Summary
Præsenteret er en protokol for udvidelsen af Gamma-Delta (γδ) T celle stof produkt. Lymfocytter er isoleret ved opstemthed og γδ-beriget med zoledronsyre og interleukin-2. Alpha-beta T-celler er udtømt ved hjælp af en klinisk-grade magnetisk adskillelse enhed. ΓΔ-cellerne er co-cultured med K562-afledte, kunstige antigen-præsentere celler og udvidet.
Abstract
Selv om Vγ9Vδ2 T-celler er en mindre delmængde af T-lymfocytter, er denne population efterspurgt for sin evne til at genkende antigener i et større histokompatibilitetskompleks (MHC)-uafhængig måde og udvikle stærk cytolytisk effektorfunktion, der gør det til en ideel kandidat til kræftimmunterapi. På grund af den lave frekvens af Gamma-Delta (γδ) T-celler i det perifere blod udviklede vi en effektiv protokol til i høj grad at udvide et meget rent γδ T-celler lægemiddelprodukt til første-i-menneskelig brug af allogene γδ T-celler hos patienter med akut myeloid leukæmi (AML). Ved hjælp af sund donoraferese som en allogen cellekilde isoleres lymfocytterne ved hjælp af en valideret enhed til en kontraflowcentrifugeringsmetode til at adskille celler efter størrelse og tæthed.
Den lymfocyt-rige fraktion udnyttes, og γδ T-cellerne er fortrinsvis aktiveret med zoledronsyre (FDA-godkendt) og interleukin (IL)-2 i 7 dage. Efter præferenceudvidelsen af γδ T-celler anvendes en magnetisk celleadskillelsesanordning af klinisk kvalitet og TCRαβ-perler til at nedbryde forurenende T-cellereceptor (TCR)αβ T-celler. De højt berigede γδ T-celler gennemgår derefter en anden udvidelse ved hjælp af manipulerede kunstige antigen-præsenterende celler (aAPCs) afledt af K562 celler-genetisk manipuleret til at udtrykke enkeltkædet variabelt fragment (scFv) til CD3 og CD28, 41BBL (CD137L) og IL15-RA-sammen med zoledronsyre og IL-2. Såning hele dagen-7 beriget γδ T celler i co-kultur med aAPCs letter fremstillingen af meget ren γδ T-celler med en gennemsnitlig fold udvidelse af >229.000 gange fra sundt donorblod.
Introduction
Leukæmi tilbagefald er den hyppigste årsag til dødelighed efter hæmatoopoietic celletransplantation (HCT) hos patienter med AML1,2,3. Bedre leukæmifri overlevelse blev rapporteret med øget genvinding af blod γδ T-celler efter HCT uden øget risiko for Graft-versus-Host Disease (GVHD)4. Γδ T-cellernes evne til at genkende antigener på en MHC-uafhængig måde og udvikle stærke cytolytiske og Th1-lignende effektorfunktioner gør denne mindre delpopulation af T-celler ideel til behandling af AML-patienter, der gennemgår allogen transplantation med risiko for tilbagefald5. I betragtning af at Vγ9Vδ2 T-cellerne er en mindre delmængde af T-lymfocytter fra 0,5% til 5% af T-cellerne i periferien6, satte vi os for at etablere et robust system til at udvide denne sjældne population af blodlegemer for at opnå potentielt terapeutiske doser til kliniske forsøg.
Selv om andre med succes har udvidet γδ T-celler ved hjælp af zoledronsyre og endda aAPCs, har vi udviklet en proces, der potentielt kan udvide γδ T-celler med 229.749 gange. Udvidelsen er bifasisk: For det første opnås lymfocytter ved opstemthed ved hjælp af separationsinstrumentet. Udstyret giver et lukket system, der gør det muligt adskillelse af celler baseret på deres størrelse, form og tæthed ved kontraløb centrifugering. Efter berigelse for lymfocytter opnås selektiv udvidelse af Vγ9Vδ2 T-celler ved behandling med zoledronsyre og IL-2 i 7 dage. Umiddelbart efter denne behandling nedbrydes TCR-αβ T-celler ved hjælp af mikroperleteknologi, hvilket giver mulighed for efterfølgende udvidelse af γδ T-cellerne med K562-afledte aAPCs.
Til procesvalidering blev der kun brugt 5 × 106 zoledronsyreforvoksede γδ T-celler til fase-2-samkulturudvidelsen med aAPCs. I denne anden fase af udvidelsen aktiveres γδ T-celler ved hjælp af en aktuel good manufacturing practices (cGMP)-kompatibel working cell bank (WCB) af genetisk manipulerede K562-afledte aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) fremstillet på Moffitt. Rationalet for denne bifasiske ekspansion er baseret på zoledronsyres evne til at hæmme farnesyldiphosphatsynase (FDPS) i monocytter, hvilket fører til akkumulering af isopentenyl pyrophosphat, som direkte stimulerer Vγ2Vδ2-cellerne. I anden fase af udvidelsen giver de K562-afledte aAPCs (K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)) en robust stimulering til alle T-celler. Celleproduktet er dog allerede blevet beriget til γδ T-cellerne, hvilket resulterer i en robust udvidelse af γδ T-cellerne.
Ved brug af specifikt udstyr og kolber er processen et funktionelt lukket system, hvilket reducerer risikoen for forurening. Derudover letter 1 L-bioreaktoren 1 L-lukket system maksimal vækst og ekspansion af celler i et samlet volumen på 1 L medium med minimalt behov for fodring. Fordelen ved Moffitt-metoden er, at den giver et hurtigt, reproducerbart og meget muligt GMP-system til fremstilling af et meget rent, donorafledt γδ T-celleprodukt til allogen administration. Denne metode kan anvendes på ethvert klinisk forsøg, der har til formål at bruge humane γδ T-celler, der udtrykker Vγ2Vδ2 T-cellereceptorer som adoptivimmunterapi for at mægle immunitet mod mikrober og tumorer hos kræftpatienter med delvis og fuldstændig remission. Derudover giver det en robust platform til udvikling og produktion af γδ kimær antigen receptor-positive (CAR +) T-celler.
Protocol
BEMÆRK: IRB-godkendelse blev indhentet, og der blev indhentet informeret samtykke fra donorerne.
1. Lymfocyt isolation
- Overfør afereseproduktet til et rent rum.
BEMÆRK: Procesvalidering blev udført ved hjælp af normal donoraferese fra en ekstern kommerciel leverandør, der er i overensstemmelse med reglerne for indsamling af råvarer til cellulær materiale. - Indsamle prøver til sterilitet test, celletal, og celle phenotyping.
- Elutriate på kontraflow centrifugering enhed ved hjælp af et primært medium af Hanks Balanced Salt Solution med 1% human serum albumin (HSA) og et sekundært medium af saltvandsopløsning (0,9% natriumchlorid Injection USP) eller Dulbecco's Fosfat-Buffered Saline (DPBS). Indstil elutriation centrifugering hastighed på 900 × g og indsamle fraktioner baseret på flowhastighed og tid.
- Prøver udtages prøver fra fraktion 2 og udfører følgende prøver: 2 mL til sterilitetstest; 0,5 mL for celleantal og levedygtighed ved hjælp af acridin orange/propidium jod (AO/PI); 5 × 106 celler til celle phenotyping ved flow cytometri.
- Udvid en ren lymfocytfraktion (fraktion 2) af celler i kultur ved 10 × 106 celler/cm2 i en 1 L lukket bioreaktor med 5 μmol/L zoledronsyre og 300 IE/mL IL-2.
- Inkuberes i syv dage i en inkubator, der er indstillet til 37 °C med 5% CO2.
2. Alpha-beta (αβ) T celle udtømning
- Høst celler fra 1 L lukket system bioreaktor kolbe. Steril-svejsning en 1 L overførselspakke til den røde linje af det lukkede system bioreaktor, og bruge den relevante farmaceutiske pumpe til at overføre cellerne i overførselspakken.
- Tag følgende prøver: 10 mL for brugt medium sterilitet; 0,5 mL celler til celleantal og levedygtighed ved hjælp af AO/PI 5 × 106 celler til flowcytometri
- Brug cellerne ved ~5 × 108 celler/mL i fosfatbufferet saltvand (PBS) eller (PBS/ethylendiamintetraacesyre (EDTA)) buffer + 0,5 % HSA og biotinyleret TCR αβspecifikt antistof.
- Sæt shakeren i køleskabet, og inkuber cellerne ved 2-8 °C i ca. 15 min med rysten.
- Vask cellerne med i alt 600 mL PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA. Centrifuge til fjernelse af det ubundne antistof ved 200-500 × g i 15 min ved 2-8 °C. Resuspend ~5 × 108 celler/mL i PBS/EDTA buffer + 0,5% HSA med antibiotinspecifikke mikroperler (7,5 mL/1 hætteglas).
- Sæt shakeren i køleskabet, og inkuber cellerne ved 2-8 °C i ca. 15 min med rysten. Efter inkubation centrifugerer cellerne ved 200-500 × g i 15 min ved 2-8 °C for at fjerne de ubundne mikroperler. Resuspend ~ 6 × 107 celler / mL i PBS / EDTA buffer + 0,5% HSA og overføre dem til en overførsel pakke taske.
- Installer slangesættet i den magnetiske celleadskillelsesanordning af klinisk kvalitet ved at følge fabrikantens anvisninger, placer pakningerne med PBS/EDTA-bufferen og overførselspakken med celleproduktet i instrumentet, og spikes det, når instrumentet instruerer det.
- Vælg protokollen Udtømning 1.2 for udtømning af de mærkede αβ T-celler.
- Centrifuge målfraktionen (beriget γδ T-celler) og genbruge cellerne i medium suppleret med 10% human AB serum.
- Tag en 0,5 mL prøve og udføre en celle tæller og levedygtighed med AO / PI plet. Bringe celler til en endelig koncentration på ca. 1 × 106 celler / mL. Tag en prøve på 5 × 106 celler i produktet for flowcytometri phenotyping post-udtømning.
3. Co-kultur med aAPCs
- Bestråle 5 × 107 aAPCs/kolbe ved 100 Gy på røntgengenereringsinstrumentet.
- Brug aAPCs i co-kultur på en 10:1 forhold med γδ T celler. Anbring de bestrålede aAPC'er (5 × 107 celler/kolbe) og γδ T-celler (5 × 106 celler/kolbe) i 1 L lukkede bioreaktorflasker med 1 L kulturmedium suppleret med 10 % human AB-serum. Frø op til 10 kolber.
- Udvid cellerne i kulturen i 10 dage i en inkubator ved 37 °C og 5% CO2.
- Overvåg glukose- og laktatniveauer hver 3-4. dag ved hjælp af strimler, glukose og en laktatmåler.
- Hvis glukose falder til 250 mg/dL, reduceres volumenet i kolben til 200 mL ved hjælp af en farmaceutisk pumpe ved steril svejsning en 1 L-overførselspakke til den røde linje i det lukkede system bioreaktor.
- Bland cellerne i de resterende 200 mL, og tag en 0,5 mL prøve til celletælling og levedygtighedsmåling ved AO-PI farvning. Hvis celletallet er ≥109, opdeles en kolbe i to kolber og hver kolbe fyldes op til 1 L med AIM-V suppleret med 10% human AB serum. Hvis celletallet er <109, fodre cellerne med en frisk liter kulturmedium suppleret med 10% human AB serum.
- Gentag trin 3.6 for alle kolber, og sæt dem tilbage til inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Gentag trin 3,4-3,7 hver 3.-4.
4. Cellehøst
- I slutningen af 10 dage i co-kultur, høste alle bioreaktor kolber. Høst 1 bioreaktorkolbe ad gangen, og pulje alle cellerne i en overførselspakke af passende størrelse. Steril-svejse overførselspakken til den røde linje af den lukkede system bioreaktor, og bruge den farmaceutiske pumpe til at overføre cellerne i overførselspakken.
- Fjern følgende kvalitetskontrolprøver: 1% af lægemidlet (DP) til sterilitet ved blodkultur og gram farvning; 0,5 mL for celletælling og levedygtighed ved hjælp af AO/PI 5-10 × 106 celler til flowcytometri (se figur 1 for gating strategi); 0,5 mL for endotoksin; 0,5 mL til gram farvning; 106 celler spiked i 10 mL af brugt medium til Mycoplasma test.
- Centrifugere cellerne ved 200-500 × g i 15 min ved stuetemperatur og kassér supernatanten.
- Vask cellerne i en opløsning af afbalanceret krystalloid opløsning+ 0,5% HSA ved 200-500 × g i 15 min ved stuetemperatur. Resuspend dem i et målvolumen på 100-300 mL afbalanceret krystalloid opløsning + 0,5% HSA.
5. Udgivelsestest
- Udføre kvalitetskontrol af γδ T-celle DP for følgende: renhed og identitet efter flowcytometri (Live/Dead, CD45, CD3, TCR αβ, TCR γδ, CD20, CD56, CD16); levedygtighed ved AO/PI farvning endotoxin; Mycoplasma test ved polymerase kædereaktion (PCR); sterilitet ved gram farvning og aerob og anaerobe blodkulturer; resterende K562-analyse efter flowcytometri (CD3-CD16-CD56-CD71+).
Representative Results
γδ T-celleprocessen blev karakteriseret og optimeret til produktion af γδ T-cellelægemidlet. Procesoptimering omfattede 1) lymfocytberigelse ved hjælp af elitriation, 2) γδ T-cellestofstof (DS) cellespecifik ekspansion med zoledronsyre, 3) γδ T-celle DS udtømning af TCRαβ, 4) sekundær udvidelse af γδ T-celle DS ved hjælp af K562-afledte aAPCs og 5) endelig DP-høst og formulering af produkt til administration eller kryopreservation. Efter procesoptimering blev bekræftelseskørsler udført i stor skala ved hjælp af materialet afledt af tre sunde donorer for at bekræfte cellebehandlingsegnethed. Alle data er analyseret og opsummeret i tabel 1, tabel 2 og tabel 3. Cellerne adskilt fra post-counterflow centrifugation fraktion 2 (F2) gav en ren lymfocyt befolkning med et gennemsnit på 99,23% CD45 + celler (rapporteret som hyppigheden af den samlede levende gate) og fremragende gennemsnitlig levedygtighed på 95,80% (tabel 1).
Den γδ T-celle-specifikke ekspansion med zoledronsyre afhang af den oprindelige procentdel af naturlige dræber (NK) celler til stede i lymfocyt fraktion (F2) efter opsigtsvækkende. Berigelsen af γδ T celle DS med TCRαβ udtømning var konsekvent (tabel 2). Γδ T-celle DP fremstillet af tre raske donorer havde i gennemsnit 0,11% ± 0,05% CD20 + B-celler og 0,00% ± 0,00% TCR αβ + T-celler, hvilket opfylder udgivelseskriteriet for ≤1% af TCR αβ + T-celler. Den gennemsnitlige procentdel af NK-celler i slutproduktet er 17,06% ± 26,19% og opfylder udgivelseskriteriet på <35%. Derudover var den gennemsnitlige procentdel af T-celle- og NK-cellelinje-negative celler i det endelige produkt 0,48 % ± 0,42 % (tabel 3). Celle overflade farvning og flow cytometri analyse blev udnyttet til at karakterisere identitet, renhed og proces urenheder af DS og DP, som vist i figur 2A-D.
Den sekundære udvidelse, opnået fra samkulturen af aAPC (K562CL6(CD3-CD137L:CD28-IL-15RA)) WCB og γδ T celle DS i et forhold på 10:1, genererede en γδ T celle DP, der opfyldte alle udgivelseskriterier, som vist i tabel 4. Derudover blev cellerne farves og vurderet ved flowcytometri ved dag 0-kontraløb centrifugering F2-celler, dag 7-zoledronsyre-udvidede T-celler, Dag 7-TCR αβ T celleudtømning, dag 17-endelige DP for følgende biomarkører klynge af differentiering (CD)3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CC chemokine receptor 7 (CCR7), programmeret celledød protein-1 (PD-1), cytotoksisk T-lymfocyt-associeret protein 4 (CTLA4), lymfocytaktiverende gen 3 (LAG3) og T-celle immunoglobulin og mucindomæneholdigt protein 3 (TIM3). Data vist i figur 3 beregnes i gennemsnit fra tre uafhængige kørsler og viser, at cellerne ikke har nået udmattelse. Moffitt CTF udviklede også en resterende K562-analyse til bestemmelse af DP-urenheder relateret til de K562-afledte aAPC'er (figur 4).
Den flowcytometriske gating strategi, der anvendes til at karakterisere procenterne af celletyper var som følger: 1) gating på T og NK celle afstamning-negativ befolkning (CD3-CD56-CD16-); 2) gate på CD71 + (transferrin receptor udtrykt i erythroid afstamning og AML giver mulighed for påvisning af resterende K562 celler). Denne gating strategi gjorde det muligt at evaluere CD3-CD16-CD56-CD71+ celler, som er aAPC (K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)) WCB (betegnet "resterende K562" i figur 4). Denne gating gør det muligt at optælle resterende K562 i den endelige DP ved at multiplicere hyppigheden af resterende K562 med det samlede antal levedygtige tællinger (TVC) for DP (%CD71+ × DP TVC = Residual K562-celler i DP). Alle flowcytometriske data rapporteres som hyppigheden af levende celler. Tabel 5 og figur 4 indeholder procentdelene af T-celle- og NK-cellelinje-negative samt resterende K562-celler. Der blev udført en tohalet t-test for at bestemme den statistiske betydning af forskellene mellem disse populationer og afslørede, at der var en betydelig forskel mellem WCB- og γδ T-celle DP og mellem WCB- og γδ T-celler (t = 0,0019 for T-celle- og NK-cellelinje-negative; t < 0,0001 for resterende K562 og t = 0,0314 for T-celle og NK celle afstamning-negativ; t < 0,0001for resterende K562) (tabel 5).
Figur 1: Skematisk repræsentation af flowcytometrisk gatingstrategi. Forkortelser: aAPC = , kunstig antigen-præsenterer celle; SSC-A = side scatter-område af peak; FSC-A = fremadrettet scatter-område af peak; SSC-H = side scatter-højde af peak; FSC-H = fremadrettet scatter-højde af peak; CD = klynge af differentiering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Sammensætning af udgangsmateriale, mellemprodukter og slutlægemiddel. Alle viste data er i gennemsnit fra tre uafhængige kørsler. (A) Aferese fra raske donorer gennemgår opsigtskning ved hjælp af kontraflow centrifugeringsanordningen, hvilket resulterer i F2 (lymfocyt-rig fraktion), der bruges som udgangsmateriale. (B) F2 gennemgår Vγ9Vδ2 T cellespecifik ekspansion i 7 dage med 5 μmol/L zoledronsyre og 300 IE/mL IL-2 i 1 L medium suppleret med 10% human AB serum. (C) TCR αβ T-celleudtømningen udføres på det zoledronsyreforspændede produkt. (D) Et meget rent γδ T-cellelægemiddel høstes efter en anden 10-dages udvidelse med bestrålede aAPCs i et 1:10-forhold med 5 μmol/L zoledronsyre og 300 IE/mL IL-2 i 1 L medium suppleret med 10% human AB serum. Forkortelser: NK = naturlig dræber; CD = klynge af differentiering; TCR= T-celle receptor; IL = interleukin; aAPCs = kunstige antigen-præsentere celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Biomarkører af udgangsmateriale, mellemprodukter og slutlægemiddel. Celler indsamles og farves til CD3, TCRαβ, TCR γδ, CD45RA, CD45RO, CCR7, PD-1, CTLA4, LAG3 og TIM3 på Dag 0-Counterflow Centrifugation F2 celler, Dag 7-zoledronsyre-ekspanderede T-celler, Dag 7-TCR αβ T celle udtømning, Dag 17-Final Drug Product. Alle viste data er i gennemsnit fra tre uafhængige kørsler. (A) Stem-lignende (CD3+, TCR γδ+, CD45RA+, CD45RO-og CCR7+) vist som et samlet antal levende celler. (B) Central hukommelse (CD3+, TCR γδ+, CD45RA-, CD45RO+ og CCR7+) afbildet som en procentdel af CD3+ TCR γδ+-celler. Forkortelser: CD = klynge af differentiering; TCR= T-celle receptor; IL = interleukin; . CCR7 = CC chemokin receptor 7; PD-1 = programmeret celledødsprotein-1; CTLA4 = cytotoksisk T-lymfocyt-associeret protein 4; LAG3 = lymfocytaktiverende gen 3; TIM3 = T-celle immunoglobulin og mucin domæneholdigt protein 3. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative data fra en resterende K562-analyse (CD3-CD16-CD56-CD71+). Forkortelser: aAPC = kunstig antigen-præsenterer celle; NK = naturlig dræbercelle; SSC-A = side scatter-område af peak; CD = klynge af differentiering; IL = interleukin; TCR = T-celle receptor; MCB =mastercellebank; FMO = fluorescens minus en; DP = lægemiddel; WCB = arbejder celle bank. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Udfør procestrin | Parametre | Donorer | Gennemsnitlig | St. Dev. | |||
| Kør 1 | Kør 2 | Kør 3 | |||||
| Post-berigelse (lymfocyt brøk F2) | TVC Alle Proces Valideringer blev seedet på 109 TVC | 1,00 X 109 | 1,00 X 109 | 1,00 X 109 | 1,00 X 109 | 0.00 | |
| Levedygtighed (%) | 98.6 | 96.6 | 92.2 | 95.8 | 3.27 | ||
| CD20+ B-celler (%) | 15.6 | 23.4 | 15.2 | 18.07 | 4.62 | ||
| CD3+ T-celle (%) | 80.04 | 66.7 | 76.1 | 74.28 | 6.85 | ||
| TCR αβ+ (%) | 77.59 | 58.03 | 68.96 | 68.19 | 9.8 | ||
| TCR γδ+ (%) | 2.48 | 1.59 | 2.1 | 2.06 | 0.45 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK-celler (%) | 6.57 | 19.4 | 10.5 | 12.16 | 6.57 | ||
| T-celle og NK celle afstamning negativ (%) | 13 | 13.7 | 13.4 | 13.37 | 0.35 | ||
Tabel 1: Resumé af lymfocytberigelse ved opstemthed rapporteret som hyppigheden af levende celler. Forkortelser: TVC = samlet levedygtigt antal; TCR = T-celle receptor; CD = klynge af differentiering; NK = naturlig dræbercelle.
| Udfør procestrin | Parametre | Donorer | Gennemsnitlig | St. Dev. | |||
| Kør 1 | Kør 2 | Kør 3 | |||||
| 7-dages Post Zoledronic syre Ekspansion (pre-TCRαβ udtømning) | TVC | 3,69 X 109 | 1,79 X 109 | 1,42 X 109 | 2,3 X 109 | 1,22 X 109 | |
| Levedygtighed (%) | 99.2 | 82.6 | 89.8 | 90.53 | 8.32 | ||
| CD20+ B-celler | 2.1 | 11.5 | 7.08 | 6.89 | 4.7 | ||
| CD3+ T-celle (%) | 95.7 | 64.1 | 91.9 | 83.9 | 17.25 | ||
| TCR αβ+ (%) | 13.88 | 38.14 | 31.98 | 28 | 12.61 | ||
| TCR γδ+ (%) | 81.44 | 24.93 | 56.98 | 54.45 | 28.34 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK-celler (%) | 3.59 | 33.1 | 7.28 | 14.66 | 16.08 | ||
| T-celle og NK celle afstamning negativ (%) | 0.67 | 2.7 | 0.82 | 1.4 | 1.13 | ||
| Post-TCRαβ udtømning | TVC | 1,81 x 109 | 4,95 X 108 | 3,80 X 108 | 8,95 X108 | 7,94 X 108 | |
| Celle levedygtighed (%) | 98.8 | 87.6 | 89.8 | 92.07 | 5.93 | ||
| CD20+ B-celler | 2.26 | 12 | 6.59 | 6.95 | 4.88 | ||
| CD3+ T-celle (%) | 95.8 | 45.3 | 89.7 | 76.93 | 27.56 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | 0.001 | ||
| TCR γδ+ (%) | 95.61 | 45.07 | 89.16 | 76.61 | 27.51 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK-celler (%) | 3.85 | 59.9 | 9.79 | 24.51 | 30.79 | ||
| T-celle og NK celle afstamning negativ (%) | 0.34 | 1.72 | 0.45 | 0.84 | 0.77 | ||
| TCR αβ+ TVC | 0.00 | 4,95 x 103 | 3,8 X 103 | 2,92 X 103 | 2,59 X 103 | ||
| TCR γδ+ TVC | 1,73 X 109 | 2,23 X 108 | 3,39 X 108 | 7,64 X 108 | 8,39 X 108 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK TVC | 6,97 X 107 | 2,97 X 108 | 3.72E+07 | 1,35 X 108 | 1,42 X 108 | ||
Tabel 2: Resumé af γδ T celle ekspansion med zoledronsyre og instrument berigelse rapporteret som hyppigheden af levende celler. Forkortelser:TVC = samlet antal levedygtige; TCR = T-celle receptor; CD = klynge af differentiering; NK = naturlig dræbercelle.
| Produktattributter | Parametre | Donorer | Gennemsnitlig | St. Dev. | |||
| Kør 1 | Kør 2 | Kør 3 | |||||
| Dag 0 γδ T-celler | 2,48 X 107 | 1,59 X 107 | 2,10 X 107 | 2,06 X 107 | 4,47 X 107 | ||
| Dag 7 efter berigelse γδ T-celler | 1,73 X 109 | 2,23 X 108 | 3,39 X 108 | 7,64 X 108 | 8,39 X 108 | ||
| Fold udvidelse på dag 7 | 69.76 | 14.03 | 16.14 | 33.31 | 31.58 | ||
| TVC ved høst* | 8,14 X 1010 | 1,67 X 1010 | 6,84 X 1010 | 5,55 X 1010 | 3,42 X 1010 | ||
| Celle levedygtighed (%) | 92.8 | 85.5 | 87.3 | 88.53 | 3.80 | ||
| CD20+ B-celler (%) | 0.12 | 0.06 | 0.15 | 0.11 | 0.05 | ||
| CD3+ T-celle (%) | 97.8 | 52 | 97.5 | 82.43 | 26.36 | ||
| TCR αβ+ (%) | 0 | 0.001 | 0 | 0.00 | 0.00 | ||
| TCR γδ+ (%) | 97.51 | 50.13 | 97.21 | 81.62 | 27.27 | ||
| CD3-CD56+CD16+ NK-celler (%) | 2.16 | 47.3 | 1.71 | 17.06 | 26.19 | ||
| T-celle og NK celle afstamning negativ, CD71 + Resterende K562 (%) | 0.018 | 0.61 | 0.82 | 0.48 | 0.42 | ||
| I alt γδ T-celler ved Harvest | 7,93 X 1012 | 8,38 X 1011 | 6,65 X 1012 | 5,14 X 1012 | 3,78 X 1012 | ||
| Samlet fold udvidelse af γδ T-celler (Fra dag 0 til høst) | 3,20 X 105 | 5,27 X 104 | 3,17 X 105 | 2,30 X 105 | 1,53 X 105 | ||
| *Procesvalidering blev skaleret ned til kolbe med 5 X 106 γδ T-celle og 50 X106 bestrålede aAPCs. De rapporterede tal er for en forventet fuld skala køre, hvis 24 kolber er seedet fra D7 stof blev anvendt. | |||||||
Tabel 3: Resumé af γδ+ T celle co-kultur med aAPCs og udvidet γδ + T celle høst rapporteret som hyppigheden af levende celler. *Procesvalidering blev skaleret ned til én bioreaktor i det lukkede system (1 L-kapacitet) med 5 × 106 γδ T-celler og 50 × 106 bestrålede aAPCs. De rapporterede tal er for en forventet fuldskalakørsel, hvis 24 kolber er seedet fra D7-stoffet. Forkortelser: aAPCs = kunstige antigen-præsentere celler; TVC = samlet levedygtigt antal; TCR = T-celle receptor; CD = klynge af differentiering; NK = naturlig dræbercelle.
| Testparameter | Kriterier for accept | Resultater | ||
| Validering 1 | Validering 2 | Validering 3 | ||
| Levedygtighed | ≥ 70% | 92.80% | 85.50% | 87.30% |
| Mycoplasma | Negativ | Negativ | Negativ | Negativ |
| Sterilitet | Ingen vækst endelig (14 dage) | Ingen vækst endelig (14 dage) | Ingen vækst endelig (14 dage) | Ingen vækst endelig (14 dage) |
| Gram plet | Ingen organismer set (NOS) | NOS | NOS | NOS |
| Endotoxin | ≤ 2 EU/mL | <0,50 EU/mL | <0,50 EU/mL | <0,50 EU/mL |
Tabel 4: Oversigt over kvalitetskontrol frigive testresultater for γδ T celler.
| Resterende K562-analyse | K562 | WCB | γδ Kun | γδ + WCB Produkt | ||||
| T- og NK-cellelinje neg. % | Resterende K562 % | T- og NK-cellelinje neg. % | Resterende K562 % | T- og NK-cellelinje neg. % | Resterende K562 % | T- og NK-cellelinje neg. % | Resterende K562 % | |
| 99.4 | 98.8 | 98.7 | 96.83 | 3.49 | 0.58 | 0.48 | 0.07 | |
| 99.2 | 98.31 | 99.5 | 98.21 | 12.8 | 0.38 | 3.87 | 0.71 | |
| 98.9 | 98.6 | 97.6 | 95.55 | NIELSEN | NIELSEN | 14.4 | 0.63 | |
| 99.2 | 98.9 | 97.9 | 96.53 | NIELSEN | NIELSEN | NIELSEN | NIELSEN | |
| 98.7 | 98.3 | 98.6 | 97.6 | NIELSEN | NIELSEN | NIELSEN | NIELSEN | |
| Gennemsnitlig | 99.08 | 98.58 | 98.46 | 96.94 | 8.15 | 0.48 | 6.25 | 0.47 |
| St. Dev. | 0.28 | 0.27 | 0.74 | 1.02 | 6.58 | 0.14 | 7.26 | 0.35 |
Tabel 5: T-celle- og NK-cellelinje-negative og resterende K562-procenter rapporteret som hyppigheden af levende celler. Forkortelser: NK = naturlig dræbercelle; WCB = arbejder celle bank.
Discussion
Moffit Cell Therapy Lab har udviklet en protokol med en bifasisk udvidelse af meget rene γδ T-celler til brug som DP i kliniske forsøg. Denne protokol giver en fremstillingsmetode under cGMP retningslinjer i et lukket system, der giver en meget ren γδ T celle DP, der er succesfuldt aktiveret og udvidet med zoledronsyre og WCB aAPCs. Denne protokol er blevet godkendt af FDA til fremstilling af en allogen γδ T celle DP til AML patienter. Ved hjælp af sunde donorer, vi med succes udvidet den lille befolkning af donor γδ T-celler på bare 7 dage fra 2,06 ± 0,45% til 54,45 ± 28,34%. Efter 7-dages ekspansion med zoledronsyre blev det observeret, at donor 2 havde en stigning i NK-populationen.
Zoledronsyre hæmmer farnesyldiphosphatsyntase (FDPS) i monocytter, hvilket igen fører til ophobning af isopentenyl pyrophosphat (IPP), som er blevet korreleret med en betydelig stigning i spredningen af T-celler og naturlige NK-celler7,8,9. Denne øgede NK-population hindrer 2. fase af ekspansionen med AAPCs, da AAPCs kun vil bidrage til yderligere udvidelse af NK-celler. Af denne grund blev donorkriterierne ændret for at udelukke donorer med høje NK-populationer. Efter udtømning af αβ T-cellerne blev γδ T-cellerne yderligere beriget til 76,61 ± 27,51%. Denne unikke protokol indeholder en anden udvidelse udnytte Moffit-fremstillede aAPCs til at målrette CD8, CD28, og CD127L receptorer i γδ T celler. Denne anden udvidelsesfase med aAPCs gav en DP med ≥65% for CD3 + TCR γδ + T-celler, ≤1% TCRαβ T og <35% CD3-CD16 + CD56 + NK celler. På grund af anvendelsen af K562-afledte aAPCs var det nødvendigt at påvise, at disse AAPC'er udgjorde <1 % af slutproduktet.
Moffit CTF udviklede en flowcytometrisk analyse, der blev anvendt til frigivelseskriterierne til at måle procentdelen af de resterende K562-celler i den endelige DP. Denne flow cytometrisk assay afbøder alle de spørgsmål om at udnytte celle overflade antigener til at identificere K562 celler. Da aktiverede T-celler kan udtrykke CD71, udtænkte vi en strategi for at udelukke alle T-celler og NK-celler ved at gating på CD3- CD56- og CD16-populationer og derefter undersøge CD71+ celler, som udelukkende ville være K562-celler. Denne protokol viser, at γδ T-cellen DP giver 0,48 ± 0,42% af de resterende K562-celler og opfylder alle frigivelseskriterierne for ≥70% levedygtighed, Mycoplasma-negativitet af PCR, ingen organismer set ved gramfarvning, ≤2 EU / mL af endotoksin og ingen vækst endelig (14 dage) blodkultur sterilitet.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Cellular Immunotherapies-Investigator Initiated Trials Award Intramural Funding Opportunity fra Moffitt Cancer Center for at yde finansiering til denne protokol udvikling. Vi takker også Dr. Claudio Anasetti for hans uvurderlige hjælp og vejledning gennem dette projekt. Endelig takker vi Dr. Justin Boucher for hans indsigt og gennemgang af manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks Balanced Salt Solution | R&D | 285-GMP | |
| Human Albumin 25% | Grifolis | 65483-16-071 | |
| Plasmalyte A | Fisher | 2B2543Q | |
| Zoledronic Acid (Zometa) | Hos pira | 4215-04--8 | FDA approved drug |
| DMSO | WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH | WAK-DMSO-10 | |
| CS10 | BIOLIFE SOLUTIONS | 210374 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | |
| 10 mL syringe | BD | 309604 | |
| 20 mL syringe | BD | 302830 | |
| 50 mL syringe | BD | 309653 | |
| 100 mL syringe | JMS | 992861 | |
| 18g Needle | Fisher | 305198 | |
| Cryovials 1.8 mL | Fisher | 375418 | |
| 5 mL pipette | Fisher | 1367811D | |
| 50 mL pipette | Fisher | 1367610Q | |
| 10 mL pipette | Fisher | 1367811E | |
| 100 mL pipette | Fisher | 07-200-620 | |
| 15 mL conical | Fisher | 05-539-12 | |
| 50 mL conical | Fisher | 05-539-7 | |
| 250 mL conical | Fisher | 430776 | |
| 600 mL Transfer Pack | TERUMO BCT INC | 1BBT060CB71 | |
| 4" Plasma Transfer Set | INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES | 03-220-90 | |
| Elutra Tubing Set | TerumoBCT | 70800 | |
| 100 MCS GREX | WILSON WOLF MFG CORP | 81100-CS | |
| Ashton Sterile Pumpmatic Liquid dispensing system | Fisher Scientific | 22-246660 | |
| Acacia Pump boot | MPS Medical In | 17789HP3MLL | |
| CliniMACS PBS/EDTA Buffer | Miltenyi Biotec Inc | 130-070-525 | |
| Dornase Alpha | Genentech, Inc | 50242-100-40/186-0055 | FDA approved drug |
| 1000 mL 0.22 um Filter | Fisher | 157-0020 | |
| Blood Filter 170um | B.Braun | V2500 | |
| CliniMACs Tubing set | Miltenyi Biotec Inc | 130-090-719 | |
| CliniMACS TCRα/β Kit | Miltenyi Biotec Inc | 130-021-301 | |
| Y-Type blood set | Fenwal | FWL4C2498H | |
| 75 mL Flask | Fisher | 430641U | |
| IL-2 | Prometheus | 65483-116-071 | FDA approved drug |
| AIM-V | Fisher | 0870112BK | |
| Human AB serum | Gemini Bio-Product | 100H41T | |
| 3 Liter Transfer pack | Independent Medical Associates | T3109 | |
| 1000 pipette tips | Fisher Scientific | 5991040 | |
| CF-250 | KOLBio | CF-250 | |
| Elutra | TERUMOBCT | ||
| CliniMACS | Miltenyi Biotec Inc | ||
| GatheRex Liquid Handling, Cell Harvest Pump | WILSON WOLF MFG CORP | ||
| HERAcell Vios CO2 Incubator | Thermo Scientific |
References
- Bejanyan, N., et al. Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).
- Bejanyan, N., et al. Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation. Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).
- Schmid, C., et al. Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation. Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).
- Siegers, G. M., et al. Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model. PLoS One. 6 (2), 16700 (2011).
- Airoldi, I., et al. γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes. Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).
- Acuto, O., et al. The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors. Cell. 34 (3), 717-726 (1983).
- Xiao, L., et al. Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells. Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).
- Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy. Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).
- Xu, Y., et al. Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer. Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).
