Summary
神経筋接合成分を正確に検出する能力は、病理学的または発達的プロセスのために、そのアーキテクチャの変更を評価する上で非常に重要です。ここでは、定量的測定を行うために使用できる全マウント神経筋接合部の高品質画像を得るための簡単な方法の完全な説明を提示する。
Abstract
神経筋接合部(NMJ)は、運動神経と骨格筋の間の特殊な接触点である。この周辺シナプスは、高い形態学的および機能的可塑性を示す。多くの神経系障害において、NMJは神経伝達障害、衰弱、萎縮、さらには筋線維死に至る初期の病理学的標的である。その関連性により、NMJコンポーネント間の関係の特定の側面を定量的に評価する可能性は、その組み立て/分解に関連するプロセスを理解するのに役立ちます。筋肉を扱うときの最初の障害は、繊維を傷つけることなく迅速に識別し、解剖するための技術的専門知識を得ることである。第2の課題は、高品質な検出方法を用いて、定量分析に使用できるNMJ画像を取得することです。この記事では、ラットから伸び器ジジドーラムロンゴラスとソレウスの筋肉を解剖するためのステップバイステップのプロトコルを提示します。また、全型NJのプリリシナプス要素とポストナプティクス要素を視覚化するための免疫蛍光の使用についても説明しています。得られた結果は、この技術がシナプスの顕微鏡解剖学を確立し、生理学的または病理学的条件下でのその成分の一部の状態の微妙な変化を特定するために使用できることを実証する。
Introduction
哺乳動物神経筋接合部(NMJ)とは、運動ニューロン神経終末部、骨格筋線維上のポストナプティック膜、及びシュワン細胞1、2、3の末端からなる大きなコリン作動性三者分裂性シナプスである。このシナプスは、MJが動的構造修飾を受けることができる成人期においても、高形態学的および機能的可塑性4、5、6、7、8を示す。例えば、一部の研究者は、運動神経終末がマイクロメートルスケール9で絶えず形を変えることを示している。また、NMJの形態は、機能的要件、変更された使用、老化、運動、または運動活動4、10、11、12、13、14、15の変動に応答することが報告されている。したがって、トレーニングと使用の欠如は、NMJのいくつかの特性を変更するための本質的な刺激を表し、そのサイズ、長さ、シナプス小胞および受容体の分散、ならびに神経末分岐14、16、17、18、19、20などである。
さらに、この重要な接合の構造変化または変性は、運動ニューロン細胞死および筋萎縮21をもたらす可能性があることを示している。また、神経と筋肉間のコミュニケーションの変化は、生理学的な加齢に伴うNMJの変化と、おそらく病理学的状態におけるその破壊の原因となり得ると考えられている。神経筋接合部解体は筋萎縮性側索硬化症(ALS)の発症において重要な役割を果たすが、これは、筋神経相互作用障害の最良例の1つを構成する神経変性疾患である3。運動ニューロン機能障害に関して行われた数多くの研究にもかかわらず、ALSで観察された劣化が運動ニューロンへの直接的な損傷のために起こり、その後コルチコ脊髄投影22に及ぶかどうかはまだ議論されている。または、変性が神経終末で始まり、運動ニューロンソマ23、24に向かって進行する遠位奇数症と考えるべきである場合。ALS病理の複雑さを考えると、独立したプロセスの組み合わせが起こることを考慮することは論理的です。NMJは筋肉と神経の間の生理病理学的相互作用の中心的なプレーヤーであるため、その不安定化は分析されるべき関連する疾患の起源における極めて重要なポイントを表す。
哺乳類の神経筋系は、機能的に、運動ニューロンとその神経末端によって排他的に内在する筋線維からなる離散運動単位に編成される。各モータユニットは、構造特性および機能特性が25に類似しているか、同一の繊維を有する。運動ニューロン選択的リクルートメントは、機能的要求に対する筋肉応答を最適化することを可能にする。哺乳類の骨格筋は4種類の異なる繊維で構成されているのは明らかです。いくつかの筋肉は、最も豊富な繊維の種類の特性に応じて命名されています。例えば、ソレウス(体の姿勢の維持に関与する後肢の後肢)は、遅いけいれんユニット(タイプ1)の大部分を担い、遅い筋肉として認識される。代わりに、伸びジデンソルロンゴ(EDL)は本質的に同様の高速けいれん特性(タイプ2繊維)を持つ単位で構成され、運動に必要なフェジス運動に特化した高速筋肉として知られています。つまり、成人の筋肉はホルモンや神経の影響により自然の中ではプラスチックであるが、その繊維組成は、連続的な低強度活性を経験するソレソウスと、より急速な単一のけいれんを示すEDLに見られるように、異なる活性を行う能力を決定する。異なるタイプの筋線維の中で可変的である他の特徴は、その構造(ミトコンドリア含有量、サルコプラズムレチクルの拡張、Z線の厚さ)、ミオシンATPase含有量、およびミオシン重鎖組成物26、27、28、29に関連している。
げっ歯類のNJの場合、筋肉28、29の間で有意な違いがあります。ラットからソレウスとEDLで行われた形態測定解析は、シナプス領域と繊維径との間に正の相関関係を明らかにした(すなわち、ソレウス遅繊維におけるシナプス領域はEDL高速繊維よりも大きい)が、NMJ面積と繊維サイズの比率は両方の筋肉30,31で類似している。また、神経末端に関しては、1型繊維のエンドプレート絶対領域は2型繊維よりも低く、一方、繊維径による正規化は1型繊維の神経末端の領域を最大32にした。
しかし、NMJ成分33,34の変化の証拠を示す形態解析に焦点を当てた研究はほとんどない。したがって、様々な病理において形態や生理学が変化する生物の機能におけるNMJの関連性のために、NMJ構造全体の可視化を可能にする十分な品質で異なるタイプの筋肉の解剖プロトコルを最適化することが重要である。また、老化や運動35、36、37、38などの異なる実験状況または条件における前または後の昼寝の変化の発生を評価する必要があります。また、ALS39に報告されているように、末端神経終末における神経フィラメントリン酸化の変化などのNMJ成分においてより微妙な変化を証明するのに役立つ可能性がある。
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Protocol
すべての動物の手順は、実験目的のために使用される動物の世話のための国法N°18611のガイドラインに従って行われました。この議定書は、制度倫理委員会(CEUA IIBCE、プロトコル番号004/09/2015)によって承認されました。
1. 筋解剖(1日目)
注:開始する前に、ダルベッコのリン酸生理食塩(DPBS)で0.5%パラホルムアルデヒド(PFA)、pH 7.4の40 mLを作ってください。必要に応じて、4% PFA の 20 mL を作ります。5 mLアリコートを準備し、-20°Cで凍結します。 解剖の日に、4%のアリコートを解凍し、DPBSの35 mLを加え、0.5%PFAの40 mLを得る。
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EDLの分離(速い筋をぴくぴくする)
- ネズミを安楽死させる。腹部を上向きにして動物を置きます。後肢に向かってつま先の間の外科用ブレードを使用して最初の切開を行います。
注:この場合、90:10 mg/Kgケタミンの腹腔内注射:キシラジンはラットを安楽死させるために与えられたが、麻酔の他の選択肢も許可されている。 - 皮膚を剥がし、ラットの膝が露出するまで上方に引っ張ります。
- EDLを見つけるには、足腱を環状靭帯まで従ってください。この靭帯は2つの腱を囲む。ユニバンドはさみ(または同様)で2つの腱の間の靭帯を切断します。両方を持ち上げてEDL腱を識別し、つま先を上に動かしたものを選択します。
- ユニバンドはさみで腱を切ります。次に、細かい生体ピンセットで腱を保持しながら、後方の脛表筋、ペローヌス・ブレビス、及びペロネウス・ロンダス40 からEDL筋をゆっくりと分離し始める( 図1Aを参照)。
メモ:筋肉が損傷を受けることなく分離されていることを確認してください。EDL筋肉を保持し、持ち上げながら、それらの間のパスを開くために横方向の筋肉の残りの部分を切断することによってこれを行います(EDLは表面的な位置を持っていません)。 - 筋肉を完全に分離するには、ラットの膝に付着した腱をユニバンドハサミで切ります。
- 解剖した筋肉を0.5%PFAの5mLに浸し、4°Cで24時間放置する。 必要に応じて、段ボールの一部に筋肉をホチキス止めし、筋肉を下に向けて回します。その後、完全に8 mLの固定溶液に浸漬します。このステップは、固定プロセス中に伸長した筋肉を維持するのに役立ちます.
- ネズミを安楽死させる。腹部を上向きにして動物を置きます。後肢に向かってつま先の間の外科用ブレードを使用して最初の切開を行います。
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ソレウスの分離 (ゆっくりぴくぴく筋肉)
- 動物を反転します(腹部は現在下向きです)。皮膚を通して、外科用ブレードを使用して踵腱を切断する。
- 生体ピンセットとユニバンドはさみの助けを借りて、胃腸筋を骨から分離し、「筋肉のふた」を作り出します。ソレウスは筋肉の蓋の内側側になります。それは色が赤で、平らな形態を有するので識別することができる。
- 一対の生物学的ピンセットを使用して、胃食用腱の上にあるソレウス腱に手を伸ばして持ち上げます( 図1Bを参照)。
- ユニバンドはさみで腱を切ります。弱い取り付けポイント(すなわち、神経血管要素)の一部を切断しながら、筋肉全体を持ち上げます。最後に、ソレウスの筋肉を完全に解放するために、ユニバンドハサミで踵腱を形成するソレウスの魅惑をカットします。
- 解剖されたソレウスの筋肉を修正するためにステップ1.1.6を繰り返します。
2.からかわれた繊維の準備(2日目)
- 24時間の固定後、6 mLのDPBS溶液3xで筋線維を単離する前にそれぞれ10分間リンスします。
- 繊維を分離するには、顕微鏡スライドに筋肉を置きます。実体顕微鏡を使用して、1組の生物学的ピンセットで腱の1つをそっと保持します。その後、他の生体ピンセットと共に、腱をゆっくりとつまみ始め、筋線維を分離する。その後、ゆっくりと反対側の筋肉腱に向かって上方につままれた組織を引っ張ります.複数の小さな分離バンドルを取得するまで、この操作を数回繰り返す必要があります。
- 前処理されたスライド(シラナイズ)に注意して置きます。繊維が重ならないように、すべての繊維を順番に保つ必要があります。この時点で、24時間繊維を空気乾燥する。
3. 免疫蛍光
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一次抗体インキュベーション(3日目)
注: 特に明記されていない限り、すべてのステップは室温で実行されました。スライドから繊維を取り外すことなく、異なるソリューションを除去する最も効率的な方法は、インスリン注射器を使用することです。- 免疫染色プロセスを開始するには、乾燥した単離された筋線維をパップペンで囲み、防水バリアを作成します。
- 筋線維を水和するには、蒸留水200μLを5分間加え、次の5分間のインキュベーションのために200 μLのDPBSに水を交換します。この時点で、免疫蛍光標識を開始する。
- 50 mMグリシン、1%BSA、トリトンX-100を含む300μLのブロッキングバッファー(BB)を用いたインキュベート繊維を30分間インキュベートします。
- BBをメーカーが提案した濃度で一次抗体に置き換えます。BBを使用して抗体を希釈します。この実験では、非リン酸化(Nf)またはリン酸化(Phos-Nf)の神経フィラメントHを認識したSMI32またはSMI 31の400μLを1/800希釈で使用し、NMJシナプス前成分を検出した。
注:ニューロフィラメントリン酸化を評価するのではなく、シナプス前の元素全体を認識することを決定する場合は、シナプシン、シナプトフィシンまたはSV2aに対する抗体を選択してください。 - 一次抗体希釈を一晩4°Cでインキュベートする(場合によっては、インキュベーションは1時間37°Cで行うことができる)。どちらの場合も、湿気の多いチャンバーを使用してインキュベーションを行うことが重要になります。
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免疫蛍光:二次抗体インキュベーション(4日目)
- 一次抗体を取り除き、繊維3xをそれぞれ10分間、500 μLのDPBSで、最後にBBでリンスします。
- この最後の洗浄を取り除き、BBで希釈した蛍光標識二次抗体を加えます。この実験では、BBで1/1000希釈時に500μLのヤギ抗マウスアレクサFluor 488を使用した。NmJのポストナプティック要素を見るために、1:300 α-ブンガロトキシン(Btx)ビオチン-XXコンジュゲートを二次抗体希釈に添加した。
注:Btx-ビオチンXXを追加すると、シグナルを増幅するストレプトアビジンで検出された信号対雑音画像が向上します。さらに、異なるフルオロフォアへのストレプトアビジン結合は、共標識アッセイにおける色の組み合わせを増加させる。あるいは、蛍光標識Btxは、同様の品質の画像を得ることができます。 - 二次抗体とBtxを室温で2時間、光から保護された37°Cで1時間インキュベートします。
- 2次抗体とBtx.は、DPBS 500 μLとBBで最後のリンスをそれぞれ10分間洗浄3倍洗浄します。
- 500 μLのストレプトアビジン アレクサ Fluor 555 を 1/1000 希釈で、BB を室温で 1 時間インキュベートします。この時点で、必要に応じて、1μg/mLの最終濃度でジアミノフェニルドノールなどの核に対抗するプローブを追加します。
- インキュベーション溶液を取り外し、繊維3xを10分間、それぞれ500 μLのDPBSで洗浄します。次に、繊維を取り付ける。
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マウンティング
- 正方形の頂点であるかのように顕微鏡スライドに透明なマニキュアの4ドットを置きます。1-2分乾燥させます。これらは、カバーリップが休むポイントであり、組織の粉砕を避けるのに役立ちます。
- 最後のDPBS洗浄を取り外し、繊維をカバーするのに十分な取り付け媒体(〜200 μL)を追加します。乾燥を避けてください。
注:取り付けメディアミックスの10 mLを準備するには、トリス-HCl 1,5 M pH 8,8:グリセロールを4:1(v:v)で使用してください。 - 200 μL のピペットチップを使用して、取り付けメディアを繊維に慎重に分散させ、それらすべての完全な浸漬を確実にします。カバーガラスを配置する前に、気泡を取り除きます。
- 気泡の発生を防ぐためにサンプルにカバースリップを置きます。この動きは鉗子の助けによって行うことができる。
4. 顕微鏡・形態測定解析
- レーザー共焦点顕微鏡を使用して、からかわれた繊維製剤を画像化します。
- 1マイクロメートル間隔でシナプス全体にわたって一連の光セクション(30 μm Zスタック)を取ります。スタックを設定するには、Btx 信号を使用します。2048 px x 2048 ピクセル解像度の筋肉状態ごとに、15~20 個以上の NmJ をイメージします。この方法は、モルフォメトリクス解析のための十分な光学品質と解像度を持つ画像を得るために選択されました。
- 測定を実行するには、解析ソフトウェアでスタックの投影画像を使用します。
注:説明された形態測定解析は手動で行われましたが、最近開発された2つのImage Jベースのツールがあり、前およびポストナプティクスNMJ形態33、34の多くの異なる側面を研究しています。 - 合計 NMJ 領域の値を取得するには、Photoshopの磁気投げ縄ツールを使用して、エンドプレートの外部境界(染色領域の外部アウトライン、図 2を参照)を選択し、ヒストグラムウィンドウで選択したピクセル数を決定します。次に、共焦点ソフトウェアで指定された尺度を使用して、ピクセル領域を平方マイクロメートルに変換することができます。
- 同じ投げ縄ツールで、内部境界(エンドプレート内の染色された領域の輪郭、 図2を参照)を選択し、上記の詳細に示すように、構造全体(または空の領域)の非染色領域を決定します(ステップ4.4.各 NMJ の空の領域から合計領域を差し引いた後、ポストナプティック領域の値が取得されます。
- シナプス前領域を得る、すなわち抗ニューロフィラメント免疫蛍光を有する領域として定義される、全NMJ領域と同様の方法で。
注: これらのパラメータはすべて、シナプス後密度指数(ポストシナプス領域/総面積)およびNMJカバレッジ(シナプス前領域/ポストシナプス領域)を決定するために使用されました。より高いポストナプティクス密度指数は、より密度の高い、またはよりコンパクトなエンドプレートを意味しますが、より小さいNMJカバレッジは、神経末端とエンドプレート(両方とも脱樹プロセスと互換性がある)の間の相互作用がはるかに悪いことを反映しています。ここに示す場合、神経フィラメントのリン酸化および非リン酸化形態が神経末レベルで検出されたので、リン酸化/非リン酸化前シナプス信号比およびリン酸化/非リン酸化被覆率を計算した。
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Representative Results
このプロトコルは、2種類の異なる筋肉から筋線維を分離および免疫する簡単な方法を提供します(高速および遅い筋、図1を参照)。正しいマーカーおよび/またはプローブを使用して、NMJ成分は、疾患進行または特定の薬物治療の結果として起こり得る形態学的変化の一部を評価するために定量的観点から検出および評価することができる。本研究では、NMJのシナプス前およびポストナプティック成分を、それぞれ抗Nfまたは抗Phos-Nf抗体およびBtxを用いて蛍光標識した(図2、上部パネル)。免疫染色後に得られたNMJの各高解像度共焦点像を用いて、図2の下部パネルに記載されたパラメータを適用するプロトコルセクション(表1)で指定された形態測定および指標を決定した。
この全マウントNMJ製剤がシナプスアーキテクチャを完全に保持していることを実証するために、それに進行性の神経系疾患を有する効果の可視化を可能にし、ヒト遺伝子SOD1G93A(ALSモデル)を発現するトランスジェニックラットの線維を、プロトコルを用いて免疫染色した(図3)。DAPIで染色された核と前とポストナプティクス信号の合成画像は、トランスジェニックと非トランスジェニックエイジマッチ動物の間のNmJの違いがはっきりと見え、文献が期待する結果と互換性があることを示した。
また、画像の品質により、モルフォメトリクス解析を行うことで観察された変化を定量化することが可能になった。例えば、 図4 は、トランスジェニック動物のポストナプティクスシグナルが、主にNMJ総面積の減少により、よりコンパクト(約20%)であるように見える証拠を示している。
一方、図5は、トランスジェニック動物におけるNmJのシナプス前領域も減少していることを示している。この全マウントNMJ製剤の品質は、神経末端の引き込みの程度を分析し、神経フィラメントリン酸化状態に関する変化を検出することによって証明された。この事実は、採用されたモデルにおけるALS疾患に関連するNMJ分解プロセスに関する深い洞察を得るために重要である。検出された最小のシナプス前領域は、抗リン酸化ニューロフィラメントで標識されたものであった(図5B、E、C、F)。
カバレッジインデックス(図6)を使用すると、トランスジェニックNmJが部分的に否定されていることを確立することが可能になりました。また、リン酸化ニューロフィラメントの被覆率が非リン酸化ニューロフィラメントで得られるものよりも低いと判断できる。これらの結果は、NMJ全体の状態に関するものであり、この全実装NMJ製剤を用いたニューロフィラメントリン酸化状態(フィラメント可塑性及び安定性の重要な決定要因)の研究を導入することが有用であることを示している。
最後に、この研究で提示される方法は、NMJ全体またはその構成要素の1つで微妙な変化を特定、評価、評価するための最大のNMJ品質を提供します。
図1:EDLとソレウス解剖学的ランドマークラット下肢の他の筋肉の中の画像ハイライト(A)EDLと(B)ソレウスの位置。インセットは、EDL(赤)とソレウス(緑)の筋肉に近い後肢の筋肉のスキームを示しています。
図2:EDL筋線維の全実装神経筋接合 部(A)α-ブンガロトキシン(Btx,マゼンタ)を用いて検出されたNMJのポストナプティック成分は、アセチルコリン受容体(AChR)に特異的に結合するプローブである。(B)抗神経フィラメント(抗Nf、緑)を使用して検出されたモータ端末。(C,D)シナプス成分は、プロトコルで詳述されている形態測定解析に使用される測定値(総面積、シナプス前および後の領域)を定義したパラメータ(外部および内部境界)を示すためにスキーマ化されます。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ALSモデルのNmJで観察される前および後の変化EDL筋線維から得られた全型MJから得られた代表的な共焦点画像は、神経フィラメント(緑色)、AChR(マゼンタ)、および核(青色)を非トランスジェニック(--)またはトランスジェニック(hSOD1G93A/-)ラットから検出するために染色された。(A,C)非トランスジェニックラットは、モータ端が抗Phos-Nf(A)または抗Nf(C)を用いて視覚化される場合、両方とも正常NMJ形態(プレッツェル形状)を有する。(B,D)トランスジェニックラットは、よりコンパクトなポストナプティック領域および小さなシナプス前末端を、ニューロフィラメントリン酸化シグナルの減少と共に提示する。スケールバー= 50 μm
図4:180日齢雄hSOD1G93AラットからのEDL筋肉におけるNMJポストナプティクス要素の形態評価非トランスジェニックおよび(B,E)トランスジェニック動物におけるポストナプティクス成分の代表的な共焦点画像。非トランスジェニック(固形カラム)およびトランスジェニック(縞状カラム)動物のNmJにおける(C)ポストナプティック領域および(F)ポストナプティクス密度指数の評価トランスジェニック動物ではポストナプティック領域がわずかに減少したが、表1に示すようにトランスジェニック動物の総面積の減少によって示されるように、NMJ圧縮の程度を強調するポストナプティクス指数は大きな割合で増加した。スケールバー= 50 μm表されるデータは、それぞれp<0.05およびp<0.001を示す ±SEM(*)および(***)を平均する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:180日齢雄hSOD1G93AラットからのEDL筋肉におけるNMJシナプス前素子の形態評価 ALS疾患におけるNMJ分解の重要性を考えると、製剤の質は、神経末端の引き込みの程度だけでなく、NMJシナプス前素子のリン酸化の変化を検出する可能性も分析することによって評価した。(A,D)非トランスジェニックおよび(B,E)トランスジェニック動物(A,B)抗Phos-Nfまたは(D,E)抗Nf抗体を用いて検出されたトランスジェニック動物におけるシナプス前成分の代表的な共焦点像。非トランスジェニック(固体カラム)およびトランスジェニック(縞状カラム)動物のNmJにおける(C)リン酸化および(F)非リン酸化ニューロフィラメントで区切られた前シナプス領域の評価。これらの領域は、トランスジェニック動物のNJの有意な減少を示す一方で、非トランスジェニック動物において非常に類似していることに注意してください。スケールバー= 50 μm表されるデータは、SEM±平均値です<。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6: EDL hSOD1G93Aファイバの全マウントNmJにおけるインネクレーションステータスの評価 カバレッジ インデックスは、インナビネーションの状態を評価するために広く使用されます。「完全にインナートイン」されたNmJはカバレッジインデックス 
50%を提示し、「部分的にインナート」された人は≥20%から≤50%の間のカバレッジを持ち、空いている人は「デナーバト」と見なされます。(A,D)非トランスジェニックおよび(B,E)トランスジェニックNMJの代表的な共焦点画像は、(A,B)抗Phos-Nfまたは(D,E)抗Nf抗体を用いて検出されたシナプス前および亜科の元素を示すトランスジェニックNmJが、モータ末端を観察する。非トランスジェニック(固体カラム)およびトランスジェニック(ストライプカラム)動物のNMJにおける(C)リン酸化および(F)非リン酸化ニューロフィラメントを用いた被覆の評価。画像とグラフィックスは、トランスジェニック動物のNmJが非トランスジェニック動物よりもカバレッジインデックスが低いという証拠を示しています。また、トランスジェニック動物では、リン酸化されたニューロフィラメントの被覆率は 、非リン酸化形態(25%)が検出された場合に得られるものよりも低い (18%)。この事実は、 表 1に示すように、両方のインデックス間の関係で裏付けられています。準備の質は 「完全にインナート」として期待されるNmJsのために規定されるカバレッジインデックスの50%を得ることを可能にすることに注意してください。スケールバー= 50 μm表されるデータは、それぞれp<0.001およびp<0.0001を示す ±SEM(***)および(****)を示す平均値である。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
表 1.非トランスジェニックおよびトランスジェニックEDL繊維の全型NJから得られるモルフォメトリックパラメータと比。このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、2つのラット骨格筋(1つの遅いけいれんと他の速いけいれん)、線維筋分離およびNMJの変化および組み立て/分解プロセスを定量的に評価するための前および後回しマーカーの免疫蛍光検出の解剖のための詳細なプロトコルを提示する。この種のプロトコルは、ALS hSOD1G93Aラットに見られるような運動ニューロン変性のモデルでここで例示される生理学的または病理学的プロセス中にNMJを評価するためにげっ歯類モデル41、42で有用であり得る。
成功と有益な結果を得るためには、いくつかのヒントを念頭に置く必要があります。例えば、説明されたプロトコルは、解剖された筋肉の即時使用を可能にする。しかし、筋肉を長期間維持するために必要な場合は、0.05%アジドナトリウム+4°C保存でDPBSを使用すると、4週間までの優れた筋肉保存を延長することができます。このオプションを使用する場合、染色プロセスを開始する前に、DPBSでの広範な打ち込み(それぞれ5倍、10分)を行う必要があります。良質の画像を得るための別の有用なオプションは、それが筋肉の自己蛍光を減少させたので0.5%でPFA濃度を下げることが含まれます。これは4°Cで24時間までの長い固定を伴わなければなりません。
繊維の分離に関しては、繊維の小さいグループはよりよい免疫検出の質を作り出す。シラナイズスライドで乾燥した繊維は、2〜3日以内に使用する必要があります。この時間の後、免疫検出は良質ではない。
単一の方法として、単一の繊維末端の腱組織(筋線維の「房」)に腱組織を一緒に保持する部分的に単離された繊維のセットを生成し、「自由浮遊」法によってマイクロ遠心チューブのインキュベーションを行う方法です。このオプションを使用すると、抗体のインキュベーション回数を数時間(24〜48時間)、また、少なくとも6回の10分の10分の量を増加させる必要があります。
損傷のない繊維分離に関しては、繊維分離を達成するために腱が優しく反対方向に引っ張られる端部を取り除くことによって「いじめ」を行う必要がある。
免疫検出を改善するもう1つの重要なステップは、BBに1%トリトンX-100および50 mMグリシンを添加することです。これは、均質な染色と少しの背景を有する調製物を得るために重要である。また、染色されていない繊維を画像化する必要がある場合、背景を少し持つことは有益であり得ることを言及する価値があります。繊維径は、このレベルで増加し得ると記載されているのでNMJ分野から遠く離れて測定することがよい。したがって、NMJ プロファイルの値と等しい距離で繊維径を求めます。
提示された手順を用いて、生理学的条件下でNMJ成分を同定し定量することができる。また、ALSの病態に記載されているように、NMJ解体24 および末端末端39 におけるリン酸化ニューロフィラメントの喪失として初期の主要な病理学的事象を研究することを可能にする。このため、説明されたプロトコルは、NMJリモデリングのより良い理解を得るのに役立つ代替的かつ簡単なアプローチを提供し、視覚化された形態学的特徴がNmJの退化状態を診断したり、異なる治療アプローチを評価するのに有用なツールとなり得ることを示唆している。また、NMJの破壊を示すシャルコー・マリー・トゥース41 および脊髄性筋萎縮42 の疾患モデルにも適用可能である。
さらに、この研究で説明するアプローチは、この三種シナプスを統合するシュワン細胞を同定し、最終的にはNMJリモデリング43中にその役割の一部を評価するために使用することができる。研究は、成人まで新生児で行うことができます, 生理学的条件下で、または神経筋系に影響を与えるさまざまな治療への応答として.
最後に、手動測定を行うために使用される時間と一緒にサンプルを解剖し、ラベルを付けるために必要な優れた取り扱いにもかかわらず、ここで提示される方法論は、抗体およびプローブの浸透を促進するため、異なるNMJ成分の最適な標識を可能にする。より良い浸透は、セクション化された筋肉の準備で得ることができますが、からかいは、筋肉のセクションで失うことができるシナプス成分の3D形態学的完全性を維持します。また、筋肉片の含みやさらなる抗原検索などのセクションを作るために必要なすべての準備を避け、実現可能な認識を得る。さらに、完全なインネレーションパターンを保持する全体のマウント調製物と比較すると、からかいは、単離された繊維の研究を可能にする。これは、病理学的状態で報告される繊維の不均一性を評価するために必要な場合に重要な利点であり得る。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この仕事に与えられた財政支援のためのCSICとPEDECIBAに感謝します。彼女の原稿の訂正のためにナタリア・ロサノに。ビデオを作るマルセロ・カサキューブルタとそれに彼の声を貸すためにニコラス・ボラットに。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
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