Summary
المقدمة هو بروتوكول لتوسيع غاما دلتا (γδ) تي منتج المخدرات الخلية. يتم عزل الخلايا الليمفاوية عن طريق التملؤ وتخصيب γδ مع حمض الزوليدرونيك وبينلوكين-2. يتم استنفاد خلايا ألفا بيتا تي باستخدام جهاز فصل مغناطيسي من الدرجة السريرية. يتم استزراع الخلايا مع خلايا تقديم مستضد اصطناعية مشتقة من K562 وتوسيعها.
Abstract
على الرغم من أن Vγ9Vδ2 T الخلايا هي مجموعة فرعية ثانوية من الخلايا الليمفاوية T, وسعى بعد هذه المجموعة لقدرتها على التعرف على المستضدات في مجمع التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) بطريقة مستقلة وتطوير وظيفة قوية التأثير الخلوي الذي يجعلها مرشحا مثاليا للعلاج المناعي للسرطان. نظرا لانخفاض وتيرة غاما دلتا (γδ) الخلايا التائية في الدم المحيطي، وضعنا بروتوكول فعال لتوسيع كبير في نقية للغاية γδ الخلايا التائية المنتج المخدرات للاستخدام الأول في الإنسان من الخلايا التائية الالوجينية في المرضى الذين يعانون من سرطان الدم النخاعي الحاد (AML). باستخدام التخسيس المانح السليم كمصدر للخلايا المسببة للسرطان ، يتم عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام جهاز تم التحقق من صحته لطريقة الطرد المركزي للتدفق المضاد لفصل الخلايا حسب الحجم والكثافة.
يستخدم الكسر الغني بالخلايا اللمفاوية ، ويتم تنشيط الخلايا التائية بشكل تفضيلي مع حمض الزوليدرونيك (وافقت عليه FDA) وinterleukin (IL) - 2 لمدة 7 أيام. بعد التوسع التفضيلي للخلايا التائية γδ، يتم استخدام جهاز فصل الخلايا المغناطيسية من الدرجة السريرية والخرز TCRαβ لاستنفاد مستقبلات الخلايا التائية الملوثة (TCR)αβ T cells. ثم تخضع الخلايا التائية عالية الإثراء لتوسع ثان باستخدام خلايا عرض مستضد اصطناعية هندسية (aAPCs) مشتقة من خلايا K562 المعدلة وراثيا للتعبير عن جزء متغير أحادي السلسلة (scFv) ل CD3 و CD28 و 41BBL (CD137L) و IL15-RA جنبا إلى جنب مع حمض الزولدروك وIL-2. البذر كل يوم-7 المخصب γδ الخلايا التائية في الثقافة المشتركة مع aAPCs يسهل تصنيع الخلايا التائية نقية للغاية مع متوسط توسيع أضعاف >229,000 أضعاف من الدم المتبرع صحية.
Introduction
الانتكاس سرطان الدم هو السبب الرئيسي للوفيات بعد زرع الخلايا الدموية (HCT) في المرضى الذين يعانون من AML1,2,3. تم الإبلاغ عن بقاء أفضل خالية من سرطان الدم مع زيادة انتعاش خلايا الدم T γδ بعد HCT دون زيادة خطر الكسب غير المشروع مقابل المرض المضيف (GVHD)4. قدرة الخلايا التائية γδ على التعرف على المستضدات بطريقة مستقلة MHC وتطوير وظائف قوية المتحللة الخلوية وTh1 مثل تأثير جعل هذا السكان الفرعية طفيفة من الخلايا التائية مثالية لعلاج المرضى الذين يخضعون لعملية زرع الخلايا الالوجينية في خطر الانتكاس5. وبالنظر إلى أن الخلايا التائية Vγ9Vδ2 هي مجموعة فرعية ثانوية من الخلايا الليمفاوية T تتراوح بين 0.5٪ إلى 5٪ من الخلايا التائية في المحيط6، شرعنا في إنشاء نظام قوي لتوسيع هذه المجموعة النادرة من خلايا الدم لتحقيق جرعات علاجية محتملة للتجارب السريرية.
على الرغم من أن البعض الآخر قد توسعت بنجاح γδ الخلايا التائية باستخدام حمض الزوليدروك وحتى aAPCs, لقد وضعنا عملية يمكن أن توسع يحتمل أن γδ الخلايا التائية من قبل 229,749 أضعاف. التوسع ثنائي الطور: أولا ، يتم الحصول على الخلايا الليمفاوية عن طريق التملص باستخدام أداة الفصل. توفر المعدات نظاما مغلقا يسمح بفصل الخلايا استنادا إلى حجمها وشكلها وكثافتها عن طريق الطرد المركزي للتدفق المضاد. بعد إثراء للخلايا الليمفاوية، يتم تحقيق التوسع الانتقائي للخلايا T Vγ9Vδ2 عن طريق العلاج مع حمض الزوليدرونيك وIL-2 لمدة 7 أيام. بعد هذا العلاج مباشرة، يتم استنفاد الخلايا TCR-αβ باستخدام تكنولوجيا الميكروبات، مما يسمح للتوسع اللاحق للخلايا T γδ مع AAPCs المشتقة من K562.
للتحقق من صحة العملية، تم استخدام 5 × 106 خلايا تي موسعة حمض الزوليدرونيك فقط لتوسيع المرحلة-2 الثقافة المشتركة مع aAPCs. في هذه المرحلة الثانية من التوسع، يتم تنشيط الخلايا التائية باستخدام بنك خلايا العمل المتوافق مع ممارسات التصنيع الجيدة الحالية (cGMP) (WCB) من AAPCs المشتقة من K562 المعدلة وراثيا (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL; scFv-CD28-IL15-RA)) المصنعة في موفيت. ويستند الأساس المنطقي لهذا التوسع ثنائي الطور على قدرة حمض الزوليدرونيك على تثبيط فارنيسيل ثنائي فوسفات synthase (FDPS) في الخلايا الأحادية، مما يؤدي إلى تراكم الفوسفات البروفاسي الإيزوبينيل، الذي يحفز مباشرة خلايا Vγ2Vδ2. في المرحلة الثانية من التوسع، توفر المركبات المشتقة من K562 (K562VL6 (scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) تحفيزا قويا لجميع الخلايا التائية. ومع ذلك، تم بالفعل إثراء منتج الخلية للخلايا التائية γδ، مما أدى إلى توسع قوي في الخلايا التائية γδ.
مع استخدام معدات وقوارير محددة ، فإن العملية هي نظام مغلق وظيفيا ، وبالتالي تقليل خطر التلوث. بالإضافة إلى ذلك، يسهل المفاعل الحيوي المغلق 1 لتر النمو الأقصى وتوسيع الخلايا في حجم إجمالي قدره 1 لتر من المتوسط مع الحد الأدنى من الحاجة للتغذية. ميزة طريقة موفيت هو أنه يوفر نظام خلية T سريعة وقابلة للاستنساخ وقابلة للاستنساخ وممكنة للغاية لإنتاج نقية للغاية، مشتقة من المانح γδ منتج الخلية التائية للإدارة allogeneic. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي تجربة سريرية تهدف إلى استخدام الخلايا التائية البشرية التي تعبر عن مستقبلات الخلايا T Vγ2Vδ2 كتناعي بالتبني للتوسط في المناعة ضد الميكروبات والأورام في مرضى السرطان الذين يعانون من مغفرة جزئية وكاملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر منصة قوية لتطوير وإنتاج γδ مستقبلات مستضد الشيمي إيجابية (CAR +) الخلايا التائية.
Protocol
ملاحظة: تم الحصول على موافقة مجلس الهجرة والحواسة، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من الجهات المانحة.
1. عزل الخلايا الليمفاوية
- نقل المنتج apheresis إلى غرفة نظيفة.
ملاحظة: تم إجراء التحقق من صحة العملية باستخدام apheresis المانح العادي من بائع تجاري خارجي متوافق مع لوائح جمع المواد الخلوية الخام. - جمع عينات لاختبار العقم، وعدد الخلايا، وphenotyping الخلية.
- Elutriate على جهاز الطرد المركزي التدفق المضاد باستخدام وسيلة أساسية من هانكس متوازنة ملح الحل مع 1٪ من الألبومين مصل الإنسان (HSA) ووسيط ثانوي من محلول ملحي (0.9٪ كلوريد الصوديوم حقن USP) أو ملحية الفوسفات المخزنة بالفوسفات (DPBS). تعيين سرعة الطرد المركزي elutriation في 900 × غرام وجمع الكسور على أساس معدل التدفق والوقت.
- جمع عينات من الكسر 2 وإجراء الاختبارات التالية: 2 مل لاختبار العقم; 0.5 مل لعدد الخلايا وقابليتها للاستمرار باستخدام برتقالة acridine / البروبيديوم يوديد (AO / PI)؛ 5 × 106 خلايا لفينوتيبينج الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي.
- توسيع كسر الخلايا الليمفاوية النقية (كسر 2) من الخلايا في الثقافة في 10 × 106 خلايا / سم2 في 1 لتر مفاعل حيوي مغلق النظام مع 5 ميكرومول / لتر من حمض الزوليدرونيك و 300 وحدة/ مل من IL-2.
- احتضان لمدة سبعة أيام في حاضنة حددت في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
2. ألفا بيتا (αβ) استنفاد الخلايا التائية
- حصاد الخلايا من قارورة مفاعل حيوي مغلقة 1 لتر. العقيمة لحام حزمة نقل 1 لتر إلى الخط الأحمر من المفاعل الحيوي مغلق النظام، واستخدام مضخة الصيدلانية المناسبة لنقل الخلايا إلى حزمة نقل.
- خذ العينات التالية: 10 مل للعقم المتوسط المستهلك؛ 0.5 مل من الخلايا لحساب الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام AO / PI؛ 5 × 106 خلايا لقياس التدفق الخلوي
- إعادة إنفاق الخلايا في ~ 5 × 108 خلايا / مل في المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) أو (PBS / حمض الإيثيلينامينتتراستيك (EDTA)) العازلة + 0.5٪ HSA والأجسام المضادة TCR αβ محددة.
- وضع شاكر في الثلاجة واحتضان الخلايا في 2-8 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا مع اهتزاز.
- غسل الخلايا مع ما مجموعه 600 مل من مخزن مؤقت PBS / EDTA + 0.5٪ HSA. جهاز طرد مركزي لإزالة الأجسام المضادة غير المنضمة في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية. Resuspend ~ 5 × 108 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني / EDTA العازلة + 0.5 ٪ HSA مع الميكروبات المضادة للبيوتين محددة (7.5 مل / 1 قارورة).
- وضع شاكر في الثلاجة واحتضان الخلايا في 2-8 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا مع اهتزاز. بعد الحضانة، والطرد المركزي الخلايا في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في 2-8 درجة مئوية لإزالة الميكروبات غير المنضمة. Resuspend ~ 6 × 107 خلايا / مل في برنامج تلفزيوني / EDTA العازلة + 0.5 ٪ HSA ونقلها إلى حقيبة نقل حزمة.
- تثبيت مجموعة أنابيب في الصف السريري جهاز فصل الخلايا المغناطيسية باتباع تعليمات الشركة المصنعة، ووضع حزم مع المخزن المؤقت PBS / EDTA وحزمة نقل مع المنتج الخلية في الصك وارتفاع عندما أمرت من قبل الصك.
- حدد بروتوكول Depletion 1.2 لاستنفاد الخلايا التائية المسماة αβ.
- الطرد المركزي الكسر المستهدف (المخصب γδ الخلايا التائية) وإعادة إنفاق الخلايا في المتوسط تكملها 10٪ مصل AB الإنسان.
- خذ عينة 0.5 مل واحسب عدد الخلايا وقابليتها للاستمرار مع بقعة AO/PI. جلب الخلايا إلى تركيز النهائي من حوالي 1 × 106 خلايا / مل. خذ عينة من 5 × 106 خلايا من المنتج لتدفق الخلايا phenotyping بعد الاستنفاد.
3. الثقافة المشتركة مع AAPCs
- إشعاع 5 × 107 aAPCs / قارورة في 100 Gy على أداة توليد الأشعة السينية.
- استخدام aAPCs في الثقافة المشتركة بنسبة 10:1 مع الخلايا التائية γδ. ضع AAPCs المشععة (5 × 107 خلايا / قارورة) والخلايا التائية (5 × 106 خلايا / قارورة) في 1 L قوارير مفاعل حيوي مغلق النظام مع 1 لتر من الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. البذور تصل إلى 10 قوارير.
- توسيع الخلايا في الثقافة لمدة 10 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
- مراقبة مستويات الجلوكوز واللاكتات كل 3-4 أيام باستخدام شرائح, الجلوكوز, ومتر اللاكتات.
- إذا انخفض الجلوكوز إلى 250 ملغم/ديسيلتر، قم بتخفيض الحجم في القارورة إلى 200 مل باستخدام مضخة صيدلانية عن طريق اللحام العقيم لحزمة نقل 1 لتر إلى الخط الأحمر للمقلح الحيوي للنظام المغلق.
- اخلط الخلايا في 200 مل المتبقية، وأخذ عينة 0.5 مل لعد الخلايا وقياس قابليتها للحياة عن طريق تلطيخ AO-PI. إذا كان عدد الخلايا هو ≥109، وتقسيم قارورة واحدة إلى قارورتين وملء كل قارورة تصل إلى 1 L مع AIM-V تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. إذا كان عدد الخلايا هو <109، تغذية الخلايا مع لتر جديد من الثقافة المتوسطة تكملها 10٪ مصل AB الإنسان.
- كرر الخطوة 3.6 لجميع القوارير وإعادتها إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. كرر الخطوات 3.4-3.7 كل 3 إلى 4 أيام.
4. حصاد الخلية
- في نهاية 10 أيام في الثقافة المشتركة، حصاد جميع قوارير المفاعل الحيوي. حصاد قارورة مفاعل حيوي واحد في وقت واحد، وتجمع جميع الخلايا في حزمة نقل من الحجم المناسب. العقيمة لحام حزمة نقل إلى الخط الأحمر من المفاعل الحيوي مغلق النظام، واستخدام مضخة الصيدلانية لنقل الخلايا إلى حزمة نقل.
- إزالة عينات مراقبة الجودة التالية: 1٪ من منتج الدواء (DP) للعقم عن طريق زراعة الدم وتلطيخ الغرام؛ 0.5 مل لحساب الخلايا وقابليتها للاستمرار باستخدام AO/PI؛ 5-10 × 106 خلايا لقياس التدفق الخلوي (انظر الشكل 1 لاستراتيجية الغاينغ)؛ 0.5 مل للسمين الإندوتوشين؛ 0.5 مل لتلطيخ غرام; ارتفعت 106 خلايا إلى 10 مل من المتوسطة المستهلكة لاختبار الميكوبلازما.
- الطرد المركزي الخلايا في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتخلص من supernatant.
- غسل الخلايا في حل من محلول كريستالويد متوازن + 0.5٪ HSA في 200-500 × غرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. Resuspend لهم في حجم مستهدف من 100-300 مل من محلول كريستالويد متوازن + 0.5٪ HSA.
5. اختبار الإصدار
- إجراء اختبار مراقبة الجودة للخلية γδ T DP لما يلي: النقاء والهوية حسب قياس التدفق الخلوي (لايف / ميت، CD45، CD3، TCR αβ، TCR γδ، CD20، CD56، CD16)؛ قابلية البقاء بواسطة AO / PI تلطيخ; السموم الداخلية; اختبار الميكوبلازما بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)؛ العقم عن طريق تلطيخ غرام والثقافات الهوائية والهوائية الدم; فحص K562 المتبقي حسب قياس التدفق الخلوي (CD3-CD16-CD56-CD71+).
Representative Results
تم وصف عملية الخلية T γδ والأمثل لإنتاج المنتج المخدرات الخلية T γδ. وشملت عملية التحسين 1) إثراء الخلايا الليمفاوية باستخدام التبرأ، 2) γδ T الخلية مادة المخدرات (DS) توسيع الخلية محددة مع حمض الزوليدرونيك، 3) γδ T خلية DS استنفاد TCRαβ، 4) التوسع الثانوي للخلية T γδ DS باستخدام K562 المشتقة aAPCs، و 5) الحصاد DP النهائي وصياغة المنتج للإدارة أو cryopreservation. بعد تحسين العملية، تم إجراء عمليات التأكيد على نطاق واسع باستخدام المواد المشتقة من ثلاثة متبرعين أصحاء لتأكيد ملاءمة معالجة الخلايا. تم تحليل جميع البيانات وتلخيصها في الجدول 1 والجدول 2 والجدول 3. الخلايا المنفصلة عن كسر الطرد المركزي بعد التدفق المضاد 2 (F2) أسفرت عن مجموعة من الخلايا الليمفاوية النقية بمعدل 99.23٪ خلايا CD45 + (ذكرت كتردد إجمالي البوابة الحية) ومتوسط صلاحية ممتاز قدره 95.80٪ (الجدول 1).
اعتمد التوسع الخاص بالخلايا التائية مع حمض الزوليدرونيك على النسبة المئوية الأولية لخلايا القاتل الطبيعي (NK) الموجودة في كسر الخلايا الليمفاوية (F2) بعد التملز. وكان إثراء الخلية T DS مع استنفاد TCRαβ متسقا (الجدول 2). الخلية T γδ DP المصنعة من ثلاثة متبرعين أصحاء كان متوسط 0.11٪ ± 0.05٪ خلايا CD20 + B و 0.00٪ ± 0.00٪ TCR αβ + T الخلايا، وبالتالي تلبية معيار الإفراج عن ≤1٪ من الخلايا TCR αβ + T. متوسط نسبة خلايا NK في المنتج النهائي هو 17.06٪ ± 26.19٪ ويلبي معيار الإصدار <35٪. بالإضافة إلى ذلك، كان متوسط النسبة المئوية للخلايا التائية والخلايا السلبية للخلايا NK في المنتج النهائي 0.48٪ ± 0.42٪ (الجدول 3). تم استخدام تلطيخ سطح الخلية وتحليل التدفق الخلوي لتوصيف هوية ونقاء وشوائب العملية في DS و DP ، كما هو موضح في الشكل 2A-D.
التوسع الثانوي، الذي تحقق من الثقافة المشتركة للAPC (K562CL6 (CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB و γδ T الخلية DS بنسبة 10:1، ولدت خلية γδ T DP التي تلبي جميع معايير الإصدار، كما هو مبين في الجدول 4. بالإضافة إلى ذلك، كانت الخلايا ملطخة وتقييمها عن طريق قياس التدفق الخلوي في اليوم 0-counterflow الطرد المركزي خلايا F2، اليوم 7-zoledronic حمض الموسعة الخلايا التائية، اليوم 7-TCR αβ استنفاد الخلايا التائية، يوم 17-النهائي DP لمجموعة المؤشرات الحيوية التالية من التمايز (CD)3، TCRαβ، TCR γδ، CD45RA، CD45RO، CC مستقبلات chemokine 7 (CCR7)، مبرمجة بروتين موت الخلية-1 (PD-1)، البروتين 4 المرتبط بالخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا الخلوية 4 (CTLA4)، والجين 3 المنشط للخلايا الليمفاوية (LAG3)، والغلوبولين المناعي للخلايا التائية والبروتين المحتوي على مجال الموسين 3 (TIM3). يتم متوسط البيانات المعروضة في الشكل 3 من ثلاثة أشواط مستقلة وتبين أن الخلايا لم تصل إلى الإرهاق. كما طور صندوق Moffitt CTF فحصا متبقيا ل K562 لتحديد شوائب DP المتعلقة ب AAPCs المشتقة من K562 (الشكل 4).
وكانت استراتيجية تدفق قياس الخلايا المستخدمة لتوصيف النسب المئوية لأنواع الخلايا على النحو التالي: 1) النقب على T وNK الخلايا النسب السلبية السكان (CD3-CD56-CD16-); 2) بوابة على CD71 + (مستقبلات نقل أعرب في نسب الغدة الدرقية ومكافحة غسل الأموال السماح للكشف عن الخلايا K562 المتبقية). سمحت استراتيجية التجعيد هذه بتقييم خلايا CD3-CD16-CD56-CD71+ وهي AAPC (K562CL6 (scFv-CD3-CD137; scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (يطلق عليها "K562 المتبقية" في الشكل 4). يسمح هذا gating تعداد K562 المتبقية في DP النهائي عن طريق ضرب وتيرة K562 المتبقية من قبل مجموع عدد قابلة للحياة (TVC) من DP (٪ CD71 + × DP TVC = K562 المتبقية الخلايا في موانئ دبي). يتم الإبلاغ عن جميع البيانات الخلوية التدفق كتردد الخلايا الحية. الجدول 5 والشكل 4 توفر النسب المئوية للخلية T والنسب الخلية NK سلبية وكذلك الخلايا K562 المتبقية. تم إجراء اختبار t ذو ذيلين لتحديد الأهمية الإحصائية للاختلافات بين هذه المجموعات السكانية وكشف عن وجود فرق كبير بين WCB و οδ T Cell DP وبين WCB و γδ T cells (t = 0.0019 للخلية التائية والنسب السلبي للخلايا NK؛ ر < 0.0001 لK562 المتبقية و t = 0.0314 للخلية T والنسب الخلية NK سلبية؛ ر < 0.0001 لK562 المتبقية) (الجدول 5).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لاستراتيجية تدفق قياس الخلايا. المختصرات: aAPC = ، خلية تقديم مستضد اصطناعية؛ SSC-A = الجانب مبعثر منطقة الذروة; FSC-A = إلى الأمام مبعثر منطقة الذروة; SSC-H = الجانب مبعثر الارتفاع من الذروة; FSC-H = إلى الأمام مبعثر الارتفاع من الذروة؛ CD = مجموعة من التمايز. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تكوين المواد الأولية، الوسيطة، ومنتج الدواء النهائي. يتم متوسط جميع البيانات المعروضة من ثلاثة أشواط مستقلة. (أ) يخضع التحلل من المتبرعين الأصحاء للتملوص باستخدام جهاز الطرد المركزي المضاد للتدفق، مما يؤدي إلى F2 (الكسر الغني بالخلايا الليمفاوية)، والذي يستخدم كمادة البداية. (ب) F2 يخضع Vγ9Vδ2 T الخلايا الخاصة التوسع لمدة 7 أيام مع 5 ميكرومول / لتر من حمض الزوليدرونيك و 300 وحدة في اللتر من IL-2 في 1 لتر من المتوسطة تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. (ج) يتم إجراء استنفاد الخلايا TCR αβ على المنتج الموسع حمض الزوليدرونيك. (د) يتم حصاد منتج المخدرات الخلية التائية نقية للغاية بعد التوسع الثاني لمدة 10 أيام مع AAPCs المشععة في نسبة 1:10 مع 5 ميكرومول / لتر من حمض الزوليدرونيك و 300 وحدة/مل من IL-2 في 1 لتر من المتوسطة تكملها 10٪ مصل AB الإنسان. المختصرات: NK = القاتل الطبيعي. CD = مجموعة من التمايز؛ TCR = مستقبلات الخلايا التائية; IL = إنترلوكين; aAPCs = خلايا تقديم مستضد اصطناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المؤشرات الحيوية للمواد الأولية والمتوسطة والمنتج الدوائي النهائي. يتم جمع الخلايا وملطخة لCD3، TCRαβ، TCR γδ، CD45RA، CD45RO، CCR7، PD-1، CTLA4، LAG3، وTIM3 في اليوم 0-Counterflow الطرد المركزي F2 الخلايا، يوم 7-zoledronic حمض الموسعة الخلايا التائية، اليوم 7-TCR αβ استنفاد الخلايا التائية، يوم 17-المنتج النهائي المخدرات. يتم متوسط جميع البيانات المعروضة من ثلاثة أشواط مستقلة. (أ) مثل الجذعية (CD3 +، TCR γδ+، CD45RA+، CD45RO-، وCCR7+) كما هو موضح في العدد الإجمالي للخلايا الحية. (ب) الذاكرة المركزية (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+, وCCR7+) التي تم تصويرها كنسبة مئوية من خلايا CD3+ TCR γδ+ . المختصرات: CD = مجموعة من التمايز; TCR = مستقبلات الخلايا التائية; IL = إنترلوكين; . . CCR7 = CC مستقبلات كيموكين 7; PD-1 = بروتين موت الخلايا المبرمج-1; CTLA4 = البروتين الليمفاوي T السام للخلايا الخلوية 4; LAG3 = الجينات تنشيط الخلايا الليمفاوية 3; TIM3 = الغلوبولين المناعي للخلايا التائية والبروتين المحتوي على مجال الموسين 3. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: البيانات التمثيلية لمقاايسة K562 المتبقية (CD3-CD16-CD56-CD71+). المختصرات: aAPC = خلية تقديم مستضد اصطناعية؛ NK = الخلية القاتلة الطبيعية; SSC-A = الجانب مبعثر منطقة الذروة; CD = مجموعة من التمايز؛ IL = إنترلوكين; TCR = مستقبلات الخلايا التائية; MCB = بنك الخلية الرئيسية ; FMO = مضان ناقص واحد؛ DP = منتج المخدرات; WCB = بنك الخلايا العاملة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| خطوات العملية | البارامترات | المتبرعون | متوسط | سانت ديف. | |||
| تشغيل 1 | تشغيل 2 | تشغيل 3 | |||||
| ما بعد التخصيب (الخلايا الليمفاوية كسر F2) | تم بذر TVC جميع عمليات التحقق من الصحة في 109 TVC | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 1.00 X 109 | 0.00 | |
| قابلية البقاء (٪) | 98.6 | 96.6 | 92.2 | 95.8 | 3.27 | ||
| خلايا CD20+ B (٪) | 15.6 | 23.4 | 15.2 | 18.07 | 4.62 | ||
| CD3+ تي الخلية (٪) | 80.04 | 66.7 | 76.1 | 74.28 | 6.85 | ||
| TCR αβ+ (٪) | 77.59 | 58.03 | 68.96 | 68.19 | 9.8 | ||
| TCR γδ+ (٪) | 2.48 | 1.59 | 2.1 | 2.06 | 0.45 | ||
| خلايا CD3-CD56+CD16+ NK (٪) | 6.57 | 19.4 | 10.5 | 12.16 | 6.57 | ||
| T الخلية والنسب الخلية NK سلبية (٪) | 13 | 13.7 | 13.4 | 13.37 | 0.35 | ||
الجدول 1: ملخص إثراء الخلايا الليمفاوية عن طريق التمليل المبلغ عنه كتواتر للخلايا الحية. الاختصارات: TVC = العدد الإجمالي القابل للتطبيق؛ TCR = مستقبلات الخلايا التائية; CD = مجموعة من التمايز؛ NK = الخلية القاتلة الطبيعية.
| خطوات العملية | البارامترات | المتبرعون | متوسط | سانت ديف. | |||
| تشغيل 1 | تشغيل 2 | تشغيل 3 | |||||
| 7 أيام بعد التوسع حمض الزوليدرونيك (قبل- استنفاد TCRαβ) | TVC | 3.69 × 109 | 1.79 × 109 | 1.42 × 109 | 2.3 × 109 | 1.22 × 109 | |
| قابلية البقاء (٪) | 99.2 | 82.6 | 89.8 | 90.53 | 8.32 | ||
| خلايا CD20+ B | 2.1 | 11.5 | 7.08 | 6.89 | 4.7 | ||
| CD3+ تي الخلية (٪) | 95.7 | 64.1 | 91.9 | 83.9 | 17.25 | ||
| TCR αβ+ (٪) | 13.88 | 38.14 | 31.98 | 28 | 12.61 | ||
| TCR γδ+ (٪) | 81.44 | 24.93 | 56.98 | 54.45 | 28.34 | ||
| خلايا CD3-CD56+CD16+ NK (٪) | 3.59 | 33.1 | 7.28 | 14.66 | 16.08 | ||
| T الخلية والنسب الخلية NK سلبية (٪) | 0.67 | 2.7 | 0.82 | 1.4 | 1.13 | ||
| استنفاد ما بعد TCRαβ | TVC | 1.81 × 109 | 4.95 × 108 | 3.80 × 108 | 8.95 X108 | 7.94 × 108 | |
| صلاحية الخلية (٪) | 98.8 | 87.6 | 89.8 | 92.07 | 5.93 | ||
| خلايا CD20+ B | 2.26 | 12 | 6.59 | 6.95 | 4.88 | ||
| CD3+ تي الخلية (٪) | 95.8 | 45.3 | 89.7 | 76.93 | 27.56 | ||
| TCR αβ+ (٪) | 0 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | ||
| TCR γδ+ (٪) | 95.61 | 45.07 | 89.16 | 76.61 | 27.51 | ||
| خلايا CD3-CD56+CD16+ NK (٪) | 3.85 | 59.9 | 9.79 | 24.51 | 30.79 | ||
| T الخلية والنسب الخلية NK سلبية (٪) | 0.34 | 1.72 | 0.45 | 0.84 | 0.77 | ||
| TCR αβ + TVC | 0.00 | 4.95 × 103 | 3.8 × 103 | 2.92 × 103 | 2.59 × 103 | ||
| TCR γδ+ TVC | 1.73 × 109 | 2.23 × 108 | 3.39 × 108 | 7.64 × 108 | 8.39 × 108 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK TVC | 6.97 × 107 | 2.97 × 108 | 3.72E +07 | 1.35 × 108 | 1.42 × 108 | ||
الجدول 2: ملخص توسع الخلية التائية مع حمض الزوليدرونيك وإثراء الأدوات المبلغ عنها كتردد للخلايا الحية. الاختصارات:TVC = العدد الإجمالي القابل للتطبيق؛ TCR = مستقبلات الخلايا التائية; CD = مجموعة من التمايز؛ NK = الخلية القاتلة الطبيعية.
| سمات المنتج | البارامترات | المتبرعون | متوسط | سانت ديف. | |||
| تشغيل 1 | تشغيل 2 | تشغيل 3 | |||||
| اليوم 0 γδ الخلايا التائية | 2.48 × 107 | 1.59 × 107 | 2.10 × 107 | 2.06 × 107 | 4.47 × 107 | ||
| اليوم السابع بعد التخصيب γδ T الخلايا | 1.73 × 109 | 2.23 × 108 | 3.39 × 108 | 7.64 × 108 | 8.39 × 108 | ||
| أضعاف التوسع في اليوم 7 | 69.76 | 14.03 | 16.14 | 33.31 | 31.58 | ||
| TVC في الحصاد* | 8.14 X 1010 | 1.67 X 1010 | 6.84 X 1010 | 5.55 X 1010 | 3.42 X 1010 | ||
| صلاحية الخلية (٪) | 92.8 | 85.5 | 87.3 | 88.53 | 3.80 | ||
| خلايا CD20+ B (٪) | 0.12 | 0.06 | 0.15 | 0.11 | 0.05 | ||
| CD3+ تي الخلية (٪) | 97.8 | 52 | 97.5 | 82.43 | 26.36 | ||
| TCR αβ+ (٪) | 0 | 0.001 | 0 | 0.00 | 0.00 | ||
| TCR γδ+ (٪) | 97.51 | 50.13 | 97.21 | 81.62 | 27.27 | ||
| خلايا CD3-CD56+CD16+ NK (٪) | 2.16 | 47.3 | 1.71 | 17.06 | 26.19 | ||
| T الخلية والنسب الخلية NK السلبية، CD71 + K562 المتبقية (٪) | 0.018 | 0.61 | 0.82 | 0.48 | 0.42 | ||
| مجموع الخلايا التائية في الحصاد | 7.93 X 1012 | 8.38 X 1011 | 6.65 X 1012 | 5.14 X 1012 | 3.78 X 1012 | ||
| إجمالي أضعاف التوسع من الخلايا T γδ (من اليوم 0 إلى الحصاد) | 3.20 × 105 | 5.27 × 104 | 3.17 × 105 | 2.30 × 105 | 1.53 × 105 | ||
| *تم تقليص التحقق من صحة العملية إلى قارورة مع خلية T 5 × 106 و50 X106 aAPCs المشععة. الأرقام المبلغ عنها هي لتشغيل النطاق الكامل المتوقع إذا تم زرع 24 قوارير من مادة المخدرات D7 المستخدمة. | |||||||
الجدول 3: ملخص الثقافة المشتركة للخلايا γδ+ T مع aAPCs وحصاد الخلايا التائية الموسع الذي تم الإبلاغ عنه كتردد للخلايا الحية. *تم تقليص التحقق من صحة العملية إلى مفاعل حيوي واحد مغلق (قدرة 1 لتر) مع 5 × 106 خلايا T γδ و50 × 106 aAPCs مشع. الأرقام المبلغ عنها هي لتشغيل كامل المتوقعة إذا تم بذر 24 قوارير من مادة المخدرات D7. المختصرات: aAPCs = خلايا تقديم مستضد اصطناعية؛ TVC = مجموع عدد قابلة للحياة؛ TCR = مستقبلات الخلايا التائية; CD = مجموعة من التمايز؛ NK = الخلية القاتلة الطبيعية.
| معلمة الاختبار | معايير القبول | النتائج | ||
| التحقق من الصحة 1 | التحقق من الصحة 2 | التحقق من الصحة 3 | ||
| صلاحيه | ≥ 70٪ | 92.80% | 85.50% | 87.30% |
| الميكوبلازما | سالب | سالب | سالب | سالب |
| العقم | لا يوجد نهائي للنمو (14 يوما) | لا يوجد نهائي للنمو (14 يوما) | لا يوجد نهائي للنمو (14 يوما) | لا يوجد نهائي للنمو (14 يوما) |
| غرام وصمة عار | لا توجد كائنات حية (NOS) | نص | نص | نص |
| اندوتوكين | ≤ 2 الاتحاد الأوروبي / مل | <0.50 الاتحاد الأوروبي/مل | <0.50 الاتحاد الأوروبي/مل | <0.50 الاتحاد الأوروبي/مل |
الجدول 4: ملخص نتائج اختبار إصدار مراقبة الجودة للخلايا التائية γδ.
| المقايسة المتبقية K562 | K562 | البنك المركزي العراقي | γδ فقط | γδ + منتج WCB | ||||
| T و NK نسب الخلية neg. | المتبقية K562 ٪ | T و NK نسب الخلية neg. | المتبقية K562 ٪ | T و NK نسب الخلية neg. | المتبقية K562 ٪ | T و NK نسب الخلية neg. | المتبقية K562 ٪ | |
| 99.4 | 98.8 | 98.7 | 96.83 | 3.49 | 0.58 | 0.48 | 0.07 | |
| 99.2 | 98.31 | 99.5 | 98.21 | 12.8 | 0.38 | 3.87 | 0.71 | |
| 98.9 | 98.6 | 97.6 | 95.55 | N/A | N/A | 14.4 | 0.63 | |
| 99.2 | 98.9 | 97.9 | 96.53 | N/A | N/A | N/A | N/A | |
| 98.7 | 98.3 | 98.6 | 97.6 | N/A | N/A | N/A | N/A | |
| متوسط | 99.08 | 98.58 | 98.46 | 96.94 | 8.15 | 0.48 | 6.25 | 0.47 |
| سانت ديف. | 0.28 | 0.27 | 0.74 | 1.02 | 6.58 | 0.14 | 7.26 | 0.35 |
الجدول 5: نسب K562 السلبية والنسب المتبقية للخلايا T وNK كتردد للخلايا الحية. المختصرات: NK = الخلية القاتلة الطبيعية؛ WCB = بنك الخلايا العاملة.
Discussion
وقد وضعت مختبر Moffit العلاج بالخلايا بروتوكول مع التوسع ثنائي الطور من الخلايا التائية نقية للغاية لاستخدامها ك DP في التجارب السريرية. يوفر هذا البروتوكول طريقة تصنيع تحت المبادئ التوجيهية cGMP في نظام مغلق ينتج خلية T نقية للغاية DP التي يتم تنشيطها وتوسيعها بنجاح بواسطة حمض الزوليدروك وAPCs WCB. وقد تمت الموافقة على هذا البروتوكول من قبل ادارة الاغذية والعقاقير لتصنيع خلية γδ T allogeneic DP لمرضى مكافحة غسل الأموال. باستخدام المتبرعين الأصحاء، قمنا بنجاح بتوسيع عدد السكان الصغير من الخلايا التائية المانحة في 7 أيام فقط من 2.06 ± 0.45٪ إلى 54.45 ± 28.34٪. بعد التوسع لمدة 7 أيام مع حمض الزوليدرونيك ، لوحظ أن المانح 2 كان لديه زيادة في عدد سكان ناغورني كاراباخ.
حمض الزوليدرونيك يمنع فارنسيل ثنائي فوسفات synthase (FDPS) في monocytes، والذي، بدوره، يؤدي إلى تراكم الفوسفات ثنائي فوسفات الإيزوبينيل (IPP)، والتي ارتبطت مع زيادة كبيرة في انتشار الخلايا التائية والخلايا الطبيعية NK7،8،9. هذه الزيادة في عدد سكان ناغورني كاراباخ تعيق المرحلة الثانية من التوسع مع AAPCs ، لأن AAPCs لن تسهم إلا في زيادة توسيع خلايا ناغورني كاراباخ. ولهذا السبب، عدلت معايير المانحين لاستبعاد المانحين الذين ترتفع أعدادهم في ناغورني كاراباخ. بعد استنفاد الخلايا التائية αβ، تم إثراء الخلايا التائية إلى 76.61 ± 27.51٪. يتضمن هذا البروتوكول الفريد توسعا ثانيا باستخدام مستقبلات Moffit المصنعة لاستهداف مستقبلات CD8 و CD28 و CD127L في الخلايا التائية. هذه المرحلة التوسع الثاني مع aAPCs أسفرت عن DP مع ≥65٪ للخلايا CD3 + TCR γδ + T، ≤1٪ TCRαβ، وخلايا CD3-CD16 + CD56 + NK <35٪. ونظرا لاستخدام مركبات الكربون الهيدروفلورية المشتقة من K562، كان من الضروري إثبات أن هذه المركبات تشكل <1 في المائة من المنتج النهائي.
طور Moffit CTF فحصا للتدفق الخلوي يستخدم لمعايير الإطلاق لقياس النسبة المئوية لخلايا K562 المتبقية في DP النهائي. هذا المقايسة الخلوية التدفق يخفف من جميع القضايا من استخدام مستضدات سطح الخلية لتحديد خلايا K562. كما تنشيط الخلايا التائية يمكن التعبير عن CD71، وضعنا استراتيجية لاستبعاد جميع الخلايا التائية وخلايا NK عن طريق gating على CD3- CD56- و CD16- السكان ومن ثم فحص خلايا CD71+ ، والتي ستكون حصرا خلايا K562. هذا البروتوكول يدل على أن οδ T الخلية DP تسفر عن 0.48 ± 0.42٪ من الخلايا K562 المتبقية ويلبي جميع معايير الإفراج عن ≥70٪ الجدوى، سلبية الميكوبلازما من قبل PCR، لا الكائنات الحية التي ينظر إليها من قبل تلطيخ غرام، ≤2 الاتحاد الأوروبي / مل من endotoxin، وليس نهائي النمو (14 يوما) عقم ثقافة الدم.
Disclosures
ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.
Acknowledgments
نقدم الشكر للعلاجات المناعية الخلوية - المحقق بدء التجارب جائزة فرصة التمويل داخل العين من مركز موفيت للسرطان لتوفير التمويل لهذا التطور البروتوكول. كما نشكر الدكتور كلاوديو أنسيتي على مساعدته وتوجيهاته القيمة من خلال هذا المشروع. وأخيرا، نشكر الدكتور جاستن باوتشر على أفكاره ومراجعة المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
| Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
| Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
| Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04--8 | FDA approved drug |
| DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
| CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 100 mL syringe | JMS | 992861 | |
| 18g Needle | Fisher | 305198 | |
| Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
| 5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
| 50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
| 10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
| 100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
| 15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
| 50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
| 250 mL conical | Fisher | 430776 | |
| 600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
| 4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
| Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
| 100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
| Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
| Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
| Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
| 1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
| Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
| CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
| CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
| Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
| 75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
| IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
| AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
| Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
| 3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
| 1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
| CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
| Elutra | TERUMOBCT | ||
| CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
| GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
| HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |
References
- Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
- Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
- Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
- Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
- Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
- Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
- Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
- Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
- Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).
