questo metodo è stato scelto per ottenere immagini con qualità ottica e risoluzione sufficienti per l'analisi morfometrica.
- Per eseguire le misurazioni, utilizzare le immagini di proiezione delle pile con qualsiasi software di analisi.
NOTA: Sebbene l'analisi morfometrica spiegata sia stata eseguita manualmente, esistono due strumenti basati su Image J recentemente sviluppati per studiare molti aspetti diversi della morfologia NMJ pre e postinaptica33,34. - Per ottenere i valori dell'area NMJ totale, selezionate il bordo esterno (contorno esterno dell'area macchiata, vedere figura 2) della piastra finale utilizzando lo strumento lazo magnetico di Photoshop e determinate il numero di pixel selezionati nella finestra Istogramma. Quindi, le aree pixel possono essere convertite in micrometri quadrati utilizzando la scala specificata dal software confocale.
- Con lo stesso strumento lazo, selezionare il bordo interno (contorni dell'area macchiata all'interno della piastra finale, vedere figura 2) e determinare l'area non macchiata nell'intera struttura (o nell'area vuota) come descritto sopra (passaggio 4.4.). I valori dell'area postsinaptica verranno ottenuti dopo aver sottratto l'area totale dall'area vuota di ogni NMJ.
- Ottenere l'Area Presnaptica, che è definita come l'area con immunofluorescenza anti-neurofilamento, in modo simile all'area NMJ totale.
NOTA: Tutti questi parametri sono stati utilizzati per determinare l'indice di densità post-sinaptica (area postsinaptica/area totale) e la copertura NMJ (area presnaptica/area postsinaptica). Un indice di densità postsinaptica più elevato implica una banda terminale più densa o più compatta, mentre una copertura NMJ più piccola riflette un'interazione molto più povera tra terminale nervoso e piastra terminale (entrambe compatibili con un processo di denervazione). Nel caso qui mostrato, poiché sono state rilevate forme fosforilate e non fosforilate di neurofilamenti a livello terminale nervoso, sono stati calcolati il rapporto segnale presnaptico fosforilato/non fosforilato e il rapporto di copertura fosforilato/non fosforilato.
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Representative Results
Questo protocollo offre un metodo semplice per isolare e immunostain fibre muscolari da due diversi tipi di muscoli (muscoli a contrazione rapida e lenta, vedi Figura 1). Utilizzando i marcatori e/o le sonde corretti, i componenti NMJ possono essere rilevati e valutati poiché un punto di vista quantitativo per valutare alcuni dei cambiamenti morfologici che possono verificarsi come conseguenza della progressione della malattia o di uno specifico trattamento farmacologico. Nel presente studio, i componenti presnaptici e postsinaptici della NMJ sono stati etichettati fluorescentmente utilizzando anticorpi anti-Cf o anti-Phos-Nf e Btx rispettivamente (Figura 2, pannelli superiori). Ogni immagine confocale ad alta risoluzione di un NMJ ottenuta dopo l'immunostaining è stata utilizzata per determinare le misurazioni morfometriche e gli indici specificati nella sezione protocollo (Tabella 1) applicando i parametri descritti nei pannelli inferiori della figura 2.
Per dimostrare che questa preparazione NMJ a montaggio intero ha mantenuto perfettamente l'architettura sinapsi, consentendo la visualizzazione dell'effetto che ha una malattia progressiva del sistema nervoso su di esso, le fibre prese in giro dei ratti transgenici che esprimono il gene umano SOD1G93A (un modello SLA) sono state immunostained utilizzando il protocollo(Figura 3). Le immagini che fondono i segnali pre e postinaptici con i nuclei macchiati di DAPI hanno mostrato che le differenze tra i NMJ tra animali transgenici e non transgenici abbinati all'età sono chiaramente visibili e compatibili con i risultati attesi dalla letteratura.
Inoltre, la qualità delle immagini ha permesso di quantificare i cambiamenti osservati eseguendo l'analisi morfometrica. Ad esempio, la figura 4 mostra che il segnale postsinaptico negli animali transgenici sembra essere più compatto (circa il 20%), principalmente a causa della riduzione della superficie totale nmj.
D'altro canto, la figura 5 mostra che anche l'area presettica dei NMJ negli animali transgenici è ridotta. La qualità di questa preparazione NMJ a montaggio intero è stata evidenziata analizzando l'estensione della retrazione terminale nervosa e rilevando i cambiamenti riguardanti gli stati di fosforilazione del neurofilamento. Questo fatto sarà importante per ottenere una visione approfondita del processo di smontaggio NMJ relativo alla malattia della SSS nel modello utilizzato. La più piccola area presnaptica rilevata è stata quella etichettata con neurofilamento anti-fosforilato(Figura 5B, E, C, F).
L'uso dell'indice di copertura (figura 6) ha permesso di stabilire che gli NMJ transgenici sono stati parzialmente denervatati. Inoltre, potrebbe determinare che gli indici di copertura del neurofilamento fosforilato sono inferiori a quelli ottenuti con neurofilamento non fosforilato. Questi risultati mostrano il relativo stato di NMJ a montaggio intero e che potrebbe essere utile introdurre lo studio dello stato di fosforilazione del neurofilamento (un importante fattore determinante della plasticità e della stabilità del filamento) utilizzando questa preparazione NMJ a montaggio intero.
Infine, i metodi presentati in questo lavoro offrono la massima qualità NMJ per identificare, valutare e valutare anche sottili cambiamenti in NMJ nel suo complesso o in uno dei suoi componenti.
Figura 1: Punti di riferimento anatomici EDL e soleus. Evidenziazionedell'immagine( A ) EDL e (B) posizione del soleus tra gli altri muscoli dell'arto posteriore inferiore del ratto. Gli inserti mostrano schemi dei muscoli degli arti posteriori vicini ai muscoli EDL (rosso) e soleus(verde). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Giunzione neuromuscolare a montaggio intero delle fibre muscolari EDL. (A) Componente postssinaptica di NMJ rilevata utilizzando alfa-bungarotossine (Btx, magenta), una sonda che si lega specificamente ai recettori dell'acetilcolina (AChR). (B) Terminale motore rilevato mediante antinevrofilamenti (anti-Cf, verde). (C,D) I componenti sinaptici sono schematizzati al fine di illustrare i parametri (bordi esterni ed interni) che hanno definito le misure (Total Area, Presynaptic e Postsynaptic Area) utilizzate per l'analisi morfometrica dettagliata nel protocollo. Barra di scala = 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Alterazioni pre e postsinaptiche osservate nei NMJ di un modello SRIA. Immagini confocali rappresentative ottenute da NMJ a montaggio intero ottenute in preparati da fibre muscolari EDL macchiate per rilevare neurofilamenti (verde), AChR (magenta) e nucleo (blu) da ratti non transgenici (-/-) o transgenici (hSOD1G93A/-). (A,C) I ratti non transgenici hanno una morfologia NMJ normale (forma pretzel) sia quando l'estremità del motore viene visualizzato utilizzando anti-Phos-Nf (A) o anti-Nf (C). (B,D) I ratti transgenici presentano un'area postsinaptica più compatta e terminali presnaptici più piccoli con una riduzione del segnale di fosforilazione del neurofilamento. Barra di scala = 50 μm.
Figura 4: Valutazione morfometrica dell'elemento postsinaptico NMJ nei muscoli EDL dei ratti maschi hSOD1G93A di 180 giorni. Immagini confocali rappresentative di componenti postinaptici negli animali transgenici(A,D)non transgenici e (B,E). Valutazione dell'area postsinaptica(C)e dell'indice di densità postsinaptica(F)nei NMJ di animali non transgenici (colonne solide) e transgenici (colonne a strisce). Mentre la superficie postinaptica è stata leggermente ridotta negli animali transgenici, l'indice postsinaptico è aumentato in proporzione maggiore evidenziando il grado di compattazione di NMJ indicato dalla superficie totale ridotta negli animali transgenici, come mostrato nella tabella 1. Barra di scala = 50 μm. I dati rappresentati sono ± sem. (*) e (***) indicati rispettivamente p<0,05 e p<0,001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Valutazione morfometrica dell'elemento presettico NMJ nei muscoli EDL a partire da ratti maschi hSOD1G93A di 180 giorni. Data l'importanza dello smontaggio della NMJ nella malattia della SLA, la qualità della preparazione è stata valutata analizzando, non solo l'estensione della retrazione terminale nervosa, ma anche la possibilità di rilevare cambiamenti nella fosforilazione dell'elemento presnaptico NMJ. Immagini confocali rappresentative della componente presettica negli animali transgenici(A,D)non transgenici e (B,E) rilevati utilizzando anticorpi anti-Nf(A,B) anti-Phos-Nf o (D,E). Valutazione dell'area presnaptica delimitata da (C) neurofilamenti fosforilati e (F) non fosforilati in NMJ di animali non transgenici (colonne solide) e transgenici (colonne a strisce). Si noti che queste aree sono molto simili negli animali non transgenici, mentre presentano una significativa riduzione degli NMJ degli animali transgenici. Barra di scala = 50 μm. I dati rappresentati sono ± SEM. (****) indicato p<0.0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Valutazione dello stato di innervazione presso nmj a montaggio intero di fibre EDL hSOD1G93A. L'indice di copertura è ampiamente utilizzato per valutare lo stato di innervazione. Si ritiene che gli NMJ "completamente innervati" presentino un indice di 
copertura del 50%, mentre quelli "parzialmente innervati" hanno coperture tra il ≥20% e il ≤50% e quelli vacanti sono considerati "denervatati". Immagini confocali rappresentative di NMJ transgenici (A,D) non transgenici e (B,E) che mostrano elementi presnaptici e postsinaptici rilevati utilizzando anticorpi anti-Nf(A,B)o(D,E)per osservare il terminale motorio. Valutazione della copertura mediante(C)neurofilamenti fosforilati e(F)non fosforilati in NMJ di animali non transgenici (colonne solide) e transgenici (colonne a strisce). Le immagini e la grafica mostrano prove che gli NMJ di animali transgenici presentano un indice di copertura inferiore rispetto a quelli non transgenici. Inoltre, negli animali transgenici, gli indici di copertura dei neurofilamenti fosforilati sono inferiori (18%) a quelli ottenuti quando viene rilevata la forma non fosforilata (25%). Questo fatto è confermato dal rapporto tra i due indici, come illustrato nella tabella 1. Si noti che la qualità dei preparati consente di ottenere il 50% dell'indice di copertura stabilito per gli NMJ previsti come "completamente innervati". Barra di scala = 50 μm. I dati rappresentati sono ± SEM. (***) e (****) indicati rispettivamente p<0.001 e p<0.0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La tabella 1. Parametri e rapporti morfometrici ottenuti da NMJs a montaggio intero di fibre EDL non transgeniche e transgeniche. Clicca qui per scaricare questa Tabella.
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Discussion
In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per la dissezione di due muscoli scheletrici del ratto (uno a contrazione lenta e l'altro a contrazione rapida), isolamento muscolare delle fibre e rilevamento dell'immunofluorescenza dei marcatori pre e postinaptici per valutare quantitativamente i cambiamenti nmj e i processi di assemblaggio / smontaggio. Questo tipo di protocollo può essere utile nei modelli diroditori 41,42 per valutare NMJ durante i processi fisiologici o patologici come esemplificato qui in un modello di degenerazione dei motoneuroni come si trova nei ratti ALS hSOD1G93A.
Per ottenere successo e risultati positivi, è necessario tenere a mente alcuni suggerimenti. Ad esempio, il protocollo descritto consente l'uso immediato di muscoli sezionati. Tuttavia, quando necessario per preservare il muscolo più a lungo l'uso di DPBS con 0,05% di azide di sodio più 4 ° C di conservazione consente di prolungare un'eccellente conservazione muscolare fino a 4 settimane. Quando si utilizza questa opzione, è necessario fare lavaggi estesi con DPBS (5x, 10 min ciascuno) prima di iniziare il processo di colorazione. Un'altra opzione utile per ottenere immagini di buona qualità include l'abbassamento della concentrazione di PFA allo 0,5% perché ha ridotto l'autofluorescenza muscolare. Questo deve essere accompagnato da una fissazione più lunga fino a 24 ore a 4 °C.
Per quanto riguarda l'isolamento delle fibre, gruppi più piccoli di fibre producono migliori qualità di immunodetezione. Le fibre essiccate su vetrini silanizzati devono essere utilizzate entro 2-3 giorni. Dopo questo tempo, le immunodecezioni non sono di buona qualità.
Un'alternativa alle fibre essiccate su scivoli silanizzati è quella di generare una serie di fibre parzialmente isolate che sono tenute insieme dal tessuto tendineo in una delle fibre finali (un "ciuffo" di fibre muscolari) ed effettuare incubazioni in tubi di microcentrifugo con il metodo "free-floating". L'uso di questa opzione è necessario per aumentare i tempi di incubazione degli anticorpi di diverse ore (24-48 ore) e il numero di lavaggi (almeno 6 di 10 minuti ciascuno).
In relazione all'isolamento della fibra senza danni, è necessario eseguire la "presa in giro" rimuovendo le estremità in cui il tendine viene delicatamente tirato in direzioni opposte per ottenere la separazione della fibra.
Un altro passo fondamentale per migliorare l'immunodetezione è l'aggiunta di 1% tritone X-100 e 50 mM di glicina nel BB. Questo è importante per ottenere preparati che hanno colorazione omogenea e un po 'di background. Vale anche la pena ricordare che avere un piccolo sfondo può essere utile quando le fibre non macchiate devono essere immagini. Il diametro della fibra è buono per essere misurato lontano dal campo NMJ poiché è descritto che può essere aumentato a questo livello. Pertanto, determinare il diametro della fibra a una distanza uguale al valore di un profilo NMJ.
Utilizzando la procedura presentata è possibile identificare e quantificare i componenti NMJ in condizioni fisiologiche. Permette anche di studiare i primi eventi patologici chiave come lo smantellamento della NMJ24 e la perdita di neurofilamento fosforilato nelle terminazioni terminali39 come descritto nella patogenesi della SLA. Per questo motivo, il protocollo descritto offre un approccio alternativo e semplice per aiutare a comprendere meglio il rimodellamento nmj, suggerendo che le caratteristiche morfologiche visualizzate possono essere strumenti utili per diagnosticare lo stato degenerativo degli NMJ o per valutare diversi approcci terapeutici. È applicabile anche ad altri modelli di malattia come quelli di Charcot-Marie-Tooth41 e atrofia muscolare spinale42 che presentano interruzione nmj.
Inoltre, gli approcci descritti in questo lavoro possono essere utilizzati per identificare le cellule di Schwann che integrano questa sinapsi tripartita ed eventualmente per valutare alcuni dei suoi ruoli durante ilrimodellamento nmj 43. Gli studi possono essere fatti nei neonati fino agli adulti, in condizioni fisiologiche o come risposta a diversi trattamenti che hanno un impatto sul sistema neuromuscolare.
Infine, nonostante l'eccellente manipolazione necessaria per sezionare ed etichettare i campioni insieme al tempo consumato per effettuare misurazioni manuali, la metodologia qui presentata consente un'etichettatura ottimale dei diversi componenti NMJ a causa della penetrazione facilitata di anticorpi e sonde. Sebbene sia possibile ottenere una migliore penetrazione nei preparati muscolari sescati, la presa in giro preserva l'integrità morfologica 3D di tutti i componenti sinaptici che possono essere persi nelle sezioni muscolari. Evita anche tutta la preparazione necessaria per realizzare sezioni come l'inclusione del pezzo muscolare e un ulteriore recupero dell'antigene per ottenere un riconoscimento fattibile. Inoltre, rispetto alle preparazioni a montaggio intero che preservano i modelli di innervazione completi, la presa in giro consente lo studio di fibre isolate. Questo può essere un vantaggio significativo quando necessario per valutare l'eterogeneità delle fibre riportata in condizioni patologiche.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Molte grazie al CSIC e al PEDECIBA per il sostegno finanziario dato a questo lavoro; a Natalia Rosano per le sue correzioni manoscritte; a Marcelo Casacuberta che realizza il video e a Nicolás Bolatto per aver prestato la sua voce per questo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
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