Summary
Förmågan att exakt upptäcka neuromuskulära knutpunkter komponenter är avgörande för att utvärdera modifieringar i dess arkitektur på grund av patologiska eller utvecklingsmässiga processer. Här presenterar vi en komplett beskrivning av en enkel metod för att få högkvalitativa bilder av helmonterade neuromuskulära korsningar som kan användas för att utföra kvantitativa mätningar.
Abstract
Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en specialiserad kontaktpunkt mellan motornerven och skelettmuskeln. Denna perifera synaps uppvisar hög morfologisk och funktionell plasticitet. I många nervsystemet störningar, NMJ är ett tidigt patologiskt mål som resulterar i neurotransmission misslyckande, svaghet, atrofi, och även i muskel fiber död. På grund av dess relevans kan möjligheten att kvantitativt bedöma vissa aspekter av förhållandet mellan NMJ-komponenter bidra till att förstå de processer som är förknippade med dess montering/ demontering. Det första hindret när man arbetar med muskler är att få den tekniska expertisen att snabbt identifiera och dissekera utan att skada sina fibrer. Den andra utmaningen är att använda högkvalitativa detektionsmetoder för att få NMJ-bilder som kan användas för att utföra kvantitativ analys. Den här artikeln presenterar ett steg-för-steg-protokoll för dissekering av extensor digitorum longus och soleus muskler från råttor. Det förklarar också användningen av immunofluorescens för att visualisera pre- och postsynaptiska element i hela berget NMJs. Erhållna resultat visar att denna teknik kan användas för att fastställa synapsis mikroskopiska anatomi och identifiera subtila förändringar i statusen för vissa av dess komponenter under fysiologiska eller patologiska förhållanden.
Introduction
Däggdjur neuromuskulära korsningen (NMJ) är en stor kolinerg trepartssynaps som består av motorisk neuronnervändelse, det postsynaptiska membranet på skelettmuskelfibern och de terminala Schwann-cellerna1,2,3. Denna synaps uppvisar hög morfologisk och funktionell plasticitet4,5,6,7,8, även under vuxen ålder när NMJs kan genomgå dynamiska strukturella modifieringar. Till exempel har vissa forskare visat att motoriska nervändar ständigt ändrar sin form vid mikrometerskalan9. Det har också rapporterats att NMJ: s morfologi svarar på funktionella krav, förändrad användning, åldrande, motion eller variationer i lokomotoriskaktivitet 4,10,11,12,13,14,15. Således representerar träning och brist på användning viktig stimulans för att ändra vissa egenskaper hos NMJ, såsom dess storlek, längd, spridning av synaptiska blåsor och receptorer, liksom nervterminal förgrening14,16,17,18,19,20.
Dessutom har det visat sig att varje strukturell förändring eller degenerering av denna vitala korsning kan leda till motorisk neuroncelldöd och muskelatrofi21. Man tror också att förändrad kommunikation mellan nerver och muskler kan vara ansvarig för de fysiologiska åldersrelaterade NMJ-förändringarna och eventuellt för dess förstörelse i patologiska tillstånd. Neuromuskulär junction demontering spelar en avgörande roll i uppkomsten av Amyotrophic Laterala skleros (ALS), en neurodegenerativ sjukdom som utgör ett av de bästa exemplen på nedsatt muskel-nerv samspel3. Trots de många studier som utförts på motorisk neuron dysfunktion, diskuteras det fortfarande om försämringen som observerats i ALS uppstår på grund av den direkta skadan i motoriska neuron och sträcker sig sedan till cortico-spinal prognoser22; eller om det bör betraktas som en distal axonopathy där degeneration börjar i nervändarna och fortskrider mot motoriska neuron somas23,24. Med tanke på komplexiteten i ALS patologi är det logiskt att tänka på att en blandning av oberoende processer uppstår. Eftersom NMJ är den centrala aktören i det fysiopatologiska samspelet mellan muskler och nerver, representerar dess destabilisering en central punkt i ursprunget till sjukdomen som är relevant för att analyseras.
Däggdjurets neuromuskulära system är funktionellt organiserat i diskreta motorenheter, bestående av en motorisk neuron och muskelfibrerna som uteslutande innervateras av nervterminalen. Varje motorenhet har fibrer med liknande eller identiska strukturella och funktionella egenskaper25. Motor neuron selektiv rekrytering möjliggör optimering muskelrespons på funktionella krav. Nu står det klart att däggdjursskeletmusklerna består av fyra olika fibertyper. Vissa muskler namnges enligt egenskaperna hos deras mest rikliga fibertyp. Till exempel bär soleus (en bakre muskel i bakbenen som är involverad i underhållet av kroppsställningen) en majoritet av långsamma enheter (typ 1) och känns igen som en långsam muskel. Istället består extensor digitorum longus (EDL) huvudsakligen av enheter med liknande snabbryckningsegenskaper (typ 2-fibrer) och är känd som en snabb muskel specialiserad för phasic rörelser som behövs för rörelse. Med andra ord, även om vuxna muskler är plast i naturen på grund av hormonella och neurala influenser, bestämmer dess fiberkomposition kapaciteten att utföra olika aktiviteter, vilket ses i soleus som upplever kontinuerlig lågintensiv aktivitet och EDL som uppvisar en snabbare enda ryckning. Andra funktioner som är varierande mellan olika typer av muskelfibrer är relaterade till deras struktur (mitokondriellt innehåll, förlängning av sarkoplasmiskt retikulum, tjocklek på Z-linjen), myosin ATPase-innehåll och myosin tungkedjekomposition 26,27,28,29.
För gnagare NMJs, Det finns betydande skillnader mellan muskler28,29. Morfometriska analyser utförda i soleus och EDL från råttor visade en positiv korrelation mellan synaptiska området och fiberdiameter (dvs synaptiska området i soleus långsamma fibrer är större än i EDL snabba fibrer) men förhållandet mellan NMJ område och fiber storlek är liknande i bådamusklerna 30,31. I förhållande till nervterminalerna var endplate absoluta områden i typ 1-fibrer lägre än i typ 2-fibrer, medan normaliseringen av fiberdiameter gjorde områden av nervterminaler i typ 1-fibrer destörsta 32.
Men mycket få studier fokuserar på morfometrisk analys för att visa tecken på förändringar i några av NMJ-komponenterna33,34. Således, på grund av NMJ: s relevans i organismens funktion, vars morfologi och fysiologi ändras i olika patologier, är det viktigt att optimera dissekeringsprotokoll av olika typer av muskler med kvalitet nog för att möjliggöra visualisering av hela NMJ-strukturen. Det är också nödvändigt att utvärdera förekomsten av pre- eller postsynaptiska förändringar i olika experimentella situationer eller tillstånd som åldrande eller motion35,36,37,38. Dessutom kan det vara till hjälp att bevisa mer subtila förändringar i NMJ-komponenter såsom förändrad neurofilamentfosforylering i terminalnervens som rapporterats i ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med riktlinjerna i den nationella lagen nr 18611 för vård av djur som används för försöksändamål. Protokollet godkändes av Den institutionella etiska kommittén (CEUA IIBCE, protokollnummer 004/09/2015).
1. Muskelav dissekering (dag 1)
OBS: Före start, gör 40 ml 0,5% paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 i Dulbeccos fosfat saltlösning (DPBS). Eventuellt, gör 20 ml 4% PFA. Förbered 5 ml alikvoter och frys vid -20 °C. På dissekeringsdagen avfrostar du en 4% alikvot och lägger till 35 ml DPBS för att erhålla 40 ml 0,5% PFA.
-
Isolering av EDL (snabbrycker muskel)
- Avliva en råtta. Placera djuret med buken vänd uppåt. Gör ett första snitt med ett kirurgiskt blad mellan tårna mot bakbenet.
OBS: I detta fall gavs en intraperitoneal injektion av 90:10 mg/Kg ketamin:xylazin att avliva råttan, men andra alternativ för anestesi är också tillåtna. - Skala av huden och dra den uppåt tills rått knät är exponerat.
- För att hitta EDL, följ fot senorna upp till det ringformiga ligamentet. Detta ligament cirklar två senor. Klipp ligamentet mellan de två senorna med unibandsax (eller liknande). Identifiera EDL-senan genom att lyfta båda och välj den som får tårna att röra sig uppåt.
- Skär senan med unibandssax. Sedan, medan du håller senan med fina biologiska pincett, börja långsamt separera EDL-muskeln från tibialis främre, peroneus brevis och peroneus longus40 (se figur 1A).
OBS: Se till att muskeln är separerad utan skador. Gör detta genom att skära resten av laterala muskler för att öppna en väg mellan dem (EDL har inte en ytlig plats) medan du håller och lyfter EDL-muskeln. - För att helt isolera muskeln, skär senan fäst vid rått knäet med uniband sax.
- Sänk ner den dissekerade muskeln i 5 ml 0,5% PFA och låt den vara 24 timmar vid 4 °C. Alternativt häfta muskeln i en bit kartong och vrid den med muskeln vänd nedåt. Sänk sedan ner den helt i 8 ml av fixeringslösningen. Detta steg hjälper till att upprätthålla muskeln långsträckt under fixeringsprocessen.
- Avliva en råtta. Placera djuret med buken vänd uppåt. Gör ett första snitt med ett kirurgiskt blad mellan tårna mot bakbenet.
-
Isolering av soleus (långsam muskel)
- Vänd djuret (buken är nu vänd nedåt). Skär calcaneal senan genom huden med ett kirurgiskt blad.
- Med hjälp av de biologiska pincetterna och unibandsaxen separerar du gastrocnemiusmuskeln från benen och skapar ett "muskulöst lock". Soleusen kommer att vara på insidan av muskellocket. Det kan identifieras eftersom det är rött i färg och har en platt morfologi.
- Med ett par biologiska pincett når och lyfter du soleussenan som ligger ovanför gastrocnemius (se figur 1B).
- Skär senan med unibandssax. Lyft hela muskeln medan du skär några av de svaga fästpunkterna (dvs. neurovaskulära element). Slutligen, för att helt frigöra soleusmuskeln, skär soleusfascicle som bildar calcaneal sena med uniband sax.
- Upprepa steg 1.1.6 för att fixa dissekerad soleusmuskel.
2. Retad fiberberedning (dag 2)
- Efter 24 h fixering, skölj musklerna med 6 ml DPBS-lösning 3x i 10 minuter vardera innan du isolerar muskelfibrerna.
- För att isolera fibrerna, sätt en muskel på en mikroskopbild. Använd ett stereomikroskop och håll försiktigt en av senorna med ett par biologiska pincett. Sedan, med de andra biologiska pincetterna, börja nypa senan långsamt för att separera muskelfibrerna. Därefter drar långsamt den klämda vävnaden uppåt mot motsatt muskelsena. Det kommer att vara nödvändigt att upprepa denna åtgärd flera gånger tills du får flera små, isolerade buntar.
- Placera dem försiktigt på en förbehandlad bild (silaniserad). Det är nödvändigt att hålla alla fibrer i ordning så att de inte överlappar varandra. Vid denna tidpunkt, lufttorka fibrerna i 24 timmar.
3. Immunofluorescens
-
Primär antikroppsinkubation (dag 3)
OBS: Alla steg utfördes i rumstemperatur, förutom om annat anges. Det mest effektiva sättet att ta bort de olika lösningarna utan att lossa fibrer från glidbanan är att använda en insulinspruta.- För att starta immunostainingprocessen, omringa de torkade isolerade muskelfibrerna med en pap-penna för att skapa en vattentät barriär.
- För att återfukta muskelfibrerna, tillsätt 200 μL destillerat vatten i 5 minuter och byt sedan vatten till 200 μL DPBS för nästa 5 minuters inkubation. Börja vid denna tidpunkt immunofluorescensmärkningen.
- Inkubera fibrer med 300 μL av en blockeringsbuffert (BB) som innehåller 50 mM glycin, 1% BSA och 1% Triton X-100 i 30 min.
- Ersätt BB med den primära antikroppen vid en koncentration som föreslagits av tillverkarna. Använd BB för att späda ut antikroppen. I detta experiment användes 400 μL SMI 32 eller SMI 31 som kände igen icke-fosforylerad (Nf) eller fosforylerad (Fos-Nf) neurofilament H vid 1/800 utspädning för att upptäcka NMJ-presynaptisk komponent.
OBS: När du bestämmer dig för att känna igen hela det presynaptiska elementet istället för att utvärdera neurofilamentfosforylering, välj antikroppar mot synapsin, synaptophysin eller SV2a som tidigare framgångsrikt användes. - Inkubera fibrerna med den primära antikroppsutspädningen vid 4 °C över natten (eventuellt kan inkubation utföras vid 37 °C i 1 timme). I båda fallen kommer det att vara viktigt att utföra inkubationen med hjälp av en fuktig kammare.
-
Immunofluorescens: Sekundär antikroppsinkubation (dag 4)
- Ta bort den primära antikroppen och skölj fibrerna 3x i 10 min vardera med 500 μL DPBS och sista gången med BB.
- Ta bort denna sista tvätt och tillsätt fluorescerande märkt sekundär antikropp utspädd i BB. För detta experiment användes 500 μL getantimus Alexa Fluor 488 vid 1/1000 utspädning i BB. För att se det postsynaptiska elementet i NMJs, 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotin-XX konjugat lades till sekundär antikroppsutspädning.
OBS: Tillsats av Btx-biotin XX möjliggör bättre signal-till-brus-bilder när de har upptäckts med streptavidin som förstärker signalen. Dessutom ökade streptavidinkonjugation till olika fluorforer färgkombinationer i komärkningsanalyser. Alternativt tillåter fluorescerande märkta Btx att få bilder av liknande kvalitet. - Inkubera den sekundära antikroppen och Btx i 2 timmar vid rumstemperatur eller 1 timme vid 37 °C skyddad mot ljus.
- Ta bort den sekundära antikroppen och Btx. Tvätta 3x i 10 min vardera med 500 μL DPBS och den sista sköljningen med BB.
- Inkubera med 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 vid 1/1000 utspädning med BB i 1 timme vid rumstemperatur. Vid denna tidpunkt, om så önskas, tillsätt en sond för att motverka kärnorna, såsom diaminophenylindole vid en slutlig koncentration av 1 μg/ml.
- Ta bort inkubationslösningen och tvätta fibrerna 3x i 10 min vardera med 500 μL DPBS. Montera sedan fibrerna.
-
Beslag
- Placera 4 punkter transparent nagellack på mikroskopet glida som om de var hörnen på en kvadrat. Låt dem torka 1-2 min. Dessa kommer att vara de punkter där täckena kommer att vila, vilket hjälper till att undvika vävnadskrossning.
- Ta bort den sista DPBS-tvätten och tillsätt tillräckligt med monteringsmedier (~ 200 μL) för att täcka fibrerna; undvik torkning.
OBS: För att förbereda 10 ml av monteringsmedieblandningen, använd Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glycerol i en 4:1 (v:v). - Använd en 200 μL pipettspets för att försiktigt sprida monteringsmedierna över fibrerna för att säkerställa en fullständig nedsänkning av dem alla. Innan du placerar täckglaset, ta bort luftbubblor.
- Placera täcket på proverna för att förhindra generering av luftbubblor. Denna rörelse kan göras med hjälp av tång.
4. Mikroskopi och morfometrisk analys
- Avbilda de retade fiberpreparaten med laserkonfokal mikroskopi.
- Ta en serie optiska sektioner (30 μm Z-staplar) över hela synapsen med ett intervall på en mikrometer. Om du vill ställa in stapeln använder du Btx-signalen. Bild minst 15-20 NMJs för varje muskeltillstånd med en upplösning på 2048 px x 2048 px. Denna metod valdes för att erhålla bilder med tillräcklig optisk kvalitet och upplösning för den morfometriska analysen.
- För att utföra mätningarna använder du projektionsbilderna av staplar med alla analysprogram.
OBS: Även om den förklarade morfometriska analysen gjordes manuellt, finns det två nyligen utvecklade Image J-baserade verktyg för att studera många olika aspekter av pre och postsynaptic NMJ morfologi33,34. - Om du vill hämta värdena för nmj-området totalt markerar du den yttre kantlinjen (den yttre konturen av det färgade området, se figur 2) i ändplattan med hjälp av photoshopmagnetiska lassoverktyget och bestämmer antalet markerade pixlar i histogramfönstret. Sedan kan pixelområdena konverteras till kvadratiska mikrometer med hjälp av skalan som anges av den konfokala programvaran.
- Med samma lassoverktyg väljer du den inre kantlinjen (konturer av det färgade området i ändplattan, se figur 2) och bestämmer det ofärgade området i hela strukturen (eller det tomma området) enligt ovan (steg 4.4). Postsynaptic Area-värdena erhålls efter att den totala areapen har subtraherats från det tomma området för varje NMJ.
- Få det presynaptiska området, som definieras som området med anti-neurofilament immunofluorescens, på ett liknande sätt som det totala NMJ-området.
OBS: Alla dessa parametrar användes för att bestämma indexet postsynaptisk densitet (postsynaptiskt område/total yta) och NMJ-täckningen (presynaptiskt område/postsynaptiskt område). Ett högre postsynaptiskt densitetsindex innebär en tätare eller mer kompakt endplate, medan en mindre NMJ-täckning återspeglar en mycket sämre interaktion mellan nervterminal och ändplatta (båda kompatibla med en denervationsprocess). I det fall som visas här, eftersom fosforylerade och icke-fosforylerade former av neurofilament upptäcktes på nervterminalnivå, beräknades fosforylerade/icke-fosforylerade presynaptiska signalförhållandet och fosforylerade/icke-fosforylerade täckning förhållandet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll erbjuder en enkel metod för att isolera och immunostain muskelfibrer från två olika typer av muskler (snabba och långsamma muskler, se figur 1). Med hjälp av rätt markörer och / eller sonder kan NMJ-komponenter detekteras och utvärderas eftersom en kvantitativ synvinkel för att bedöma några av de morfologiska förändringar som kan uppstå till följd av sjukdomsprogression eller en specifik läkemedelsbehandling. I denna studie var presynaptiska och postsynaptiska komponenter i NMJ fluorescerande märkta med anti-Nf- eller antifos-Nf-antikroppar respektive Btx (figur 2, övre paneler). Varje högupplöst konfokal bild av ett NMJ som erhållits efter det att immunostainningen användes för att bestämma de morfometriska mätningar och index som anges i protokollavsnittet(tabell 1)med tillämpning av de parametrar som beskrivs i de nedre panelerna i figur 2.
För att visa att denna fullmonterade NMJ-beredning perfekt behöll synapsarkitekturen, vilket gjorde det möjligt att visualisera effekten som har en progressiv nervsystemet sjukdom på den, retade fibrer av transgena råttor som uttrycker mänskliga gen sod1G93A (en ALS-modell) var immunostained med hjälp av protokollet (Figur 3). De sammansmã¤ndende bilderna av pre- och postsynaptiska signaler med atomkärnorna färgade med DAPI visade att skillnaderna mellan de transgena och icke-transgena åldersmatchade djuren är tydligt synliga och förenliga med de resultat som litteraturen förväntade sig.
Dessutom gjorde kvaliteten på bilderna det möjligt att kvantifiera de förändringar som observerats genom att utföra den morfometriska analysen. Figur 4 visar till exempel att den postsynaptiska signalen hos transgena djur verkar vara mer kompakt (cirka 20 %), främst på grund av minskningen av NMJ:s totala areal.
Å andra sidan visar figur 5 att nmjs presynaptiska område hos transgena djur också minskar. Kvaliteten på denna hela mount NMJ förberedelse visades genom att analysera omfattningen av nerv terminal upprullning och genom att upptäcka förändringar som rör neurofilament fosforylering stater. Detta faktum kommer att vara viktigt för att få en djup insikt för NMJ:s demonteringsprocess relaterad till ALS-sjukdomen i den modell som används. Det minsta presynaptiska området som upptäcktes var det som var märkt med antifosforylerad neurofilament (figur 5B, E, C, F).
Användningen av täckningsindexet (figur 6) gjorde det möjligt att fastställa att de transgena NMJs delvis var bucklade. Det kan också fastställa att täckningsindexen för fosforylerad neurofilament är lägre än de som erhålls med icke-fosforylerad neurofilament. Dessa resultat visar statusen för hela nmj och att det kan vara användbart att införa studien av neurofilament fosforylering tillstånd (en viktig determinant för glödtråd plasticitet och stabilitet) med hjälp av denna hela mount NMJ beredning.
Slutligen erbjuder metoder som presenteras i detta arbete den största NMJ-kvaliteten för att identifiera, bedöma och utvärdera även subtila förändringar i NMJ som helhet eller i en av dess komponenter.
Figur 1:EDL och soleus anatomiska landmärken. Bildmarkering (A) EDL och (B) soleus plats bland de andra musklerna i råttan nedre bakbenet. Insets visar scheman av bakbensmusklerna nära EDL (röda) och soleus (gröna) muskler. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2:Helmonterad neuromuskulär korsning av EDL muskelfibrer. (A) Postsynaptisk komponent i NMJ upptäckt med alfa-bungarotoxin (Btx, magenta), en sond som binder specifikt till acetylkolinreceptorerna (AChR). (B) Motorterminal upptäckt med antineurofilament (anti-Nf, grön). C,D) Synaptiska komponenter schemaläggs för att illustrera de parametrar (yttre och inre gränser) som definierade de mätningar (total yta, presynaptiskt och postsynaptiskt område) som används för den morfometriska analys som beskrivs i protokollet. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: För- och postsynaptiska förändringar som observerats i NMJs av en ALS-modell. Representativa konfokala bilder från helt mount NMJs erhålls i preparat från EDL muskelfibrer färgas för att upptäcka neurofilament (grön), AChR (magenta) och kärnan (blå) från antingen icke-transgena (-/-) eller transgena (hSOD1G93A/-) råttor. A,C) Icke-transgena råttor har normal NMJ-morfologi (kringlaform) både när motoränden visualiseras med anti-Phos-Nf (A) eller anti-Nf (C). B,D) Transgena råttor presenterar mer kompakt postsynaptiskt område och mindre presynaptiska terminaler med en minskning av neurofilamentfosforyleringssignalen. Skalstång = 50 μm.
Figur 4:Morfometrisk utvärdering av NMJ postsynaptiskt element i EDL muskler från 180 dagar gamla manliga hSOD1G93A råttor. Representativa konfokala bilder av postsynaptiska komponenter i(A,D)icke-transgena och(B,E)transgena djur. Utvärdering av(C)postsynaptiskt område och(F)postsynaptiskt densitetsindex i NMJs av icke-transgena (fasta kolonner) och transgena (randiga kolonner) djur. Medan det postsynaptiska området minskade något hos transgena djur, ökade det postsynaptiska indexet i större andel och belyste graden av NMJ-komprimering, vilket indikeras av minskad total yta hos transgena djur enligt tabell 1. Skalstång = 50 μm. Representerade uppgifter är ± SEM. (*) och (***) som anges p<0,05 respektive p<0,001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Morfometrisk utvärdering av NMJ presynaptiskt element i EDL muskler från 180 dagar gamla manliga hSOD1G93A råttor. Med tanke på vikten av NMJ demontering i ALS sjukdom utvärderades kvaliteten på preparatet genom att analysera, inte bara omfattningen av nerv terminal upprullning, men också möjligheten att upptäcka förändringar i fosforylering av NMJ presynaptic element. Representativa konfokala bilder av den presynaptiska komponenten i(A,D)icke-transgena och(B,E)transgena djur som påvisats med antikroppar mot phos-Nf eller (D,E)som inte är transgena. Utvärdering av presynaptiskt område avgränsat med(C)fosforylerade och (F) icke-fosforylerade neurofilament i NMJs av icke-transgena (fasta kolonner) och transgena (randiga kolonner) djur. Observera att dessa områden är mycket lika hos icke-transgena djur, medan de innebär en betydande minskning av nmjs hos transgena djur. Skalstång = 50 μm. Representerade uppgifter är ± SEM. (***** ) angiven p<0.0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 6: Utvärdering av innervationsstatus vid helt monterade NMJs av EDL hSOD1G93A-fibrer. Täckningsindexet används ofta för att utvärdera innervations tillstånd. Det anses att "helt innervated" NMJs presenterar ett 
täckningsindex 50%, medan de "delvis innervated" har täckningar mellan ≥20% och ≤50% och de lediga anses vara "denervated". Representativa konfokala bilder av (A,D)icke-transgena och(B,E)transgena NMJs som visar presynaptiska och postsynaptiska element som detekteras medhjälp av (A,B)antifos-Nf- eller (D,E)anti-Nf-antikroppar för att observera motorterminalen. Utvärdering av täckning medhjälp av (C)fosforylerade och(F)icke-fosforylerade neurofilament i NMJs av icke-transgena (fasta kolonner) och transgena (randiga kolonner) djur. Bilderna och grafiken visar bevis för att NMJs från transgena djur presenterar ett index med lägre täckning än icke-transgena. Dessutom är täckningsindexen för fosforylerade neurofilament lägre (18%) hos transgena djur än de som erhålls när den icke-fosforylerade formen ( 25 %) detekteras. Detta faktum bekräftas med förhållandet mellan båda indexen som visas i tabell 1. Observera att preparatens kvalitet gör det möjligt att erhålla 50 % av det täckningsindex som anges för de nmjs som förväntas vara "helt innervated". Skalstång = 50 μm. Representerade uppgifter är ± SEM. (***) respektive (***** ) som anges p<0,001 respektive p<0.0001. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Tabell 1. Morfometriska parametrar och förhållanden som erhålls från helt mount NMJs av icke-transgena och transgena EDL fibrer. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den här artikeln presenterar vi ett detaljerat protokoll för dissekering av två rått skelettmuskler (en långsam-twitch och den andra snabbryckning), fiber muskel isolering och immunofluorescens detektion av pre och postsynaptic markörer att kvantitativt bedöma NMJ förändringar samt montering /demontering processer. Denna typ av protokoll kan vara användbart i gnagaremodeller 41,42 att utvärdera NMJ under fysiologiska eller patologiska processer som exemplifieras här i en modell av motorisk neuron degeneration såsom finns i ALS hSOD1G93A råttor.
För att uppnå framgång och fördelaktiga resultat är det nödvändigt att komma ihåg några tips. Det beskrivna protokollet tillåter till exempel omedelbar användning av dissekerade muskler. Men när det är nödvändigt för att bevara muskeln längre kan användningen av DPBS med 0,05% natriumazid plus 4 °C lagring förlänga utmärkt muskelbevarande upp till 4 veckor. Vid användning av detta alternativ måste omfattande tvättar med DPBS göras (5x, 10 min vardera) innan färgningsprocessen påbörjas. Ett annat användbart alternativ för att få bilder av god kvalitet inkluderar att sänka PFA-koncentrationen med 0,5% eftersom det minskade muskeln autofluorescens. Detta måste åtföljas av längre fixering upp till 24 timmar vid 4 °C.
När det gäller fiberisolering producerar mindre grupper av fibrer bättre immundetection egenskaper. Fibrerna som torkas på silaniserade diabilder måste användas inom 2 till 3 dagar. Efter denna tid är immunodetectionsna inte av god kvalitet.
Ett alternativ till torkade fibrer på silaniserade diabilder är att generera en uppsättning delvis isolerade fibrer som hålls ihop av senvävnaden i en av fibrernas ände (en "tuft" av muskelfibrer) och utföra inkubationer i mikrocentrifugrör med den "fritt flytande" metoden. Med detta alternativ är det nödvändigt att öka antikroppens inkubationstider med flera timmar (24-48 h) samt antalet tvättar (minst 6 av 10 minuter vardera).
I förhållande till fiberisolering utan skador är det nödvändigt att utföra "retningen" genom att ta bort ändarna där senan försiktigt drar i motsatta riktningar för att uppnå fiberseparation.
Ett annat kritiskt steg för att förbättra immundetection är tillsats av 1% Triton X-100 och 50 mM glycin i BB. Detta är viktigt för att få preparat som har homogen färgning och lite bakgrund. Det är också värt att nämna att ha lite bakgrund kan vara fördelaktigt när osedda fibrer behöver avbildas. Fiberdiametern är bra att mäta långt från NMJ-fältet eftersom det beskrivs att den kan ökas på denna nivå. Bestäm därför fiberdiametern på ett avstånd som motsvarar värdet på en NMJ-profil.
Med hjälp av det förfarande som presenteras är det möjligt att identifiera och kvantifiera NMJ-komponenter under fysiologiska förhållanden. Det gör det också möjligt att studera tidiga viktiga patologiska händelser som NMJ demontering24 och förlust av fosforylerad neurofilament i terminaländelser 39 som beskrivs i ALS patogenes. Av denna anledning erbjuder det beskrivna protokollet ett alternativt och enkelt tillvägagångssätt för att hjälpa till att få en bättre förståelse för NMJ-ombyggnaden, vilket tyder på att morfologiska funktioner visualiserade kan vara användbara verktyg för att diagnostisera degenererande tillstånd av NMJs eller för att bedöma olika terapeutiska metoder. Det är också tillämpligt på andra sjukdomsmodeller som charcot-Marie-Tooth41 och spinal muskelatrofi42 som utgör NMJ-störningar.
Dessutom kan metoder som beskrivs i detta arbete användas för att identifiera Schwann-cellerna som integrerar denna trepartssynaps och så småningom bedöma några av dess roller under NMJ-ombyggnad43. Studier kan göras på nyfödda tills vuxna, under fysiologiska förhållanden eller som svar på olika behandlingar som påverkar det neuromuskulära systemet.
Slutligen, trots den utmärkta hantering som krävs för att dissekera och märka prover tillsammans med tid som förbrukas för att göra manuella mätningar, möjliggör metodik som presenteras här en optimal märkning av de olika NMJ-komponenterna på grund av underlättad penetration av antikroppar och sonder. Även om bättre penetration kan erhållas i sektionerade muskelpreparat, bevarar retning den morfologiska integriteten hos 3D för alla synaptiska komponenter som kan gå förlorade i muskelsektioner. Det undviker också alla förberedelser som behövs för att göra avsnitt som införandet av muskelstycket och ytterligare antigenhämtning för att få genomförbart erkännande. Dessutom, jämfört med hela monteringspreparat som bevarar de fullständiga innervationsmönstren, möjliggör retning studier av isolerade fibrer. Detta kan vara en betydande fördel när det behövs för att bedöma fiber heterogenitet rapporteras i patologiska förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Stort tack till CSIC och PEDECIBA för det ekonomiska stöd som ges till detta arbete. till Natalia Rosano för hennes manuskriptkorrigeringar; till Marcelo Casacuberta som gör videon och till Nicolás Bolatto för att han lånade ut sin röst för den.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
